CN112592446A - 三维大孔冷冻凝胶支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维大孔冷冻凝胶支架及其制备方法和应用，该三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法包括：将甲基丙烯酰胺基多糖的水溶液在引发剂的存在下，进行冷冻交联。通过将特定修饰的多糖通过在低温下发生自由基聚合反应而生成具有连续贯穿的较大孔洞结构的支架，其独特的结构有利于物质交换和促进细胞的黏附、生长，在制备中不需要任何有机溶剂，只需要用水作为模板即可得到多孔结构。并且通过特定修饰的多糖在反应体系中的浓度即可控制冷冻凝胶支架的孔隙大小以及调节冷冻凝胶支架的力学性能，整个过程温和可控，产率高且可以拓展至多种多糖材料，在生物材料和组织工程领域具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

Description

三维大孔冷冻凝胶支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及一种三维大孔冷冻凝胶支架及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶作为一类重要的生物材料已经被广泛应用于生物医药和组织工程领域。然而大多数水凝胶的孔径不允许在整个支架中形成血管，并且常常因营养物质转运缺乏和细胞废料清除受阻而导致细胞活力降低。此外，在水凝胶中，细胞渗透通常是困难的，细胞在整个凝胶中常呈现出不均匀的分布。高含水量更是影响凝胶的机械稳定性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维大孔冷冻凝胶支架及其制备方法和应用，以改善上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其包括：将甲基丙烯酰胺基多糖的水溶液在引发剂的存在下，进行冷冻交联。
第二方面，本发明实施例还提供了一种三维大孔冷冻凝胶支架，其由上述制备方法制备得到。
第三方面，本发明实施例还提供了上述三维大孔冷冻凝胶支架在细胞培养、组织工程或制备药物中的应用。
本发明的上述技术方案具有以下有益效果：通过将特定修饰的多糖通过在低温下发生自由基聚合反应而生成具有连续贯穿的较大孔洞结构的支架，其独特的结构有利于物质交换和促进细胞的黏附、生长，在制备中不需要任何有机溶剂，只需要用水作为模板即可得到多孔结构。并且通过特定修饰的多糖在反应体系中的浓度即可控制冷冻凝胶支架的孔隙大小以及调节冷冻凝胶支架的力学性能，整个过程温和可控，产率高且可以拓展至多种多糖材料，在生物材料和组织工程领域具有重要的研究价值和广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架样品(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)在激光扫描共聚焦显微镜下的形貌和孔径分布图；
图2为白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架样品(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)的孔隙率结果图；
图3为白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架样品(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)的溶胀率结果图；
图4为白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架样品(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)的应变扫描结果图；
图5为白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架样品(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)的频率扫描结果图；
图6为白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架样品(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)和对照组BA2与BA4水凝胶(根据对比例1制备)培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的增殖实验结果图，***代表P<0.001；
图7为激光扫描共聚焦显微镜检测的白芨多糖三维大孔冷冻凝胶支架(根据实施案例1制备的BA2与BA4冷冻凝胶支架)中培养的人静脉血管内皮细胞(HUVEC)在不同时间点的状态图，其中图7中的(a)和(c)为BA2冷冻凝胶支架培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)6小时和72小时的结果图；图7中的(b)和(d)为BA4冷冻凝胶支架培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)6小时和72小时的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明提供的一种三维大孔冷冻凝胶支架及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明的一些实施方式提供了一种三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其包括：将甲基丙烯酰胺基多糖(BSP-MA)的水溶液在引发剂的存在下，进行冷冻交联。
发明人在现有的水凝胶的基础上进行了大量的研究和实践，提供了上述全新的孔大小可调及凝胶力学性能可控，并且有利于细胞黏附和生长的大孔三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其主要通过选择了特定修饰的多糖在低温下发生自由基聚合反应而生成具有连续贯穿的较大孔洞结构的支架，其独特的结构有利于物质交换和促进细胞的黏附、生长，在制备中不需要任何有机溶剂，只需要用水作为模板即可得到多孔结构。整个过程温和可控，产率高且可以拓展至多种多糖材料，在生物材料和组织工程领域具有重要的研究价值和广泛的应用前景。
白芨是我国的一味传统中药，味苦、甘、涩，性寒，归肝、肺、胃经，具有收敛止血，消肿生肌的功效，可用于治疗咳血吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂，肺结核咳血，溃疡病出血等。从中药白芨中提取得到的一种由葡萄糖和甘露糖构成的天然高分子化合物被称为白芨多糖(Bletilla striata polysaccharide,BSP)，它具有抗菌、抗炎、促进伤口愈合、抗老化和抗肿瘤等药理活性,同时也表现出良好的生物可降解性和生物相容性。白芨多糖的主链上含有多个羟基，可以和大量化学官能团结合，便于修饰改性。常见的白芨多糖的修饰方法有硫酸酯化，乙酰化，硬脂酸化和氧化等。
因此，发明人通过对现有的能够制备凝胶的物质进行了大量研究和实践，进而筛选出了以白芨多糖作为原料来制备凝胶，能够获得孔隙结构和力学性能以及生物性能较佳的冷冻凝胶支架。因此，一些实施方式中，甲基丙烯酰胺基多糖为甲基丙烯酰胺基白芨多糖，其化学结构式为：
Figure BDA0002827126960000041
需要说明的是，甲基丙烯酰胺基多糖的来源不限，其可以通过制备得到，也可以通过其他途径购买得到。
具体地，本发明的一些实施方式提供的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法可包括：
S1、多糖被TEMPO体系选择性氧化。
将多糖溶解在缓冲液中，依次加入亚氯酸钠(NaClO2)、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)和次氯酸钠(NaClO)，反应12～48小时；再加入1～5倍体积的乙醇后在0～8℃的温度下静置沉淀，再进行固液分离得到氧化多糖。其中，上述反应过程为搅拌反应过程。静置沉淀为过夜沉淀。
其中，固液分离为透析并冷冻干燥；本发明的实施方式中可以利用红外分光光度法和核磁共振碳谱分析来表征氧化多糖的结构。
一些实施方式中，多糖在缓冲液中的浓度为1～4mg/mL，例如浓度可为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL或4mg/mL，缓冲液的pH为5.0～7.0，例如，pH可为5.5、6.0、6.5或7.0等，反应温度为25～65℃。
一些实施方式中，次氯酸钠在反应体系中的浓度为0～1mmol/g，多糖与亚氯酸钠的质量之比为1：0.6～6，例如，1:1、1:2、1:3、1:4或1:5等，多糖与2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的质量之比为1：1～10，例如，1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1：9等。
本发明的实施方式首次使用2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)氧化体系将白芨多糖C-6位伯羟基选择性地氧化成羧基，其选择性高，反应条件温和且避免了多糖的降解。
进一步地，上述多糖可为天然多糖，可以是从中药白芨中提取得到的白芨多糖时，该白芨多糖由白芨经过水提醇沉，Sevag法除去蛋白和凝胶色谱法纯化得到的高纯度的均一的产品。
S2、通过氧化多糖与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯(AEMA)的酰胺反应得到甲基丙烯酰胺基多糖(BSP-MA)。
具体地，将氧化多糖与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯酰胺反应，以得到甲基丙烯酰胺基多糖。
进一步地，一些实施方式中，将氧化多糖与AEMA反应包括：
将氧化多糖溶解于缓冲液中，再加入活化剂活化氧化多糖上的羧基后，然后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯反应12～48小时；一些实施方式中，氧化多糖在缓冲液中的浓度为1～5mg/mL，例如可为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL。
一些实施方式中，氧化多糖与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的质量比为1：1～10，例如可为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1：9等。
一些实施方式中，缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)的缓冲液，可选地，缓冲液的pH为6～7，更优选pH为6.5。
一些实施方式中，上述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1：1.5～2.5，更优选1：2。
需要说明的是，酰胺反应后，加入1～5倍体积的乙醇后在0～8℃的温度下静置沉淀，再进行固液分离得到终产物BSP-MA，固液分离的具体操作为洗涤，离心，透析和冷冻干燥。可通过核磁共振氢谱分析来表征终BSP-MA的结构。
S3、甲基丙烯酰胺基多糖(BSP-MA)的水溶液在引发剂的存在下，进行冷冻交联得到冷冻凝胶支架(即BSP-MA在低温下发生自由基聚合反应得到冷冻凝胶支架)。
一些实施方式中，引发剂包括四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(APS)。
一些实施方式中，四甲基乙二胺在反应体系中的浓度为0.1wt％～0.4wt％，例如可为0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％或0.4wt％，过硫酸铵在反应体系中的浓度为0.0625wt％～0.25wt％，例如可为0.0625wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％或0.25wt％。
一些实施方式中，甲基丙烯酰胺基多糖的水溶液的浓度为5～100mg/mL，例如可为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL或90mg/mL等，优选20～40mg/mL。本发明的实施方式可以通过控制甲基丙烯酰胺基多糖的水溶液来达到冷冻凝胶支架的孔洞大小的控制和力学性能的调节，进而为生物材料的研究提供了大量的素材和理论基础。
一些实施方式中，冷冻交联的温度为-25℃～-10℃，优选-20℃，冷冻交联的时间为12～20h。
本发明的一些实施方式还提供了一种三维大孔冷冻凝胶支架，由上述任意实施方式的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法制备得到。该大孔冷冻凝胶支架可适用于细胞培养，组织工程和药物释放等多个领域。
本发明的一些实施方式还提供了上述三维大孔冷冻凝胶支架在细胞培养、组织工程或制备药物中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种基于白芨多糖的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其包括：
将100mg白芨多糖溶解在100mL的缓冲液(pH＝5.0)中，在溶液中依次加入72.35mg亚氯酸钠(NaClO2)，7.97mg 2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)和0.655mL次氯酸钠溶液(NaClO)，60℃加热搅拌24小时。停止反应后，加入3倍体积的乙醇，搅拌均匀后放在0-8℃静置沉淀过夜。随后离心得到氧化白芨多糖沉淀，乙醇洗涤，溶于水后透析3天。透析后的溶液经冷冻干燥得到干燥样品。接着，称量100mg氧化白芨多糖溶解在50mL的MES缓冲液(50mM,pH＝6.5)中,向混合溶液中加入108.92mg EDC和47.05mg NHS，活化30分钟后加入94.10mg AEMA，常温搅拌反应24小时。然后加入3倍体积的乙醇于0-8℃静置沉淀过夜，离心，洗涤，透析和冷冻干燥后得到甲基丙烯酰胺基白芨多糖(BSP-MA)。
配制两份体积均为0.6mL的多糖水溶液(浓度分别为20mg/mL和40mg/mL)，称为BA2溶液和BA4溶液。在两份多糖水溶液中都加入0.03mL APS(10wt％)溶液和0.048mL TEMED(v/v，10％)溶液。混匀后立刻放入-20℃冰箱冷冻18h。在室温下解冻，纯水洗涤后得到BA2冷冻凝胶支架和BA4冷冻凝胶支架。
实施例2
按实施案例1中的方法制备得到甲基丙烯酰胺基白芨多糖(BSP-MA)，配制体积为0.6mL的多糖水溶液(浓度为40mg/mL)，加入0.06mL APS(10wt％)溶液和0.096mL TEMED(v/v，10％)溶液。混匀后立刻放入-20℃冰箱冷冻18h。在室温下解冻，纯水洗涤后得到BA4-I2冷冻凝胶支架。
实施例3
按实施案例1中的方法制备得到甲基丙烯酰胺基白芨多糖(BSP-MA)，配制体积为0.6mL的多糖水溶液(浓度为2.5mg/mL)，加入0.03mL APS(10wt％)溶液和0.048mL TEMED(v/v，10％)溶液。混匀后立刻放入-20℃冰箱冷冻18h。在室温下解冻，纯水洗涤后得到BA0.25冷冻凝胶，但因单体浓度过低，此凝胶形态不完整，凝胶效果不好。
对比例1
将100mg白芨多糖溶解在100mL的缓冲液(pH＝5.0)中，在溶液中依次加入72.35mg亚氯酸钠(NaClO2)，7.97mg 2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)和0.655mL次氯酸钠溶液(NaClO)，60℃加热搅拌24小时。停止反应后，加入3倍体积的乙醇，搅拌均匀后放在5℃静置沉淀过夜。随后离心得到氧化白芨多糖沉淀，乙醇洗涤，溶于水后透析3天。透析后的溶液经冷冻干燥得到干燥样品。接着，称量100mg氧化白芨多糖溶解在50mL的MES缓冲液(50mM,pH＝6.5)中，向混合溶液中加入108.92mg EDC和47.05mg NHS，活化30分钟后加入94.10mg AEMA，常温搅拌反应24小时。然后加入3倍体积的乙醇于5℃静置沉淀过夜，离心，洗涤，透析和冷冻干燥后得到甲基丙烯酰胺基白芨多糖(BSP-MA)。
配制体积为0.6mL的多糖水溶液(浓度分别为20mg/mL和40mg/mL)，称为BA2溶液和BA4溶液。在两份多糖水溶液中都加入0.04mL APS(10wt％)溶液和0.05mL TEMED(v/v，10％)溶液，混匀后置于室温下聚合，3分钟内即可得BA2和BA4水凝胶。
试验例1
利用激光扫描共聚焦显微镜观察冷冻凝胶支架的孔结构。将实施例1制备得到的BA2和BA4冷冻凝胶支架，加入少量异硫氰酸荧光素溶液染色，孵育过夜并洗去多余的染料。然后切开凝胶，将切片置于共聚焦显微镜下观察其微观形貌，用5倍和20倍物镜观测并拍照。采用Image J软件处理多张照片并统计分析孔径得到孔径分布图。结果如图1所示，其中，图1中的(a)为BA2的孔径分布图，(b)为BA4的孔径分布图。由图1可知，BA2和BA4冷冻凝胶支架均呈现连通的大孔网络结构，其平均孔径分别为约170微米和90微米。
试验例2
测定冷冻凝胶支架的孔隙率。将实施例1制备得到的BA2和BA4冷冻凝胶支架，并将冷冻凝胶支架浸泡在PBS中(过夜，使其充分溶胀)。称量溶胀后的冷冻凝胶支架的重量并记录。随后把充分溶胀的冷冻凝胶支架置于擦镜纸上(次更换擦镜纸)，直至冷冻凝胶支架完全干燥，称量干燥的冷冻凝胶支架的重量并记录。最后，计算冷冻凝胶支架的孔隙率，计算公式如下：
冷冻凝胶支架孔隙率(％)＝(充分溶胀后的冷冻凝胶支架重量-完全干燥后的冷冻凝胶支架重量)/充分溶胀后的冷冻凝胶支架重量。
结果如图2和图3所示，BA2冷冻凝胶支架的孔隙率略高于BA4冷冻凝胶支架，二者的平均孔隙率分别为约87％和78％。
试验例3
将实施例1制备的BA2和BA4冷冻凝胶支架进行流变力学测试：实施例1制备的BA2和BA4冷冻凝胶支架浸泡在PBS中使其充分溶胀。使用旋转流变仪对各溶胀的冷冻凝胶支架样品进行应变扫描，设置扫描频率为1Hz,扫描的应变范围为0.01～100％；使用旋转流变仪对各溶胀的冷冻凝胶支架样品进行频率扫描，设置扫描的应变为0.1％，扫描的频率范围为0.1～100Hz。结果如图4和图5所示，BA2和BA4冷冻凝胶支架的储能模量分别约为0.7kPa和2kPa。
试验例4
将实施例1制备的BA2冷冻凝胶支架，BA4冷冻凝胶支架以及对比例1制备得到的BA2水凝胶和BA4水凝胶进行人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC，ATCC公司，美国)的培养，采用CCK8实验测定HUVEC在上述材料中的增殖情况。具体实验步骤如下：利用75％乙醇消毒，然后在用PBS溶液洗涤和细胞培养液浸泡并除去多余培液后，加入含有HUVEC细胞(浓度为2×104个/mL)的1640培养液，同时设置空白孔和重复孔。放在细胞培养箱(5％CO2，37℃)中培养24小时和72小时后用CCK8法检测HUVEC增殖情况并计算细胞增殖率。结果如图6所示，与BA2水凝胶组和BA4水凝胶组相比，BA2冷冻凝胶支架组和BA4冷冻凝胶支架组均在培养72小时的时候，出现了显著的细胞增殖。
试验例5
采用活细胞/死细胞染色法(Calcein-AM/PI双染法)在共聚焦显微镜下观察BA2和BA4冷冻凝胶支架中的不同时间点的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC，ATCC公司，美国)的状态。按试验例4中的方法在BA2和BA4冷冻凝胶支架材料中种上HUVEC，放在细胞培养箱中培养6小时和72小时。取出后用PBS洗涤3次以除去未粘附的细胞。然后加入提前配好的Calcein-AM/PI染色工作液，37℃避光孵育30分钟。最后将染好的样品拿到共聚焦显微镜下观察细胞的状态，结果如图7所示，可以从图中直观地看出HUVEC在BA2和BA4冷冻凝胶支架中在培养6小时和72小时的时候其生长状态均为良好。
综上所述，本发明的实施方式的三维大孔冷冻凝胶支架先由多糖氧化修饰后引入双键得到甲基丙烯酰胺基多糖，然后甲基丙烯酰胺基多糖水溶液在低温下发生自由基聚合反应而生成具有多孔结构的支架。该三维大孔冷冻凝胶支架是一种有利于物质交换的类细胞基质，其能够促进细胞的黏附和生长。因此，该三维大孔冷冻凝胶支架可适用于细胞培养，组织工程和药物释放等多个领域。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，其包括：
将甲基丙烯酰胺基多糖的水溶液在引发剂的存在下，进行冷冻交联。
2.根据权利要求1所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基多糖为甲基丙烯酰胺基白芨多糖，其化学结构式为：
Figure FDA0002827126950000011
3.根据权利要求1所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述引发剂包括四甲基乙二胺和过硫酸铵；
优选地，所述四甲基乙二胺在反应体系中的浓度为0.1wt％～0.4wt％，所述过硫酸铵在反应体系中的浓度为0.0625wt％～0.25wt％。
4.根据权利要求1所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基多糖的水溶液的浓度为5～100mg/mL，优选20～40mg/mL。
5.根据权利要求1所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，冷冻交联的温度为-25℃～-10℃，优选-20℃，冷冻交联的时间为12～20h；
优选地，将冷冻交联后得到的产物在室温下融化，以获得所述三维大孔冷冻凝胶支架。
6.根据权利要求1～5任一项所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酰胺基多糖主要由以下步骤制备得到：
将氧化多糖与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯酰胺反应，以得到甲基丙烯酰胺基多糖；其中，氧化多糖由多糖被TEMPO体系选择性氧化得到；
优选地，当所述多糖为白芨多糖时，所述白芨多糖由白芨经过水提醇沉，Sevag法除去蛋白和凝胶色谱法纯化得到。
7.根据权利要求6所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，将氧化多糖与甲基丙烯酸2-氨基乙基酯酰胺反应包括：
将所述氧化多糖溶解于缓冲液中，再加入活化剂活化所述氧化多糖上的羧基后，然后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯反应12～48小时；
优选地，所述氧化多糖在所述缓冲液中的浓度为1～5mg/mL；
优选地，所述氧化多糖与所述甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的质量比为1：1～10；
优选地，所述缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸的缓冲液，优选地，所述缓冲液的pH为6～7，更优选pH为6.5；
优选地，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1：1.5～2.5，更优选1：2；
优选地，酰胺反应后，加入1～5倍体积的乙醇后在0～8℃的温度下静置沉淀，再进行固液分离。
8.根据权利要求6所述的三维大孔冷冻凝胶支架的制备方法，其特征在于，多糖被TEMPO体系选择性氧化包括：将多糖溶解在缓冲液中，依次加入亚氯酸钠、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基和次氯酸钠，反应12～48小时；再加入1～5倍体积的乙醇后在0～8℃的温度下静置沉淀，再进行固液分离；
优选地，所述多糖在缓冲液中的浓度为1～4mg/mL，缓冲液的pH为5.0～7.0，反应温度为25～65℃；
优选地，次氯酸钠在反应体系中的浓度为0～1mmol/g，多糖与亚氯酸钠的质量之比为1：0.6～6，多糖与2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基的质量之比为1：1～10。
9.一种三维大孔冷冻凝胶支架，其特征在于，其由权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的三维大孔冷冻凝胶支架在细胞培养、组织工程或制备药物中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058053A (zh) * 2022-06-30 2022-09-16 浙江大学滨江研究院 一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1634119A (zh) * 2004-11-16 2005-07-06 南京大学 颅内动脉瘤液体栓塞剂及其制备方法
CN101249274A (zh) * 2008-04-01 2008-08-27 南京大学 促进伤口愈合的白芨多糖水凝胶的制备及其应用
US20100272669A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Dr. Suwelack Skin & Health Care Ag Freeze-Dried Composition
EP2505214A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-03 University of Brighton A tissue engineering scaffold
US20140227327A1 (en) * 2011-04-28 2014-08-14 President And Fellows Of Harvard College Injectable Cryogel Vaccine Devices and Methods of Use Thereof
WO2016020050A1 (de) * 2014-08-05 2016-02-11 Karlsruher Institut für Technologie 3d-zellkultursystem, dessen herstellung und verwendung

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1634119A (zh) * 2004-11-16 2005-07-06 南京大学 颅内动脉瘤液体栓塞剂及其制备方法
CN101249274A (zh) * 2008-04-01 2008-08-27 南京大学 促进伤口愈合的白芨多糖水凝胶的制备及其应用
US20100272669A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Dr. Suwelack Skin & Health Care Ag Freeze-Dried Composition
EP2505214A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-03 University of Brighton A tissue engineering scaffold
US20140227327A1 (en) * 2011-04-28 2014-08-14 President And Fellows Of Harvard College Injectable Cryogel Vaccine Devices and Methods of Use Thereof
WO2016020050A1 (de) * 2014-08-05 2016-02-11 Karlsruher Institut für Technologie 3d-zellkultursystem, dessen herstellung und verwendung

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOLUNOVA, A. 等: "N-(2-Hydroxypropyl) Methacrylamide Based Cryogels - Synthesis and Biomimetic Modification for Stem Cell Applications", 《PHYSIOLOGICAL RESEARCH》 *
侯绪浩 等: "天然药物材料白及胶制备生物支架材料的实验研究", 《中草药》 *
刘耀华: "《有机化学中的选择性氧化作用》", 30 June 2008, 中国科学技术出版社 *
裴继诚 等: "《植物纤维化学》", 31 May 2020, 中国轻工业出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115058053A (zh) * 2022-06-30 2022-09-16 浙江大学滨江研究院 一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用
CN115058053B (zh) * 2022-06-30 2023-06-27 浙江大学滨江研究院 一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用

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