CN101084026A - 含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇－双丙烯酸酯(pegda)交联的水凝胶 - Google Patents

含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇－双丙烯酸酯(pegda)交联的水凝胶 Download PDF

Info

Publication number
CN101084026A
CN101084026A CNA2005800292687A CN200580029268A CN101084026A CN 101084026 A CN101084026 A CN 101084026A CN A2005800292687 A CNA2005800292687 A CN A2005800292687A CN 200580029268 A CN200580029268 A CN 200580029268A CN 101084026 A CN101084026 A CN 101084026A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tissue
soft tissue
cell
thing
support
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800292687A
Other languages
English (en)
Inventor
毛剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Arkansas
University of Illinois
Original Assignee
University of Illinois
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Illinois filed Critical University of Illinois
Publication of CN101084026A publication Critical patent/CN101084026A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

本发明描述了由生物相容支架中的成体间充质干细胞(MSCS)从头和体内合成预定形状和尺寸的软组织的方法和组合物。将支架植入宿主动物体内并在其中制造，或者用于体内回输的体外处理进行保持。诱导血管生成强化了软组织植入物的成功。

Description

含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇-双丙烯酸酯(PEGDA)交联的水凝胶
使用包埋在生物相容的水凝胶中的成体间充质干细胞，将包括脂肪组织和成纤维细胞在内的软组织生物工程化为预定的形状和尺寸。
背景
软组织缺损的修复是当代医疗实践的重大挑战。多种类型的乳腺癌和面部癌症是危及生命的并且一旦将其切除就会造成患者的软组织缺损和变形。乳房切除术和肿瘤切除外科手术是必须的手术操作的实例，这种手术操作需要替换缺失的软组织以恢复自然形状和/或生理功能。在诸如基底细胞癌、鳞状上皮细胞癌、黑素瘤以及其它头与颈部癌症等癌症切除术之后，需要面部整形手术。改善的癌症医学控制可以提高生存率，并且使癌症生存者产生恢复其软组织缺损的形态和功能的愿望。在战争期间造成的损伤会导致除了骨骼损伤以外的软组织创伤。与工作相关的事故和交通事故是造成软组织缺损的其它原因。在烧伤后软组织缺损不仅需要对皮肤而且还要对皮下软组织进行重建。在先天异常，例如半侧面部肢体发育不良(与另一侧面部相比一侧面部发育不良)中，缺损大量的软组织并且需要对其进行重建。在2003年，美国有总共约6百万个体接受了由整形外科医生进行的重建手术操作(美国整形外科医生协会，http://www.plasticsurgery.org/public_education/2004Statistics.cfm)。
在美国，2002年在外科美容操作上花费了约50亿美元，在非外科美容操作上花费了约20亿美元(例如胶原注射)。与之相关的是一年进行的约7百万整容外科和非外科操作。
近几十年来，外科医生使用其创造性的智慧改善了软组织重建操作。在软组织重建操作中自体软组织移植和合成材料是主要的实践。每种方法均具有其优缺点，并且适合基于临床判断的特定类型的患者和软组织缺损。不幸的是，当前的软组织重建和增大操作并不理想，其具有不良副作用，例如供体部位发病、泄漏、突出、不自然的结构、再吸收以及免疫排异反应。虽然已经将自体成熟脂肪组织用作软组织缺损的填充物，但是结果难以预见的。体积减少似乎是自体移植物高达70％的再吸收的主要问题。自体软组织移植的体积减少可能是由于移植的成熟脂肪细胞的细胞凋亡，这是因为移植的成熟脂肪细胞对局部缺血和较低的血管再造率的耐受性较低。脂肪切除术或吸脂操作提供脂肪移植的另一途径。已经将通过吸脂作用分离的成熟脂肪细胞的单细胞混悬液与支架结合并移植以填充软组织缺损。然而，体积减少仍然是个问题，这可能是因为成熟脂肪细胞的85％的细胞质是脂质，这导致对血管生成的巨大需求。在大多数严重的病例中，来自吸脂抽吸物的脂肪移植物伴随着非最理想的血液供给和移植物的坏死。由吸脂作用造成的机械应激会造成高达90％植入的脂肪细胞的损害。另一复杂因素是成熟脂肪细胞是完全分化的并且不再增殖，这导致脂肪移植物中的生脂细胞的不足。
与成熟脂肪细胞相比，优选通过切除或吸脂操作可以从动物或人类脂肪组织分离的前脂肪细胞(pre-adipocytes)，这是因为前脂肪细胞被认为能够通过用于回输的体外处理(ex vivo)增殖至某一程度，并且与成熟脂肪细胞相比，其低氧环境更耐受。然而，在切除和/或吸脂操作期间可能损伤某些前脂肪细胞。已经将诸如3T3-L1和3T3-F442A等若干前脂肪细胞细胞株用于在诸如PGA网等的生物材料中工程化脂肪组织。虽然这些生脂细胞系对于体外研究来说十分有价值，但是它们是永生的并且因此对于体内前脂肪细胞的工程化来说，它们不如原代前脂肪细胞那么有价值。例如，接种在多孔PLA支架中的前脂肪细胞在体内产生脂肪组织。被肽连接的藻酸盐移植物支持接种的绵羊前脂肪细胞的附着和增殖以及脂肪组织的形成。向人类和鼠类外源性输送的bFGF据报道可以在胶原或Matrigel支架中促进连续的生脂分化和脂肪组织的形成。
间充质干细胞(MSCs)来自胚胎干细胞并分化为形成全部结缔组织的细胞系，该结缔组织例如脂肪组织、软骨、骨、骨骼肌以及间质纤维组织。可以从骨髓、脂肪组织、乳牙和骨骼肌中分离MSCs。除了其多潜能的性质以外，MSCs可以自我更新并且复制许多代而不丧失其干细胞特性(stemness)。MSCs是首先被分离并鉴别为附着在细胞培养Petri培养皿上的成纤维细胞样的细胞。在人类中，通常从髂嵴上骨髓中抽吸MSCs，然而通常从胫骨和股骨的中段骨干中抽吸鼠类的MSCs。根据以曝光的各种已确立的诱导培养基，例如生脂的、软骨形成的、成骨的、生肌的等，MSCs分化进入确定的途径并且开始表达相应细胞系的基因和蛋白质标志物特征。
间充质干细胞(MSCs)是生脂细胞和脂肪细胞的祖细胞。末期的脂肪细胞既不复制也不进一步分化。因此，在其它因素之中，脂肪细胞形成细胞的缺少造成了当前软组织移植操作后的体积减少。据报道，人间充质干细胞(hMSCs)可以在Petri培养皿的单层培养物中分化为生脂细胞。已经描绘了在体外人MSCs脂肪形成期间所表达的大量的基因。
通常需要支架材料提供对工程化移植物中组织形成细胞的最初的粘着和支撑。对于努力之成功，为特殊的组织工程应用选择合适的支架是重要的。组织的发育取决于结构环境、细胞-生物材料相互作用以及支架中结合的潜在生物信号。
基于细胞的脂肪组织工程的先前的工作主要使用多孔支架。然而，脂肪组织工程中多孔支架的常见缺点是与侵入宿主细胞产生的酶潜在相关的成熟前的再吸收和/或多孔支架的降解。包括胶原、弹力蛋白、透明质酸、琼脂糖、藻酸盐、壳聚糖和聚乙二醇水凝胶在内的水凝胶涵盖支架的大部分。PEG水凝胶被用于包囊包括软骨细胞和成骨细胞在内的多种类型的细胞。据报道，PEGDA水凝胶的流变学和恢复性质具有可与人类腹部脂肪组织可比拟的若干参数。
重建和整形外科关注于特殊的形状和尺寸。假定如果实现了从干细胞成功地得到工程化的组织肾脏，只要工程化的肾脏在体内功能正常，那么就不再需要与患者正常肾脏相同的精确的形状。相反地，必须恢复如图1A和B所示的软组织缺损以使其具有除了生理功能以外，还必须具有原始的形状和尺寸。随着时间的流逝体积减少可以高达60％。事实上，在外科文献中的软组织重建的其它并发症中，软组织移植物的“术后体积减少”是主要问题。
虽然诸如瘢痕化或非最理想的组织整合可能造成体积减少，但是推测主要问题是缺少能够1)持续合成脂肪和纤维基质以维持体积，以及2)自我复制以补充脂肪和纤维基质形成细胞的供给的结合的细胞。诸如脂肪细胞的末期细胞不能满足这些需求。
在组织工程中应用生物材料的主要障碍是非最理想的组织向内生长和较弱的血管化作用。已经用于体内的生物材料的成功归因于替代的诸如软骨和皮肤等宿主组织的无血管性质。天然软骨和皮肤很大程度上无血管并在缺少血管化作用中营养素的扩散十分稀少。然而，对于尺寸大于几毫米的工程化的组织或器官体内组织形成细胞的存活通常是很弱的，然而，需要更大质量的组织形成细胞以工程化大多数组织和器官。因此，需要新生血管形成以促进组织形成细胞工程化的组织和器官的存活。
血管被认为实质上是通过两种性质不同的生物学过程形成的，血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。血管发生是由内皮祖细胞形成毛细血管的过程。血管生成，即由已经存在的血管来形成新的血管，对于组织发育和创伤愈合是重要的和必须的过程。血管生成是通过两个机理潜在地进行的：套迭和萌发。当间充质细胞柱迁移至已经存在的血管中时，发生套迭血管生成。这种类型的血管生成引起局部血管网络的重塑。另一方面，萌发血管生成指由存在的血管结构形成新的血管。虽然在出生以后已经观察到了血管发生，但是血管生成是引起成体新血管形成的通常过程。血管生成和血管发生涉及需要大量信号处理的事件的复杂级联反应并且涉及多重细胞系。虽然天然组织的血管形成过程日益清晰，但是对于工程化组织的新血管发生的理解还是处于初期。
组织工程主要使用两种方法诱导血管形成：激发内源性生成血管的应答以及工程化模仿天然血管网络的生物材料中的物理结构。可以通过大量的诸如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等生成血管的分子激发静止的内皮细胞以便转变为生成血管的内皮细胞。除了其生成血管的活性以外，证明bFGF可以激发成骨细胞的增殖，使得bFGF对于骨组织工程变得尤其重要。
通过光刻法摹制组织工程材料中的微通道来模拟毛细血管。虽然以前在促进大量生物相容的聚合物材料中的血管生成进行了不懈的努力，但是体内非多孔水凝胶中的新血管形成仍然是组织工程应用的挑战。
聚乙二醇(PEG)是用于组织工程中的大量水凝胶聚合物之一。PEG是无毒的和水溶性的不被免疫系统识别的聚合物。食品及药物管理局(FDA)已经批准PEG在人类中进行生物应用。PEG的优点是对于工程化组织和器官所必须的对给定形状和尺寸的成型性。可以使用光引发剂来生产PEG水凝胶，所述光引发剂导致线形PEG连接的丙烯酸酯低聚物结点的交联。然而，PEG是稠密的水凝胶并且具有缓慢的降解速率，根据特定组织工程的应用，上述特点既可以被视为优点也可以被视为缺点。对于药物输送，PEG缓慢的降解速率有助于进行包被的细胞因子的控制释放。可以通过改变分子量和PEG水凝胶的浓度来改变细胞因子的扩散速率。作为组织工程的支架，可以根据PEG的交联、浓度和共聚作用来改变PEG的降解速率。例如，通过与聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)的共聚来改变PEG的降解速率。然而，对于体内组织工程来说与PEG广泛使用相关的有待解决的问题是在PEG水凝胶中宿主组织向内生长和血管化作用的缓慢的和最小的量。
概述
来自生物相容支架中的成体间充质干细胞的生物工程化的软组织具有预设的三维结构；即形状和大小或尺寸。可以从成体间充质干细胞制备任何形状或大小的生物工程化的软组织构成物并且容易在体外(in vitro)、用于体内回输的体外处理(ex vivo)和体内(in vivo)制造。这些植入物可用于由于美学、疾病、先天性畸形或创伤而需要整形手术的患者。
含有多种添加物的水凝胶中的间充质干细胞提供具有降低的体积减少的植入物、细胞退化的低速率和对预设的形状和尺寸的成型性。
通过在生物相容的支架中的成体间充质干细胞提供在体内或用于体内回输地体外(ex vivo)制备具有预定(或预设)形状和尺寸的生物工程化的软组织的方法和组合物。根据该方法，提供分散在预设三维结构的生物相容支架中的间充质干细胞(MSCs)。通过将MSCs与生脂诱导添加物和/或成纤维细胞生长因子bFGF接触来诱导这些细胞分化为脂肪和成纤维细胞组织形成细胞。将所述接触时间段维持至足以至少使某些成体间充质干细胞分化为具有预定三维结构的软组织，所述结构由需要重建或修复的性质决定。构成物是通过标准的外科操作植入需要所述构成物的受者中的软组织。在形成的软组织中存在脂肪细胞和成纤维细胞以及小至无法觉察量的干细胞。
由诸如聚合的聚乙二醇双丙烯酸酯等水凝胶聚合物来构造生物相容的支架。所述生物相容的支架以及因此使用该支架制备的工程化的软组织具有预设的三维结构。可以在将MSCs分散至生物相容的支架前体以前或者以后形成水凝胶聚合物，以便使所述聚合物包裹住MSCs。例如通过生物相容的支架前体的光聚合作用来形成所述水凝胶聚合物。
对于脂肪组织工程应用的支架来说PEG水凝胶是有利的。PEG是亲水的、生物相容的并且降解缓慢，这对工程化的脂肪组织的体积维持来说是有用的。
因为组织形成细胞来自患者自身的骨髓或与其匹配的其他来源，所以可以防止构成物的免疫排斥。软组织与患者自身组织生物学驱动的愈合过程整合。可以使用现代整形外科手术方法来缓解独立的单位审批的需求。此外，使用成体干细胞(而非胚胎干细胞)以便最小化伦理组织。
改良标准细胞培养操作以便指导大量组织工程实验室制造生物工程化的软组织。
本文所描述的材料和方法表示使血管组织在体内向内生长入非多孔生物相容的水凝胶中的物理和化学方法罕见的组合。由PEG水凝胶中内皮样细胞内衬的血管样结构含有红细胞并且对抗VEGF和WGA抗体呈阳性染色，这表明在浸润的宿主组织中存在内皮细胞。结合在工程化的大通道中由内皮样细胞内衬的腔中所含有的红细胞形态学，在当前的研究中，组织向内生长可能是血管组织。表明，单独或以组合使用的大于先前使用的微通道的物理大通道及化学刺激剂、碱性成纤维细胞生长因子，促进了体内PEG水凝胶中血管组织向内生长。然而，在大通道和bFGF的效果之间存在重要的不同。与被负载有bFGF的不含大通道的PEG的宿主血管组织的随机浸润相比，血管和颗粒组织向内生长入负载有bFGF的PEG的大通道的腔中，而不浸润PEG的其它部分。因此，组织工程应用所不期望的由PEG水凝胶中bFGF诱导的明显随机的宿主组织侵入的能力迫使由工程化的大通道引导的血管组织向内生长。该定向的血管组织向内生长在需要血管生成的通用组织工程应用中是重要的。虽然不含bFGF的大通道的PEG诱导血管组织在通道中向内生长，但是浸润入大通道的、负载有bFGF的PEG中血管组织体积的量比不含bFGF的大通道的PEG中血管组织体积的量要大的多。
附图简要说明
图1是系列的4张照片(A-D)，其显示了在免疫缺陷小鼠的背部皮下植入4周后的组织工程化的脂肪组织构成物以及对照构成物的大体外观：(A)在构成物装配期间用于负载聚合物/细胞混悬液的塑形模型；(B)包被生脂处理的hMSCs的组织工程化脂肪组织构成物，所述构成物被保持原始模型的形状和尺寸；(C)包被未处理的hMSCs的采集的对照构成物；(D)不含包被细胞的采集的对照构成物。注意到所有构成物与原始模型之间的尺寸相似性并且注意到组织工程化的构成物(B)和对照构成物(C和D)之间的对比。
图2是系列的4张照片(A-D)，其显示了在单层培养和水凝胶构成物中用于体内回输的体外(ex vivo)维持的人间充质干细胞(hMSCs)所产生的脂肪形成；(A)在生脂培养基中维持4周的hMSCs单层培养物的油红O阳性染色；(B)与(A)相应的对照单层培养物，当使用基础培养基保持4周时，对油红O染色其表现出阴性反应；(C)在水凝胶构成物的有代表性的显微照片中，由油红O阳性染色所表明的脂肪沉着体，所述水凝胶构成物包被生脂处理的hMSCs并在生脂培养基中由用于体内回输的体外保持4周；(D)与(C)相应的对照的显微照片，其对油红O无反应。
图3是系列的4张照片(A-D)，其通过组织化学染色和RT-PCR显示了由维持在体内的组织工程化构成物中的hMSCs所形成的脂肪；(A)在组织工程化水凝胶构成物中油红O的阳性染色，所述构成物包被生脂处理的hMSCs并被移植入免疫缺陷小鼠的背部皮下4周；(B)对照水凝胶构成物的有代表性的显微照片显示对油红O染色呈阴性反应为证据的无脂肪沉着，所述水凝胶构成物包被未处理的hMSCs并被移植入免疫缺陷小鼠的背部皮下4周；(C)没有包被细胞的对照水凝胶构成物的有代表性的显微照片显示了对油红O的阴性反应以及与环绕构成物的纤维囊之间的完整的边界，并且不存在宿主细胞对所述构成物的侵入；(D)RT-PCR分析显示在免疫缺陷小鼠的背部皮下植入4周后采集的构成物中脂肪细胞特异性基因(PPAR-γ2)相对于看家基因(GAPDH)的表达，所述构成物包被了生脂处理的hMSCs(+脂肪)或未处理的hMSCs(-脂肪)。
图4.体内植入后PEG水凝胶中和对照组中hMSC衍生的脂肪组织的采集。A：无细胞的PEG水凝胶(箭头之间)。B：包被hMSCs的PEG水凝胶(无生脂分化)(箭头之间)。C：包被hMSC衍生的生脂细胞的PEG水凝胶中的工程化的脂肪组织(箭头之间)，其显示了对周围宿主组织的附着性并且维持了原始9mm的直径(高于A和B的放大率)。
图5.工程化脂肪组织和对照的脂肪组织的形状、尺寸和光不透明度：(A)用作一般的形状和尺寸模型的Eppendorf管(直径为9mm)的塑料帽；(B)采集的不含细胞的PEG水凝胶是相当透明的；(C)包被hMSCs(无生脂分化)的PEG水凝胶显示一定程度的光不透明性；(D)包被hMSC衍生的生脂细胞的PEG水凝胶显示基本的光不透明性并且保持了预定的形状和尺寸。
图6.体内采集的使用hMSCs接种的胶原海绵和对照组的形状和尺寸，其显示了原始形状和尺寸的丧失。(A)被修剪为约4×4×4mm立方体的无菌胶原海绵；(B)采集的不含细胞的使用hMSCs接种的胶原海绵以及体内植入4周后hMSC衍生的脂肪细胞(从左侧连续)，其显示了尺寸的严重减少和形状的严重改变。
图7.体内植入4周后采集的PEG的和胶原移植物的支架直径的量变(×100％±S.D.)。hMSCs：人间充质干细胞。灰色的直方图表示PEG移植物，而空白的直方图表示胶原移植物。不含细胞的PEG构成物(N＝6)、包被hMSCs的PEG水凝胶构成物(N＝6)、或包被hMSCs衍生的脂肪细胞(N＝6)维持了将近100％的支架原始直径。相反地，不含接种细胞的胶原海绵损(N＝4)损失了65.0％±5.0的原始直径，而由hMSCs接种的胶原海绵(N＝4)和hMSC衍生的脂肪细胞(N＝6)分别损失31.7％±5.8和31.7％±5.4的原始直径。**：P＜0.01。
图8.体内植入4周后工程化脂肪组织和对照脂肪组织的H&E和油红O染色(A)；hMSCs：人间充质干细胞；(B)无细胞的PEG水凝胶，其既没有显示定居细胞也没有显示出脂质空泡；(C)包被hMSCs但不进行生脂分化的PEG水凝胶，其显示了丰富的细胞；(D)hMSC PEG水凝胶的油红O染色，其显示没有脂质空泡；(E)包被hMSC衍生的生脂细胞的PEG水凝胶，其显示了在间隙小岛间丰富的定居细胞；(F)包被hMSC衍生的生脂细胞的PEG水凝胶的油红O染色，其显示了在与脂肪细胞相似的扁平细胞间丰富的脂质空泡。10×放大。
图9显示了负载有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的PEG水凝胶圆柱体和人皮肤成纤维细胞(hDFs)包被的示意图。
图10是负载有bFGF的PEG水凝胶的体内植入和大通道的建立的示意图。
图11显示了包被在PEG水凝胶中的bFGF的体内释放。
图12显示了体内植入样品的采集：(A)不含细胞、bFGF和通道的PEG水凝胶，其显示了缺乏肉眼可见的宿主组织侵入；(B)带有3个大通道(每个直径为1mm)的PEG水凝胶，其显示了在建立的大通道的3个腔中宿主组织的向内生长；(C)负载有bFGF但是不含大通道的PEG水凝胶；(D)含有bFGF和大通道的PEG水凝胶，其显示了通常的红色并且在建立的大通道的3个腔中3个宿主组织的向内生长。
图13显示了体内采集的使用不同物理和化学条件处理的PEG水凝胶的高倍放大图，即带有或不带有大通道的bFGF，这些图显示了血管样结构的形成。
图14显示了基于抗VEGF抗体在采集的既不含bFGF也不含大通道的PRG水凝胶圆柱体的有代表性的切片上的阴性免疫印迹。
图15显示了带有来自Triticum vulgaris的凝集素(小麦胚凝集素)(WGA)的侵入宿主组织的大片的阳性染色。
公开的详细说明
软组织是重建和增大外科手术中需要恢复的关键结构。当前用于软组织重建和/或增强的材料具有如下缺点，例如非最理想的体积保持、供体部位的发病率以及低生物相容性。可以通过采集患者的一茶匙容量的成体干细胞、扩增该成体干细胞、并使该成体干细胞分化为生脂细胞并将所述生脂细胞包被入合适的生物相容的聚合物材料中从而工程化生物活性软组织。最终的结果是如同针状大小的最小的供体部位创伤、免疫相容性以及长期的体积维持，所述免疫相容性是因为使用的是患者自身的干细胞，所述长期的体积维持是因为干细胞能够补充维持工程化脂肪组织的预定形状和尺寸的生脂细胞。在整形和重建外科操作中可以实现干细胞衍生的软组织移植。
由成体间充质干细胞(MSCs)在预定三维构型的生物相容支架中制备软组织的从头合成(De novo)提供用于软组织的修复、增大或重建的构成物。成体MSCs能够分化为所有形成包括软骨组织、骨组织和脂肪组织在内的结缔组织的细胞系。可以通过最低限度地侵入操作由骨髓或身体的其它结缔组织来源中得到MSCs，该MSCs在培养中是可以高度扩增的并且暴露在已经建立的生脂诱导添加物后，易于被诱导分化为脂肪组织形成细胞(Pittenger et al.，Caplan，2003)。此外，出于程序和伦理原因，使用成体MSCs也比使用胚胎干细胞或分化的脂肪细胞更为有利。
成体间充质干细胞来自骨髓细胞。至少某些间充质干细胞分化为脂肪细胞，以便最初存在两种细胞类型的混合物，随着时间的推移，基本上只存在脂肪细胞，而只存在小到不能检测到量的干细胞。由干细胞在体内制造肪组织或由干细胞通过用于体内回输的体外处理制备脂肪组织。
将MSCs置于用于脂肪组织工程化的支架材料中。可以在支架制备之后，将MSCs置于该支架中，例如干细胞由宿主机体扩散至制备好的支架中的情况。将MSCs与支架前体混合，然后在MSCs周围构建支架，借此至少将某些细胞俘获在支架网络之中。所述支架是生物相容的，其支撑组织的形成并且具有足以使新形成的组织与周围宿主组织成功整合的能力。
示例性的宿主动物包括诸如大鼠、小鼠和家兔等实验室动物，诸如狗或猫等伴侣动物，诸如马(马科动物)、牛(牛族动物)、绵羊(绵羊科动物)或山羊(山羊科动物)等家畜，诸如猴子、猿(黑猩猩、猩猩或大猩猩)或人等灵长类的动物。
合适的生物相容支架包括水凝胶聚合物构成物或聚合的、辐射聚合单体或其它合适的构成物。水凝胶聚合物提供具有模仿机体内环境细胞外基质的组织形成细胞。水凝胶聚合物是亲水的、吸收或吸附(sorb)大量水或生物液体，而同时维持其不同的三维结构的三维网络。诸如藻酸盐、珊瑚、琼脂糖、纤维蛋白、胶原、骨、软骨、羟磷灰石、磷酸钙、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或其共聚物(PLGA)、壳聚糖等水凝胶聚合物以及诸如聚乙二醇双丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯及其混合物等基于聚乙二醇的聚合物(基于标记的聚合物)均是合适的。通过聚乙二醇双丙烯酸酯单体[MW 3400；Shearwater Polymers，Huntsville，AL]的聚合形成支架。聚乙二醇双丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯的分子量分别为约1000至约100,000道尔顿和约2000至约5000道尔顿。支架的物理形式例如固体、液体、凝胶、网状、粉末、海绵状或糊状。
基于聚乙二醇的水凝胶聚合物对于组织工程应用具有某些优点，因为其已被证明的生物相容性及其已经表明的支持MSCs生长以及向诸如骨的多细胞系分化的能力。此外，有可能皮下最低限度地侵入操作(注射)给予细胞-聚合物体系以及这些水凝胶具有经历诸如光聚合作用的经皮辐射诱发的聚合作用的能力。在植入宿主动物以后，可以使用对宿主动物无害的X-或γ-辐射的剂量以引发聚合作用。
生物相容的支架中的来自成体间充质干细胞的生物工程化的脂肪组织优选具有预定的三维构型：即形状和尺寸。通过聚合(形成)模型中生物相容的支架或通过用于体内回输的体外处理(宿主机体之外)的其它形式来得到该构型。可以通过宿主机体中的体内部位的尺寸和形状来确定生物相容支架的三维构型，其中所述生物相容的支架是在该宿主机体内制备的。
制造脂肪组织的生脂构成物包括生物相容的支架和来自骨髓的成体间充质干细胞。该构成物包括分散在所述支架中生脂剂。该生脂剂可以是吡格列酮(proglitazone)、β家族生长因子、前列腺素、环格列酮、地塞米松或上述的混合物。
组合物包括生物相容的支架和来自人骨髓的成人间充质干细胞，其中所述支架由水合的诸如聚乙二醇双丙烯酸酯的水凝胶聚合物，并且所述组合物还包括生脂剂、营养介质、任选的生长因子和至少一种抗生素。示例性生脂剂、营养素和抗生素包括两性霉素B、环格列酮、生物素、地塞米松、庆大霉素、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和L-甲状腺素。
体内生产生物工程化的软组织的方法包括向宿主动物植入包含生物相容支架的组合物，该生物相容支架含有成体间充质干细胞和生脂培养基。在含有细胞和诸如聚乙二醇双丙烯酸酯的单体前体并且还含有两性霉素B、环格列酮、生物素、地塞米松、庆大霉素、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和L-甲状腺素的混合物聚合后，通过俘获将成体间充质干细胞附着于支架中。聚合形成的生物相容支架包括聚合的水合水凝胶聚合物。
其它的步骤包括收集成体间充质干细胞、将该细胞与生脂培养基接触以及将该接触维持足够的时间以诱导分化为脂肪细胞、向生物相容支架上负载该脂肪细胞以及将负载有脂肪细胞的所述支架植入宿主动物中。
通过用于体内回输的体外处理产生生物工程化的软组织的方法包括向生物相容的支架中附着成体间充质干细胞，其中通过在该支架中俘获所述细胞来影响该支架、水凝胶基质，该支架还含有生脂剂、营养培养基和至少一种抗生素。所述支架包括聚合的水合聚乙二醇双丙烯酸酯基质，该聚乙二醇双丙烯酸酯含有所述生脂剂、营养培养基和至少一种抗生素，所述抗生素包括两性霉素B、环格列酮、生物素、地塞米松、庆大霉素、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和L-甲状腺素。
将商业上可以得到的来自匿名成人供体的人间充质干细胞分化为生脂细胞。将hMSC衍生的脂肪细胞包被在PEG水凝胶中并且将其植入免疫缺陷小鼠背部通过外科手术所形成的皮下口袋中。体内植入4周后，收集干细胞衍生的脂肪组织植入物。图4显示PEG水凝胶支架的修补过程。如图1D所示的那样，包被hMSC衍生的脂肪细胞的PEG水凝胶颜色较深并且良好地附在该宿主皮下组织上(图5)。图6显示了体内植入后PEG脂肪组织植入物的形状、尺寸和不同的光不透明性。包被hMSC衍生的脂肪细胞的PEG水凝胶构成物不但维持了原始的形状和尺寸，还显示了相当程度的光不透明性(图6)，这表明在hMSC衍生的生脂PEG构成物中形成了大量的生物结构。与PEG水凝胶构成物相反，同样是体内植入4周后胶原海绵丧失了其原始的形状和尺寸。如图7所示，无论是无细胞的、使用hMSCs接种的或hMSC衍生的脂肪细胞，全部的胶原海绵均丧失了其原始形状并且大量萎缩(图7C)。hMSC衍生的生脂PEG和胶原构成物的脂质积蓄的组织学标记，即油红O染色表现出阳性染色。然而，H&E染色没有显示宿主细胞侵入PEG构成物，这表明所有产生的脂肪组织均来自植入的人MSC衍生的生脂细胞。相比之下，可能存在宿主小鼠细胞侵入胶原海绵，导致宿主细胞有可能在胶原构成物中产生脂肪形成(图8)。
人间充质干细胞不但在Petri培养皿的单层培养中，而且在3D水凝胶和动物模型体内易于分化为软组织的成分。易于从需要外科修复的软组织缺损的患者中分离人MSCs，以便可以得到自体细胞疗法以防止免疫排异的问题。PEG水凝胶中的hMSC衍生的软组织植入物能够在皮下植入4周后，维持其几乎100％的预定的形状和尺寸。
对于包括脂肪组织工程化在内的工程化组织，血管生成仍然是个挑战。虽然进行了独立的尝试，但是需要在工程化的软组织植入物中诱导控制的血管生成。来自前脂肪细胞系的脂肪垫中的血管生成是来自宿主的，而非来自前脂肪细胞，这表明需要刺激宿主血管生成。虽然脂肪组织是软组织的主要成分，但是软组织是由脂肪组织和其它成分组成的。例如，在工程化的软组织植入物中需要宿主纤维组织。诱导骨组织工程化的血管生成的一些方法可以用于工程化脂肪组织中的血管生成。
增大是包括软组织工程化在内的普通的组织工程的挑战。本公开的工程化的软组织植入物的直径高达9mm并且对某些面部软组织缺陷以及其它小的软组织缺陷来说是充分的。然而，乳房切除术和大面积创伤后的软组织缺陷要求多倍的增大。诸如大量运送、营养物的扩散、血管生成以及神经分布的问题是工程化软组织的增大的所面对的日益增加的挑战。
实施例
实施例1：脂肪组织工程的用于体内回输的体外培养和体内植入物
A. 人MSCs的分离和培养
从来自22岁健康男性供体髂嵴的全骨髓抽吸物中分离人MSCs(hMSCs)(AllCells，LLC.，Berkely，CA)。简而言之，通过向全骨髓样品中加入RosetteSep间充质富集混合物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)来富集细胞。然后使用两倍体积的含有2％胎牛血清(FBS)(Atlanta Biologicals，Inc.，Norcross，GA)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Sigma，St.Louis，MO)的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释细胞。
在Ficoll-Paque(Stemcell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)垫层顶部加上稀释的样品并以300xg离心分离25分钟。从ficoll-Paque等离子界面移除富集的细胞，使用含有2％FBS和1mM EDTA的PBS洗涤细胞，并在完全培养基中再次混悬细胞：MesenCult的hMSCs基础培养基(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)，10％人间充质干细胞刺激添加物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)以及1％抗生素-抗真菌素(Gibco，Carlsbad，CA)。对细胞计数，并将其接种于100mm培养皿中10ml的完全培养基中，并在37℃下95％空气/5％CO2中维持。24小时后，丢弃非粘附细胞；使用PBS洗涤粘附细胞两次并且在每3-4天更换使用新鲜培养基的条件下维持10-14天。当形成大的集落(通常10-14天)时并且在融合以前，使用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA在37℃下对原代hMSCs进行胰蛋白酶化5分钟，计数，再次接种于100-mm的培养皿中。仅使用第一代的hMSCs。
B. 使用生脂添加物对hMSCs进行处理
对于包被研究，在基础或生脂培养基中独立地培养1周第一代hMSCs。基础培养基由MesenCult的人间充质干细胞基础培养基(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)、10％人间充质干细胞刺激添加物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)以及1％抗生素-抗真菌素(Gibco，Carlsbad，CA)组成。生脂培养基由MesenCult的人间充质干细胞基础培养基(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)、10％人生脂刺激添加物(StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，Canada)以及1％抗生素-抗真菌素(Gibco，Carlsbad，CA)组成。在37℃下95％空气/5％CO2中维持培养并且每3-4天更换培养基。
为了表明单层培养中的生脂过程，在基础或生脂培养基中分别培养4周第一代hMSCs并且使用油红O染色(Sigma，St.Louis，MO)。将培养物进行表明在培养物中脂肪的沉着的阳性油红O染色对比。
C. 水凝胶/光引发剂溶液的制备和构成物的制造
为了制备水凝胶溶液，将聚(乙二醇)双丙烯酸酯(PEGDA)(MW3400；Shearwater Polymers，Huntsville，AL)溶于含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco，Carlsbad，CA)的无菌PBS中以形成10％w/v的终溶液。向PEGDA溶液中加入光引发剂2-羟基-1-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Ciba，Tarrytown，NY)以使最终的光引发剂浓度为0.5％w/v。
在基础或生脂培养基中维持1周，在73℃下使用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA对第一代hMSCs进行胰蛋白酶化5分钟，计数，分别再次混悬于密度为5/106细胞/ml的PEGDA聚合物/光引发剂溶液中。为了制备每一构成物，将150μl等份的细胞/聚合物/光引发剂混悬液负载入直径为9mm的塑形嵌入物中(1.5ml微量离心管帽)(FisherScientific，Hampton，NH)。负载后，将携带细胞/聚合物/光引发剂混悬液的塑形嵌入物暴露在长波365nm强度约为4mW/cm2的紫外线灯(Glowmark，Upper Saddle River，NJ)下5分钟。然后将光聚合的构成物从塑形嵌入物中取出，使用无菌PBS洗涤两次，并转移至含有相应基础或生脂培养基的6孔培养板中(Fisher Scientific，Hampton，NH)。
D. 构成物的用于体内回输的体外培养和体内植入
对于用于体内回输的体外培养研究，将包被hMSC衍生的生脂细胞的水凝胶构成物(N＝12)维持在生脂培养基中(本发明所描述的)，而将包被未处理的hMSCs水凝胶构成物(N＝12)维持在基础培养基中(本发明所描述的)。在37℃下95％空气/5％CO2中维持全部培养物4周，每3-4天更换使用新鲜培养基。
对于体内研究，从模型中取出包被生脂处理的hMSCs的聚合水凝胶构成物(N＝8)、包被生脂处理的hMSCs的构成物(N＝4)和不含细胞的对照构成物(N＝4)，并使用无菌PBS洗涤两次。将全部构成物植入重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的背部的皮下口袋中(4个构成物/小鼠)(Harlan，Indianapolis，IN)，所述皮下口袋是通过腹膜内注射100mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪的常规麻醉并使用钝性解剖制成的。
E. 细胞生存力分析
根据厂商所建议的实验方案，使用存活的/死亡的生存力/细胞毒性试剂盒(Molecular Probes，L-3224，Eugene，OR)评价用于体内回输的体外维持4周的构成物中的细胞生存力。钙黄绿素(荧光染料)通过细胞膜扩散并与细胞内酯酶反应以产生绿色荧光，而乙啡啶同型二聚体仅通过损坏的细胞膜扩散并与核酸结合以产生红色荧光。细胞标记以后，在配置有长通二元发射荧光过滤器(Chroma，Rockingham，VT)的倒置光学显微镜(Leica Microsystems，Wetzler，Germany)下观察样品。
F. 组织学
在4周的用于体内回输的体外维持以及SCID小鼠的背部的体内培养后，将构成物包埋在最适切割温度(OCT)的组织冷冻混合液中(IMEB，Chicago，IL)并且使用标准组织学技术将其切割为10μm的切片。使用油红O(Sigma，St.Louis，MO)对切片染色，加上甘油明胶(Sigma，St.Louis，MO)，并在光学显微镜(Leica Microsystems，Weltzer，Germany)下观察。
G. RNA提取和逆转录聚合酶链式反应
使用RNeasy Purification Reagent(Qiagen；Valencia，CA)从体内收集的构成物中提取总RNA。在来自RNeasy试剂盒的含有200μ的RLT缓冲液的1.5ml微量离心管中将所述构成物匀浆(pelled pestle mixer；Kimble/Kontes，Vineland，NJ)。然后，加入400μl的缓冲液，然后使用QUIshredder(Qiagen，Valencia，CA)柱进一步匀浆。使用六核苷酸和superscript扩增系统(Gibco，Carlsbad，CA)进行逆转录(RT)。使用ExTaq DNA Polymerase Premix(Takara Bio，Otsu，Shiga，Japan)在58℃的退火温度下，在50μl的体系中将1μl份的所得cDNA进行30个循环的扩增。使用PPAR-γ2的特异性人引物进行聚合酶链式反应(PCR)，有义链：5′-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3′(SEQ ID NO：1)，反义链：5′-ATAAGGTGGAGATGCAGGCTC-3′(SEQ ID NO.：2)，以及看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，有义链：5′-CCCATGTTCGTCA-TGGGTGT-3′(SEQ ID NO：3)，反义链：5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′(SEQ ID NO.：4)。PCR进行30-35个循环，每一循环由在95℃下变性30秒，在55-60℃下退火30秒并在72℃下延伸1分钟，以及在完成最后一个循环后，保持另外的10分钟组成。为了排除基因组DNA的污染的可能性，还将PCR应用于没有RT的反应。在1％琼脂糖凝胶中对扩增的互补DNA进行电泳，染色，并在紫外线下拍照。
H. 组织工程化的脂肪组织构成物的大体检查
体内植入和用于体内回输的体外维持4周后，构成物(包被hMSC衍生的生脂细胞)和对照构成物(包被未处理的hMSCs或不含细胞)保持了其原始塑形模型(图1A)的物理形状和尺寸。物理加工后，构成物是坚硬的、有弹性的并且不屈服于某一限定程度。与采集自体内移植的含有使用基本培养基处理的hMSCs的透明构成物(图1C)和采集的不含包被细胞的对照构成物(图1D)相反，组织工程化的生脂构成物(图1B)呈淡黄色并且不透光。
I. 由用于体内回输的体外维持的单层培养物中和水凝胶构成物中 的hMSCs产生的脂肪形成
使用生脂培养基维持4周的人MSC单层培养通过呈现红色表示对油红O染色显示阳性反应(图2A)，与之相比的是，在基本培养基(并且不存在生脂培养基)的单层中培养的hMSCs的油红O染色没有显示反应。油红O是深红色的脂肪染色剂(脂肪可溶性染料)，主要用于显示冰冻切片中的甘油三酯(Lillie， Conn′s Biological Stains，9th Ed.Baltimore Williams&Wilkins co.，1977)。类似地，在基于PEG的水凝胶中用于体内回输的体外维持4周后，包被生脂处理的hMSCs的水凝胶构成物使用油红O显示阳性染色，与之相比的是，在基于PEG的水凝胶中，包被的非生脂处理的hMSCs对油红O染色没有显示反应(图2C和2D)。
J. 体内组织工程化的生脂构成物
组织学和RT-PCR分析显示了在SCID小鼠背部中体内培养4周后，包被生脂处理的hMSCs的水凝胶构成物中脂肪组织的从头生成(图3)。相对于包被未处理的hMSCs的对照构成物(图3B)和不含包被细胞的对照构成物(图3C)生脂构成物对油红O染色显示阳性(图3A)。此外，不含包被细胞的对照构成物没有显示宿主细胞侵入的信号并且显示了水凝胶构成物的完整边界(图3C)。在包被生脂处理的hMSCs的脂肪组织构成物中，脂肪细胞特异性PPAR-γ2基因呈阳性表达(图3D)。在一定温度下和光量控制的房间内(23-25℃，14小时光照/天)饲养所述小鼠，并对其每天喂食标准量的食物和水。
实施例2：在非多孔生物材料中工程化软组织向内生长和血管生成
A. PEG水凝胶的制备
将聚(乙二醇)双丙烯酸酯(1g)(Sheanvater Huntsville，AL，USA)溶于6.6mL含有133单位/mL青霉素和133mg/mL链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的PBS中以达到最终浓度为6.6％w/v。
将紫外线光引发剂2-羟基-1-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(Irgacure)(Ciba，Tarrytown，NY，USA)溶于100％乙醇中达到50mg/mL的浓度。通过向6.6mL PEG溶液中加入100μL光引发剂/乙醇溶液制备最终的PEG单位储液。
B. bFGF体内释放谱
根据制造者的指导方针，使用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS重新配制浓度为25μg/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)人重组体(Sigma，St.Louis，MI，USA)。使用含有BSA的PBS进一步将该溶液稀释为0.4 μg/mL的终浓度。向含有200μL PEG储液的无菌小管中加入总量为100μL的0.4μg/mL bFGF溶液。使用微量移液器将该混合物混合5次以确保混匀，然后分为75μL等份，并转移至Eppendorf帽的圆柱状模型中。使用365nm UV对这些圆柱状模型进行5分钟的光聚合(Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ，USA)。将单独的小管中的负载有bFGF的PEG水凝胶圆柱体置于37℃的水浴中1、3、7、14、21和28天(每一时间点N＝4)以测定bFGF的释放动力学，每一所述试管中有1mL含有0.1％BSA的PBS。在每一时间点，使用人bFGF免疫分析来分析每一检测小管的上清液(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)(Alhadlaq et al.，2004；Moioli et al.，2005)。
C. 从PEG水凝胶中释放的bFGF的生物活性
使用本发明所述的方法重新配制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)人重组体(Sigma，St.Louis，MI，USA)。向含有400μL PEG储液的无菌检测小管中加入总量为200μL 4μg/mL bFGF溶液。使用微量移液器将该混合物混合5次以确保混匀，然后分为75μL等份，并转移至Eppendorf帽的圆柱状模型中。使用365 nm UV对这些圆柱状模型进行5分钟的光聚合(Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ，USA)。使用200mL含有0.1％BSA的PBS来代替bFGF溶液以制备不含bFGF的PEG水凝胶。
将人皮肤成纤维细胞(hDFs)(Cambrex，Walkersville，MD，USA)接种于密度为20,000细胞/孔的4mL含有10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的改良的Eagle培养基中(完全DMEM)。在下列4个条件下孵育粘附细胞(每组N＝6)：1)含有0.1％BSA的PBS的空白液体(图9A)，2)负载有含有0.1％BSA的PBS的空白PEG水凝胶(图9A)，3)含有6.25ng/mL bFGF而不含PEG水凝胶的bFGF溶液(图9B)，4)含有0.1μgbFGF的负载有bFGF的PEG水凝胶(图9B)。对于组4，在37℃下5％CO2中使用transwell嵌入物(Becton Dickinson Labware，FranklinLakes，NJ)在DMEM中孵育hDFs 1周，所述transwell嵌入物被置于每一细胞培养孔中(0.4μm的孔径)(图9C)。在DMEM培养基中将transwell嵌入物置于比hDFs单层培养物高0.9mm的位置处，因此将全部细胞暴露于释放的bFGF而不直接与负载有bFGF的PEG圆柱体接触(图9C)。在每一上述4种条件下孵育1周后，通过使用500μL 0.1％TritonX溶液(Sigma，St.Louis，MI，USA)进行处理来收集bFGFs，使用无菌一次性的细胞起子(Fisherbrand，Pittsburgh，PA)来刮除细胞，收集在组织培养管中，使用声波降解法(Sonica Dismembrator Mode 100，Fisher，piitsburgh，PA，USA)在冰上进行裂解并均浆。然后将hDF裂解物收集在离心管中并在-80℃储藏。根据现有方法(Fluorescent DNAQuantitation kit，Bio-Rad，Hercules，CA)(Alhadlaq et al.，2004；Moioli etal.，2005)使用与双链DNA结合的Hoechst 33258的荧光定量分析测定DNA的含量。
D. 负载有bFGF的PEG水凝胶的体内植入
向200μL的PEG溶液中加入总量为100μL的1μg/μL bFGF溶液，然后温和混合，再使用微量移液器向Eppendorf帽的圆柱体模型中加入75μL等份。使用365nm的UV对所得的PEG圆柱体进行5分钟的光聚合(Glo-Mark，Upper Saddle River，NJ，USA)。通过使用无菌毛细管引入3个刺穿在每一PEG水凝胶圆柱体中建立总计为3个的大通道(图10B和D)。制备以下的PEG水凝胶用于体内植入(每组N＝4)：1)空白(不含bFGF也没有大通道)(图10A)，2)负载有bFGF但没有大通道(图10B)，3)具有大通道但不含bFGF(图10C)，4)负载有bFGF并且具有大通道(图10D)。
通过腹腔内注射氯胺酮(100mg/kg体重)和甲苯噻嗪(4mg/kg体重)将雄性重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(系C.B17；4-5周龄)麻醉(Alhadlaq et al.，2004)。将小鼠背部的毛剪掉并将小鼠置于俯卧位，然后使用10％聚乙烯吡咯酮碘和70％乙醇进行消毒。沿着背部的上中矢线做1cm长的线性切口，然后通过钝性解剖形成皮下小袋。每一SCID小鼠接受4个PEG水凝胶植入物：空白PEG水凝胶、负载有bFGF但不含大通道的PEG水凝胶、不含bFGF但具有大通道的PEG以及含有bFGF和大通道的PEG。使用可吸收的纯(plain)肠4-0线封闭切口。将全部PEG水凝胶圆柱体植入体内4周。公共动物管理委员会同意本动物实验方案。
E. 体内水凝胶样品的收集，组织学、免疫组织化学和数据分析
在SCID小鼠背部皮下植入4周后，收集PEG水凝胶圆柱体。使用CO2窒息后，在SCID小鼠背部无菌地形成切口。在小心地去除周围的纤维囊后，从宿主中分离PEG水凝胶圆柱体，使用PBS洗涤所述PEG水凝胶圆柱体，将所述PEG水凝胶圆柱体固定于10％福尔马林中至少24小时。然后将PEG样品包埋在石蜡中并制作5μm厚的横断面切片(大通道的横向，参看图10B和10D)。使用苏木精和伊红对石蜡切片染色。
对邻近H&E染色切片的连续切片进行脱石蜡，在PBS中洗涤，并在室温下使用牛睾丸透明质酸酶(1600U/ml)的含150mM氯化钠的乙酸钠缓冲液，pH 5.5，消化30分钟。按照以前的方法进行免疫组织化学操作(Mao et al.，1998；Alhadlaq and Mao，2005)。简而言之，室温下使用5％牛血清白蛋白(BSA)处理切片20分钟以阻断非特异性反应。使用下列抗体：抗血管内皮生长因子(抗VEGF)(ABcam，Cambridge，MA USA)和含有和不含有抑制剂乙酰基甲氧苄二胺(Sigma，St.Louis，MI，USA)的生物素标记的来自Triticum vulgaris的凝集素(小麦胚凝集素)(WGA)。WGA与富含D-GlcNAc和NeuAc的血管内皮细胞的碳水化合物族结合(Jinga et al.，2000；Izumi et al.，2003)。在潮湿箱中使用初级抗体孵育过夜后，使用PBS洗涤切片并使用IgG抗小鼠二抗(1∶500；Antibodies，Davis，CA)孵育30分钟。然后在潮湿箱中使用抗生蛋白链菌素-HRP轭合物孵育切片30分钟。在PBS中洗涤后，使用二抗重复双重连接操作。使用二氨基联苯胺(DAB)溶液对载玻片显影并使用Mayer苏木精复染3至5分钟。在梯度乙醇中将复染的载波片脱水并在二甲苯中清洁。对阴性对照进行除了省略初级抗体以外的相同的操作。
通过手工描绘4倍放大的H&E染色切片上含有或不含有负载的bFGF的大通道PEG水凝胶中浸润宿主组织的量，对工程化大通道中组织向内生长的量进行定量化。使用Student t检验和ANOVA方差比较由计算机化的图像分析产生的自动化面积值以确定有bFGF负载的大通道PEG水凝胶和无bFGF负载的大通道PEG水凝胶之间的组织向内生长的量是否存在显著差异。
F. 体外bFGF释放谱
图11A显示了包被在PEG水凝胶中的bFGF的释放谱。包被在PEG中的bFGF的当前释放动力学显示，在第一个24小时中爆发释放(约5.8％)，然后持续释放直至测试的28天(图11A)。到28天时从PEG水凝胶中总共释放了15.3％的包被bFGF。
G. 依赖PEG释放的bFGF生物活性
从PEG释放包被的bFGF显示出对单层培养中人皮肤成纤维细胞的显著的作用。使用bFGF溶液处理的hDFs的DNA含量为69.8±5.6ng(平均值±标准误；N＝6；图11B中左侧实心直方图)，明显高于未暴露于bFGF的hDFs的DNA含量，后者的值为34.5±2.7ng(N＝6；图11B中的‘空白的’或左侧空白直方图)。类似地，从PEG水凝胶释放的使用bFGF处理的hDFs的DNA含量为52.6±3.7(N＝6；图11B中右侧实心直方图)，明显高于暴露于不含bFGF的PEG水凝胶的hDFs的DNA含量，后者的值为27.5±1.7 ng(N＝6；图11B中的‘空白的’或右侧空白直方图)。有趣的是，在含有bFGF溶液的DMEM中培养的hDFs的DNA含量明显高于在含有由PEG水凝胶释放的bFGF的DMEM中培养的hDFs的DNA含量(P＝0.43)(图11B中的两个实心直方图)。本文将讨论由bFGF溶液和由PEG水凝胶释放的bFGF所诱导的hDFs的DNA含量的差异。
H. 体内收集的含有大通道和/或bFGF的PEG水凝胶
关于SCID小鼠背部的4周体内植入，收集的既不含有大通道也不含有bFGF的PEG水凝胶圆柱体的H&E染色切片没有显示宿主组织的向内生长(图12A)。然而，不含bFGF的大通道PEG水凝胶显示了宿主组织仅向大通道腔中的向内生长，而没有显示向PEG其余部分的向内生长(图12B)。相反地，负载有bFGF而不含大通道的PEG水凝胶显示了PEG水凝胶独立区域中的宿主组织向内生长的非常随机的区域(图12C)。最有趣的是，负载有bFGF并具有大通道的PEG水凝胶显示宿主组织向大通道腔中的向内生长，但是并不显示向PEG其余部分的向内生长(图12D)。具有大通道并负载有bFGF的PEG水凝胶圆柱体显示了比具有大通道但不含bFGF的PEG水凝胶圆柱体更加显著的宿主组织向内生长，前者的值为0.47±0.18mm2，后者的值为0.13±0.05mm2(平均值±标准差；P＜0.01；每组N＝4)，这表明与具有大通道但不含bFGF的PEG水凝胶相比，有更多的宿主组织向具有大通道和bFGF的PEG水凝胶中生长。
高倍放大使用不同物理和化学条件，即bFGF以及具有大通道或不具有大通道，处理的体内收集的PEG水凝胶显示形成了血管样的结构(图13)。体内采集的具有大通道但不含bFGF的PEG水凝胶在20倍的放大下显示了广泛分布的血管样结构(图13A)。在60倍的放大下，内皮细胞样细胞明显地内衬于小血管样结构并且所述小血管样结构含有几乎代表红细胞的伊红阳性细胞。相反地，负载有bFGF但不具有大通道的PEG水凝胶显示了明显随机的广泛的细胞浸润，而PEG水凝胶的区域仍然存在(图13C中的H)。图13C中的多重泡沫样结构可能代表在被入侵的宿主细胞和组织中正经历降解的PEG水凝胶(参看图13C中使用H标记的大片PEG水凝胶)。在60倍放大下，具有细胞结构的厚的膜样结构带将PEG水凝胶与被入侵的宿主组织分开(图13D)。特征性的是，具有大通道并负载有bFGF的PEG水凝胶显示在如图13E中箭头所标记明显的血管样结构中强烈的宿主细胞侵入的例子。在60倍的放大下，标记有箭头的血管样结构显示了由内皮样细胞形成的界限清楚的内衬，并且所述血管样结构具有环形形状，与红细胞非常相似的无核细胞(图13F)。
抗VEGF抗体在采集的既不含bFGF又不具有大通道的PEG水凝胶的有代表性的切片上显示阴性免疫印迹(图14A)。然而，具有大通道但是不含有bFGF的PEG水凝胶仅在大通道中显示某些模糊的反应，而在PEG的其余部分没有反应(图14B)。相反地，负载有bFGF而不含有大通道的PEG水凝胶显示出广泛的抗VEGF免疫印迹，虽然还存在具有不存在组织向内生长的明显的水凝胶支架区域(图14C)。具有大通道并且负载有bFGF的PEG水凝胶在大通道中而非PEG的其余部分显示阳性的抗VEGF染色(图14D)。
使用来自Triticurn vulgaris(小麦胚凝集素)(WGA)的凝集素对侵入宿主组织的大部分染色呈阳性(图15)，所述凝集素是标记血管内皮细胞的抗体(Jinga et al.，2000；Izumi et al.，2003)。使用WGA抑制剂乙酰基甲氧苄二胺的染色证明了使用WGA的阳性染色。图15A中的阳性WGA染色条带代表由宿主组织形成的植入的不含有大通道也不含有bFGF的PEG水凝胶圆柱体的膜包围。不仅在具有大通道但不含有bFGF的PEG水凝胶圆柱体中(图15B)，而且在具有大通道并含有bFGF的PEG水凝胶圆柱体中(图15D)均出现很深的WGA染色，这表明在被侵入的宿主血管组织和粒状组织中存在内皮细胞。相反地，负载有bFGF但不具有大通道的有代表性的PEG水凝胶圆柱体的WGA染色呈现较浅的颜色(图15C)。
引用的文献
Alcantar，NA.，Aydil，ES.，Israelachvili，JN(2000)J Biomed MaterRes 51(3)：343-351.
Alhadlaq A，Mao JJ(2003)J Dent Res 82：951-956.
Alhadlaq A，Mao JJ(2004)Stem Cells and Development 13：436-448.
Alhadlaq A，Tang M，Mao JJ(2005)Tissue Engineering 11：556-566.
Alster et al.，Plast.Reconstr.Surg.(2000)，105：2515-2525
Atala A(1999)Urol Clin North Am 26：157-168.
Atala，(1999)；Walgenbach et al.，(2001)，Anat.Rec.263：372-378；
Billings E，May，J(1989)Plast Reconstr Surg.83：368-381.
Brey and Patrick，Jr.，(2000)IEEE Eng.Med.Biol.Mag.19：122；
Brey EM，Patrick，CW Jr(2000)IEEE Eng Med Biol Mag 5：122-125.
Bryant，SJ，Anseth，KS(2003)J Biomed Mater Res 64：70-79.
Burdick and Anseth，(2002)Biomaterials 23：43 15；
Butler et al.，(1998)Plast.Reconstr.Surg.102：161；
Caplan，(2003)Novartis Found.Symp.249：17
Caplan，A1(1991)J Orthop Res 9：641.
Coleman SR(1995)Aesth Plast Surg 19：421-429.
Coleman，(1995)Aesth.Plast.Surg.19：421；
Coppit GL，Lin DT，Bwkey BB(2004)Curr Opin Otolaryngol HeadNeck Surg 12：281-287.
Davis RE，Guida RA，Cook TA(1995)Arch Otolavyngol Head NeckSurg121：95-100.
Duranti et al.，(1998)Dermatol.Surg 24：1317；
Elisseeff et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：3104；
Eppley，(1999)Plast.Reconstr.Surg.104：1761；
Fischbach C，et al.(2004a)Exp Cell Res 300：54-64.
Friedenstein，AJ，Petrakova，KV(1966)J Embry Exp Morp 16；381-390.
Fu et al.，2002 Biomaterials 23：4425；
Garfein ES，Orgill DP，Pribaz JJ(2003)Clin Plast Surg 4：485-98.
Garfein et al.，(2003)Clin.Plast.Surg.30：485).
Gath et al.，(2002)Plast.Reconstr.Surg.109：889.
Griffith LG，Naughton G(2002)Science 295：1009-1014.
Halberstadt et al.，(2002)Tissue Eng.8(3)：309-319.
Halberstadt，C，et al.(2002)Tissue Eng.8：309-19.
Hart，(2003)Plast.Surg.Nurs.23：55).
Hoffman，(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54：3
Kaban LB，Padwa BL，Mulliken JB(1998)J Oral Maxillofac Surg56：628-638.
Katz et al.，1999 Clin Plast.Surg.26：587；
Kim et al，(2003)Osteoarthritis Cartilage 11：653；
Kimura Y，Ozeki M，Inamoto T，Tabata Y(2003)Biomaterials 14：2513-21.
Kononas，TC，Bucky，LP，Hurley，C，Amy，JWJ(1993)PlastRecorzstr Surg 91：763-768.
Kral et al，(1999)Plas.Reconstr.Surg 104(6)：1732-1738；
Langer RS，Vacanti JP(1 999)Sci Am280：86-89.
Lee and Mooney，(2001)Chem.Rev.10 1：1869
Lee et al.，in Lanza，et al.(Eds.)，Principles of Tissue Engineering，2nd Ed.San Diego：Academic Press，2000：409-423；
Lee KY，Halberstadt CR，Holder WD，Mooney DJ(2000)In R.P.Lanza，R.Langer，and J.Vacanti(Eds.)，Principles of Tissue Engineering，2nd Ed.San Diego：Academic Press，2000.Pp.409-423.
Lorenz et al.，2000 Plast.Reconstr.Surg.105：2467；
Mao JJ(2005)Biol Cell 97：289-301.
Marler et al.，2000，Plast.Reconstr.Surg.105：2049-2058；
Marler et al.，2000；Patrick，Jr.，2000，Surg.Oncol.19：302-311；
Marler JJ，et al.(2000)Plast Reconstr Surg 105：2049-2057.
Martens，P，Bryant，SJ.，Anseth，KS(2003)Biomacromolecules2：283-292.
Monahan R，et al.(2001)J Am Dent Assoc 132：1402-1408.
Neels JG，Thinnes T，Loskutoff DJ(2004)FASEB J 18：983-985.
Nguyen and West，(2002)Biomaterials 23：4307
Oxley et al.，(1993)Biomaterials 14：1064；
Patel PN，Smith CK，Patrick CW Jr(2005)J Biomed Mater Res A73A：313-319.
Patrick CW Jr(2000).Semin Surg Oncol 3：302-11.
Patrick CW Jr，Chauvin PB，Reece GP(1999)Tissue Eng 5：139.
Patrick CW Jr，Friedrich J，Miller MJ(1998)Anal Quant CytolHistol 3：199-206.
Patrick Jr.，(2000)Surg.Oncol.19：302-311
Patrick Jr.，Frontiers in Tissue Engineering，1st Ed.，Oxford，ElsevierScience，1998：369-382；
Patrick，CW Jr.，Miller，MJ(2003)Clin Plast Surg 1：91-103.
Patrick，Jr.et al，(1999)Tissue Eng.5：139；
Patrick，Jr.，(2000)Surg.Oncol.19：302-311；
Patrick，Jr.，(2001)Anat.Rec.263：361-366；
Patrick，Jr.，Frontiers in Tissue Engineering，1st Ed.，Oxford，Elsevier Science，1998：369-382；
Peterson SL，Moore EE(2003)Plast Reconstr Surg 112：1371-1375
Pittenger et al.，(1999)Science 284：143-147；
Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，Jaiswal RK，Douglas R，MoscaJD，Moorrnan MA，Poshusta and Anseth，(2001)Cells Tissues Organs169：272；
Rahaman MN，Mao JJ(2004)Biotechnol Bioeng(In press).
Roncevic R，Roncevic D(1999)J Craniofac Surg 10：284-300.
Shin H，Temenoff JS，Bowden GC，Zygowakis K，Farach-CarsonMC，Yaszemski MJ，Mikos AG(2005)Biomaterials 26：3645-3654.
Simonetti DW，Craig S，Marshak DR(1999)Science 284：143-147.
Smaehel J，Meyer V，Shutz K(1990)Eur J Plast Surg 13：163-168.
Thaller  SR，Zarem HA，Kawamoto  HK(1987)Am J Surg154：149-153.
Toriyama K，Kawaguchi N，Kitoh J，Tajima R，Inou K，Kitagawa Y，Torii S(2002)Tissue Eng 1：157-65.
Tremain N，Korldto J，Ibberson D(2001)Stem Cells 19：408-418.
von Heimbwg D，Zachariah S，Heschel I，Kuhling H，Schoof H，Hafemann B，Pallua N(2001).Biomaterials 22：429-438.
Vural E(2004)Curr Oncol Rep 6：133-140.
Walgenbach et al.，(2003)Clin.Plast.Surg.30：485；
Walgenbach et al.，(2001)，Anat.Rec.263：372-378
Williams et al.，(2003)Tissue Eng.9：679
Yaremchuk MJ(2003)Plast Reconstr Surg 111：1818-1827.
Alhadlaq and Mao 2003.J.Dent.Res.82：951.

Claims (20)

1.软组织构成物，其包含分散在非多孔生物相容支架中的成体间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的软组织构成物，其进一步的特征在于具有预定的三维形状和尺寸。
3.如权利要求1所述的软组织构成物，其中所述支架是水凝胶聚合物。
4.如权利要求3所述的软组织构成物，其中所述水凝胶聚合物是聚乙二醇双丙烯酸酯。
5.如权利要求1所述的软组织构成物，其包含脂肪组织和纤维组织。
6.如权利要求1所述的软组织构成物，其中所述成体间充质干细胞来自骨髓细胞。
7.如权利要求1所述的软组织构成物，其中所述支架为选自固体、液体、凝胶、网状、粉末、海绵状和糊状物理形式。
8.如权利要求1所述的软组织构成物，其中所述支架包括选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚乙二醇及其混合物的材料。
9.如权利要求1所述的软组织构成物，其中所述支架包括选自藻酸盐、壳聚糖、珊瑚、琼脂糖、纤维蛋白、胶原、骨、硅酮、软骨、羟磷灰石、磷酸钙及其混合物的天然材料。
10.如权利要求1所述的软组织构成物，其中所述生脂剂选自吡格列酮、β家族生长因子和前列腺素。
11.制备具有预定的三维形状和尺寸的软组织构成物的方法，所述方法包括
(a)提供分散在预定的三维形状和尺寸的非多孔生物相容支架中的成体间充质干细胞；
(b)将所述成体间充质干细胞与生脂诱导添加物接触；
(c)将负载有所述脂肪细胞的所述支架植入宿主。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述非多孔生物相容支架是水凝胶聚合物。
13.如权利要求11所述的方法，其还包括：
(c)将所述间充质细胞与成纤维细胞生长因子接触。
14.如权利要求12所述的方法，其中在所述水凝胶聚合物形成之前，将所述间充质干细胞分在生物相容支架前体中。
15.如权利要求15所述的方法，其还包括在植入宿主之后引发所述水凝胶的聚合。
16.如权利要求11所述的方法，其中软组织包含脂肪组织和纤维组织。
17.权利要求1所述的软组织构成物在宿主软组织修复、增大或重建中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述宿主是哺乳动物。
19.诱导软组织植入物中血管生成的方法，所述方法包括：
(a)制备至少一个含有bFGF和成体间充质干细胞的水凝胶圆柱体；以及
(b)在宿主中植入至少一个水凝胶圆柱体以诱导血管生成。
20.组合物，其包含：
(a)生物相容支架，其中所述支架包含聚乙二醇双丙烯酸酯、2-羟基-1-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、地塞米松、转化生长因子β-1、营养培养基，所述营养培养基包含β-甘油磷酸盐和抗坏血酸-2-磷酸盐、青霉素和链霉素；以及
(b)来自人骨髓的成体间充质干细胞。
CNA2005800292687A 2004-06-30 2005-06-30 含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇－双丙烯酸酯(pegda)交联的水凝胶 Pending CN101084026A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58465704P 2004-06-30 2004-06-30
US60/584,657 2004-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101084026A true CN101084026A (zh) 2007-12-05

Family

ID=35385452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800292687A Pending CN101084026A (zh) 2004-06-30 2005-06-30 含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇－双丙烯酸酯(pegda)交联的水凝胶

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20080274185A1 (zh)
EP (1) EP1793874B1 (zh)
JP (1) JP2008504933A (zh)
CN (1) CN101084026A (zh)
AU (1) AU2005260656B2 (zh)
BR (1) BRPI0512831A (zh)
CA (1) CA2579755A1 (zh)
CR (1) CR8878A (zh)
IL (1) IL180437A0 (zh)
WO (1) WO2006004951A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468635A (zh) * 2013-08-23 2013-12-25 浙江大学 基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法
CN104027847A (zh) * 2014-06-20 2014-09-10 西安交通大学 一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法
CN104306083A (zh) * 2014-10-11 2015-01-28 清华大学 一种含通道的仿生结构及其电磁力训练装置和方法
CN104306083B (zh) * 2014-10-11 2017-01-04 清华大学 一种含通道的仿生结构及其电磁力训练装置和方法
CN111511900A (zh) * 2017-11-09 2020-08-07 南加利福尼亚大学阿尔弗雷德·E·曼恩生物医学工程研究所 用于骨再生的干细胞和装置
CN112567020A (zh) * 2018-03-06 2021-03-26 埃皮博恩股份有限公司 可注射的即用的软骨、肌腱和韧带修复组合物及其使用方法

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5538493B2 (ja) * 2006-01-16 2014-07-02 株式会社アイ・ティー・オー 生体内組織用創傷治癒用フィルム及び生体内接着用フィルム
JP5173199B2 (ja) * 2006-01-16 2013-03-27 株式会社アイ・ティー・オー 創傷治癒用高分子組成物
TW200817019A (en) * 2006-07-10 2008-04-16 Univ Columbia De novo formation and regeneration of vascularized tissue from tissue progenitor cells and vascular progenitor cells
US8753391B2 (en) 2007-02-12 2014-06-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fully synthetic implantable multi-phased scaffold
JP5161482B2 (ja) * 2007-05-09 2013-03-13 オリンパス株式会社 生体組織補填材の製造方法
WO2008148026A1 (en) * 2007-05-24 2008-12-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hybrid soft tissue implants from progenitor cells and biomaterials
CN102099462B (zh) * 2008-07-14 2013-09-18 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于提供细胞微载体的组装体的方法
US9216188B2 (en) 2008-09-04 2015-12-22 The General Hospital Corporation Hydrogels for vocal cord and soft tissue augmentation and repair
WO2010048418A1 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Cartilage regeneration without cell transplantation
HUE043110T2 (hu) * 2008-11-20 2019-08-28 Cartiheal 2009 Ltd Szilárd formák szövetjavításhoz
US8034363B2 (en) * 2008-12-11 2011-10-11 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc. Sustained release systems of ascorbic acid phosphate
EP2851098B1 (en) 2008-12-31 2017-08-09 KCI Licensing, Inc. Systems for inducing fluid flow to stimulate tissue growth
KR20110102930A (ko) 2008-12-31 2011-09-19 케이씨아이 라이센싱 인코포레이티드 신경 조직에 유체 흐름을 제공하기 위한 시스템
GB0900269D0 (en) * 2009-01-08 2009-02-11 Univ Aberdeen Silicate-substituted hydroxyapatite
DK2442749T3 (da) 2009-06-15 2019-05-27 Cartiheal 2009 Ltd Faste former til reparation af væv
US9198568B2 (en) 2010-03-04 2015-12-01 The General Hospital Corporation Methods and systems of matching voice deficits with a tunable mucosal implant to restore and enhance individualized human sound and voice production
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
CA2807762C (en) 2010-08-13 2023-08-08 Wake Forest University Health Sciences Methods for making a tissue engineered muscle repair (temr) construct in vitro for implantation in vivo
US9446075B2 (en) * 2011-05-06 2016-09-20 Bioregenerative Sciences Compositions derived from stem cell released molecules and methods for formulation thereof
US8834928B1 (en) 2011-05-16 2014-09-16 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissugenic implants, and methods of fabricating and using same
CN102430151B (zh) * 2011-09-05 2013-12-04 西安交通大学 组织工程骨软骨复合支架及其一体化光固化成型方法
US9545370B2 (en) 2012-05-08 2017-01-17 BioRegenerative Sciences, Inc. Bioactive compositions and methods for their preparation and use
KR101304015B1 (ko) * 2012-06-15 2013-09-04 단국대학교 산학협력단 조직 공학용 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법
EP2703018A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-05 Ludwig Boltzmann Gesellschaft GmbH One step method for casting hydrogels for tissue engineering
US20160296664A1 (en) * 2013-04-12 2016-10-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for host cell homing and dental pulp regeneration
MX2016001247A (es) 2013-07-30 2016-08-17 Musculoskeletal Transplant Foundation Matrices derivadas de tejido suave acelular y metodos para preparar las mismas.
CN103463676B (zh) * 2013-08-14 2016-01-20 西安交通大学 一种仿生骨/软骨复合支架及其制备工艺和固定方法
WO2015061800A2 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Collins Scott Forrest Tissue engineered devices and methods for making same
US20150266986A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 National University Of Ireland, Galway Multifunctional Hyperbranched Polymers
DE102014111091A1 (de) * 2014-08-05 2016-02-11 Karlsruher Institut für Technologie 3D-Zellkultursystem, dessen Herstellung und Verwendung
KR101613478B1 (ko) * 2014-09-22 2016-04-19 (주)안트로젠 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법
US10531957B2 (en) 2015-05-21 2020-01-14 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
US20170216346A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 Cook Medical Technologies Llc Injectable compositions and methods of use thereof
CN106754667A (zh) * 2016-11-09 2017-05-31 云南舜喜再生医学工程有限公司 一种围产期间充质干细胞二次分离培养方法
US10525406B2 (en) * 2017-05-30 2020-01-07 Saudi Arabian Oil Company Polymer blended membranes for sour gas separation
JP2022526302A (ja) 2019-03-21 2022-05-24 アンテロジェン シーオー．，エルティーディー． 間葉系幹細胞－ヒドロゲルを含有する注射用組成物、並びにその製造、凍結及び解凍方法
CN115120772B (zh) * 2022-06-20 2023-01-17 北京科技大学 维持干细胞干性的多功能dna水凝胶整合敷料及其制备方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5492697A (en) * 1990-03-05 1996-02-20 Board Of Regents, Univ. Of Texas System Biodegradable implant for fracture nonunions
US5782789A (en) * 1994-10-19 1998-07-21 Atrium Medical Corporation Macrochannel phosthetic/delivery patch
US20030161817A1 (en) * 2001-03-28 2003-08-28 Young Henry E. Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof
ATE283714T1 (de) * 2000-05-03 2004-12-15 Fidia Advanced Biopolymers Srl Preadipozyten enthaltende biomaterialien zur regeneration von weichgewebe
US6913626B2 (en) * 2001-08-14 2005-07-05 Mcghan Jim J. Medical implant having bioabsorbable textured surface
US7166133B2 (en) * 2002-06-13 2007-01-23 Kensey Nash Corporation Devices and methods for treating defects in the tissue of a living being
US20040147016A1 (en) * 2002-09-30 2004-07-29 Rowley Jonathan A. Programmable scaffold and methods for making and using the same
US20050074877A1 (en) * 2003-07-28 2005-04-07 Mao Jeremy Jian Biological engineering of articular structures containing both cartilage and bone
US7375077B2 (en) * 2003-09-19 2008-05-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois In vivo synthesis of connective tissues

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468635A (zh) * 2013-08-23 2013-12-25 浙江大学 基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法
CN104027847A (zh) * 2014-06-20 2014-09-10 西安交通大学 一种附带血管网流道的人工软组织体的制造方法
CN104306083A (zh) * 2014-10-11 2015-01-28 清华大学 一种含通道的仿生结构及其电磁力训练装置和方法
CN104306083B (zh) * 2014-10-11 2017-01-04 清华大学 一种含通道的仿生结构及其电磁力训练装置和方法
CN111511900A (zh) * 2017-11-09 2020-08-07 南加利福尼亚大学阿尔弗雷德·E·曼恩生物医学工程研究所 用于骨再生的干细胞和装置
US11484625B2 (en) 2017-11-09 2022-11-01 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California Stem cells and devices for bone regeneration
CN112567020A (zh) * 2018-03-06 2021-03-26 埃皮博恩股份有限公司 可注射的即用的软骨、肌腱和韧带修复组合物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1793874B1 (en) 2012-12-19
CR8878A (es) 2007-08-28
CA2579755A1 (en) 2006-01-12
US20080274185A1 (en) 2008-11-06
EP1793874A2 (en) 2007-06-13
WO2006004951A2 (en) 2006-01-12
IL180437A0 (en) 2007-06-03
BRPI0512831A (pt) 2008-04-08
WO2006004951A3 (en) 2006-02-16
AU2005260656A1 (en) 2006-01-12
AU2005260656B2 (en) 2011-09-22
JP2008504933A (ja) 2008-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101084026A (zh) 含有生脂间充质干细胞的聚乙二醇－双丙烯酸酯(pegda)交联的水凝胶
Yamada et al. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold
JP5483035B2 (ja) 動物組織の粉末を利用した多孔性３次元支持体の製造方法およびこれを利用して製造された多孔性３次元支持体
CN101589139B (zh) 包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法
Wang et al. Cartilage regeneration in SCID mice using a highly organized three-dimensional alginate scaffold
TWI258372B (en) Use of a device in manufacture of a medical product, a method of producing a device for repairing diseased or damaged tissue in a subject, and a device having tissue-like characteristics
Ting et al. In vitro prefabrication of human cartilage shapes using fibrin glue and human chondrocytes
CN101925675A (zh) 生物工程化组织构建物及其制备和使用方法
KR20050085079A (ko) 분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료
CN102892880A (zh) 生物工程化组织构建物及其制备和使用方法
JP2001502905A (ja) ホウォートンゼリーから分離した細胞を用いた軟骨組織の形成
AU2004226939A1 (en) Conformable tissue repair implant capable of injection delivery
JP2003510108A (ja) 生物学的関節構造体
CN101534747A (zh) 从组织祖细胞和血管祖细胞从头形成和再生血管化组织
JP3680067B2 (ja) 移植用軟骨細胞の製法
Zhao et al. Conditions for seeding and promoting neo-auricular cartilage formation in a fibrous collagen scaffold
Schantz et al. Differentiation potential of mesenchymal progenitor cells following transplantation into calvarial defects
US20220265900A1 (en) Neocartilage constructs using universal cells
KR20110032433A (ko) 세포이식술을 위한 혼합세포복합체인 세포스페로이드의 제조방법 및 이의 이용방법
CN101148657A (zh) 转化生长因子beta2基因修饰的组织工程化软骨的构建
Sasimonthon Craniofacial bone defect repair with polymer scaffold and cell-derived matrix
KR20070035592A (ko) 지방형성 중간엽 줄기 세포를 포함하는 폴리(에틸렌글리콜)-디아크릴레이트-(ｐｅｇｄａ)-가교된 하이드로겔
Helgeland Scaffold-Based Temporomandibular Joint Cartilage Regeneration: Using Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells
Zheng et al. yuliu1211@ 163. com The scarcity of ideal biocompatible scaffolds makes the regeneration of cartilage in the subcutaneous environment of large animals difficult. We have previously reported the successful regeneration of good-quality cartilage in a nude mouse model using the electrospun gelatin/polycaprolactone (GT/PCL) nanofiber membranes. The GT/PCL ratios were varied to generate different sets of membranes to conduct the
AU2011265508A1 (en) Poly (ethylene glycol) - diacrylate- (PEGDA) - crosslinked hydrogels comprising adipogenic mesenchymal stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1109351

Country of ref document: HK

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20071205

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1109351

Country of ref document: HK