DE102014111091A1

DE102014111091A1 - 3D-Zellkultursystem, dessen Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE102014111091A1
Application number: DE102014111091.9A
Authority: DE
Inventors: Friederike Gruhl; Bettina Göppert; Andrew Cato; Antje Neeb
Original assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Current assignee: Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Priority date: 2014-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-02-11
Also published as: WO2016020050A1; EP3177710A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein 3D-Zellkultursystem aufweisend ein Cryogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda). Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat-Cryogel wobei zunächst eine vorgekühlte Mischung aus Polyethylenglykol-diacrylat in einer Pufferlösung bereitgestellt wird und anschließend mindestens ein Polymerisationsinitiators und mindestens ein Polymerisationskatalysators zugegeben werden. Die Mischung wird gefroren und anschließend kann das Cryogel entnommen werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein 3D-Zellkultursystem, dessen Herstellung und Verwendung für die Prostatakrebsforschung und die Untersuchung potentieller Therapeutika zur Behandlung von Prostatakrebs.
Nach heutigem Stand sind Tierversuche die ultima ratio für die abschließende Beurteilung, ob ein Wirkstoff für z.B. die Tumortherapie geeignet ist. Die konventionelle 2D Zellkultur ist nur unzureichend in der Lage, das Verhalten und die Eigenschaften von Zellen im Tumor nachzubilden. Hier sind vor allem die dreidimensionale (3D) Vernetzung und die Interaktion mit den umgebenden Stromazellen signifikante Faktoren. Durch die 3D Zellkultur soll eine bessere Nachbildung der Bedingungen für die Tumorzellen gelingen und auf diesem Wege Tierversuche auf ein Minimum eingeschränkt werden.
In der Tumorforschung werden momentan vor allem drei Untersuchungsmethoden eingesetzt (Jung, V. et al. Urologe 47, 199–1204 (2008), Zergel, T. et al. Eur Urol 33, 414–423 (1998), Winter, S. et al. Pros Cancer Pros Dis 6, 204–211 (2003), Ahmad, I. et al. Exp Rev in mol med 10:16, 1–20 (2008):
Zum einen Klinische Gewebeproben, die z.B. im Fall von Prostatakarzinomen mittels Prostatektomien gewonnen werden. Sie bieten den Vorteil der absoluten Patientennähe und spiegeln die Momentaufnahme der in vivo Situation wieder. Diese werden als Frischgewebe oder Formalin-fixiertes, in Paraffin eingebettetes Material zur Analyse verwendet. Diese Gewebeproben können allerdings nicht für funktionelle Studien eingesetzt werden.
Des Weiteren werden, trotz des hohen Aufwandes und morphologischer Unterschiede, Tiermodelle verwendet. Zu den am häufigsten verwendeten Modellen zählen (immundefiziente) Mäuse. Obwohl die Aussagekraft und Relevanz anzuzweifeln ist, da es keine eindeutigen Analogien zwischen muriner lobulärer und humaner zonaler Architektur der Prostata gibt, ist der Vorteil durch eine vollständige in vivo-Umgebung unumstritten. Die Einführung von Xenograft-Modellen (Implantation von humanem Karzinomgewebe in immundefiziente Mäuse) lieferte Informationen, deren Auswertung jedoch auf Grund der heterogenen Mikroumgebung, der fehlenden endogenen Immunantwort und der geringen Anzahl an verschiedenen Zelllinien zur Implantation, schwierig ist. Diese Modelle lösen das intrinsische Problem der intratumoralen Heterogenität nicht und weisen zudem auf Grund der enormen Komplexität der einzelnen und der Heterogenität zwischen den Individuen eine geringe Transparenz auf.
Funktionelle Studien erfolgen in der Regel an den etablierten permanenten Zelllinien. Diese werden meist aus Metastasen generiert und repräsentieren damit bereits weit fortgeschrittene Karzinomzellen. Im Falle des Prostatakarzinoms stehen nur wenige zur Verfügung und diese weichen zudem stark von den Primärzellen ab. Des Weiteren besteht auf Grund der geringen genetischen Langzeitstabilität die seit einigen Jahren diskutierte Kontroverse zur Aussagekraft über die mit diesen Zelllinien ermittelten Ergebnisse. Erst durch die Einführung von Kokultivierungen mit Fibroblasten und extrazellulärer Matrix konnten erste Erfolge in der Langzeitstabilität genetisch aberranter Karzinomzellen erzielt werden. Es ist allgemein anerkannt, dass das Zusammenspiel unterschiedlicher Zelltypen durch Veränderungen der genetischen Ausstattung und sekretorischen Reaktionen, zu unterschiedlichen Ergebnissen führt und die Einzelkultivierung von Prostataepithelzellen keine Rückschlüsse auf das in vivo Verhalten geben kann. Dennoch ist es bisher nicht gelungen ein Modellsystem zu entwickeln, dass die vollständige in vivo Situation widerspiegelt.
3D-Kultursysteme (Wells, R.G. Hepatology 47:4, 1394–1400 (2008), Meli, L. et al. Biomaterials 33, 9087–9096 (2012), Hutmacher, D.W. et al. Trends in Biotech 28:3, 125–133 (2009), Yamada, K.M. et al. Cell 130:24, 601–610 (2007)) schließen durch Imitation von Merkmalen, welche in der natürlichen Umgebung der Zellen zu finden sind, die Lücke zwischen 2D-Zellkultursystemen und Tiermodellen. Zellen, kultiviert auf konventioneller Hartplastik oder einer Glasschicht mit einem Elastizitäts(E)-Modul von mehreren GigaPascal (GPa), zeichnen sich durch abweichende Eigenschaften aus, die im Wesentlichen Morphogenese, Genexpression, Wachstum, Beweglichkeit und Differenzierung betreffen. Zusätzlich kommt es zu einer unnatürlichen Zellpolarisation und zu einer abnormen Produktion von extrazellulären Matrix(EZM)-Proteinen. Während der 3D-Kultivierung werden Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen aufgebaut, die helfen molekulare Mechanismen besser zu verstehen. Im Folgenden werden kurz die Vor- und Nachteile der momentan eingesetzten 3D-Zellkultursysteme dargestellt:
Sphäroid-Modelle (Takagi, A. et al. Anticancer Research 27: 45–54 (2007), Härma, V. et al. PLoS ONE 5:5, 1–17 (2010), Griffith, L. G. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 211–224 (2006)) sind 3D-Systeme, die die Eigenschaft vieler Zelltypen zur Aggregation nutzen. Das Prinzip beruht auf der Kultivierung adhärenter Zellen auf nicht-adhäsiven Oberflächen, wie z.B. Agarose, oder frei in einem „hängenden Tropfen“ Kulturmediums. Die Zellen lagern sich dann in Einzel- oder Kokulturen, als mono- oder multizelluläre Sphäroide, mit einem Durchmesser von mehreren hundert µm (z.B. etwa 650 µm bei LNCaP-Zellen) zusammen. Sie werden vor allem als Tumormodell eingesetzt, da maligne Zellen im Allgemeinen nicht nur eine größere Tendenz zur Zellaggregation besitzen, sondern diese sogar als Malignitätskriterium herangezogen wird. Hinsichtlich Morphologie und Verhalten der Zellen sind Sphäroide vor allem für das Nachbilden der Situation in avaskulären Mikrotumoren oder schlecht versorgten Anteilen größerer Tumore geeignet. Allerdings wurde festgestellt, dass multizelluläre Sphäroide in Abhängigkeit von den eingesetzten Kultivierungsbedingungen unterschiedliche Typen mit verschiedenen Genexpressionsmustern ausbilden. Des Weiteren entstehen wegen des inhomogenen dreischichtigen Aufbaus aus äußerer, intermediärer und nekrotischer Zone ein radialer Sauerstoff- und Nährstoffgradient, sowie ein entgegengesetzter „Abfallstoff“-Gradient.
Basalmembran Matrix (Nyga, A. et al. J. Cell Commun Signal 5, 239–248 (2011), Levental, I. et al. Soft Matter 3, 299–306 (2007), Soofi, S. S. et al. J Struct Biol. 167:3, 216–219 (2009)), auch als Matrigel bekannt, ist ein gelatineartiges Proteingemisch, welches seit rund 30 Jahren in der Zellkultur Verwendung findet. In diesem Gemisch befinden sich Komponenten der Basalmembran, wie Laminin, Kollagen Typ IV und Entactin. Auf bzw. innerhalb des Gels kommt es zur Vereinigung der Zellen und zur Bildung von Strukturen, welche denen in vivo sehr nahe kommen. Aufgrund dessen finden Matrigele Verwendung für Studien zur Zelldifferenzierung, Angiogenese und Tumorwachstum. Jedoch erschweren Reste von Wachstumsfaktoren oder nicht-quantifizierten bzw. teilweise auch unbekannten Substanzen, die im Matrigel enthalten sind, sowie ihre Batch-to-Batch-Schwankungen, die Vergleichbarkeit mit anderen Studien. Des Weiteren weist Matrigel ein E-Modul von nur ca. 500 Pa auf, womit es weit unter dem E-Modul der meisten Tumorgewebe (4–130 kPa). Beim Prostatakarzinom: 65–126 kPa
Hydrogele (Holliday, D. L. et al. Breast Cancer Res 11 (2009), Cunliffe, D. et al. Eur Polym J 40, 5–25 (2004), Chen, R. et al. Biomaterials 30, 1954–1961 (2009), Villanueva, I. et al. Acta Biomat 5, 2832–2846 (2009), Chevalier, E. et al. J Pharm Sci 97, 1135–54 (2008)) sind wasserenthaltende Polymernetzwerke. Dabei werden die Eigenschaften des Trägermaterials entscheidend durch die Hauptkomponente beeinflusst. Es wird zwischen natürlichen und synthetischen Materialien unterschieden. Hydrogele aus natürlichen Komponenten, wie Kollagene, Hyaluronate, Alginate, Agarose und Chitosane, bieten den Zellen eine biologische Umgebung. Hydrogele aus synthetischen Polymeren, wie z.B. Polyvinylcaprolactam (PVCl) oder Polyethylenglykcol-diacrylatPolyethylenglykcoldiacrylat (PEGda), sind mechanisch belastbarer, lassen jedoch eine geringere Zelladhäsion zu. Aus diesem Grund findet häufig eine Oberflächenmodifikation der Polymere statt. Möglich ist dabei eine Integration von funktionellen Gruppen an spezifische Loci innerhalb der Polymerketten oder eine Mischung aus Polymeren und bestimmten EZM-Komponenten, wie z.B. PVCl, modifiziert mit Gelatine, deren größere Oberfläche die Zelladhäsion zusätzlich unterstützt. Der Vorteil von synthetisch hergestellten Zellgerüsten liegt in ihrer Variabilität, d.h. je nach Anforderung können diese ihre Oberflächeneigenschaften (hydrophil/hydrophob) und Struktur (Vernetzungsgrad) verändern und dementsprechend das Zellverhalten beeinflussen. Das E-Modul von Hydrogelen liegt allerdings nicht im Bereich der Tumorgewebe und auf Grund der geringen Porosität sind die Nährstoffversorgung und Abtransport der Abfallprodukte erschwert. Die Herstellung von porösen Strukturen ist vor allem mittels Versetzen mit Porogenen durchführbar. Zu diesen gehören Gas (Kohlenstoffdioxid), Flüssigkeiten (Wasser) und Feststoffe (Paraffin), die anschließend durch Sublimation, Evaporation oder Schmelzen entfernt werden und eine schwammartiges Polymer hinterlassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es also, ein 3D-Zellkultursystem bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
Des Weiteren bestand die Aufgabe, ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem sich 3D-Zellkultursysteme, bevorzugt das beschriebene 3D-Zellkultursystem, bereitstellen lassen.
Diese Aufgabe wird im Hinblick auf das 3D-Zellkultursystem durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst, in Hinblick auf das Verfahren zur Herstellung des 3D-Zellkultursystems durch die Merkmale des Anspruchs 7 und auf die Verwendung durch die Merkmale der Ansprüche 12 und 13. Die Unteransprüche beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Diese Aufgabe wird durch ein 3D-Zellkultursystem aufweisend ein Cyrogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda) gelöst.
Des Weiteren wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems aus Polyethylenglykol-diacrylat-Cryogelen mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst. Zunächst wird eine vorgekühlte Mischung aus mindestens einem PEGda in einer Pufferlösung bereitgestellt. Anschließend erfolgt die Zugabe mindestens eines Polymerisationsinitiators und mindestens eines Polymerisationskatalysators. Das Gemisch wird dann gefroren und man erhält ein PEGda-Cryogel.
Der Begriff Cryogel bezieht sich im Folgenden auf ein polymeres Gel, dass im wässrigen Medium, bei Temperaturen unter 0°C hergestellt wird. Kernpunkt der Cryogelsynthese ist die Kristallisation des Lösungsmittels (Wasser), dessen wachsende Eiskristalle ein dichtes Netzwerk ergeben und somit die Grundlage für die spätere Porenstruktur schaffen. Nach dem Gefrierprozess werden Cryogele aufgetaut, wobei das in den Poren enthaltene Wasser schmilzt und abläuft. Dadurch wird die poröse Struktur zugänglich. Cryogele grenzen sich hinsichtlich ihrer Morphologie und Synthese deutlich von Hydrogelen ab. Ihr Name ist auf die Art und Weise ihrer Herstellung zurückzuführen. „Kryos“ ist griechisch und steht für Frost oder Eis, somit können Cryogele im übertragenen Sinne als Frost- oder Eisgele bezeichnet werden.
Polyethylenglykcol-diacrylat (PEGda), ist ein Polymer mit der allgemeinen Summenformel (C₃H₃O)-(C₂H₄O)_n-O-(C₃H₃O) mit n gleich einer natürlichen Zahl größer/gleich 1 (1) und wird mit seinem mittleren Molekulargewicht beschrieben, wie z.B. PEGda575, PEGda700, PEGda6000. Die Definition umfasst auch die hochkettigen Polyethylenglykol-diacrylate mit einer Molekularmasse > 35.000g/mol.
Die mittlere Molmasse wird im Folgenden definiert als eine Kenngröße der Molekularmassenverteilung, wobei die Molekularmassen sämtlicher in einer Mischung vorliegenden Kettenlängen gemittelt werden. Dabei weist PEGda 700 z.B. eine Verteilung der Molekularmassen von 675–725 g/mol auf.
Die Gesamtporosität bescheibt das Hohlraumvolumen in % eines porösen Körpers. Der Begriff Gesamtporosität (P) eines Materials bezeichnet das Verhältnis aus dem gesamten Volumen zu dem Volumen des porösen Körpers. Die Porosität kann offen sein, d.h. einzelne Poren sind untereinander verbunden (zugänglich für von außen eindringende Gase und Flüssigkeiten) oder geschlossen, d.h. die Porenräume sind voneinander getrennt. Die Porosität des Materials beeinflusst dessen Festigkeit, mechanische Eigenschaften, Volumenstabilität, Permeabilität, Wasseraufnahme und Langzeitstabilität.
Quecksilber-Porosimeter-Analysen ermöglichen über das Einpressen von Quecksilber in eine poröse Substanz die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet werden kann. Die Gesamtporosität (P) wurde mit der Washburn Formel (3) berechnet.

Φ: – Porosität
p: – Rohdichte
p_o: – Reindichte

P_L: – Druck des Quecksilbers
P_G: – Druck des Gases
σ: – Oberflächenspannung des Quecksilbers 485 mN/m
Θ: – Kontaktwinkel von Quecksilber; Standardwinkel 140°C
D_P: – Porendurchmesser

Der Begriff Trockengewicht bezeichnet das Gewicht eines Körpers nach vollständiger Trocknung. Das Trockengewicht ist das Gewicht eines Materials im getrockneten (also wasserfreien) Zustand.
Die Schwellrate entspricht der Aufnahmefähigkeit eines Körpers von Flüssigkeiten über Zeit. Die Begriffe Schwellrate, Schwellpotential und Quellpotential werden äquivalent verwendet. Der Begriff Schwellrate beschreibt die prozentuale Flüssigkeitsaufnahme eines trockenen Materials bis zum geschwollenen Gleichgewichtszustand (Equilibrium). Um die Schwellrate von PEGda-Cryogelen zu ermitteln, wurden diese zunächst vollständig getrocknet und anschließend in Zellkulturmedium, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder destilliertem H₂O aufbewahrt. Nach definierten Zeitpunkten wurden die PEGda-Cryogele aus der Lösung entfernt und gewogen. Das Gewicht wurde notiert und somit die Zunahme des Eigengewichtes als Schwellrate in % (4) ermittelt.

W_r: – Wasseraufnahmefähigkeit
W_t: – Gewicht zu bestimmten Zeitpunkten
W_g: – Trockengewicht der Probe
W_e: – Gewicht im Gleichgewichtszustand (Equilibrium) der gesättigten Probe

Der Begriff Elastizitäts-Modul (E-Modul) oder Youngsches Modul, wenn nicht anders angegeben in Kilo-Pascal (kPa), beschreibt als Materialkennwert den Zusammenhang zwischen Spannung und Dehnung bei der Verformung eines festen Körpers bei linear elastischem Verhalten. Im Folgenden werden hiermit die rheologischen Eigenschaften der Cryogele dargestellt. Hierbei wird das Deformationsverhalten der Matrizes über Zug- und Scherkräfte mittels einer Zugprüfmaschine ermittelt. Die synthetisierten Cryogele werden direkt nach Herstellung dreimalig in destilliertem H₂O gewaschen und anschließend auf einen Edelstahlblock, der an der Zugprüfmaschine angebracht ist, aufgelegt. Anschließend wird ein Stempel bis zu einer Vorkraft von 0,05 N an das PEGda-Cryogel herangefahren. Nachdem die Vorkraft erreicht ist, wird der Druck auf das PEGda-Cryogel bis zu 1N erhöht und ein sogenanntes Spannungs-Dehnungsdiagramm aufgenommen. Anhand dieses Spannungs-Dehnungsdiagramms kann die Elastizität der gemessenen PEGda-Cryogele im elastischen Bereich (Hookesche Gerade) des Diagramms berechnet werden.
Der Begriff Polymerisationsinitiator bezeichnet einen chemischen Stoff, der den Vorgang einer radikalischen Polymerisationsreaktion einleitet.
Der Begriff Polymerisationskatalysator bezeichnet einen chemischen Stoff, der für die Vernetzung von Akrylgruppen während der radikalischen Polymerisationsreaktion zuständig ist.
Wenn nicht anders angegeben, finden Reaktionen oder Verfahrensschritte bei Raumtemperatur (25°C) statt. Wenn nicht anders angegeben, finden Reaktionen oder Verfahrensschritte unter Standardatmosphäre (1013,25 hPa) statt.
Ausgestaltungen können frei miteinander kombiniert werden.
Das erfindungsgemäße 3D-Zellkultursystem weist ein Cryogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda) auf. Das Erscheinungsbild des Gels wird während der Synthese durch Variation der Einfriertemperatur, Konzentration und Kettenlänge der Monomere, Auswahl der Polymerisationskatalysatoren und -initiatoren stark beeinflusst.
Das erfindungsgemäße Cryogel weist im wasserfreien Zustand einen Anteil von mindesten 80 %, bevorzugt mindesten 90 %, besonders bevorzugt 100 % PEGda auf. In einer weiteren Ausgestaltung werden PEGda mit verschiedenen mittleren Molmassen eingesetzt. Deren Gesamtanteil im Cryogel beträgt bevorzugt mindestens 80 %. In einer Ausgestaltung werden PEGda mit einer mittleren Molmasse von mindestens 100 g/mol, bevorzugt mindestens 150 g/mol, besonders bevorzugt mindestens 400 g/mol und maximal 10000g/mol, bevorzugt maximal 1500 g/mol, besonders bevorzugt maximal 1000 g/mol eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden PEGda 700 und/oder PEGda 575 verwendet. Allgemein lässt sich feststellen, je länger die Polymerketten, desto größer die Poren, höher die Porosität und geringer die Elastizität. In einer weiteren Ausgestaltung werden Cryogele aus mindestens einem PEGda und mindestens einem weiteren Polymer, bevorzugt ausgewählt aus folgender Liste Polyhydroxyethylenmethacrylat, Alginat, Gelatine, Chitosan, Kollagen verwendet.
Das erfindungsgemäße 3D Zellkultursystem besteht in einer Ausgestaltung zu maximal 10%, bevorzugt zu maximal 5 %, besonders bevorzugt zu maximal 1,5 % aus PEGda, bezogen auf das Trockengewicht des PEGda-Cryogel-pro Gesamtmasse des 3D-Zellkultursystems, wobei sich die Gesamtmasse des 3D-Zellkultursystems aus seinen Einzelbestandteilen zusammensetzt. Weitere Bestandteile sind mindestens ein Zellkulturmedium. Das 3D-Zellkultursystem wird dann mit Zellen beladen. In einer Ausgestaltung werden noch Komponenten zur Analyse hinzugefügt.
PEGda-Cryogele werden homogen und reproduzierbar hergestellt. Sie besitzen eine hohe Porosität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 70%, und eine maximale Porosität von 90 %, bevorzugt maximal 85%, besonders bevorzugt maximal 80%. Die Porosität wird mittels Quecksilber-Porosimeter-Analyse bestimmt. Das durchgängige Porennetzwerk wird mittels Mikro-Röntgen-Tomographie nachgewiesen. Aufgrund des durchgängigen Porennetzwerks ermöglichen sie die Versorgung von im Cryogel wachsenden Zellen mit Nährstoffen, den Abtransport von Abfallprodukten, die freie Zirkulation von Peptiden, Hormonen, sowie zu testende Therapeutika. Die Cryogele lassen sich in beliebiger Form, Größe und Anzahl herstellen. Die Porengröße variiert je nach Material und Syntheseparameter zwischen 1 und 1000 µm, bevorzugt zwischen 10 und 100 µm, besonders bevorzugt zwischen 50 und 80 µm. Das ermöglicht eine freie Zirkulation von Peptiden und Wirkstoffen (wie Hormonen und Therapeutika). PEGda700-Cryogele besitzen eine durchschnittliche Porengröße von 70 µm. Die Porengröße, Porengeometrie und Porenverteilung ist kontrollierbar, indem man Polymere mit unterschiedlichen Kettenlängen verwendet. Auf diese Weise kann, im Vergleich zu den Sphäroidmodellen, ein geeignetes Maß aus ausreichend Freiraum zur Aggregatsbildung bei gleichzeitiger Einschränkung des Größenwachstums der Zellverbände ermöglicht werden.
Das 3D-Zellkultursystem weist eine Schwellrate auf, die beim 5-15-fachen, bevorzugt 7-10-fachen, besonders bevorzugt 7,5-9-fachen des Trockengewichtes liegt.
Um ein möglichst in vivo-nahes Modell zu erhalten, muss das 3D-Zellkultursystem ein Elastizitäts-Modul im Bereich des natürlichen Gewebes aufweisen. Für die Untersuchung von Prostatatumoren ist ein E-Modul von 60–130kPa, ermittelt mit einer Zugprüfmaschine, bevorzugt. Es konnte gezeigt werden, dass die PEGda700-Cryogele ein E-Modul von etwa 77 kPa besitzen. Damit liegen sie innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65–126 kPa).
Die mit PEGda-Cryogelen generierte Möglichkeit, Zellen innerhalb einer Matrix in dreidimensionalen Zellverbänden zu kultivieren, stellt eine wesentliche Verbesserung bei der Nachbildung des in vivo-Tumors des Tiermodells in Zellkultur dar.
Das Cryogel wird mittels radikalischer Polymerisationsreaktion hergestellt, wobei nicht kovalente Bindungen zwischen den Akryl-Gruppen der PEGda-Moleküle ausgebildet werden. Die Reaktion wird durch mindestens einen Polymerisationsinitiator, der Sulfatradikale bildet, bevorzugt Ammoniumperoxidsulfat APS (CAS-Nummer: 7727-54-0), eingeleitet. Bei der Zersetzung des Polymerisationsinitiators entstehen Sulfatradikale, die einen elektrophilen Angriff auf Kohlenstoffatome mit Doppelbindungen durchführen. Dadurch werden die Doppelbindungen in den Akrylgruppen des PEGda geöffnet und eine Kettenreaktion gestartet. Der mindestens eine Polymerisationskatalysator, bevorzugt Tetramethylethylendiamin TEMED (CAS-Nummer: 110-18-9) fördert hierbei die Bildung freier Sulfatradikale durch APS, was zu einer Katalyse der Polymerisationsreaktion führt. Die Polymerisationsreaktion folgt dabei dem allgemeinen Prinzip von Kettenstart, Kettenfortpflanzung und Kettenabbruchsreaktion, sobald die Sulfatradikale aufgebraucht sind.
Im Falle der radikalischen Polymerisationsreaktion kommt es durch eine erhöhte Zugabe von Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu einer vorzeitigen Polymerisation von PEGda, und eine Kristallisation des Porogens bleibt aus. Folglich werden hydrogelartige Strukturen gebildet, die keine Poren besitzen. Ist die TEMED-Konzentration zu gering gewählt, bleibt eine Polymerisation aus, oder die Kristallisation des Porogens zerstört eine wünschenswerte, rundporige Struktur der Cryogele.
In einer weiteren Ausgestaltung werden verschiedene PEGda Ausgangsstoffe, mit unterschiedlichen mittleren Molekulargewichten verwendet. Durch das Mischen von unterschiedlichen PEGda-Molekülen kann zum einen eine Variation der Porengröße erzielt werden und damit direkt verbunden, Einfluss auf Porosität und Elastizität genommen werden.
In einer weiteren Ausgestaltung werden Cryogele mit weiteren Substanzen, bevorzugt mit RGD-Sequenzen durch vorige Anbindung an ein heterobifunktionales, d.h. ein mit mindestens 2 reaktiven funktionellen Gruppen versehenes, Polyethylenglykol, wie z.B. Akryl-Polyethylenglykol-N-Hydroxysuccinimid (ACRL-PEG-NHS).
Des Weiteren soll ein Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems, aufweisend ein Cryogel aus Polyethylenglykol-diacrylat vorgeschlagen werden. Zunächst wird im Verfahrensschritt a) eine vorgekühlte Mischung aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat und einem Puffer, bevorzugt PBS+/+ (Mg²⁺- und Ca²⁺-enthaltendes PBS), besonders bevorzugt PBS –/– (Mg²⁺- und Ca²⁺-freies PBS) bereitgestellt. Das Vorkühlen ermöglicht die Synchronisierung von Polymerisationsreaktion und Kristallisation des verwendeten Porogens. Diese Mischung weist in einer Ausgestaltung eine Temperatur von –10 bis –40 °C auf.
Anschließend erfolgt im Verfahrensschritt b) die Zugabe mindestens eines Polymerisationsinitiators und mindestens eines Polymerisationskatalysators. In einer Ausgestaltung ist der mindestens eine Polymerisationsinitiator Ammoniumperoxidsulfat. In einer weiteren Ausgestaltung ist der mindestens eine Polymerisationskatalysator Tetramethylethylendiamin.
Diese Mischung wird nun im Verfahrensschritt c) eingefroren. In einer Ausgestaltung wird die Mischung bei einer Temperatur von –10 bis –40 °C, bevorzugt bei –20 °C gefroren. Die Dauer des Gefrierschritts hängt von der Größe des gewünschten Cryogels ab und ist beendet, sobald das gesamte Gel durchgefroren ist.
Nach der Gefrierung werden die Gele aufgetaut und liegen als fertiges Produkt vor. Mit diesem Verfahren erhält man PEGda-Cryogele definierter Größe. In einer Ausgestaltung werden die Gele in Scheiben oder Stücke geschnitten, mit einer Dicke von maximal 10 mm, bevorzugt maximal 5 mm, besonders bevorzugt maximal 3 mm. Diese Gele werden dann in einer weiteren Ausgestaltung so in mit Zellen beladen, dass die Zellen auf der Seite senkrecht zur Dicke des Gels aufgebracht werden und dann in das Gel hineinwandern. Bei einer Dicke größer als 10mm kann kein vollständiges durchwandern der Zellen sichergestellt werden. Die Beladbarkeit des Gels mit Zellen steigt mit sinkender Geldicke, da dann die Nährstoffversorgung und das Eindringen der Zellen in das System besser funktioniert. Die Geldicke muss minimal 0,1 mm, bevorzugt 0,5 mm, besonders bevorzugt mindestens 1 mm betragen, damit ein 3D-Zellkultursystem entsteht und das beinhaltete Cryogel sich verarbeiten lässt.
In einer Ausgestaltung werden die Cryogele anschließend gewaschen, bevorzugt mit destilliertem Wasser und unter aseptischen Bedingungen in Zellkulturmedium bis zur Aussaat der zur kultivierenden Zellen und darüber hinaus gelagert. In einer weiteren Ausgestaltung werden die Gele nach der Herstellung getrocknet und werden dann, vor einer Beladung mit Zellen, in Zellkulturmedium gegeben. Darin schwillt das Cryogel unter Aufnahme des Zellkulturmediums auf seine finale Größe an und liegt dann als 3D-Zellkultursystem vor.
Die Eigenschaften des gewählten PEGda-Polymers und die Herstellungsweise des Cryogels resultieren in einer hochporösen Struktur, deren Oberfläche, Porengröße und Konnektivität für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen ideal sind. Sowohl im Wachstumsverhalten wie auch in der Art der Bildung der Zell-Zell-Kontakte ähnelt die 3D-Kultur im PEGda-Cryogel mehr dem Tumor als den Zellen in der 2D Kultur in der Petrischale.
Das erfindungsgemäße 3D-Zellkultursystems findet seinen Einsatz bei der Kultivierung mindestens einer Zelllinie, bevorzugt ausgewählt unter Prostataepithelzellen, Prostatastromazellen und Primärzellen aus der Prostata und/oder einer Prostatametastase eines Patienten und Tumorzelllinie und Kombinationen daraus, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Liste LNCaP (Lymphknotenmetastase; aus einer Metastase eines humanen Prostata-Drüsenkarzinoms), PC3 (Lendenmetastase; entnommen einem 62 jährigen Kaukasier mit Grad 4 Prostata-Drüsenkarzinom), DU145 (Epithelzelle eines humanen Prostata-Drüsenkarzinom; entnommen einer Hirnmetastase), VCaP (Vertebral-Krebszelle aus der Prostata, gewonnen aus eine Metastase der Lendenwirbelsäule eines Patienten mit Hormon-resistentem Prostatkrebs), RWPE (Zelllinie erhalten durch Transfektion eines Prostata-Epithels eines erwachsenen Kaukasiers mit humanen Papilloma-Viren (HPV18) und Infektion durch v-K-ras) und 22Rv1 (entnommen aus CWR22R, einer Androgen-abhängigen Prostatakarzinom-Xenograftzelllinie). In einer weiteren Ausgestaltung erfolgt die Zellkultur mit mindestens zwei verschiedenen Zelllinien, bevorzugt ausgewählt aus derselben Liste.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung findet das 3D-Zellkultursystems als Modell für Prostatakrebs Einsatz.
Sphäroidmodelle ähneln dem erfindungsgemäßen System über die Erzeugung von Sphäroiden. Die Größen der Zellaggregate werden jedoch nicht eingeschränkt und es kommt zu unvorhersagbaren Bedingungen im System, die reproduzierbare Ergebnisse unmöglich machen. Matrigel (gelartiger Proteinmix aus den Zellen eines Engelbreth-Holm-Swarm-Sarkoms der Maus) wird am häufigsten eingesetzt, um 3D-Modelle mit verschiedenen Zelllinien zu generieren. Die Anzahl unbekannter Faktoren und die Schwankungen in der Zusammensetzung von Batch-zu-Batch erschweren aber auch hier die Verlässlichkeit der experimentellen Aussagen. Das Hydrogel wird aus unterschiedlichen Polymeren hergestellt und deren physikalische Eigenschaften wie Porosität, Porengröße und Elastizität sind signifikant schlechter als die der erfindungsgemäßen PEGda-Cryogele. Des Weiteren sind ein verzögertes und geringeres Schwellverhalten, sowie eine Instabilität des PEGda-Hydrogels zu beobachten.
Die Kontrollierbarkeit und Reproduzierbarkeit der Porosität, der gewebeähnlichen Elastizität sowie die Integration extrazellulärer Matrixkomponenten (wie z.B. RGD-Peptid) der Cryogele ermöglichen eine in vivo-nahe Mikroumgebung für die 3D-Zellkultivierung.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:
1 Cryogele aus PEGda 575 (A) und PEGda 700 (B) sowie ein Hydrogel aus PEGda 700 (C) sowie die Porengröße (G) von 30 Poren der PEGda 575 und PEGda700-Cryogele.
2 die Schwellrate (Sr) von PEGda575 (A) und PEGda700 (B)-Cryogelen sowie von PEGda700 Hydrogelen (C) über der Zeit (t in Sekunden) als Dreifachbestimmungen des Gewichts nach Inkubation in Mg²⁺- und Ca²⁺-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), destilliertem Wasser (H₂O dest.) und dem Zellkulturmedium RPMI 1640 + 10% FCS + 1% Pen/Strep + 1X L-Glutamin (M).
3 die Langzeitstabilität der PEGda700-Cryogele bei Inkubation (I) in Zellmedium bei 37°C für 3 Wochen in Zellkulturmedium mittels Ermittlung der Gewichtsänderung (M in %) zu verschiedenen Zeitpunkten (I in Tagen) (T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 3).
4 Zell-Matrix(PEGda700)-Kontakte nach 1 wöchiger Kultur mittels REM.
5 Vergleich des relativen, androgenabhängigen Wachstums (W) von Bag-1L überexprimierenden LNCaP Prostatakarzinomzellen zu einer Vektor-transfizierten Kontrollzelllinie im 2D-Modell. Das Ergebnis zeigt die Mittelwerte und den Standardfehler dreier in Duplikaten durchgeführter unabhängiger Experimente am Tag 6 mit Ethanol (EtOH) und Dihydrotestosteron (DHT).
6 das Tumorvolumen (V) in mm² der BAG-1L exprimierende Wildtypzellinie (-•-) und der Vektor-transfizierte Zelllinie (-◊-) injiziert in Xenograft-Mausmodelle zu verschiedenen Zeitpunkten (I in Tagen).
7 das Wachstum einer BAG-1L exprimierenden Wildtypzellinie (-•-) und einer Vektor-transfizierten Zelllinie (-◊-) ermittelt über die Menge an dsDNA (in relativer Fluoreszenzintensität) kultiviert in PEGda700-Cryogel analysiert mit pico green assay (Students T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 3) zu verschiedenen Zeitpunkten (I in Tagen).
8 eine Gegenüberstellung der E-Module (in kPa) von PEGda575, 700 und 6000 sowie dem PEGda700 Hydrogel.
9 eine Gegenüberstellung der Porositäten (P) von PEGda 575 und 700 sowie dem PEGda700 Hydrogel.
Zur Untersuchung und Darstellung der Oberflächentopographie, sowie der statistischen Ermittlung der Porengrößen wurde zunächst die Rasterelektronenmikroskopie (REM) herangezogen. Nach einer vollständigen Trocknung der Cryo-/Hydrogele wurden, je Synthese, Aufnahmen von 3 Proben durch Rasterelektronenmikroskopie angefertigt. Die 1 zeigt die Porenstruktur, -verteilung, -größe und Homogenität von PEGda575-Cryogelen (A), PEGda700-Cryogelen (B) und PEGda700-Hydrogelen (C). Die Matrizes lassen sich homogen herstellen, und es sind keine signifikanten Batch-zu-Batch-Abweichungen zu erkennen, was von einer hohen Reproduzierbarkeit zeugt. Des Weiteren zeigen die Auswertungen der Porengröße (G) nach Länge und Breite, dass die Porengröße mit steigendem mittleren Molekulargewicht steigt.
Wie in 2 gezeigt, weisen PEGda575 und PEGda700-Cryogele eine enorme Schwellrate auf, das innerhalb weniger Sekunden bereits ein stabiles Equilibrium hat. Für PEGda700 konnte ein Quellpotential, das beim 8-fachen des Trockengewichts liegt, gezeigt werden, für PEGda 575 je nach medium beim 4,5-6 fachen des Trockengewichts. Das Hydrogel aus PEGda700 (C) weist eine Schwellrate von weniger als dem 2fachen des Trockengewichts auf. Hydro- und Cryogele aus PEGda 575 (A) und PEGda 700 (B) wurden in definierter Höhe (5mm) synthetisiert und nach Synthese dreimal in destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Hydro- und Cryogele vollständig getrocknet, und ihr Trockengewicht bestimmt. Zur Bestimmung der Schwellrate wurden die Hydro- und Cryogele in destilliertem H₂O, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Zellkulturmedium (RPMI1640 + 1% Penicillin/Streptomycin + 1X L-Glutamin) für bestimmte Zeiten (5, 15, 30, 60, 120, 300 s) inkubiert, ihr Gewicht erneut bestimmt und in Triplikaten statistisch ausgewertet. (Auswertung nach student´schen t-Test, Fehlerbalken repräsentieren Standardfehler, n = 3).
Zur Überprüfung der Langzeitstabilität der Cryogele wurden Degradationsassays durchgeführt. Hierzu werden die Gele in Zellmedium bei 37°C bis zu 3 Wochen gelagert und in regelmäßigen Zeitabständen das Gewicht ermittelt. Wie in 3 gezeigt, gab es keine signifikanten Veränderungen der PEGda700-Cryogele. PEGda700-Cryogele wurden nach Synthese dreimal in destilliertem H₂O gewaschen und ihr Gewicht im Equilibrium bestimmt. Um die Langzeitstabilität der PEGda-Cryogele überprüfen zu können, wurden diese unter Standardkulturbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten (1, 3, 7, 14, 21 Tage) inkubiert (I), ihr Gewicht (M) ausgewogen und in Triplikaten statistisch ausgewertet. (Auswertung nach student´schen t-Test, Fehlerbalken repräsentieren Standardfehler, n = 3)
Die Morphologie der LNCaP-Zellen in PEGda-Cryogelen nach 1-wöchiger Kultivierung wurde mittels REM-Aufnahmen durchgeführt. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Zellen innerhalb der Cryogelporen sphäroidähnliche Cluster (ca. 60–100 µm) bilden und die Zellmatrix-Kontakte bereits zu diesem Zeitpunkt erkennbar sind (4).
Ausführungsbeispiel 1 – PEGda700-Cryogele
Es werden zunächst 18 ml Mg²⁺- und Ca²⁺-freie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS–/–) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda 700-Lösung vermischt und für 8 min bei –20°C vorgekühlt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitiators Ammoniumpersulfat (APS) und 12 µl des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und der Gesamtansatz in einem Gefäß für 3 Stunden bei –20°C eingefroren. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen und die gebildeten Eiskristalle tauen. Übrig bleibt das gebildete PEGda700-Cryogel, das dann in gleichmäßige Scheiben von 3 oder 5 mm geschnitten wird. Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda700-Cryogele konnten über die Angabe des Elastizitäts(E)-Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda700-Cryogele besitzen ein E-Modul von etwa 77 kPa (8). Damit liegen sie innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65–126 kPa). Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Cryogele wurden Quecksilber-Porosimeter-Analysen durchgeführt. Erstgenanntes ermöglicht über Einpressen von Quecksilber in das Gel die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet werden kann. Hiermit ergab sich z.B. für PEGda700-Cryogele eine Porosität von etwa 74% (9). Die Porosität wurde mit der Washburn Formel berechnet (Students T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 15). Zur Überprüfung der Langzeitstabilität der PEGda-700 Cryogele wurden Degradationsassays durchgeführt. Hierzu werden die Gele in Zellmedium bei 37°C bis zu 3 Wochen gelagert und in regelmäßigen Zeitabständen das Gewicht ermittelt. Es konnte keine signifikante Veränderung verzeichnet werden.
Ausführungsbeispiel 2 – PEGda575-Cryogele
Es werden zunächst 18 ml Mg²⁺- und Ca²⁺-freie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS–/–) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda575-Lösung vermischt und für 8 min bei –20°C vorgekühlt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitiators Ammoniumpersulfat (APS) und 12 µl des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und der Gesamtansatz in einem Gefäß für 3 Stunden bei –20°C eingefroren. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen und die gebildeten Eiskristalle tauen. Übrig bleibt das gebildete PEGda575-Cryogel, das dann in gleichmäßige Scheiben von etwa 3 oder 5 mm geschnitten wird.
Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda575-Cryogele konnten über die Angabe des Elastizitäts(E)-Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda575-Cryogele besitzen ein E-Modul von etwa 76 kPa (8). Damit liegen sie innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65–126 kPa). Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Cryogele wurden Quecksilber-Porosimeter-Analysen durchgeführt. Erstgenanntes ermöglicht über Einpressen von Quecksilber in das Gel die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet werden kann. Hiermit ergab sich z.B. für PEGda575-Cryogele eine Porosität von etwa 77 % (9). Die Porosität wurde mit der Washburn Formel berechnet (Students T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 15). Zur Überprüfung der Langzeitstabilität der PEGda575 Cryogele wurden Degradationsassays durchgeführt. Hierzu werden die Gele in Zellmedium bei 37°C bis zu 3 Wochen gelagert und in regelmäßigen Zeitabständen das Gewicht ermittelt. Es konnte keine signifikante Veränderung verzeichnet werden.
Ausführungsbeispiel 3 – PEGda6000-Cryogele
Es werden zunächst 18 ml Mg²⁺- und Ca²⁺-freie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda6000-Lösung vermischt und für 8 min bei –20°C vorgekühlt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitiators Ammoniumpersulfat (APS) und 12 µl des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und der Gesamtansatz in einem Gefäß für 3 Stunden bei –20°C eingefroren. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen und die gebildeten Eiskristalle tauen. Übrig bleibt das gebildete PEGda6000-Cryogel, das dann in gleichmäßige Scheiben von etwa 3 oder 5 mm geschnitten wird. Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda6000-Cryogele können über die Angabe des Elastizitäts(E)-Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda6000-Cryogele besitzen ein E-Modul von etwa 11kPa (8). Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Cryogele sollten Quecksilber-Porosimeter-Analysen durchgeführt werden, die allerdings aufgrund kollabierender Poren nicht durchgeführt werden konnten.
Ausführungsbeispiel 4 – PEGda700-Hydrogel
Es werden zunächst 18 ml Mg²⁺- und Ca²⁺-freie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS–/–) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda700-Lösung vermischt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitiators Ammoniumpersulfat (APS) und 12 µl des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und bei RT auspolymerisiert. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen. Das gebildete PEGda700-Hydrogel wird anschließend in gleichmäßige Scheiben von etwa 3 oder 5 mm geschnitten. Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda700-Hydrogele konnten über die Angabe des Elastizitäts(E)-Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda700-Hydrogele besitzen ein E-Modul von etwa 49kPa (8). Damit liegen sie nicht innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65–126 kPa). Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Hydrogele wurden Quecksilber-Porosimeter-Analysen durchgeführt. Erstgenanntes ermöglicht über Einpressen von Quecksilber in das Gel die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet werden kann. Hiermit ergab sich z.B. für PEGda700-Hydrogele eine Porosität von etwa 24% (9). Die Porosität wurde mit der Washburn Formel berechnet (Students T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 15). Auf Grund der geringen Porosität eignen sich die PEGda700-Hydrogele nicht für die 3D-Zellkultivierung.
Ausführungsbeispiel 5 – Kultur von LNCaP-Zellen in PEGda700-Cryogelen
Nach Ermittlung geeigneter Sterilisationstechniken (Verwendung von steril filtriertem PEGda und steril filtriertem PBS sowie Aufbewahrung der Cryogele unter aseptischen Bedingungen in Zellkulturmedium mit 1% Penicillin und Streptomycin) und der notwendigen Zellkulturbedingungen (in 6-well Platten mit 5ml Kulturmedium pro Probe unter 37°C und 5% CO₂ mit Mediumwechsel im 2-tägigen Intervall) wurde die Prostatakrebszelllinie LNCaP in den hergestellten PEGda700-Cryogelen kultivieren (Aussaat: 10⁶Zellen/30 µl Kulturmedium). Vitalität, Proliferation und Morphologie wurden untersucht. Nach 14-tägiger Kultivierung in Standarmedien wurden Lebend-Tod-Färbungen zur Ermittlung der Zellvitalität durchgeführt, die eine Lebendrate von min. 80% im Vergleich zur Negativkontrolle (behandelt mit Methanol und UV-Licht). Die Morphologie der LNCaP-Zellen in PEGda-Cryogelen nach 2-wöchiger Kultivierung wurde mittels Immunfluoreszenzfärbungen des cytoskeletalen Markers α-Tubulin und des epithelialen Markers EP-CAM durchgeführt. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Zellen innerhalb der Cryogelporen sphäroidähnliche Cluster (ca. 60–100 µm) bilden. Die Zellmatrix-Kontakte sind in REM-Aufnahmen bereits nach 1-wöchiger Kultivierung erkennbar (4). LNCaP-Zellen bilden Zell-Matrix-Kontakte in PEGda-Cryogelen aus. Um die Ausbildung von Zell-Matrix-Kontakten während der Zellkultivierung zu beobachte, wurden LNCaP-Zellen für 1, 2 und 3 Wochen (hier: 1 Woche) in PEGda-Cryogelen kultiviert, anschließend dreimal in PBS (–/–) gewaschen und in Glutaraldehyd-Lösung (1% in PBS) fixiert. Die Visualisierung der Zell-Matrix-Kontakte erfolgte unter dem Rasterelektronenmikroskop.
Ausführungsbeispiel 6 – Interaktion von Koaktivatoren wie Bag-1L mit dem Androgenrezeptor (AR)
Bag-1L, ein Koaktivator des Androgenrezeptors in Prostatatumoren, beeinflusst stark das basale wie auch das androgen-abhängige Wachstum. Obwohl mehrere Studien gezeigt haben, dass eine Überexpression von Bag-1L das Prostatatumorzellwachstum fördert, und der Effekt in unabhängigen Tumorversuchen in Mäusen verifiziert werden konnte, zeigen Bag-1L überexprimierende LNCaP-Prostatatumorzellen nur marginale Wachstumsunterschiede im Vergleich zur vektortransfizierten Kontrolle. Diese Unterschiede sind wahrscheinlich auf die experimentellen Bedingungen zurückzuführen, da den Zellkultursystemen die Mikroumgebung des Tumors fehlt. Zellen, kultiviert auf Plastik, versagen oft darin, die in vivo-Funktion zu reflektieren. Die gezeigten Versuche mit LNCaP-Prostatatumorzellen, in denen die Wachstumseigenschaften der Zellen in konventionaler 2D-Zellkultur mit denen im Xenografttumor und mit der 3D-Kultur im PEGda700-Cryogel direkt verglichen wurden, zeigen klar, dass diese Struktur eine weitreichende Annäherung an die im Xenpgraft vorhandenen Bedingungen darstellt. Es konnte gezeigt werden, dass eine BAG-1L-expremierende LNCaP-Zelllinie signifikant stärker proliferiert als die nicht-exprimierende Zelllinie. Beide Zelllinien wurden 2 Wochen in PEGda700-Cryogelen kultiviert. LNCaP Zellen (Wildtyp und Vektorkontrolle) wurden in einer Konzentration von 10^6 Zellen/30 µl in PEGda-Cryogelen ausgesät und für einen Zeitraum von 2 Wochen kultiviert. Nach bestimmten Zeitpunkten (0, 1, 3, 7, und 14 Tagen) wurden die Gele geerntet und eine DNA-Isolierung durchgeführt. Der Nachweis der doppelsträngigen DNA erfolgte durch den Fluoreszenzfarbstoff pico green und wurde als Maß für die proliferative Aktivität verwendet. (Auswertung nach student´schen t-Test, Fehlerbalken repräsentieren Standardfehler, p* < 0,05, p*** < 0,001; n = 3).

Zellzahl am jeweiligen Tag Vektor BAG-1L

0 0,38·10^5 0,36·10^5

1 0,81·10^5 0,42·10^5

3 0,72·10^5 0,32·10^5

7 1,82·10^5 3,02·10^5

14 3,23·10^5 4,69·10^5
Wachstumsversuche mit transfizierten LNCaP-Prostatatumorzellen zeigen, dass diese den Tumormarker Bag-1L stabil überexprimieren. Die BAG-1L exprimierende Zelllinie weist signifikante Unterschiede im Wachstumsverhalten im Xenograft-Tierversuch im Vergleich zum Wachstum in der herkömmlichen 2D-Kultur auf Petrischalen. Während in der 2D-Kultur nach 6 Tagen nur marginale Unterschiede im Wachstum sowohl in An- wie auch in Abwesenheit des für das Wachstum der Tumorzellen wichtigen Androgens Dihydrotestosteron nachweisbar ist (5), zeigt sich im Tierversuch ein deutlicher Unterschied (6), der die Bedingungen im Patienten deutlicher wiederspiegelt. Im PEGda700-Cryogel proliferiert dieselbe Bag-1L überexprimierende Zelllinie signifikant stärker als die vektortransfizierte Kontrollzelllinie (7). Der Verlauf der Wachstumskurve reproduziert die Ergebnisse des Tumorwachstums in vivo.
Damit wurde der biologische Beweis erbracht, dass Zellkultursysteme mit PEGda700-Cryogelen, die gleichen Ergebnisse liefern wie Xenograft-Mausmodelle und somit als adäquater Ersatz für Tierversuche eingesetzt werden können.
Vergleichsexperiment 1: 2D-Kultur der LNCaP Prostatatumorzelllinie
Die Zellen wurden trypsiniert, einmal mit PBS gewaschen und in Hungermedium (RPMI ohne Phenolrot mit 3% CCS) in einer Zelldichte von 1x 104Zellen/qcm auf 6 well-Platten ausgesät. Nach 48h (Tag 1) wurde die Zellzahl mittels einer Neubauerzählkammer bestimmt und das Medium auf RPMI ohne Phenorot, 2 mM Glutamin, 100 U Penicillin, 100 µg Streptomycin gewechselt und mit 10-8 M Dihydrotestosterone bzw der gleichen Menge (1 µl/ml) Ethanol als Lösemittelkontrolle versetzt. Die Hormon bzw. Ethanolzugabe wurde an den Tagen 3 und 5 wiederholt ohne das Medium zu wechseln. Die Bestimmung der Zellzahl wurde dann am Tag 6 wieder unter Zuhilfenahme einer Neubauer Zählkammer durchgeführt. Die Wachstumsrate ergibt sich aus dem Quotient der Zellzahl am Tag 6 durch die Zellzahl am Tag 1. Die Wachstumsrate am Tag 6 beträgt für den Vektor: 0,86 (ETOH); 1,47 (DHT) und für BAG-1L: 0,75 (ETOH); 1,53 (DHT).
Vergleichsexperiment 2: Xenograft-Kultur der LNCaP Prostatatumorzelllinie
Für die Xenografttumorexperimente wurden 1x 106 Zellen in 100 µl RPMI-Medium versetzt mit 10% FCS mit 100 µl Matrigel gemischt und subkutan in die Flanke einer Nacktmaus injiziert und das Tumorwachstum zweimal wöchentlich mittels einer Schieblehre in drei Dimensionen gemessen und das Volumen unter Annahme eines Eliptoiden mittels der Formel V = 4/3π·r1·r2·r3 bestimmt.

Tag 26 29 34 37 41 44 47 50 54

Vektor Start 1,83 2,60 3,37 3,61 4,28 5,22 6,20

BAG1L Start 4,67 9,62 14,57 17,52 19,08 21,02 21,81 24,52
Literatur

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

3D-Zellkultursystem aufweisend ein Cryogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda).
3D-Zellkultursystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des mindestens einem PEGda im Cryogel mindestens 80% beträgt
3D-Zellkultursystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein PEGda mit einer mittleren Molmasse von 200 g/mol bis 10.000 g/mol eingesetzt wird.
3D-Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Cryogel eine Gesamtporosität von 50–90 % aufweist.
3D-Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Cryogel ein Elastizitäts-Modul im Bereich von 60–130kPa aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems aus einem Polyethylenglykol-diacrylat-Cryogel mit den Verfahrensschritten: a) Bereitstellen einer vorgekühlten Mischung aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat und einer Pufferlösung, b) Zugabe mindestens eines Polymerisationsinitiators und mindestens eines Polymerisationskatalysators, c) Gefrieren der Mischung, d) Entnahme des Cryogels, e) Aufnahme des Cryogels in Zellkulturmedium, f) Entnahme des 3D-Zellkultursystems.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei als Polymerisationsinitiator Ammoniumperoxidsulfat im Verfahrensschritt b) zugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei als Polymerisationskatalysator Tetramethylethylendiamin im Verfahrensschritt b) zugefügt wird.
Verwendung des 3D-Zellkultursystems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Modell für die Prostatakrebsforschung und als Analyseplattform zur Testung potenzieller Therapeutika zur Behandlung von Prostatakrebs.
Verwendung des 3D-Zellkultursystems nach Anspruch 9 zur Kultivierung mindestens einer Krebszelllinie ausgewählt aus der Liste LNCaP, PC3, DU145, VCaP, RWPE, 22Rv1