CN107540849A - 明胶化学改性方法及其交联材料和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种明胶化学改性方法，是将明胶、含二硫键的二羰基二咪唑活化酯溶解于二甲亚砜，反应；成胶后，提取明胶；将提取的明胶溶胀于水中，加入还原剂使双硫健被还原断开，室温密闭反应，经后处理得化学改性明胶。本发明还提供上述含二硫键的二羰基二咪唑活化酯及其制备方法、还提供上述化学改性方法所制得的化学改性明胶以及由该化学改性明胶所制得的二硫键交联明胶材料。本发明提供的方法，化学改性试剂与明胶的反应是在二甲亚砜溶剂的均相体系中进行，所制得的明胶可发生自交联反应，不需要额外的交联剂就可形成自交联明胶材料，由该化学改性明胶所制得的二硫键交联明胶材料不会引起炎症反应，生物相容性更好。
Description
技术领域
本发明涉及一种明胶材料化学改性方法，此外，本发明还设计明胶化学改性材料应用方式以及在医药领域的用途。
背景技术
明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性衍生物，是一种含有18种人体不可或缺的氨基酸的蛋白质。
按照制备方法不同，明胶可分为两类，即A型明胶和B型明胶。A型明胶(pH为3.8～6.0，等电点为6～8)是用酸水解猪皮得到的，可塑性和弹性较好，也称为酸法明胶。B型明胶(pH为5.0～7.4，等电点为4.7～5.3)是碱水解骨头及动物皮肤得到的，硬度较好，也称为碱法明胶。
明胶具有较好的生物降解性和生物相容性，现有的应用包括制成明胶止血海绵、明胶胶囊、明胶伤口敷料以及药物缓释制剂等。明胶在体温条件下可溶于水，现有技术中常对明胶进行物理、化学交联改性以提高明胶的热稳定性能或改善其他方面性能。目前较多的是采用化学交联方式，常见的明胶化学交联剂包括甲醛、乙二醛、戊二醛、1,6-己二异氰酸酯、丁二烯二环氧化物、顺丁烯二酸酐、多巴胺盐酸盐等等。中国发明专利CN102558589A公开了一种使用甲醛交联制备明胶/PVA复合膜的方法，明胶/PVA复合膜的力学性能相比普通膜得到提高。中国发明专利CN105561375A以多巴胺盐酸盐为交联剂，在强氧化剂过氧化氢或高碘酸钠作用下得到明胶吸液止血海绵，其生物相容性高，生物降解好。
但是上述化学改性方法中所使用的化学交联剂及交联后脱落的残留官能团常常会导致比较严重的炎症反应，因此，研究一种新的明胶化学改性方法，使其避免因交联剂引起的炎症反应是有必要的。
发明内容
本发明所需解决的技术问题之一是提供一种明胶化学改性新方法，无需使用现有技术中的交联剂，避免炎症反应。
本发明所需解决的技术问题之二是提供一种通过明胶化学改性新方法制备的侧链巯基化改性明胶衍生物及其在医药领域中的用途。
本发明所需解决的技术问题之三是提供了一种二硫键交联明胶材料，该材料以采用明胶化学改性新方法制备的侧链巯基化改性明胶衍生物为原料制备。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种明胶化学改性方法，包括以下步骤：
1)将明胶、含二硫键的二羰基二咪唑活化酯溶解于二甲亚砜，反应；
2)成胶后，提取明胶；
3)将得到的明胶颗粒溶胀于水中，调节pH值并加入还原剂还原使双硫健断开，室温密闭反应过夜，纯化冻干得化学改性明胶；
所述含二硫键的羰基二咪唑活化酯，其化学结构中包含二硫键和两个羰基咪唑基团。
具体的，所述步骤1)中，所用的明胶包括碱法明胶及其衍生物、酸法明胶及其衍生物。
具体的，所述的化学改性包括明胶化学交联改性和明胶侧链巯基化改性；所述的化学交联改性是指明胶与化学改性试剂反应形成三维网状结构。
具体的，所述步骤1)中，所述含有二硫键的二咪唑活化酯包括双丁二酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯、双丁二酸双酰胱胺酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯、双丁二酸双酰胱胺酸二乙酯二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯，二硫代二苯甲酸二羰基二咪唑活化酯中的至少一种。
优选的，所述含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯选自式(I)所示化合物和式(II)所示化合物中的至少一种，
式(I)，其化学结构中包含二硫键和两个羰基咪唑基团，其中，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；
式(II)，其化学结构中包含二硫键和两个羰基咪唑基团，其中，R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基。
进一步优选的，R1为-CH2-、-CH2CH2-、-CH(COOCH3)CH2-、-CH(COOC2H5)CH2-或苯基；更优选的，R1为-CH2CH2-。
进一步优选的，R2为-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH2CH2CH2-或-CCH3＝CH-；更优选的，R2为-CH2CH2-。
进一步优选的，R3为-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或苯基；更优选的，R3为-CH2CH2-。
最优选的，所述含有二硫键的羰基二咪唑活化酯为双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯，其R1为-CH2CH2-，R2为-CH2CH2-，其结构如下：
具体的，所述步骤1)中，含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯的摩尔量大于明胶的氨基摩尔量。
优选的，所述步骤1)中，明胶反应温度为30～60℃；更优选为40～50℃。
具体的，所述步骤2)中，提取是将凝胶捣碎后用溶剂萃取以除去二甲亚砜溶剂；优选的萃取溶剂为无水乙醇。
具体的，所述步骤3)，水优选为蒸馏水。
具体的，所述步骤3)，还原剂优选为二硫苏糖醇。
本发明还提供上述含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯及其合成方法。合成方法有两种：
第一种是：由二硫代二氨(化合物1)与二酸酸酐(化合物2)反应，得到化合物3；化合物3再与羰基二咪唑反应，得到式(I)所示的含有二硫键的羰基二咪唑活化酯。
其中，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基。
优选的实施方式中，二硫代二氨选自胱胺、胱氨酸二甲酯、胱氨酸二乙酯、二硫代二苯氨中的至少一种；
优选的实施方式中，二酸酸酐选自丁二酸酐、马来酸酐、戊二酸酐、2-甲基马来酸酐中的至少一种；
更优选的实施方式中，二硫代二氨试剂为胱胺；二酸酸酐试剂为丁二酸酐。
第二种是：由二硫代二酸(化合物4)直接与羰基二咪唑反应得到式(II)所示的含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯。
其中，R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基。
在优选的实施方式中，二硫代二酸选自二硫代二乙酸、二硫代二丙酸、二硫代二丁酸、二硫代二苯甲酸中的至少一种。
更优选的实施方式中，二硫代二酸试剂为二硫代二丙酸。
本发明所提供的含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯可以作为一种新型的化学交联试剂，明胶经该化学交联改性后再经过还原得到含有巯基侧链的改性明胶。在研究过程中发现，这种化学交联试剂在水相中的溶解性较差，反应效果不好。
进一步研究，意外发现这种化学交联试剂能够很好的溶解于二甲亚砜试剂，而明胶也可溶解于热的二甲亚砜试剂，因此，反应在二甲亚砜试剂体系中为均相反应，均相体系增加了参与反应的各分子发生碰撞的几率，反应可以高效地进行。
更进一步的研究发现，使用该化学交联改性后的明胶，在中性条件下就可发生自交联反应，不需要额外的交联剂就可形成自交联明胶材料，因此本发明所制得的改性明胶不会造成因交联剂及交联后脱落的残留官能团引起的炎症反应，生物相容性更好。
为了解决上述技术问题，本发明还提供一种侧链巯基化改性明胶衍生物，是通过本发明的明胶化学改性方法所制得。
为了解决上述技术问题，本发明还提供一种侧链巯基化改性明胶衍生物，具有以下结构：
其中G为明胶，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；或
其中G为明胶，R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基。
为了解决上述技术问题，本发明还提供一种由侧链巯基化改性明胶衍生物所制备的二硫键交联明胶材料。该二硫键交联明胶材料是由本发明的侧链巯基化改性明胶衍生物与多糖和/或多糖衍生物制得，采用的多糖包括透明质酸钠、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸等。
本发明提供的二硫键交联明胶材料可以用于生物医药领域，比如制造细胞培养基质、组织再生基质。经实验证明，本发明的二硫键交联明胶水凝胶是细胞粘附生长的良好基质，其生物相容性好，未观察到生物细胞发生炎症反应。
本发明的明胶化学改性方法中，化学改性试剂与明胶的反应是在二甲亚砜溶剂的均相体系中进行，是均相反应，化学改性试剂与明胶能够快速高效地发生交联反应形成三维网状结构。反应过程可控、高效，不需要维持体系的pH，不需要添加额外的活化剂，二甲亚砜溶剂也易除去。
本发明所得的明胶侧链巯基化改性材料可以单独使用，也可复合其它一种或多种多糖或其衍生物。这些多糖或衍生物包括但不局限于透明质酸钠、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸。这些二硫键交联的高分子材料可以制成薄膜、海绵、凝胶等各种形态，在医药中具有广泛的用途，包括细胞培养基质、组织再生基质等。
附图说明
图1为本发明的二硫键交联明胶水凝胶作为细胞粘附生长的基质在显微镜下的观察图，图中显示细胞在水凝胶表面的粘附铺展，细胞呈纺锤形。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1合成双丁二酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯
胱氨二盐酸盐10g溶解于150ml蒸馏水中，磁力搅拌透明溶液。向上述溶液中加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10。然后加入13.3g丁二酸酐，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温反应2小时后，向溶液中加入6mol/L的盐酸，调节溶液pH值2～3，过滤收集白色沉淀产物，滤饼用200ml蒸馏水水洗3次。然后置于50℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体双丁二酸双酰胱氨酸约13.4g。
向250mL烧杯中加入10g双丁二酸双酰胱氨酸、60ml无水N’N-二甲基甲酰胺，室温磁力搅拌溶解后，加入11.2g羰基二咪唑，约2分钟后，溶液中产生大量气体和白色沉淀，继续反应2小时。然后加入200ml乙酸乙酯稀释，过滤收集沉淀产物。滤饼用100ml乙酸乙酯洗涤3次，然后置于30℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体产物双丁二酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯11.3g。
实施例2合成双丁二酸双酰胱胺酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯
胱氨酸二甲酯二盐酸盐15g溶解于150ml蒸馏水中，磁力搅拌透明溶液。向上述溶液中加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10。然后加入13.3g丁二酸酐，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温反应2小时后，向溶液中加入6mol/L的盐酸，调节溶液pH值2～3，过滤收集白色沉淀产物，滤饼用200ml蒸馏水水洗3次。然后置于50℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体双丁二酸双酰胱氨酸二甲酯约13.4g。
向250mL烧杯中加入15g双丁二酸双酰胱氨酸、60ml无水N’N-二甲基甲酰胺，室温磁力搅拌溶解后，加入11.2g羰基二咪唑，约2分钟后，溶液中产生大量气体和白色沉淀，继续反应2小时。然后加入200ml乙酸乙酯稀释，过滤收集沉淀产物。滤饼用100ml乙酸乙酯洗涤3次，然后置于30℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体产物双丁二酸双酰胱胺酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯13.2g。
实施例3合成双马来酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯
胱氨二盐酸盐10g溶解于150ml蒸馏水中，磁力搅拌透明溶液。向上述溶液中加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10。然后加入13.0g马来酸酐，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温反应2小时后，向溶液中加入6mol/L的盐酸，调节溶液pH值2～3，过滤收集白色沉淀产物，滤饼用200ml蒸馏水水洗3次。然后置于50℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体双马来酸双酰胱氨酸约12.3g。
向250mL烧杯中加入10g双马来酸双酰胱氨酸、60ml无水N’N-二甲基甲酰胺，室温磁力搅拌溶解后，加入11.2g羰基二咪唑，约2分钟后，溶液中产生大量气体和白色沉淀，继续反应2小时。然后加入200ml乙酸乙酯稀释，过滤收集沉淀产物。滤饼用100ml乙酸乙酯洗涤3次，然后置于30℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体产物双马来酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯11.0g。
实施例4合成二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯
向250mL烧杯中加入11.9g二硫代二丙酸、120ml无水N’N-二甲基甲酰胺，室温磁力搅拌溶解后，加入22.4g羰基二咪唑，约2分钟后，溶液中产生大量气体和白色沉淀，继续反应2小时。然后加入400ml乙酸乙酯稀释，过滤收集沉淀产物。滤饼用200ml乙酸乙酯洗涤3次，然后置于30℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体产物二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯16.5g。
实施例5合成二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯
向250mL烧杯中加入12.8g二硫代二丁酸、120ml无水N’N-二甲基甲酰胺，室温磁力搅拌溶解后，加入22.4g羰基二咪唑，约2分钟后，溶液中产生大量气体和白色沉淀，继续反应2小时。然后加入400ml乙酸乙酯稀释，过滤收集沉淀产物。滤饼用200ml乙酸乙酯洗涤3次，然后置于30℃鼓风干燥箱中干燥，得到白色固体产物二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯16.9g。
实施例6合成侧链巯基化改性明胶衍生物(双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯)
明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，50℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。3g实施例1制备的双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，然后加至明胶溶液中，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。取出并捣碎凝胶，加入500ml无水乙醇，磁力搅拌萃取凝胶中的二甲亚砜。每隔2小时更换无水乙醇，直至凝胶成为白色硬质颗粒。
上述明胶反应物溶解于300ml蒸馏水中，35℃加热磁力搅拌，明胶反应物颗粒吸水膨胀。加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10，然后加入12g二硫苏糖醇，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温密闭反应过夜。向上述溶液中滴加6mol/L盐酸，调节pH值3左右。将试液装入透析管袋，用10L 0.001mol/L盐酸和0.3mol/L氯化钠溶液透析前3天，每隔8小时更换透析液，后4天改用10L 0.001mol/L盐酸透析。
收集透析袋内溶液，滤纸过滤后于-86℃冰箱中预冻24小时后，置于冷干燥机中干燥得到最终产物(侧链巯基化改性明胶衍生物)。
经检测，该最终产物中氨基的接枝度为105％。
对实施例6合成侧链巯基化改性明胶衍生物(双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯)在30～60℃下进行平行试验，如下：
1、明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，30℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。3g双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，向明胶溶液中加入上述混合液，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。
余下操作同实施例6。
2、明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，40℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。3g双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，向明胶溶液中加入上述混合液，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。
余下操作同实施例6。
3、明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，60℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。3g双丁二酸双酰胱氨酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，向明胶溶液中加入上述混合液，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。
余下操作同实施例6。
不同反应温度得到的最终产物中氨基的接枝度如下表：
| 温度 | 30℃ | 40℃ | 50℃ | 60℃ |
| 接枝度 | 65％ | 96％ | 105％ | 88％ |
实施例7合成侧链巯基化改性明胶衍生物(双丁二酸双酰胱胺酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯)
明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，50℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。3.3g实施例2制备的双丁二酸双酰胱胺酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，然后加至明胶溶液中，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。取出并捣碎凝胶，加入500ml无水乙醇，磁力搅拌萃取凝胶中的二甲亚砜。每隔2小时更换无水乙醇，直至凝胶成为白色硬质颗粒。
上述明胶反应物溶解于300ml蒸馏水中，35℃加热磁力搅拌，明胶反应物颗粒吸水膨胀。加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10，然后加入12g二硫苏糖醇，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温密闭反应过夜。向上述溶液中滴加6mol/L盐酸，调节pH值3左右。将试液装入透析管袋，用10L 0.001mol/L盐酸和0.3mol/L氯化钠溶液透析前3天，每隔8小时更换透析液，后4天改用10L 0.001mol/L盐酸透析。
收集透析袋内溶液，滤纸过滤后于-86℃冰箱中预冻24小时后，置于冷干燥机中干燥得到最终产物(侧链巯基化改性明胶衍生物)。
经检测，该最终产物中氨基的接枝度为94％。
实施例8合成侧链巯基化改性明胶衍生物(二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯)
明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，50℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。1.9g实施例4制备的二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，然后加至明胶溶液中，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。取出并捣碎凝胶，加入500ml无水乙醇，磁力搅拌萃取凝胶中的二甲亚砜。每隔2小时更换无水乙醇，直至凝胶成为白色硬质颗粒。
上述明胶反应物溶解于300ml蒸馏水中，35℃加热磁力搅拌，明胶反应物颗粒吸水膨胀。加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10，然后加入12g二硫苏糖醇，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温密闭反应过夜。向上述溶液中滴加6mol/L盐酸，调节pH值3左右。将试液装入透析管袋，用10L 0.001mol/L盐酸和0.3mol/L氯化钠溶液透析前3天，每隔8小时更换透析液，后4天改用10L 0.001mol/L盐酸透析。
收集透析袋内溶液，滤纸过滤后于-86℃冰箱中预冻24小时后，置于冷干燥机中干燥得到最终产物(侧链巯基化改性明胶衍生物)。
经检测，该最终产物中氨基的接枝度为105％。
实施例9合成侧链巯基化改性明胶衍生物(二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯)
明胶(B型，来自牛骨，罗赛诺，中国)12g溶解于260ml二甲亚砜中，50℃加热磁力搅拌，得到澄清溶液。2.0g实施例5制备的二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯预先用40ml二甲亚砜溶解，然后加至明胶溶液中，约5分钟后，溶液逐渐失去流动性形成凝胶，继续振荡反应2小时。取出并捣碎凝胶，加入500ml无水乙醇，磁力搅拌萃取凝胶中的二甲亚砜。每隔2小时更换无水乙醇，直至凝胶成为白色硬质颗粒。
上述明胶反应物溶解于300ml蒸馏水中，35℃加热磁力搅拌，明胶反应物颗粒吸水膨胀。加入4mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值为9～10，然后加入12g二硫苏糖醇，同时不断加入4mol/L的氢氧化钠使溶液pH值维持在8～10、室温密闭反应过夜。向上述溶液中滴加6mol/L盐酸，调节pH值3左右。将试液装入透析管袋，用10L 0.001mol/L盐酸和0.3mol/L氯化钠溶液透析前3天，每隔8小时更换透析液，后4天改用10L 0.001mol/L盐酸透析。
收集透析袋内溶液，滤纸过滤后于-86℃冰箱中预冻24小时后，置于冷干燥机中干燥得到最终产物(侧链巯基化改性明胶衍生物)。
经检测，该最终产物中氨基的接枝度为105％。
实施例10：单组分二硫键交联明胶水凝胶制备
实施例6中制备的侧链巯基化改性明胶衍生物0.4g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向上述溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4，然后将上述溶液转移25ml烧杯中并置于37℃温湿度箱中5天，溶液逐渐失去流动性并形成凝胶。
实施例11：单组分二硫键交联明胶水凝胶制备
实施例8中制备的侧链巯基化改性明胶衍生物0.5g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向上述溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4，然后将上述溶液转移25ml烧杯中并置于37℃温湿度箱中5天，溶液逐渐失去流动性并形成凝胶。
实施例12：多组分二硫键交联明胶水凝胶制备
1、二硫键交联明胶-透明质酸双组分水凝胶制备：实施例6中制备的侧链巯基化改性明胶衍生物0.4g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；取透明质酸(分子量32万)0.1g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；将上述两种溶液倒入50ml烧杯中，磁力搅拌2分钟，此后将烧杯置于37℃温湿度箱中5天，溶液逐渐失去流动性并形成凝胶。
2、二硫键交联明胶-硫酸软骨素双组分水凝胶制备：实施例6中制备的侧链改性巯基化明胶化衍生物0.4g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；取硫酸软骨素0.1g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；将上述两种溶液倒入50ml烧杯中，磁力搅拌2分钟，此后将烧杯置于37℃温湿度箱中5天，溶液逐渐失去流动性并形成凝胶。
3、二硫键交联明胶-透明质酸-硫酸软骨素三组分水凝胶制备：实施例6中制备的明胶巯基化衍生物0.4g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；取透明质酸(分子量32万)0.1g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；取硫酸软骨素0.1g溶解于0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中得到澄清透明溶液，向溶液中缓缓滴加pH＝10的NaOH溶液调节pH＝7.4；将上述三种溶液倒入50ml烧杯中，磁力搅拌2分钟，此后将烧杯置于37℃温湿度箱中5天，溶液逐渐失去流动性并形成凝胶。
实施例13：二硫键交联明胶水凝胶作为细胞粘附生长的基质
按照实施例10，在24孔标准细胞培养板内制备二硫键交联明胶水凝胶，每孔加入1ml，将铺板后的培养板放置于37℃温湿度箱中5天，溶液形成凝胶，然后每孔加入1ml细胞培养液和1万个成纤维细胞。37℃、二氧化碳细胞培养箱中培养24小时，显微镜观察到细胞在水凝胶表面的粘附铺展，细胞呈纺锤形(如图1所示)，未观察到细胞有炎症反应。结果表明二硫键交联明胶水凝胶是细胞粘附生长的良好基质。
采用同样的方法，在细胞培养板内制备实施例11和实施例12的二硫键交联明胶水凝胶，经显微镜观察，实验结果与图1所示一致，也未观察到细胞有炎症反应。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (21)
1.一种明胶化学改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将明胶、含二硫键的二羰基二咪唑活化酯溶解于二甲亚砜，反应；
2)成胶后，提取明胶；
3)将提取的明胶溶胀于水中，加入还原剂使双硫健被还原断开，室温密闭反应，经后处理得化学改性明胶；
所述含二硫键的二羰基二咪唑活化酯，其化学结构中包含二硫键和两个羰基咪唑基团。
2.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述的含有二硫键的二咪唑活化酯包括双丁二酸双酰胱胺酸二羰基二咪唑活化酯、双丁二酸双酰胱胺酸二甲酯二羰基二咪唑活化酯、双丁二酸双酰胱胺酸二乙酯二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丙酸二羰基二咪唑活化酯、二硫代二丁酸二羰基二咪唑活化酯，二硫代二苯甲酸二羰基二咪唑活化酯。
3.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯选自式(I)所示化合物和式(II)所示化合物中的至少一种；
其中，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；
其中，R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基。
4.如权利要求3所述的明胶化学改性方法，其特征在于，R1为-CH2-、-CH2CH2-、-CH(COOCH3)CH2-、-CH(COOC2H5)CH2-或苯基；更优选的，R1为-CH2CH2-。
5.如权利要求3所述的明胶化学改性方法，其特征在于，R2为-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH2CH2CH2-或-CCH3＝CH-；更优选的，R2为-CH2CH2-。
6.如权利要求3所述的明胶化学改性方法，其特征在于，R3为-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或苯基；更优选的，R3为-CH2CH2-。
7.如权利要求3所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯的R1为-CH2CH2-，R2为-CH2CH2-。
8.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述步骤1)中，含有二硫键的二羰基二咪唑活化酯的摩尔量大于明胶的氨基摩尔量。
9.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述步骤1)中，明胶反应温度为30～60℃；更优选为40～50℃。
10.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述步骤2)中，提取是将凝胶捣碎后用溶剂萃取以除去二甲亚砜溶剂；优选的萃取溶剂为无水乙醇。
11.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述步骤3)，水为蒸馏水。
12.如权利要求1所述的明胶化学改性方法，其特征在于，所述步骤3)中，还原剂为二硫苏糖醇。
13.一种如权利要求1-12任一项所述明胶化学改性方法所制备的侧链巯基化改性明胶衍生物。
14.一种采用如权利要求13所述的侧链巯基化改性明胶衍生物所制备的二硫键交联明胶材料。
15.如权利要求14所述的二硫键交联明胶材料，其特征在于，所述的二硫键交联明胶材料中还含有至少一种多糖或多糖衍生物。
16.如权利要求15所述的二硫键交联明胶材料，其特征在于，所述的多糖包括透明质酸钠、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、海藻酸等。
17.一种如权利要求14-16所述的二硫键交联明胶材料在医药领域中的用途。
18.如权利要求17所述的二硫键交联明胶材料在医药领域中的用途，其特征在于，医药领域中的用途包括细胞培养基质、组织再生基质。
19.一种二硫键的二羰基二咪唑活化酯，其结构为式(I)或式(II)所示；
其中，R1为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基、乙基、甲氧羰基或乙氧羰基；R2为取代或未取代的C1-C3烃基，取代基为甲基或乙基；
其中，R3为取代或未取代的C1-C3烃基、取代或未取代的苯基，取代基为甲基或乙基。
20.如权利要求19所述的二硫键的羰基二咪唑活化酯，其特征在于，R1为-CH2-、-CH2CH2-、-CH(COOCH3)CH2-、-CH(COOC2H5)CH2-或苯基；更优选的，R1为-CH2CH2-；R2为-CH2-、-CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH2CH2CH2-或-CCH3＝CH-；更优选的，R2为-CH2CH2-；R3为-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-或苯基；更优选的，R3为-CH2CH2-。
21.如权利要求19或20所述的二硫键的二羰基二咪唑活化酯作为化学改性试剂用于明胶化学改性的应用。
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