CN115845146A - 一种生物墨水的制备方法、细胞支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物墨水的制备方法，S1:将乙醇滴加到丝素蛋白溶液中，搅拌均匀后冷藏，解冻后进行离心干燥得到丝素蛋白微球；S2:将白藜芦醇溶解于乙醇溶液中，再将丝素蛋白微球置于混合溶液中，密封避光搅拌后离心干燥，得到载药微球；S3:将明胶、海藻酸钠和载药微球用梯度加热法混合均匀，再与含ATDC‑5细胞的细胞悬液混合得到生物墨水。本发明生物墨水的制备方法所制备的生物墨水具有良好的剪切变稀特性和可塑性，能够保证细胞支架打印过程中支架成型良好，同时减少对细胞的损伤。本发明还公开了一种细胞支架的制备方法，采用上述生物墨水为原料，通过3D打印的方式，打印出细胞支架，这种细胞支架具有药物缓释性好、空隙率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于医用可降解材料制备技术领域，特别涉及一种生物墨水的制备方法、细胞支架的制备方法。
背景技术
在我国70岁以上老人中约有80％患有骨关节炎，如何有效治疗骨关节炎至今仍是一件非常棘手的问题。临床中常见的治疗手段有微骨折法和自体细胞移植术，都在一定程度上起到了缓解病症的作用，但不能完全代替天然软骨。软骨组织工程技术着眼于将损伤后的软骨恢复到其天然状态，将由生物材料、细胞和生长因子组合形成的三维立体支架植入软骨缺损处，引导缺损部位软骨组织重新生长。因此，生物墨水除了应具备良好的可塑性外，还应该起到在支架打印过程中保护细胞的作用。由生物墨水打印的组织工程支架应当复合天然软骨特性的力学性以及可控的尺寸大小，支架的降解速率应该与软骨组织的生长速率呈负相关。并且，支架作为细胞和其他生物活性因子的载体，还需要具有良好的生物相容性和互相连通的内部孔隙结构。
目前，公开号为CN 107744602 A的专利文献公开了一种可用于3D打印的生物墨水材料的制备方法，所述制备方法主要包括改性海藻酸钠的制备及生物墨水材料的制备。所述的一种可用于3D打印的生物墨水材料的制备方法由活性细胞，细胞培养基，光引发剂，改性海藻酸钠及抗氧化酶组成。此生物材料与活性细胞具有良好的生物相容性，可实现活性打印。但是，所这种制备方法制备的生物墨水同时具有药物突释、剪切变稀特性差等问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种生物墨水的制备方法，使制备的生物墨水具有良好的剪切变稀特性和可塑性；本发明同时提供了细胞支架的制备方法，此方法制备的细胞支架具有药物缓释性好、空隙率高的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
S1:将乙醇滴加到丝素蛋白溶液中，搅拌均匀后将混合物冷藏，解冻后进行离心、干燥得到丝素蛋白微球；
S2:将白藜芦醇溶解于乙醇溶液中，再将步骤S1中得到的丝素蛋白微球置于白藜芦醇与乙醇的混合溶液中，密封避光搅拌，搅拌完成后离心、干燥，得到载药微球；
S3:将明胶、海藻酸钠和步骤S2中得到的载药微球用梯度加热法混合均匀，再将混合液与含ATDC-5细胞的细胞悬液混合得到生物墨水。
进一步优选，步骤S1中所述的冷藏温度为﹣20℃，冷藏时间为24h；步骤S1中的温度条件为37℃，搅拌时间为24h，
进一步优选，步骤S1中所述的丝素蛋白溶液体积浓度为4.5％～5.5％，乙醇溶液与丝素蛋白溶液的体积比为1∶5～1∶9，乙醇溶液体积浓度大于99.8％。
进一步优选，所述丝素蛋白溶液的配制方法包括以下步骤：
S11:将蚕壳剪碎投入到质量浓度为0.05％的Na2CO3溶液中，加热煮沸后，得到丝素纤维；
S12:将丝素纤维用去离子水搓洗，烘干；
S13:将干燥完成的丝素纤维放入9mol/L的溴化锂溶液中，使丝素纤维完全溶解后，得到溶解液；
S14:将溶解液加入透析袋中，在去离子水中透析；
S15:将透析完成后的液体离心，去除不溶杂质，得到丝素蛋白溶液。
进一步优选，步骤S11中沸腾时间60～90min；步骤S12中搓洗5～6次，将杂质洗净，烘干温度为60℃，烘干时间为24h；步骤13中的温度条件为60℃；步骤S14中透析袋的规格为截留分子量12KD，透析时间为72h，透析期间每隔3h换一次去离子水。
进一步优选，步骤S2中所述的乙醇溶液体积为1～1.5ml、白藜芦醇质量为2～5mg、丝素蛋白微球质量为16～25mg、搅拌转速为80～160rmp、乙醇溶液的体积浓度大于99.8％。
进一步优选，步骤S3中所述的梯度加热法包括以下步骤：
S31:在去离子水中加入明胶，搅拌；
S32:搅拌完成后冷却，加入海藻酸钠和的去离子水，搅拌；
S33:搅拌完成后冷却，加入去离子水、载药微球超声混合均匀；
S34:将混合完成的液体加入试管中，温搅拌，搅拌完成后冷却至室温。
进一步优选，步骤S31中的搅拌温度为80℃，搅拌时间为1h；步骤S32中的冷却温度为室温，搅拌温度为80℃，搅拌时间为1h；步骤S34中的试管用去2ml离子水洗净，以保证材料浓度不变，搅拌温度为40℃，搅拌时间为1h。
进一步优选，所述的明胶质量浓度为6.67％～8.88％，海藻酸钠质量浓度为3.33％～5.62％，载药微球质量浓度为0.33％～0.67％。
进一步优选，步骤S3中所述的明胶、海藻酸钠和载药微球按照原浓度两倍混合，将明胶、海藻酸钠和载药微球的混合液与ATDC-5细胞悬液以1∶1的体积比混合，制得生物墨水。
进一步优选，所述的ATDC-5细胞悬液通过细胞培养、胰蛋白酶脱壁、稀释后得到。
进一步优选，所述的ATDC-5细胞悬液的细胞密度为2×106kg/m3。
一种细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
S01:采用如权利要求1-8任一项所述生物墨水的制备方法所制备的生物墨水为原料；
S02:在计算机中构建模型，通过3D打印，在无菌的条件下打印出细胞支架。
进一步优选，所述的3D打印参数为：轮廓的填充速度10～15mm/s，喷头跳转速度60～70mm/s，挤料速度0.26～0.37mm/s，成型室温24～28℃。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本发明生物墨水的制备方法所制备的生物墨水具有良好的剪切变稀特性和可塑性，能够在细胞支架打印过程中保证支架成型良好的同时，减少对细胞的损伤。
2、本发明细胞支架的制备方法采用上述生物墨水为原料，结合3D打印的方式制备细胞支架，这种细胞支架具有药物缓释性好、空隙率高的优点。
附图说明
图1是丝素蛋白微球的SEM图；
图2是丝素蛋白微球、白藜芦醇、载药微球的傅里叶红外光谱图；
图3是优选实施例生物墨水粘度随剪切速率对数变化的流变特性曲线图；
图4是优选实施例细胞支架俯视图；
图5是优选实施例细胞支架的表面图；
图6是优选实施例细胞支架的截面SEM图；
图7是优选实施例细胞支架的应力-应变曲线图；
图8是优选实施例细胞支架的降解率示意图；
图9是优选实施例细胞支架的溶胀性示意图；
图10是优选实施例细胞支架的药物累计释放量随时间变化趋势图；
图11是与优选实施例细胞支架共培养下和普通培养下的细胞吸光度对比图；
图12是载细胞支架3天、5天、7天时的染色图。
具体实施方式
以下结合优选实施例并配合附图对本发明作详细说明。
一种优选实施例生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
S1:在烧杯中加入丝素蛋白溶液，将乙醇溶液滴加到烧杯中，搅拌均匀后将混合物置于﹣20℃的条件下冷藏，24h后取出，解冻、离心、干燥后得到丝素蛋白微球；
S2:将白藜芦醇溶解于乙醇溶液中，再将步骤S1中得到的丝素蛋白微球置于混合溶液中，温度37℃的条件下密封避光搅拌，24h后停止搅拌，离心、干燥后得到载药微球；
S3:将明胶、海藻酸钠和步骤S2中得到的载药微球用梯度加热法以原浓度两倍质量混合均匀，将明胶、海藻酸钠和载药微球混合液与细胞密度为2×106的ATDC-5细胞悬液以1∶1的体积比混合，得到生物墨水。
步骤S1中丝素蛋白溶液的配置方法如下：
S11:将蚕壳剪碎投入到质量浓度为0.05％的Na2CO3溶液中，加热煮沸后保持沸腾60～90min，得到丝素纤维；
S12:将丝素纤维用去离子水搓洗5～6次后，置于温度为60℃的烘干箱中干燥24h；
S13:将干燥完成的丝素纤维放入9mol/L的溴化锂溶液中，温度60℃的条件下使丝素纤维完全溶解，得到溶解液；
S14:将溶解液加入截留分子量为12KD的透析袋中，在去离子水中透析72h，透析期间每隔3h更换一次去离子水；
S15:将透析完成后的液体加入离心管中，离心去除不溶杂质，得到丝素蛋白溶液，4℃保存备用。
步骤S1中的丝素蛋白微球的具体制备方法如下：
S111:取10ml上述丝素蛋白溶液，转速为160～240r/min的条件下均匀搅拌，同时缓慢滴加2ml乙醇；
S112:将搅拌好的溶液在室温下静置3～5min，再将溶液放置于温度﹣20℃的条件下冷藏24h；
S113:将冷藏后凝固的溶液放置于室温下自然融化，融化后得到淡蓝色悬浮液；
S114:将淡蓝色悬浮液在转速10000r/min的条件下离心15min后，冷冻干燥24h得到干燥稳定的丝素蛋白微球备用。
步骤S2中载药微球的具体制备方法如下：
S21:将5mg白藜芦醇加入在1ml乙醇溶液中，完全溶解后加入16mg丝素蛋白微球，混合均匀得到混合液；
S22:将混合液于转速80r/min、密封避光的条件下孵育24h；
S23:将步骤S22中的产物在转速12000r/min的条件下离心，并加入乙醇洗去未被封包的丝素蛋白微球，冷冻干燥备用。
S3中的梯度加热法包括以下步骤：
S31:在15ml去离子水中加入4g明胶，温度80℃的条件下搅拌1h；
S32:搅拌完成后，冷却至室温，加入2g海藻酸钠和10ml的去离子水，温度60℃的条件下搅拌1h；
S33:搅拌完成后，冷却至室温，加入3ml去离子水、0.2g载药微球超声混合均匀；
S34:将混合完成的液体加入用2ml去离子水洗净的试管中，温度40℃的条件下搅拌1h，搅拌完成后冷却至室温，得到混合液；
S35:将混合液与细胞密度为2×106的ATDC-5细胞悬液以1∶1的体积比混合。
一种优选实施例细胞支架的制备方法：
S01:采用上述生物墨水为原料；
S02:在Soildworks中绘制出支架的三维结构，并以STL文件格式导出，将导出文件导入到Aurora中对三维结构进行切片分层，并以CLI格式导出，再将所得文件导入到控制执行软件Cark中，并设定执行参数。
执行参数为：喷头25G，轮廓、填充速度为10mm/s，喷头跳转速度为60mm/s，挤料速度为0.26mm/s，成型室温为10℃。在无菌的条件下打印细胞支架。
性能测试试验
上述制备得到的丝素蛋白微球和载药微球表征；
如图1所示，使用扫描电子显微镜(Sigma-300，德国Zeiss公司)对丝素蛋白微球进行形貌观察，确认其成球良好。
使用傅里叶红外光谱仪(Nicolet-is20，美国Thermo公司)分别测量丝素蛋白微球、白藜芦醇和载药微球的红外光谱，确认白藜芦醇成功嵌入进了丝素蛋白微球，如图2所示。
上述制备得到的生物墨水性能表征：
使用流变仪(HAAKE Mars-40，美国Thermo公司)，选用直径为50mm的平行板，对生物墨水进行对数剪切速率扫描。如图3所示，在剪切速率为0.1～1000(s-1)的范围内，测量温度为24℃条件下对样品旋转模式的动力学粘度进行检测，确认该生物墨水在具有可塑性的同时具有优秀的剪切变稀特性，能够在打印过程中给细胞提供足够的保护。
上述制备得到的细胞支架性能表征：
使用扫描电镜对支架的表面和截面结构进行形貌观察。如图5和图6所示，可见支架表面突出的微球结构，支架内部有明显的孔隙结构，适合细胞的黏附和生长。
使用电子万能试验机将支架垂直压缩90％，通过其应力-应变曲线来计算各组支架湿态下的杨氏模量，如图7所示，可见该支架力学性能达到了软骨组织力学性能要求。
通过测量各组支架在磷酸盐缓冲溶液中浸泡不同时间重量的变化来计算其溶胀率。如图9所示，可见该支架具有优秀的吸收能利，能够及时的为细胞生长提供营养物质。
将支架置于磷酸盐缓冲溶液中，并在37℃、二氧化碳浓度为5％的恒温细胞培养箱中进行培养，通过分析不同时间段干燥后支架的质量以及磷酸盐缓冲溶液中白藜芦醇的含量，并结合白藜芦醇在磷酸盐缓冲溶液中的紫外光吸收拟合直线分别计算支架的体外降解率和药物释放性能。如图8和图10所示，可见该支架降解速度是可以与细胞生长和软骨组织修复的速率相匹配的，微球支架的结构有效缓解了因水凝胶降解导致的白藜芦醇爆释问题，延长了其在软骨修复中的作用时间。
上述制备得到的生物支架细胞毒性测试：
如图11所示，图中的#和*表示显著性，使用CCK-8对载细胞的生物支架进行细胞活性测试，可见该支架并为对细胞生长产生抑制作用，并且提高了细胞活性。
使用活/死染色剂对载细胞生物支架进行荧光染色，观察3天、5天、7天时的情况，如图12所示，可见该支架利于细胞的贴壁生长。
上述的实施方式仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施方式做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:将乙醇滴加到丝素蛋白溶液中，搅拌均匀后将混合物冷藏，解冻后进行离心、干燥，得到丝素蛋白微球；
S2:将白藜芦醇溶解于乙醇溶液中，再将步骤S1中的丝素蛋白微球置于白藜芦醇与乙醇的混合溶液中，密封避光搅拌，搅拌完成后离心、干燥，得到载药微球；
S3:将明胶、海藻酸钠和步骤S2中得到的载药微球用梯度加热法混合均匀，再将混合液与含ATDC-5细胞的细胞悬液混合得到生物墨水。
2.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的丝素蛋白溶液体积浓度为4.5％～5.5％，乙醇溶液与丝素蛋白溶液的体积比为1∶5～1∶9，乙醇溶液体积浓度大于99.8％。
3.根据权利要求1或2所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的配制方法包括以下步骤：
S11:将蚕壳剪碎投入到质量浓度为0.05％的Na2CO3溶液中，加热煮沸后，得到丝素纤维；
S12:将丝素纤维用去离子水搓洗，干燥；
S13:将干燥完成的丝素纤维放入9mol/L的溴化锂溶液中，丝素纤维完全溶解后，得到溶解液；
S14:将溶解液加入透析袋中，在去离子水中透析；
S15:将透析完成后的液体离心，去除不溶杂质，得到丝素蛋白溶液。
4.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的乙醇溶液体积为1～1.5ml、白藜芦醇质量为2～5mg、丝素蛋白微球质量为16～25mg、搅拌转速为80～160rmp、乙醇溶液的体积浓度大于99.8％。
5.根据权利要求1或2或4所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的梯度加热法包括以下步骤：
S31:在去离子水中加入明胶，搅拌；
S32:搅拌完成后冷却＝，加入海藻酸钠和的去离子水，搅拌；
S33:搅拌完成后冷却，加入去离子水、载药微球超声混合均匀；
S34:将混合完成的液体加入离心管中，搅拌后冷却至室温。
6.根据权利要求5所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述的明胶质量浓度为6.67％～8.88％，海藻酸钠质量浓度为3.33％～5.62％，载药微球质量浓度为0.33％～0.67％。
7.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的明胶、海藻酸钠和载药微球按照梯度加热法所述浓度的两倍混合，将明胶、海藻酸钠和载药微球的混合液与ATDC-5细胞悬液以1∶1的体积比混合，制得生物墨水。
8.根据权利要求7所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述的ATDC-5细胞悬液的细胞密度为2×106kg/m3。
9.一种细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01:采用如权利要求1-8任一项所述生物墨水的制备方法所制备的生物墨水为原料；
S02:在计算机中构建模型，通过3D打印，在无菌的条件下打印出细胞支架。
10.根据权利要求9所述的细胞支架的制备方法，其特征在于，所述的3D打印参数为：轮廓的填充速度10～15mm/s，喷头跳转速度60～70mm/s，挤料速度0.26～0.37mm/s，成型室温24～28℃。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106176281A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 西安艾尔菲生物科技有限公司 | 载活性成分的丝素蛋白/ha复合微球冻干粉及制备和应用 |
| CN106215245A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-14 | 青岛三帝生物科技有限公司 | 基于3d打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管 |
| CN106729982A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 浙江大学 | 一种丝素蛋白纳米球的制备方法 |
| CN108578373A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-09-28 | 安徽大学 | 一种利福平负载丝素蛋白纳米微球的制备方法 |
| CN110124105A (zh) * | 2019-04-15 | 2019-08-16 | 杭州电子科技大学 | 可调控凝胶-溶胶相变温度的生物3d打印墨水制备方法 |
| CN110256693A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-09-20 | 杭州电子科技大学 | 一种高韧性丝素蛋白凝胶的制备方法 |
| CN110639060A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-03 | 西安工程大学 | 一种3d生物打印丝素蛋白基组织工程支架及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-11-29 CN CN202211520760.6A patent/CN115845146A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106215245A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-14 | 青岛三帝生物科技有限公司 | 基于3d打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管 |
| CN106176281A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-12-07 | 西安艾尔菲生物科技有限公司 | 载活性成分的丝素蛋白/ha复合微球冻干粉及制备和应用 |
| CN106729982A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 浙江大学 | 一种丝素蛋白纳米球的制备方法 |
| CN108578373A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-09-28 | 安徽大学 | 一种利福平负载丝素蛋白纳米微球的制备方法 |
| CN110124105A (zh) * | 2019-04-15 | 2019-08-16 | 杭州电子科技大学 | 可调控凝胶-溶胶相变温度的生物3d打印墨水制备方法 |
| CN110256693A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-09-20 | 杭州电子科技大学 | 一种高韧性丝素蛋白凝胶的制备方法 |
| CN110639060A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-03 | 西安工程大学 | 一种3d生物打印丝素蛋白基组织工程支架及其制备方法和应用 |
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