CN115058053B - 一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用。首先分别合成了侧链接枝了甲基丙烯酰基团以及酰脲基嘧啶酮基团的明胶衍生物,Gel‑MA和Gel‑UPY;配制两种明胶衍生物的水溶液,并与光引发剂充分混合后制成凝胶的成胶溶液;随后经过冷冻、紫外光照、融化过程制备得到了冷冻大孔凝胶。所得的冷冻大孔凝胶具有相互连通的大孔结构以及良好的力学性能,可以有效促进组织细胞的迁入,在骨软骨缺损再生领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物凝胶技术领域,具体涉及一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
关节软骨具有承重和低摩擦的特点,它能够帮助关节部位顺畅地运转。过度负重或者过高频率的使用关节,会增加关节软骨损伤的风险。关节软骨的损伤会引发关节疼痛、活动受限甚至导致残疾。
通过现有的临床治疗方法,骨软骨缺损通常只能再生出纤维化的软骨样组织,其在结构和功能上与天然透明软骨仍有很大不同。近年来,基于支架的组织工程策略成为促进骨软骨缺损完全再生的一种重要手段。其中,无细胞支架基于生物相容性好的天然和合成材料为内源性细胞提供适宜其生长的3D微环境,与载细胞支架相比其制备和储存简便,免疫原性低,更易临床转化。
无细胞(或因子)水凝胶支架面临的问题是水凝胶的纳米级凝胶网络结构不利于物质交换和细胞浸润,从而阻碍原位骨软骨再生。如何制备一种既能有效促进组织细胞的迁入,同时又具有良好的力学性能的无细胞水凝胶支架是有待解决的技术问题。
发明内容
本部分的目的在于提供一种明胶制备方法,使其具有大分子孔洞的同时还具有优秀的机械强度,从而达到软骨修复,促骨再生的目的。本部分概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊,而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面,本发明提供一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,由以下步骤组成:
步骤1,合成侧链接枝甲基丙烯酰基团的Gel-MA:将明胶溶解,调节pH值,滴加甲基丙烯酸酐进行反应,终止反应后,将产物加入到冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,透析,冻干,得到Gel-MA;
步骤2,合成侧链接枝酰脲基嘧啶酮基团的Gel-UPY:将六亚甲基二异氰酸酯和2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中,惰性气体保护下冷凝回流反应,沉淀产物,减压抽滤,将得到的滤饼真空干燥得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮;惰性气体保护下将明胶溶解,得到明胶溶液,将所述2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶解得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液,将所述2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液加入到所述明胶溶液中,在室温下反应,将所得产物在异丙醇中沉淀离心,将离心后产物溶解,透析,冻干,得到Gel-UPY;
步骤3,将Gel-MA、Gel-UPY以及苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂依次溶解在水中配制为成胶溶液,其中,所述Gel-MA的质量分数为4~6%、所述Gel-UPY的质量分数为4~6%、所述苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂的质量分数为0.5~1 ‰,将所述成胶溶液置于冰箱中放置1~2 h后,从冰箱取出置于紫外灯下光照30~90秒,将得到的凝胶置于37 ℃中,得到冷冻大孔凝胶。
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤1中,所述将明胶溶解,为将明胶溶解在PBS缓冲液中,70℃加热搅拌溶解,所述明胶的质量体积分数以g:mL计为10 %,
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤1中,所述调节pH值,为45 ℃下用NaOH调节溶液pH为8.0。
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤1中,所述滴加甲基丙烯酸酐进行反应,为滴加400 μL甲基丙烯酸酐反应1小时;所述终止反应,为加入40 mL的PBS缓冲液终止反应。
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤1中,所述将产物加入到冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,透析,再加入到500 mL经过-20 ℃预冷的冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,在3500 Da的透析袋中透析。
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤2中,将18 g六亚甲基二异氰酸酯和2 g 2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中,在100 ℃、氮气保护下冷凝回流反应15小时后冷却至室温得到产物,使用正戊烷沉淀产物,减压抽滤后,将滤饼在50 ℃下真空干燥得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮。
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤2中,在氮气保护、60 ℃搅拌条件下将2 g明胶溶于25mL的无水DMSO中,使明胶完全溶解得到明胶溶液,冷却至室温。
作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤2中,将0.1 g 2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶解在5mL无水DMSO中得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液,逐滴将2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液加入到明胶溶液中,在室温下反应24小时,反应结束后将所得产物在异丙醇中沉淀离心,将离心后产物溶解在去离子水中,在3500 Da的透析袋中透析,冻干后得到产物Gel-UPY。作为本发明所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法的一种优选方案:步骤3中,将Gel-MA、Gel-UPY以及苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂依次溶解在水中,分别按6 %、4 %和0.5 ‰的质量分数配制为成胶溶液,将成胶溶液置于-20 ℃的冰箱中放置1小时,从冰箱取出迅速置于紫外灯下光照60秒,置于37 ℃中得到冷冻大孔凝胶。
本发明的有益效果:本发明提供一种基于两种明胶衍生物的新型无细胞水凝胶支架,并发现其具有促进原位骨软骨再生的作用,该支架具有大孔结构和优异的机械性能。可以有效促进组织细胞的迁入,在骨软骨缺损再生领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为Gel-MA和Gel-UPY的合成示意图;
图2为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶(Hgel)和实施例1制备的冷冻大孔凝胶(Cryogel)冻干后内部的扫描电镜(SEM)图片以及内部孔洞的平均孔径;
图3为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶(Hgel)和实施例1制备的冷冻大孔凝胶(Cryogel)骨架的原位激光共聚焦显微镜(CLSM)图片;
图4为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶的(A)代表压缩应力-应变曲线、(B)压缩模量和(C)单次压缩后的回复性能;
图5为软骨细胞在Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶中的迁移情况;
图6为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶植入软骨缺损部位12周后的大体观察图和苏木精 - 伊红染色图;
图7为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶植入软骨缺损部位12周后的番红染色粘多糖图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广,因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次,此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1:
首先合成侧链接枝甲基丙烯酰基团的Gel-MA,其具体制备方法如下:将4 g明胶与40 mL PBS溶液加入单口烧瓶中,70℃加热搅拌使明胶完全溶解,之后冷却至45 ℃,用NaOH调节溶液pH为8.0,之后在45 ℃搅拌下向溶液中逐滴滴加400 μL甲基丙烯酸酐,反应1 h后加入40 mL的PBS缓冲液终止反应,将反应液加入到500 mL经过-20 ℃预冷的冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,在3500 Da的透析袋中透析,一周后将溶液冻干,即得到Gel-MA。
合成侧链接枝酰脲基嘧啶酮基团的Gel-UPY, 其具体制备方法为:将18 g六亚甲基二异氰酸酯和2 g 2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中,在100 ℃、氮气保护下冷凝回流反应15小时,将反应液冷却至室温后,使用正戊烷沉淀产物,减压抽滤后,将滤饼在50 ℃下真空干燥得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮(UPY-NCO),随后在氮气保护、60 ℃搅拌条件下将2 g明胶溶于25mL的无水DMSO中,使明胶完全溶解得到明胶溶液,冷却至室温,将0.1 g UPY-NCO溶解在5 mL无水二甲亚砜(DMSO)中得到UPY-NCO溶液,逐滴将UPY-NCO溶液加入到明胶溶液中,在室温下反应24小时,反应结束后将所得产物在异丙醇中沉淀离心,将离心后产物溶解在去离子水中,在3500 Da的透析袋中透析,冻干后得到产物Gel-UPY。
将Gel-MA、Gel-UPY以及光引发剂苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂(LAP)依次溶解在水中,分别按6 %、4 %和0.5 ‰的质量分数配制为成胶溶液。将成胶溶液置于-20℃的冰箱中放置1小时,从冰箱取出迅速置于紫外灯下光照60秒,紫外光照交联得到的凝胶置于37 ℃中使其冰晶完全融化即得到冷冻大孔凝胶。
为研究Gel-MA、Gel-UPY的最优配比和浓度,分别将Gel-MA和Gel-UPY的质量分数配制为7%(Gel-MA)和3%(Gel-UPY)、6%和4%、4%和6%、3%和7%,实验结果发现,Gel-MA和Gel-UPY的质量分数为7%和3%%时,得到的凝胶机械强度不佳,而Gel-MA和Gel-UPY的质量分数为3%和7%时难以形成凝胶,Gel-MA和Gel-UPY的质量分数为4%和6%时凝胶形成时间较慢,促进组织细胞迁入作用有所下降,Gel-MA和Gel-UPY的质量分数为6%和4%时,凝胶的生物相容性好,能够骨软骨组织再生,同时机械强度高,Gel-MA和Gel-UPY的质量分数为6%和4%时最优。光照时间对于交联效果影响较大,光照时间小于30秒无法成胶,而光照时间超过90秒,则产物固化,流动性不佳。
实施例2:
首先合成侧链接枝甲基丙烯酰基团的Gel-MA,其具体制备方法如下:将4 g明胶与40 mL PBS溶液加入单口烧瓶中,70℃加热搅拌使明胶完全溶解,之后冷却至45 ℃,用NaOH调节溶液pH为8.0,之后在45 ℃搅拌下向溶液中逐滴滴加400 μL甲基丙烯酸酐,反应1 h后加入40 mL的PBS缓冲液终止反应,将反应液加入到500 mL经过-20 ℃预冷的冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,在3500 Da的透析袋中透析,一周后将溶液冻干,即得到Gel-MA。
合成侧链接枝酰脲基嘧啶酮基团的Gel-UPY, 其具体制备方法为:将18 g六亚甲基二异氰酸酯和2 g 2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中,在100 ℃、氮气保护下冷凝回流反应15小时,将反应液冷却至室温后,使用正戊烷沉淀产物,减压抽滤后,将滤饼在50 ℃下真空干燥得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮(UPY-NCO),随后在氮气保护、60 ℃搅拌条件下将2 g明胶溶于25mL的无水DMSO中,使明胶完全溶解得到明胶溶液,冷却至室温,将0.1 g UPY-NCO溶解在5 mL无水DMSO中得到UPY-NCO溶液,逐滴将UPY-NCO溶液加入到明胶溶液中,在室温下反应24小时,反应结束后在异丙醇中沉淀离心,将离心后产物溶解在去离子水中,在3500 Da的透析袋中透析,冻干后得到产物Gel-UPY。
将Gel-MA、Gel-UPY以及光引发剂苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂(LAP)依次溶解在水中,分别按4 %、6 %和0.5 ‰的质量分数配制为成胶溶液。将成胶溶液置于-20℃的冰箱中放置1小时,从冰箱取出迅速置于紫外灯下光照90秒,紫外光照交联得到的凝胶置于37 ℃中使其冰晶完全融化即得到冷冻大孔凝胶。
实施例3:
相比于实施例1,去掉“将成胶溶液置于-20 ℃的冰箱中放置1小时”步骤作为普通凝胶组(Hgel组),将实施例1组记为“Cryogel”组,Blank组为不使用凝胶的空白对照。
图5为软骨细胞在Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶中的迁移情况,将消毒后的凝胶浸泡在含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素和链霉素的1640培养基中浸泡12小时,然后置于48孔培养板中。每孔加入1 mL,密度为1×104/mL的SW细胞悬液。细胞接种板在37℃和5%二氧化碳下孵育4小时,以允许细胞粘附。然后,将凝胶转移到6孔培养板中,每孔加入5 mL的培养基,在37℃,5%二氧化碳的环境下培养。培养1天后,细胞核用Hoechst进行显微镜荧光染色观察。使用Image-ProPlus软件测量图像中的细胞数量,见图5,从图5可以看出,本发明实施例1制备的冷冻大孔凝胶能够显著促进软骨细胞迁入。
共20只新西兰大白兔(每只2.5-3kg)进行体内评价。家兔麻醉后,用电钻在每条腿的非负重软骨下骨板下形成直径为4mm、深度为4mm的孔状缺损。将溶解于PBS的凝胶主射植入缺损处。1只兔在取样前死亡,其余术后12w处死以评估再生情况。
将收获的再生软骨和软骨下骨组织用PBS洗涤,并在4%多聚甲醛组织固定液中浸泡约14d。在此期间,一些样本使用micro-CT系统(AX2000,中国)进行分析。成像结果采用VGStudioMAX3.0进行重建。选择初始缺损区域作为测量骨体积/组织体积、骨小梁厚度和骨小梁数量的感兴趣区域。然后,样品在10% wt% 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTANa2)溶液中脱钙约1个月。常规切片后,所有切片样品均用苏木精和伊红(H&E)、番红 O&固绿染色,并进行II型胶原(ColII)免疫组化染色,按照上述程序对样品进行组织学分析。图6为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶植入软骨缺损部位12周后的大体观察图和苏木精 - 伊红染色图;图7为Gel-MA/Gel-UPY普通凝胶及实施例1制备的冷冻大孔凝胶植入软骨缺损部位12周后的番红染色粘多糖图。可见,相比于普通凝胶组,实施例1的冷冻大孔凝胶具有促进原位骨软骨再生的作用。
本发明制备出具有大孔结构、优异机械性能、促进细胞迁移并促进骨软骨组织再生的基于明胶衍生物的冷冻大孔凝胶。明胶与UPY同时具有物理交联和化学交联,Gel-UPY与Gel-MA通过光引发交联制备冷冻大孔凝胶,在得到良好的力学性能的同时可以有效促进组织细胞的迁入,促进骨软骨组织再生,在骨软骨缺损再生领域具有广阔的应用前景。应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:由以下步骤组成,
步骤1,合成侧链接枝甲基丙烯酰基团的Gel-MA:将明胶溶解,调节pH值,滴加甲基丙烯酸酐进行反应,终止反应后,将产物加入到冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,透析,冻干,得到Gel-MA;
步骤2,合成侧链接枝酰脲基嘧啶酮基团的Gel-UPY:将六亚甲基二异氰酸酯和2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中,惰性气体保护下冷凝回流反应,沉淀产物,减压抽滤,将得到的滤饼真空干燥得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮;惰性气体保护下将明胶溶解,得到明胶溶液,将所述2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶解得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液,将所述2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液加入到所述明胶溶液中,在室温下反应,将所得产物在异丙醇中沉淀离心,将离心后产物溶解,透析,冻干,得到Gel-UPY;
步骤3,将Gel-MA、Gel-UPY以及苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂依次溶解在水中配制为成胶溶液,其中,所述Gel-MA的质量分数为4~6%、所述Gel-UPY的质量分数为4~6%、所述苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂的质量分数为0.5~1 ‰,将所述成胶溶液置于冰箱中放置1~2 h后,从冰箱取出置于紫外灯下光照30~90秒,将得到的凝胶置于37 ℃中,得到冷冻大孔凝胶。
2.根据权利要求1所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤1中,所述将明胶溶解,为将明胶溶解在磷酸盐缓冲液中,70℃加热搅拌溶解,所述明胶的质量体积分数以g:mL计为10 % 。
3.根据权利要求1或2所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤1中,所述调节pH值,为45 ℃下用NaOH调节溶液pH为8.0。
4.根据权利要求1或2所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤1中,所述滴加甲基丙烯酸酐进行反应,为滴加400 μL甲基丙烯酸酐反应1小时;所述终止反应,为加入40 mL的磷酸盐缓冲液终止反应。
5.根据权利要求1或2所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤1中,所述将产物加入到冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,透析,为加入到500 mL经过-20 ℃预冷的冰乙醇中沉淀、离心,将离心后的产物溶解在水中,在3500Da的透析袋中透析。
6.根据权利要求1或2所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤2中,将18 g六亚甲基二异氰酸酯和2 g 2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶加入到反应瓶中,在100 ℃、氮气保护下冷凝回流反应15小时后冷却至室温得到产物,使用正戊烷沉淀产物,减压抽滤后,将滤饼在50 ℃下真空干燥得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮。
7.根据权利要求6所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤2中,在氮气保护、60 ℃搅拌条件下将2 g明胶溶于25 mL的无水二甲亚砜中,使明胶完全溶解得到明胶溶液,冷却至室温。
8.根据权利要求7所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤2中,将0.1 g 2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶解在5 mL无水DMSO中得到2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液,逐滴将2(6-异氰酸酯六亚甲基碳酰胺)-6-甲基-4[1H]嘧啶酮溶液加入到明胶溶液中,在室温下反应24小时,反应结束后将所得产物在异丙醇中沉淀离心,将离心后产物溶解在去离子水中,在3500 Da的透析袋中透析,冻干后得到产物Gel-UPY。
9.根据权利要求1或2所述的基于明胶衍生物冷冻大孔凝胶的制备方法,其特征在于:步骤3中,将Gel-MA、Gel-UPY以及苯基-2 ,4 ,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂依次溶解在水中,分别按6 %、4 %和0.5 ‰的质量分数配制为成胶溶液,将成胶溶液置于-20 ℃的冰箱中放置1小时,从冰箱取出迅速置于紫外灯下光照60秒,置于37 ℃中得到冷冻大孔凝胶。
10.权利要求1制备得到的冷冻大孔凝胶在制备促进骨软骨缺损再生、促进组织细胞迁移的无细胞水凝胶支架中的应用。
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