PT2211876E

PT2211876E - Método de gelificação de fibroína de seda utilizando sonicação

Info

Publication number: PT2211876E
Application number: PT87564324T
Authority: PT
Original assignee: Tufts College
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2015-01-14
Also published as: US9254333B2; EA200971116A1; EA019118B1; US20140303346A1; DK2211876T3; CA2688431A1; JP6091540B2; US8187616B2; IL202354A; SI2211876T1; IL202354A0; CY1116090T1; HK1201470A1; CN101772348B; AU2008260156A1; US20150258199A1; US20130060008A1; KR101839659B1; EP2211876A4; MX2009012978A

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE GELIFICAÇÃO DE FIBROÍNA DE SEDA UTILIZANDO SONICAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona métodos para obtenção de gelificação rápida de fibroina de seda através de ultrassonicação. Os hidrogeles formados a partir do método são úteis, por exemplo, como veículos de bioadministração.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Hidrogeles de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis são veículos úteis para administrar moléculas bioactivas e células para aplicações biomédicas, como em engenharia de tecidos e na libertação controlada de fár- macos.

A fibroina de seda nativa purificada forma estruturas de hidrogel reticuladas ricas em folhas b a partir de soluções aquosas, com os pormenores do processo e propriedades do gel influenciadas por parâmetros ambientais. Os tempos de gelificação anteriores muitas vezes levavam dias ou semanas para soluções aquosas da proteína da seda nativa, com alta temperatura e baixo pH responsáveis por aumentar a cinética da gelificação. Estas condições, embora adequadas para incorporação de algumas moléculas bioactivas, podem ser excessivamente lentas para a incorporação de células activas e moléculas bioativas lábeis.

Assim, há necessidade na arte de um processo de obtenção de gelificação rápida de fibroina de seda em condições fisiológicas suaves.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a um processo de obtenção de gelificação rápida de fibroina de seda. 0 processo expõe fibroina de seda a um tratamento compreendendo ultras-sonicação durante um período de tempo suficiente para iniciar a gelificação. Por exemplo, em condições específicas a gelificação ocorre dentro de 24 horas após o tratamento de ultrassonicação.

Uma forma de realização da invenção também se refere a um método para controlar o tempo de gelificação da fibroina de seda fazendo contactar uma solução de fibroina de seda com um tratamento por ultrassonicação durante um período de tempo suficiente para iniciar a gelificação. Num exemplo, o tempo de gelificação é inferior a duas horas.

Outra forma de realização relaciona-se com um método de encapsulação de um agente em fibroina de seda. 0 método compreende a exposição de uma solução de fibroina de seda a um tratamento de ultrassonicação durante um período de tempo para iniciar a gelificação, e a introdução do agente na solução de fibroina de seda antes que ocorra gelificação substancial na solução de fibroina de seda, formando assim um agente encapsulado ewm fibroina de seda. Alternativamente, o agente pode ser adicionado a fibroina de seda antes da sonicação. 0 agente pode ser um agente terapêutico, como um fármaco, ou um material biológico, como uma célula. Por exemplo, células estaminais mesenquimatosas humanas derivadas de medula óssea humana (hMSCs) foram incorporadas com êxito em hidrogeles de fibroina de seda após sonicação, seguida por gelificação rápida e a função sustentada das células.

Os hidrogeles resultantes dos métodos da invenção apresentam simultaneamente boas propriedades mecânicas e bons perfis de degradação proteolítica. Por exemplo, soluções de fibroina de seda sonicadas a 4%, 8% e 12% (p/v), seguidas por adição de hMSCs, gelificaram dentro de 0,5 horas a 2 horas. As células cresceram e proliferaram nos geles a 4% ao longo de vinte e um dias. Adicionalmente, podem ser utilizadas baixas concentrações de K+ e baixo pH para promover a gelificação.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra a gelificação de fibroina de seda (SF) em várias condições de sonicação. Utilizou-se 0,5 mL de solução aquosa, a sonicação foi realizada a 20% de amplitude e o tempo variou de 5 segundos a 30 segundos. Os valores são média ± desvio padrão de um mínimo de N = 3 amostras para cada grupo. * Diferenças significativas entre os grupos (teste t de Student, p <0,01).

As Figuras 2A-2C ilustram a formação dinâmica da estrutura em folha β durante o processo de gelificação. A Fig. 2A mostra as determinações de Dicroísmo Circular (CD) em soluções aquosas de fibroína de seda a 2% (p/v) sonicadas com varrimentos de comprimento de onda tomados de 8 em 8 minutos após sonicação durante 120 min. A Fig. 2B mostra um gráfico do aumento de elipticidade a 217 nm (pico da estrutura em folha β) registados em função do tempo. A Fig. 2C é uma ilustração esquemática do mecanismo de gelificação da seda. O processo de gelificação contém dois passos cinéticos (a) alteração estrutural da espiral aleatória para folha β com algumas reticulações físicas inter-cadeias que ocorrem num horizonte temporal curto; (b) estrutura em folha β estendida, grande quantidade de reticulações intercadeias de folhas β formadas e as moléculas organizadas numa rede de gel durante um horizonte temporal relativamente longo.

As Figuras 3A-3C mostram os efeitos de sais e do pH na gelificação de fibroína de seda. Antes da sonicação, soluções com várias concentrações foram suplementadas com K+ (Fig.3A) e Ca2+ (Fig.3B) até concentrações finais de 20mM-200 mM. A Fig. 3C mostra os efeitos do ajustamento do pH da solução aquosa de fibroína de seda antes da sonicação. A sonicação foi realizada a 20% de amplitude durante 15 segundos para todas as amostras. Os valores são a média ± desvio padrão de um mínimo de N = 3 amostras para cada grupo. * Diferenças significativas entre os grupos (teste t de Student, p <0,05).

As Figuras 4A-4C apresentam gráficos de análise das propriedades mecânicas dos hidrogeles de fibroína de seda. A Figura 4A ilustra a tensão de cedência (kPa) de geles de fibroína de seda (eixo dos y) em várias concentrações, 4%, 8% e 12% (eixo dos x) em condições de 30 Amp, 40 Amp ou 50 Amp. A Figura 4B ilustra o módulo elástico tradicional (kPa) de geles de fibroína de seda (eixo dos y) em várias concentrações, 4%, 8% e 12% (eixos dos x) em condições de 30 Amp, 40 Amp ou 50 Amp. A Figura 4C ilustra o módulo de equilíbrio (kPa) de geles de fibroína de seda (eixos dos y) em várias concentrações, 4%, 8% e 12% (eixo dos x). A Figura 5 ilustra a degradação enzimática de hidrogeles de fibroína de seda. Foram preparados hidrogeles a 4%, 8% e 12% (p/v) por sonicação e imersos em PBS, pH 7,4 (controlo) ou protease XIV em PBS (5 U/mL) durante sete dias. A massa remanescente foi determinada por comparação do peso húmido de provetes de gel em cada ponto de tempo com o peso húmido original. Os valores são a média ± desvio padrão de um mínimo de N = 4 amostras. A Figura 6 ilustra graficamente a quantificação do DNA de hMSCs encapsuladas em hidrogeles de fibroina de seda. 0 teor de DNA em cada grupo de geles foi analisado com o doseamento PicoGreen, e os resultados foram normalizados pelo peso húmido de cada provete de gel. Os valores são a média ± desvio padrão de um minimo de N = 4 amostras. * Diferenças significativas entre os grupos (teste t de Student, p <0,05).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Deve entender-se que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, e reagentes, etc. específicos aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia aqui utilizada é para efeitos de descrever só formas de realização específicas, e não pretende limitar o âmbito da presente invenção, que é definido somente pelas reivindicações.

Tal como aqui utilizado e nas reivindicações, as formas singulares incluem a referência ao plural e vice versa, salvo se o contexto indicar claramente o contrário. Excepto nos exemplos de aplicação, ou onde indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições reaccionais aqui utilizados devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de".

Todas as patentes e outras publicações identifi- cadas são aqui expressamente dadas como incorporadas por citação com a finalidade de descrever e revelar, por exemplo, as metodologias descritas nessas publicações que podem ser utilizadas em ligação com a presente invenção. Estas publicações são proporcionadas somente pela sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar essa divulgação em virtude da invenção anterior ou por qualquer outra razão. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo destes documentos baseiam-se na informação disponível aos requerentes e não constitui qualquer admissão quanto à exactidão das datas ou conteúdo destes documentos.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que os habitualmente entendidos por uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria à qual respeita esta invenção. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais conhecidos possam ser utilizados na prática ou no teste da invenção, são aqui descritos os métodos, dispositivos e materiais a este respeito.

Esta invenção refere-se a um processo de obtenção de gelificação rápida de fibroína de seda. 0 processo expõe a fibroína de seda a um tratamento compreendendo ultrassonicação durante um período de tempo suficiente para iniciar a gelificação. Esta abordagem proporciona métodos baseados em ultrassonicação utilizados para acelerar a transição sol-gel de um modo temporalmente controlável. 0 tempo de gelificação pode ser controlado de minutos a horas com base nos parâmetros de sonicação utilizados (potência de salda, tempo de duração e outros) e concentração de fibroina de seda dentro de condições fisiologicamente relevantes. Após a sonicação, a fibroina de seda sofre uma alteração estrutural rápida de espiral aleatória para folha β, correspondente à gelificação. Pode adicionar-se um agente, por exemplo um agente terapêutico ou um agente biológico, antes, durante ou depois do tratamento de sonicação, que fica encapsulado por gelificação. A presente invenção proporciona assim métodos úteis para várias aplicações biomédicas, como aquelas em que o encapsulamento de células é sensível ao tempo.

Os hidrogeles são considerados estruturas úteis para o encapsulamento e administração de células e moléculas bioactivas, como para engenharia de tecidos e aplicações terapêuticas de células, devido ao seu elevado teor de água, normalmente >30% (Park & Lakes, Biomats: Intro (2nd ed., Plenum Press, NY, 1992). Os hidrogeles utilizados nestes tipos de aplicações têm propriedades mecânicas e estruturais semelhantes a alguns tecidos e matrizes extracelulares (ECM), portanto, podem ser implantados para a restauração de tecidos ou libertação local de factores terapêuticos. Para encapsular e administrar células, os hidrogeles devem, preferencialmente, ser formados sem danificar as células, ser não tóxicos para as células e os tecidos circundantes, ser biocompativeis, ter a capacidade de transporte de massa adequado para permitir a difusão de nutrientes e metabolitos, ter uma integridade mecânica e resistência suficientes para resistir a manipulações associadas à implantação, ter tempos de vida controláveis, e deve manter o volume de gel após a implantação durante um período de tempo razoável dependendo da aplicação (Drury & Mooney, 24 Biomats. 4337-51 (2003).

Uma variedade de materiais sintéticos, como poli(óxido de etileno) (PEO), poli(álcool vinílico) (PVA), poli (ácido acrílico) (PAA), poli(fumarato de propileno-co-etilenoglicol) (P (PF-co-EG)) e materiais de origem natural, como agarose, alginato, quitosano, colagénio, fibrina, gelatina e ácido hialurónico (HA) tem sido utilizada para formar hidrogeles. A gelificação ocorre quando as cadeias de polímero se reticulam quimicamente ou fisicamente em redes, desencadeadas por reagentes químicos (e.g., agentes reticulantes) ou estimulantes físicos (e.g., pH e/ou temperatura). Os hidrogeles formados a partir de polímeros sintéticos oferecem a vantagem de gelificação e propriedades de gel que são controláveis e reprodutíveis, através da utilização de pesos moleculares específicos, estruturas de blocos e modos de reticulação. Genericamente, a gelificação de polímeros de origem natural é menos controlável, embora tendam a ser úteis como veículos de células e moléculas bioactivas para engenharia de tecidos e dispositivos médicos implantáveis porque as suas propriedades macromo-leculares estão mais alinhadas de perto com a matriz extracelular e os produtos de degradação são não tóxicos (Lee et al., 221 Int'1 J. Pharma. 1-22 (2001); Smidsrod et al., 8 Trends Biotech. 71-78 (1990).

Entre os biomateriais de origem natural, a proteína fibroina de seda, a proteína estrutural de auto-agregação em fibras naturais do bicho da seda, tem sido estudada devido às suas excelentes propriedades mecânicas, biocompatibilidade, velocidades de degradação controláveis e formação indutivel de redes de estruturas em folhas β cristalinas (Altman et al., 24 Biomats. 401-16 (2003); Jin & Kaplan, Nature 424 1057-1061 (2003); Horan et al., 26

Biomats. 3385-93 (2005); Kim et al., 26 Biomats. 2775-85 (2005); Ishida et al., 23 Macromolecules 88-94 (1990);

Nazarov et al., 5 Biomacromolecules 718-26 (2004)). A fibroina de seda foi fabricada em vários formatos de materiais, incluindo películas, estruturas porosas tridimensionais, fibras electrofiadas e microesferas para engenharia de tecidos e aplicações de libertação controlada de fármacos (Jin et al., 5 Biomacromolecules 711-7 (2004);

Jin et al., 3 Biomacromolecules, 1233-1239 (2002); Hino et al., 266 J. Colloid Interface Sei. 68-73 (2003); Wang et al., 117 J. Control Release, 360-70 (2007)). Ver também pedidos de patente U.S. N2 de Série 11/020650; N2 10/541182; N2 11/407373; e N° 11/664234; BCT/US07/020789; PCT/US08/ 55072.

Na natureza, a solução aquosa de fibroina de seda é produzida na secção posterior da glândula do bicho-da- seda e depois armazenada na secção média numa concentração de até 30% (p/v) e contém um elevado teor de estrutura em espiral aleatória ou hélice alfa. Durante a fiação de fibras no ar, a força de cisalhamento elevada e o fluxo de alongamento induzem a auto-agregação e uma transição estrutural para a estrutura em folha β, conduzindo à formação de fibras sólidas (Vollrath & Knight, 410 Nature, 541-48 (2001)). A presença de iões metálicos e mudanças de pH em diferentes secções da glândula influenciam esta transição (Chen et al., 3 Biomacromolecules 644-8 (2002); Zhou et al., 109 J. Phys. Chem. B, 16937-45 (2005); Dicko et al., 5 Biomacromolecules 704-10 (2004); Terry et al., 5 Biomacromolecules 768-72 (2004)). In vitro, soluções aquosas de fibroina de seda purificada sofrem auto-agregação em estruturas em folhas β e formam hidrogeles. Esta transição sol-gel é influenciada pela temperatura, pH e força iónica (Wang et al., 36 Int'1 J. Biol. Macromol. 66-70 (2005); Kim et al., 5 Biomacromolecules 786-92 (2004); Matsumoto et al., 110 J. Phys. Chem. B 21630-38 (2006)) . A resistência à compressão e o módulo de hidrogeles de seda aumenta com um aumento da concentração de fibroina de seda e da temperatura (Kim et al., 2004) .

Os hidrogeles de fibroina de seda têm interesse para muitas aplicações biomédicas. Por exemplo, os hidrogeles de fibroina foram utilizados como biomaterial de enchimento ósseo para curar defeitos esponjosos de tamanho critico em fémures distais de coelho, em que os geles de seda apresentaram melhor cura óssea do que o material de controlo poli (D,L lactido-glicolido) (Fini et al., 26

Biomats. 3527-36 (2005)).

Para muitas aplicações à base de células, a gelificação tem de ser induzida em condições suaves num período de tempo relativamente curto (dentro de horas). Contudo, o tempo de gelificação da seda pode ser proibitivamente longo, salvo se forem considerados tratamentos não fisiológicos (como pH baixo, temperatura elevada, aditivos) na ausência de modificações químicas da proteína fibroína de seda nativa. Para concentrações de fibroína de seda de 0,6% a 15% (p/v), foram necessários dias a semanas para a transição sol-gel à temperatura ambiente ou a 37°C (Kim et al., 2004; Matsumoto et al., 2006; Fini et al., 2005)). A adição de sais em concentrações acima dos níveis fisiológicos não altera significativamente a cinética de gelificação (Kim et al., 2004) . O abaixamento do pH (pH <5) ou o aumento da temperatura (> 60°C) poderia reduzir o tempo de gelificação para poucas horas (Kim et al., 2004; Fini et al., 2005; Motta et al., 15 J. Biomater. Sei. Polymer. Edu. 851-64 (2004)), mas estas condições podem potencialmente alterar a função das células e afectar a viabilidade celular.

Na presente invenção, novos métodos para acelerar o processo e controlar a gelificação de fibroína de seda são realizados através de ultrassonicação. Mais especificamente, é apresentado um novo método baseado em ultrassonicação que acelera a transição sol-gel de um modo temporalmente controlável. Mecanisticamente, o processo induz a reticulação física das folhas β através de alteração da hidratação hidrófoba das cadeias da proteína fibroína. Isto permite adições de células pós-sonicação, seguida por gelificação rápida. 0 tempo de gelificação pode ser controlado desde minutos a horas com base nos parâmetros de sonicação utilizados (potência de saída e tempo de duração) e concentrações de fibroína de seda. 0 método proporciona ainda a manipulação dos efeitos do pH e da concentração de sais sobre a gelificação; as alterações estruturais da seda dinâmicas após a gelificação; e o comportamento de células encapsuladas, como células estaminais mesenquimatosas derivadas de medula óssea humana (hMSCs) em geles de seda.

Qualquer tipo de fibroína de seda pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. A fibroína de seda produzida por bichos da seda, como Bombyx mori, é a mais comum e representa um recurso renovável ecologicamente amigável. Os casulos orgânicos do bicho da seda estão disponíveis comercialmente. Existem muitas sedas diferentes, contudo, incluindo seda de aranha, sedas transgénicas, sedas geneticamente modificadas, e as suas variantes, que podem ser utilizadas alternativamente. Uma solução aquosa de fibroína de seda pode ser preparada a partir dos casulos de bichos da seda utilizando técnicas conhecidas na arte.

Processos adequados para a preparação de solução de fibroína de seda estão descritos, por exemplo, no pedido de patente U.S. N2 de Série 11/247358; WO/2005/012606 e PCT/US07/83605. Por exemplo, a seda utilizada num biopolimero de seda pode ser obtida por extracção de sericina dos casulos de B. mori.

Geralmente ocorre gelificação substancial dentro de vinte e quatro horas após o tratamento por ultras-sonicação. Por exemplo, o gel de fibrolna de seda forma-se menos de quatro horas após o tratamento por ultrasso-nicação, tal como dentro de duas horas após o tratamento por ultrassonicação. Numa forma de realização específica, a fibrolna de seda sofre gelificação num período de tempo que varia de cerca de cinco minutos a cerca de duas horas após o tratamento por ultrassonicação. Assim, dependendo dos requisitos, o tempo de gelificação pode ocorrer desde minutos a horas, com base no tratamento por ultrassonicação utilizado na preparação da solução.

Os tratamentos por ultrassonicação são conhecidos na arte. Para efeitos deste pedido, os termos "ultrassonicação" e "sonicação" são utilizados indiferentemente e têm o mesmo significado. Os tratamentos por ultrassonicação podem ser realizados de qualquer maneira conhecida na arte que aplique ultrassons a fibrolna de seda. 0 tratamento por ultrassonicação pode envolver exposição da fibrolna de seda a sonicação uma vez, ou pode envolver exposições separadas múltiplas. A sonicação foi estudada no contexto das alterações estruturais de proteínas (Meinel et al., 71 J. Biomed. Mater. Res. A 25-34 (2004); Meinel et al., 88 Biotechnol. Bioeng. 379-91 (2004)) e foi utilizada para gerar grandes interfaces líquido-gás, efeitos de aquecimento local, tensões mecânicas/de cisalhamento e reacções de radicais livres. Em contraste, noutros estudos relacionados com a gelificação de péptidos, nanofibras de péptidos agregadas no gel foram interrompidas em fragmentos menores por sonicação (Hung et al., 32 Ann. Biomed. Eng. 35-49 (2004)). No contexto de transições sol-gel de polímeros, a sonicação tem sido tipicamente utilizada para degradar redes de geles e reliquidificar hidrogeles. A presente invenção proporciona a nova utilização da sonicação para induzir a transição sol-gel da seda. O tratamento por ultrassonicação deve durar um período de tempo suficiente para iniciar o processo de gelificação, mas não tão longa que comprometa as propriedades mecânicas do hidrogel. Tipicamente, os tratamentos por ultrassonicação podem durar desde cerca de 5 segundos a cerca de 60 segundos, dependendo da quantidade de fibroína de seda utilizada, da concentração da solução e de outros factores apreciados pelas pessoas com conhecimentos correntes da matéria. Por exemplo, os tratamentos por ultrassonicação duram de cerca de 15 segundos a cerca de 45 segundos. A gelificação tipicamente começa no início do tratamento por ultrassonicação e continua após o tratamento terminar. O tratamento por ultrassonicação pode incluir outros tratamentos para ajudar no processo de gelificação. Por exemplo, o tratamento pode incluir uma solução de sais.

As soluções de sais são conhecidas na arte por ajudarem na indução da gelificação. Podem ser utilizadas soluções de sais típicas contendo iões potássio, cálcio, sódio, magnésio, cobre e/ou zinco. 0 potássio pode ser vantajoso numa solução de sais neste contexto. 0 tratamento pode também incluir o ajustamento do pH da solução aquosa de fibroína. Como é conhecido na arte, o ajustamento do pH da solução aquosa pode auxiliar na indução da gelificação. Em particular, o ajustamento do pH acima ou abaixo pode ser eficaz. Assim, por exemplo, pode ser utilizada uma solução aquosa tendo um pH de cerca de pH 4 ou inferior, ou cerca de pH 7,5 ou superior.

Em particular, a utilização de uma solução de sal de potássio em baixas concentrações e a um pH baixo é muitas vezes eficaz. Uma forma de realização específica é dirigida à utilização de um sal de potássio, em que a concentração de sal é inferior a 100 mM e o pH da solução é de cerca de pH 4 ou inferior. A invenção também proporciona um método de controlar o tempo de gelificação de fibroína de seda por exposição de uma solução de fibroína de seda a um tratamento por ultrassonicação durante um período de tempo suficiente para iniciar a gelificação em condições tais que a gelificação ocorre dentro de cerca de duas horas. O processo de sonicação resulta em interacções entre as cadeias de fibroína de seda. Uma forma de realização específica proporciona um método de controlar o tempo de gelificação, de modo que a fibroína de seda sofre gelificação num período de tempo que varia desde cerca de cinco minutos a cerca de duas horas após o tratamento por ultrassonicação.

Adicionalmente, vários outros factores podem ser utilizados para controlar o tempo de gelificação. Por exemplo, o tempo de gelificação pode ser controlado através da amplitude da ultrassonicação e da concentração da solução de fibroína de seda. Por exemplo, a amplitude varia de cerca de 25% a cerca de 35% de potência de saída (tipicamente, 7 watts a 10 watts) e a concentração da fibroína de seda varia de cerca de 10% a cerca de 15% (p/v) . Noutra forma de realização, a amplitude varia de cerca de 25% a cerca de 55% de potência de saída (tipicamente, 7 watts a 21 watts) e a concentração da fibroína de seda varia de cerca de 5% a cerca de 10% (p/v). As pessoas com conhecimentos correntes da matéria, à luz do presente pedido, são capazes de alterar a amplitude da ultrassonicação e a concentração da solução de fibroína de seda para produzir o nível desejado de gelificação e o horizonte temporal desejado em que ocorre a gelificação. O tempo de gelificação também pode ser controlado por adição de uma solução de sal e ajustamento da concentração da solução de fibroína de seda e da concentração da solução de sal. A solução de sal pode incluir iões potássio, mas podem ser utilizadas soluções de outros sais. Numa forma de realização especifica, a concentração de fibroina de seda é 4% (p/v) ou inferior e a concentração da solução de sal de potássio varia de 20 mM a 100 mM.

Adicionalmente, o tempo de gelificação pode ser controlado por ajustamento da concentração e do pH da solução de sal, especialmente quando a solução de sal contém iões potássio. Numa forma de realização especifica, a solução de sal é uma solução de sal de potássio a um pH de cerca de pH 4 ou inferior. Por exemplo, a solução de sal de potássio tem uma concentração de 20 mM a 100 mM. A invenção também se refere a um método de encapsulação de pelo menos um agente em fibroina de seda. O método compreende (a) exposição de uma solução de fibroina de seda a um tratamento por ultrassonicação durante um período de tempo para iniciar a gelificação; e (b) introdução do agente na fibroina de seda antes que ocorra gelificação substancial da fibroina de seda, formando assim um agente encapsulado na fibroina de seda. O agente pode ser introduzido na solução de fibroina de seda antes, durante ou depois do tratamento por ultrassonicação. O agente pode representar qualquer material capaz de ser encapsulado no gel de fibroina de seda. Por exemplo, o agente pode ser um agente terapêutico, como moléculas pequenas e fármacos, ou um material biológico, como células (incluindo células estaminais), proteínas, péptidos, ácidos nucleicos (DNA, RNA, siRNA), PNA, aptâmeros, anticorpos, hormonas, factores de crescimento, citoquinas ou enzimas. 0 encapsulamento de um agente terapêutico ou material biológico é desejável porque o produto encapsulado pode ser utilizados para fins biomédicos.

Se um agente terapêutico estiver a ser encapsulado, o agente terapêutico pode ser introduzido na solução de fibroina de seda, antes, durante ou depois do tratamento por ultrassonicação, uma vez que a maioria dos agentes terapêuticos não são afectados de forma adversa por sonicação. Por outro lado, se um material biológico estiver a ser encapsulado, o material biológico pode ser afectado adversamente pela sonicação e tipicamente não deve ser introduzido na solução de fibroina de seda até depois do tratamento por ultrassonicação. Isto pode não ser necessário para todo o material biológico, mas sabe-se que a sonicação danifica ou destrói células vivas, pelo que é preciso cuidado.

Quando o agente é introduzido depois do tratamento por ultrassonicação, as condições do tratamento por ultrassonicação podem ser ajustadas de modo a que a gelificação ocorra algum período de tempo após o tratamento por ultrassonicação. Se ocorrer gelificação durante o tratamento por ultrassonicação ou imediatamente a seguir, pode haver uma quantidade de tempo insuficiente para introduzir o agente na solução de fibroina de seda. Por exemplo, quando o agente é introduzido após o tratamento por ultrassonicação, a fibroína de seda sofre gelificação num período de tempo que varia de cerca de cinco minutos a cerca de duas horas após o tratamento por ultrassonicação.

Se um agente for introduzido antes ou durante o tratamento por ultrassonicação, a gelificação pode ocorrer durante o tratamento por ultrassonicação, imediatamente a seguir ou um período de tempo depois do tratamento por ultrassonicação. Portanto, quando o agente é introduzido antes ou durante o tratamento por ultrassonicação, a fibroína de seda pode sofrer gelificação dentro de cerca de duas horas após o tratamento por ultrassonicação.

Quando da introdução de agentes terapêuticos ou de material biológico na fibroína de seda, outros materiais conhecidos na arte podem também ser adicionados com o agente. Por exemplo, pode ser desejável adicionar materiais para promover o crescimento do agente (para materiais biológicos), promover a funcionalidade do agente depois de ser libertado da encapsulação, ou aumentar a capacidade do agente para sobreviver ou reter a sua eficácia durante o período de encapsulação. Materiais conhecidos para promover o crescimento de células incluem meios de crescimento de células, como por Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal de bovino (FBS), aminoácidos não essenciais e antibióticos, e factores de crescimento e morfogénicos como o factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factores de crescimento transformantes (TGF), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), factor de crescimento da epiderme (EGF), factor de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), factores de crescimento morfogenéticos do osso (BMP), factores de crescimento dos nervos, e proteínas relacionadas podem ser utilizadas. Opções adicionais para administração através de geles incluem DNA, siRNA, antisense, plasmídeos, lipossomas e sistemas relacionados para administração de materiais genéticos; péptidos e proteínas para cascatas de sinalização celular ativas; peptídeos e proteínas para promover a mineralização ou eventos relacionados de células; péptidos e proteínas de adesão para melhorar as interfaces gel-tecido; péptidos antimicrobianos; e proteínas e compostos relacionados.

Os agentes terapêuticos ou material biológico encapsulado em fibroína de seda são adequados para um dispositivo de bioadministração. As técnicas para a utilização de fibroína de seda como um dispositivo de bioadministração podem ser encontrados, por exemplo, no pedido de patente U.S. N2 de Série 10/541182; N2 11/628930; N2 11/664234; N2 11/407373; PCT/US207/020789; PCT/US08/55072. A estrutura do hidrogel de fibroína de seda permite que o veículo de bioadministração tenha uma liberação controlada. A libertação controlada permite que as dosagens sejam administradas ao longo do tempo, com uma cinética de libertação controlada. Em alguns casos, a administração do agente terapêutico ou material biológico ao sítio onde o tratamento é necessário é contínua, por exemplo, ao longo de várias semanas. A libertação controlada ao longo do tempo, por exemplo, durante vários dias ou semanas ou mais tempo, permite a administração contínua do agente terapêutico ou material biológico para obter tratamentos preferidos. 0 veículo de administração controlada é vantajoso porque protege o agente terapêutico ou material biológico de degradação in vivo em fluidos e tecidos corporais, por exemplo, por proteases.

Além disso em relação à abordagem de induzir a formação de gel de seda utilizando sonicação, amostras de 0,5 mL de soluções aquosas de fibroína de seda com concentrações de 1%, 2%, 6% e 20% (p/v) foram sonicadas como descrito adiante. Quando a potência de saída foi mantida constante (20% de amplitude), o tempo de gelificação da fibroína de seda diminuiu com o aumento do tempo de sonicação (Fig. 1) . Para cada aumento de concentração de seda de 1% a 6% (p/v), o tempo de gelificação diminuiu significativamente (p < 0,01 entre * amostras na Fig. 1). A amostra a 20% (p/v) teve um tempo de gelificação semelhante ou mesmo mais longo do que a amostra a 6% (p/ pv) (Fig. 1) . Este resultado para a amostra a 20% é provavelmente devido à elevada viscosidade da solução, assim as ondas de sonicação não se podem propagar eficazmente na solução. Quando se utilizou uma potência de saída acima de 30% da amplitude, a sonicação gerou espumas espessas e a fibroína de seda não gelificou de forma homogénea.

Esta formação de espuma não foi observada quando o volume para sonicação foi aumentado para 5 mL, mesmo com niveis de potência tão elevados como 55% de amplitude. Quando concentrações mais elevadas foram sonicadas em volumes superiores a 5 mL, no entanto, ocorreu gelificação heterogénea. Pequenos volumes de solução de seda (sem autoclavagem) foram utilizados para optimização da sonicação e caracterizações do gel (pH, efeito salino e determinação do CD) e soluções de seda autoclavadas foram utilizadas para estudos mecânicos, de degradação e de encapsulação de células. 0 que é interessante, quando comparadas com as soluções originais, a autoclavagem não alterou significativamente os parâmetros de sonicação utilizados e os tempos de gelificação relacionados, sugerindo que a proteína fibroína de seda reteve as características importantes da sua estrutura original no estado de solução e a capacidade de transição estrutural para o estado de folha β na formação de um gel após autoclave. As alterações estruturais devidas aos tratamentos em autoclave podem ser adicionalmente investigadas, mas este aspecto proporciona facilidade na preparação em escala comercial de produtos farmacêuticos.

Durante a gelificação da fibroína de seda, a transição sol-gel foi ligada a um aumento da formação de folhas β pelas alterações observadas nas determinações de CD (Fig. 2A) . Após a sonicação, observou-se a formação rápida de estruturas em folha β, seguido por uma transição mais lenta, com base no aumento da elipticidade a 217 nm (Fig. 2B). A gelificação da fibroína de seda ocorreu neste ponto de transição, em que a formação inicial rápida de estrutura em folha β se tornou mais lenta. Esta transição é consistente com estudos realizados anteriormente (Matsumoto et al., 2006), sugerindo que podem estar envolvidos mecanismos semelhantes. A formação da estrutura em folha β resulta da interação hidrófoba alterada e subsequentes reticulações físicas. Este passo inicial é seguido por uma organização mais lenta das cadeias e formação de uma rede de gel dentro de um horizonte temporal relativamente longo em comparação com as alterações iniciais induzidas por sonicação. Este mecanismo de gelificação de seda em dois passos está representado esquematicamente na Fig. 2C.

Os parâmetros estudados para influenciar as velocidades de gelificação podem ser considerados como um método para recapitular o processo natural de fiação pelo bicho da seda. Os parâmetros chave de processamento incluem efeitos de sonicação, como uma imitação das forças de cisa-lhamento aumentadas experimentadas na divisão anterior da glândula do bicho da seda, tipo e concentração de catiões e pH. E aceite que, na sonicação, as vibrações mecânicas provocam a formação e o colapso de bolhas. Como resultado desta cavitação, o meio podem experimentar efeitos locais extremos: aquecimento (10000 K) , alta pressão (200 bar) e velocidades de deformação elevadas (107 s_1) (Paulusse & Sijbesma, 44 J. Polym. Sei. - Polym. Chem. 5445-53 (2006); Kemmere et al., 290 Macromol. Mater. Eng. 302-10 (2005). Estes fenómenos físicos foram explorados numa variedade de aplicações, incluindo auto-agregação e gelificação de copolímero de N-isopropilacrilamida/ácido acrílico (Seida et al., 90 J. Appl. Polym. Sei. 2449-52 (2003)), fluidos orgânicos com péptidos metalados (Isozaki 119 Angew. Chem. 2913-15 (2007)), e péptidos auto-agregantes sintéticos (Yokoi et al., 102 Proc. Nat. Acad. Sei. USA 8414-19 (2005)). Além de péptidos, proteínas como albumina do soro humano e mioglobina foram estudadas com sonicação como uma abordagem para caracterizar a agregação e auto-agregação relacionada com estados patológicos (Stathopulos et al., 13 Protein Sei. 3017-27 (2004); Mason & Peters, PRACTICAL SONOCHEM: USES & APPLI. ULTRASOUND (2nd ed., Chichester, West Sussex, UK (2002)).

Dado a amplitude de comportamento de sistemas de polímeros em resposta a sonicação, é provável que vários factores físicos relacionados com a sonicação, incluindo aumentos de temperatura locais, forças mecânicas/de cisalhamento e interfaces ar-líquido aumentadas afectem o processo de gelificação rápida da fibroína de seda. Em particular, as alterações induzidas por sonicação na hidratação hidrófoba resultariam na formação acelerada de reticulações físicas, como interaeções da cadeia inicial relacionadas com formação de folhas β. No presente estudo, durante o processo de sonicação, a temperatura da solução aumentou desde a temperatura ambiente até 40°C-71°C durante o curto período de tempo (5 minutos a 6 min), o que reflecte um pico transitório da temperatura local. Num estudo anterior, a gelificação necessitou de alguns dias quando amostras em massa foram mantidas a 60°C, sem sonicação (Kim et al., 2004). Portanto, os efeitos da temperatura local provavelmente contribuem para a cinética de gelificação aumentada, mas não são o único responsável pelas respostas de curta duração encontradas. Uma dinâmica de cadeias localizadas e alterações nos estados de hidratação das cadeias hidrófobas, influenciadas pelo aumento transitório de temperatura, são provavelmente responsáveis pela formação das reticulações físicas hidrófobas.

As caracteristicas das sequências de blocos hidrófobos únicos em cadeias de fibroína de seda são particularmente adequadas para este tipo de técnica devido ao papel crítico da água no controlo das interacções intra- e inter-cadeias (Jin et al., 2003). Pode ser útil estender a técnica a outros sistemas de biopolímeros para determinar o impacto da química da cadeia em processos controlados por sonicação de agregação de cadeias. Foi descrita a degradação de colagénio relacionada com a sonicação, como um método para fragmentar cadeias para facilitar estudos de reagregação (Giraud-Guille & Besseau, 113 J. Struct. Biol. 99-106 (1994)). Deve notar-se que a presente abordagem não resultou na degradação significativa das cadeias devido ao processo de sonicação de curta duração utilizado, com base na análise por SDS-PAGE.

Soluções aquosas de fibroína de seda foram suplementadas com K+ e Ca2+ em várias concentrações fisiologicamente relevantes antes da sonicação. Como ilustrado na Fig.3A, a baixa concentração de K+ (20 mM-50 mM), o tempo de gelificação diminuiu significativamente com o aumento da concentração de K+ (p <0,05 entre * amostras). A alta concentração de K+ (100 mM-200 mM) , no entanto, a gelificação foi inibida (Fig. 3A) . Estes resultados foram observados para concentrações de fibroína de seda na gama de 0,5% a 8% (p/v) . Acima de 8%, não se observou nenhum efeito de sal uma vez que a gelificação ocorreu rapidamente em todas as amostras (<2 min) . Comparado com K+, Ca2+ nas mesmas concentrações induziu gelificação mais lenta da fibroína de seda (comparar Fig. 3A e 3B). Quando a concentração de Ca2+ foi aumentada de 20 mM para 200 mM, o tempo de gelificação da fibroína de seda aumentou significativamente (p <0,05 entre amostras * na Fig. 3B). Em contraste, em trabalho anterior, Ca2+ promoveu a gelificação de fibroína de seda enquanto K+ não teve nenhum efeito (Kim et al., 2004), um resultado diferente do das observações na presente abordagem. O pH da solução aquosa de fibroína de seda foi ajustado antes da sonicação, para determinar os efeitos sobre a gelificação. Quer a diminuição quer o aumento do pH promoveram a gelificação (p <0,05 entre amostras * na Fig. 3C). O efeito de pH mais baixo (pH <4) foi mais pronunciado do que o de pH mais alto (pH> 9) na indução da gelificação (p <0,05 entre amostras 0 na Fig. 3C) , consistente com estudos anteriores (Kim et al. , 2004; Matsumoto et al., 2006).

As curvas de tensão/deformação resultantes de ensaios mecânicos dos geles aprsentaram linearidade anterior a uma zona de patamar, sugerindo que os geles têm uma grande (~5%-10% de deformação) e provável caracteris-tica viscoelástica, após o que é induzido dano permanente por formação de fissuras. Os geles fabricados neste estudo tiveram desempenho semelhantes aos geles estudados no trabalho anterior (Kim et al., 2004), em que as correspondentes concentrações de fibroina de seda deram valores semelhantes tanto para a tensão de cedência (Fig. 4A) como para o módulo de elasticidade "tradicional" (Fig. 4B). Ambas as métricas pareceram estar correlacionadas positivamente com a concentração do gel de seda. Por inspecção, as diferenças de concentração de fibroina de seda (p/v) eram determinantes mais significativas das propriedades mecânicas finais do hidrogel, e não tanto da variação devida às condições de sonicação (Fig. 4A e 4B) . Analogamente, os valores do módulo de equilíbrio pareceram estar positivamente correlacionados com a concentração do gel de seda (Fig. 4C).

Quando comparados com outros hidrogeles degradáveis encapsuladores de células, como alginato, agarose, geles reticulados de polietilenoglicol, fibrinogénio e outros sistemas (Almany Seliktar & 26 (15) Biomats. 4023-29 (2005); Kong et al., 24(22) Biomats. 4023-29 (2003); Hung

et al., 2004; Bryant et al., 86(7) Biotechnol Bioeng 747-55 (2004); Kang et al. 77(2) J. Biomed. Mater. Res. A 331-39 (2006); Rowley et al., 20(1) Biomats. 45-53 (1999); Broderick et al., 72 J. Biomed. Mater. Res. B-Appl Biomater. 37-42 (2004); Zhang et al., 15 J. Mater. Sei. Mater. Med. 865-75 (2004)), os hidrogeles de seda de alta concentração e rápida formação apresentaram propriedades mecânicas superiores (Tabela 1). Os dados foram recolhidos com base em semelhanças entre encapsulação de células e protocolos de ensaios mecânicos, em que foram determinados os valores do módulo "tradicional" ou de equilíbrio.

Tabela 1. Propriedades mecânicas comparativas entre sistemas de geles de polímeros biodegradáveis utilizados para encapsulação de células

(continuação)

A degradação enzimática (protease XIV) de películas de fibroína de seda, suportes sólidos porosos, e de fios de fibroína de seda foram estudadas anteriormente (Horan et al.r 2005; Kim et al., 2005; Jin et al., 2005) . Utilizando a mesma concentração de protease (5 U/mL), todos os hidrogeles de fibroína de seda mostraram uma degradação rápida, com perda de massa de cerca de 80% nos primeiros quatro dias, com uma velocidade de degradação muito mais lenta posteriormente (Fig. 5). A degradação dos hidrogeles era dependente da concentração de fibroína de seda. Quando a concentração foi aumentada de 4% para 12% (p/v), o tempo de degradação para atingir uma perda de massa de 50% aumentou a partir de 1,5 dias até 3 dias (Fig. 5) . As amostras de controlo, hidrogeles de fibroina de seda incubadas em PBS em vez de protease, foram estáveis durante o período de incubação (Fig. 5). A degradação rápida (dentro de dias) de hidrogeles de seda devido a processos proteolíticos pode ser adequada para algumas aplicações, como em cenários de cicatrização de feridas ou administração de fármacos rápida. Deve notar-se, no entanto, que os tempos de degradação proteolítica aqui discutidos são in vitro; em contraste os tempos de vida in vivo são geralmente mais longos e os prazos serão específicos para os tecidos. hMSCs foram encapsuladas com êxito numa variedade de sistemas de hidrogeles, como polietilenoglicol, agarose, colagénio e alginato, devido ao potencial destas células para a reparação ou regeneração de tecidos e libertação de fármacos a longo prazo (ver Nuttelman et al., 24 Matrix Biol. 208-18 (2005); Nuttelman et al., 2.Ί Biomats 1377-86 (2006); Mauck et al., 14 Osteoarthr. Cartilage 179-89 (2006); Lewus & Nauman, 11 Tissue Eng. 1015-1022 (2005); Majumdar et al., 185 J. Cell Physiol. 98-106 (2000);

Boison, 27 Trends Pharmacol. Sei. 652-58 (2006)).

Hidrogeles de seda com menos do que 4% (p/v) de proteína foram difíceis de manipular devido a limitações físicas. Portanto, para encapsulação de hMSC foram utilizados hidrogeles de 4%, 8% e 12% (p/v) de fibroina de seda. Em todas as três concentrações do gel, as células retiveram a sua forma original redonda e distribuição homogénea no dia um. No dia seis, apareceram defeitos em algumas células no gel a 12% e a morfologia celular tinha mudado. No dia vinte e um, as células no gel de 4% estavam inalteradas guando comparado com o dia um, enguanto as células nos geles de 8% e 12% estavam em grande parte deformadas e agregadas. A análise histológica mostrou gue as hMSCs dentro da matriz do gel de 4% retinha a forma redonda e estavam não agregadas ao longo do estudo, enquanto as próximas da superfície dos geles cresceram para fora do gel e alteraram a morfologia da forma redonda para formas fusiformes a partir do dia seis. Todas as hMSCs, quer fusiformes perto da superfície do gel quer de forma redonda encapsuladas no gel, estavam vivas, como observado por fluorescência verde no ensaio de células vivas e mortas. Portanto, as hMSCs mantiveram a sua actividade e função no sistema de hidrogel de seda a 4% durante pelo menos vinte e um dias. As hMSCs nos geles a 8% e 12%, no entanto, em grande parte alteraram a morfologia e muitas delas morreram, agregaram-se e/ou dissolveram-se, como se pode ver pelas cavidades vazias em imagens histológicas e poucas manchas verdes fluorescentes no ensaio de células vivas e mortas. 0 gel de seda de controlo, sem células encapsuladas, mostrou um fundo de fluorescência vermelha forte, que mascarou a fluorescência vermelha de células mortas no ensaio de células vivas e mortas.

Estas observações e conclusões foram ainda apoiadas pela quantificação do DNA (ensaio PicoGreen) (Fig. 6) . As células proliferaram significativamente em todos os três hidrogeles ao longo dos primeiros 6 dias (p <0,05 entre * amostras na Fig. 6). Para o gel a 4%, os números de células pararam de aumentar após seis dias, indicando que tinha sido atingida a capacidade máxima do gel para proliferação celular. Um fenómeno semelhante foi observado noutros sistemas de hidrogeles como PEG e alginato (Nuttleman et al.f 2006; Ramdi et al.f 207 Exp. Cell Res. 449-54 (1993) ) . Para os geles a 8% e 12%, o número de células diminuiu após seis dias, consistente com as observações microscópica, histológica e vivas-mortas. A perda de actividade nos geles de concentração mais elevada é provavelmente devida a limitações de transporte de massa, mas também pode ser devida a restrições mecânicas impostas a estas concentrações de gel mais elevadas. A possibilidade de geles de seda serem tóxicos para as hMSCs pode ser excluída porque as hMSCs que crescem na parte superior dos geles de seda a 4%, 8%, e 12% tinham velocidades de crescimento semelhantes às que cresciam na placa de cultura de células de controlo, e as morfologias celulares (fusiformes) eram semelhantes entre todos os grupos. A optimização de condições para estabilizar concentrações mais baixas de gel (1% e 2%) pode ser explorada seguindo os ensinamentos aqui proporcionados, e as velocidades de difusão de oxigénio e nutrientes através de várias concentrações de geles de seda podem ser estudadas em pormenor.

Um novo método, baseado na ultrassonicação, é aqui proporcionado, que permite a formação rápida de hidrogeles de fibroína de seda. A gelificação pode ser induzida em minutos a horas, dependendo da potência de saída e da duração da sonicação. A gelificação foi acompanhada com formação de estrutura em folha β, devido a alterações na hidratação hidrófoba. Baixas concentrações de K+ e pH baixo aceleraram as velocidades de gelificação, enquanto a presença de Ca2+ e concentrações elevadas de K+ impediram a gelificação. Os hidrogeles de fibroína de seda tinha propriedades mecânicas superiores às descritas anteriormente, na gama de 369-1712 kPa baseada no módulo de compressão. A resistência mecânica do gel aumentou com o aumento da concentração da solução de fibroína de seda. Os hidrogeles de fibroína de seda a 4% (p/v) eram adequados para encapsulação para as hMSCs; as células retiveram viabilidade e proliferação em condições de cultura estática ao longo de semanas. A invenção vai ser ainda caracterizada pelos exemplos seguintes que se destinam a ser exemplificativos das formas de realização.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Soluções de fibroína de seda

Soluções aquosas mães de fibroína de seda foram preparadas como descrito anteriormente (Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139-48 (2001)). Resumidamente, casulos de B. mori foram fervidos durante 40 min numa solução aquosa de carbonato de sódio 0,02 Me depois bem enxaguadas com água pura. Após secagem, a fibroina de seda extraída foi dissolvida em solução de LiBr 9,3 M a 60°C durante 4 horas, dando uma solução a 20% (p/v). Esta solução foi dialisada contra água destilada, utilizando cassetes de diálise Slide-a-Lyzer (MWCO 3500, Pierce, Rockford, IL) durante dois dias para remover o sal. A solução estava opticamente transparente após diálise e foi centrifugada para remover as pequenas quantidades de agregados de seda que se formaram durante o processo, geralmente a partir de contaminantes ambientais que estão presentes nos casulos. A concentração final da solução aquosa de fibroina de seda era de aproximadamente 8% (p/v) . Esta concentração foi determinada por pesagem do sólido residual de um volume conhecido de solução após secagem. Soluções de seda com concentrações mais baixas foram preparadas por diluição com água da solução a 8%. Para se obter uma solução de seda com concentração mais alta, a solução a 8% de cassetes de diálise Slide-a-Lyzer (MWCO 3500, Pierce) foi dialisada contra solução de PEG a 10% (p/v) (10000 g/mol) durante pelo menos 24 horas à temperatura ambiente (Jin & Kaplan, 2003; Kim et ai., 2004). O volume foi ajustado com água até atingir a concentração desejada. Todas as soluções foram armazenadas a 4°C antes da utilização.

Exemplo 2. Soluções de seda com várias concentrações de sais e pH

Para determinar o efeito da concentração de sais na gelificação de seda, soluções mães de KC1 e CaC12 em IM foram adicionadas a soluções de seda para se atingir uma concentração final de sal de 20 mM a 200 mM. Para determinar o efeito do pH na gelificação, soluções de seda foram tituladas com soluções de HC1 ou NaOH 1 M e o pH foi monitorizado com um medidor de pH.

Exemplo 3. Triagem para condições de gelificação de seda

Para determinar a gelificação de seda em várias condições de sonicação, 0,5 mL de solução (água) de seda num tubo de Eppendorf de 1,5 mL foram sonicados com um ultrasonicator Branson 450 (Branson Ultrasonics Co. , Danbury, CT) , que consistia no gerador de corrente modelo 450, conversor (peça N2 101-135-022), disruptor de rosca externa de 1/2" (peça N2 101-147-037) e microponta afilada com 1/8" de diâmetro (peça N2 101-148-062) . A potência de salda foi variada de 10% a 50% de amplitude (3 watts-21 watts) e o tempo de sonicação foi variado de 5-30 segundos. Para determinar os efeitos de sais e do pH na gelificação, 0,5 mL das soluções de seda preparadas como descrito acima foram sonicados a 20% da amplitude (7watts) e 15 segundos. As soluções foram incubadas a 37°C após sonicação e a transição sol-gel foi monitorizada visualmente, rodando o tubo e verificando a alteração da opacidade da solução (Matsumoto et al.) .

Com base em resultados preliminares, foram utilizadas concentrações de fibroina de seda até 12% (p/v)

para manter viscosidade mais baixa, e a solução a 12% gelificou mais rápido do que as amostras a 8% e a 4%. Estes resultados estão apresentados na Tabela 2, adiante.

Tabela 2. Tempo de gelificação para grande volume (5 mL-7 mL) de solução aquosa de fibroina de seda após sonicação.

Exemplo 4. Dicroismo circular (CD)

Uma aliquota de 0,5 mL de solução (água) de seda a 2% foi sonicada a 20% da amplitude (7 watts) durante 30 segundos e imediatamente carregada numa célula de quartzo tipo sanduíche com um comprimento do passo de 0,01 mm (Nova Biotech, EI Cajon, CA). A determinação do CD foi realizada com um espectrofotómetro Jasco-720 CD (Jasco Co., Japão) . Todas as amostras foram varridas a 37 °C com um tempo de acumulação de 4 segundos à velocidade de 100 nm/min, e foi determinada amédia dos resultados de quatro experiências repetidas. Para a medição da cinética de formação da estrutura em folha β da seda, a alteração de elipticidade a 217 nm foi monitorizada durante 2,5 horas com amostragem a cada 10 segundos.

Exemplo 5. Ensaios Mecânicos

Foi preparado um grande volume de gel de seda por sonicação de modo a acomodar os ensaios mecânicos. Soluções de seda, a 4%, 8% e 12% (p/v) em balões de vidro foram autoclavadas 20 min a 121°C. A solução autoclavada foi suplementada com pó estéril de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM em pó, Invitrogen, Carlsbad, CA) e bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) até uma concentração de 0,135 g/mL e 0,037 g/mL, respectivamente. O pH da solução resultante era pH 7,4, que foi verificada com um medidor de pH. Uma aliquota de 7 mL foi adicionada a um tubo de plástico Falcon de 15 mL e depois sonicada a 20%, 30%, 40% de amplitude (7 watts, 10 watts, 15 watts, respectivamente) durante 30 segundos. Seis mL da solução sonicada foram adicionados a pequenas placas de cultura (BD Falcon™, N2 35-3001, BD Biosciences, Paio Alto, CA) que foram monitorizadas visualmente numa incubadora a 37°C, a fim de aproximar os parâmetros de cultura de células, até a gelificação estar completada com base em características opacas e condensação na superfície do gel. Subsequentemente, provetes de 9,525 milímetros de diâmetro (2-3 mm de altura) foram retirados por perfuração para ensaios mecânicos imediatamente após a gelificação. Os provetes de gel foram pré-condicionados em solução de DMEM completo (Gibco/Invitrogen) durante > 1 hora antes do ensaio.

Todas as amostras foram submersas em DMEM para armazenagem e testadas dentro de 24 horas. As amostras foram avaliadas numa máquina Instron 3366 (Norwood, MA) equipada com placas de compressão simples e um transdutor de carga de 100 N. Foi utilizado o método de tracção e compressão com 1 mm/min de velocidade de extensão. Determinou-se a tensão e a deformação por compressão e calculou-se o módulo de elasticidade com base numa técnica semi-automática. O diagrama de tensão-deformação foi segmentado em oito secções abaixo de um nível de corte de tensão definido para além da porção linear inicial do diagrama. Utilizando ajustamento de mínimos quadrados, o maior declive entre estas oito secções foi definido como o módulo de compressão para a amostra. A resistência à compressão foi determinada utilizando uma abordagem de aproximação do limite elástico. Foi traçada uma linha paralelamente à linha do módulo, mas compensada por 0,5% do comprimento entre marcas de referência da amostra. O correspondente valor de tensão em que a linha de deslocamento cruzou a curva de tensão-deformação foi definido como a resistência à compressão da estrutura. Este ensaio foi realizado de acordo com uma modificação baseada no método ASTM F451-95.

Foram realizados dois regimes de ensaio de compressão não confinada para avaliar a influência das condições de sonicação no desempenho mecânico. Em primeiro lugar, utilizou-se o ensaio de deformação até à ruptura para extrair uma propriedade tradicional de rigidez do material e observar uma resposta à ruptura (Almany & Seliktar 26(15) Biomats. 2467-77 (2005); Kong et al., 24(22) Biomats. 4023-29 (2003)). Em segundo lugar, utilizou-se um ensaio de relaxação da tensão para avaliar as propriedades do módulo de equilíbrio, com base em parâmetros de ensaio de Hung et al. (32 Ann. Biomed. Eng. 35-49 (2004)). Juntas, estas determinações proporcionam comparações amplas com as propriedades publicadas de outros hidrogeles degradáveis utilizados para encapsulação de células. N = 4 amostras foram avaliadas para cada grupo descrito e foram testadas numa máquina Instron 3366 (Norwood, MA) equipada com placas de compressão não confinadas e transdutor de carga de 100 N e os dados das amostras exportados utilizando Bluehill Software Version 2.0.

Para os ensaios de deformação até à ruptura, cada amostra foi comprimida a uma velocidade de extensão controlada de 1 mm/min, com início após terem sido atingidas cargas nominais de tara e registadas as alturas das amostras. A tensão e deformação por compressão foram determinadas por normalização contra geometrias das amostras e o módulo de elasticidade "tradicional" foi calculado como o declive de uma linha tangencial estabelecida na porção de tensão de 5% de cada curva de tensão/deformação. A tensão de cedência foi determinada por compensação de uma linha paralela à linha tangencial por 2% de deformação; onde a linha de deslocamento intersectou a resposta ao a resposta à tensão/deformação foi definida como tensão de cedência (que coincidiu com o início da ruptura). Para o ensaio de relaxação da tensão, as amostras foram submersas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e deixadas sob uma carga de tara nominal durante 200 s. Em seguida, as amostras foram comprimidas a 1 mm/s até serem atingidos 10% da deformação, que foi mantida durante 20 min. O módulo de equilíbrio foi calculado por normalização da tensão de relaxação por 10% de deformação.

Exemplo 6. Degradação enzimática in vitro de geles de seda

Provetes de gel de seda (diâmetro = 4 mm, altura = 2 mm-3 mm) a 4%, 8%, 12% (p/v) foram preparados como descrito acima e depois imersos em 1 mL de solução de Protease XIV (Sigma-Aldrich) numa placa com 24 poços. A solução de protease foi preparada de fresco dissolvendo a enzima em pó em PBS para atingir uma concentração de 5 U/mL e substituída por solução preparada de novo a cada 24 horas. Os provetes de controlo foram imersos em 1 mL de PBS que também foi substituído por tampão fresco a cada 24 horas. Todas as amostras foram incubadas a 37°C. Nos dias 1, 2, 3, 4 e 7, quatro provetes foram lavados com água, limpos com papel absorvente para remover o excesso de água à superfície do gel e pesados.

Exemplo 7. Inoculação e cultura de hMSCs em geles de seda hMSCs foram isoladas de aspirados inteiros frescos da medula óssea de doadores que deram o seu assentimento (Clonetic-Poietics, Walkersville, MD) como descrito anteriormente (Meinel et al., 71 J. Biomed. Mater. Res. A 25-34 (2004); Meinel et al., 88 Biotechnol. Bioeng. 379-91 (2004)), e expandidas em cultura num meio de cultura contendo DMEM a 90%, soro fetal bovino (FBS) a 10%, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, 100 U/mL de penicilina, 1000 U/mL de estreptomicina, 0,2% de antimicótico fungizona e 1 ng/mL de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF). Antes da utilização, células das passagens 3-4 foram tripsinizadas de frascos de cultura e ressuspensas em DMEM para se obter uma densidade celular de 5 x 107 células/mL. Quinze mL de solução de seda a 4%, 8% e 12% (p/v) foram esterilizados com vapor (autoclavados) e suplementados com DMEM em pó e bicarbonato de sódio tal como descrito acima. Uma aliquota de 5 mL foi adicionada a um tubo de plástico Falcon de 15 mL e foi preparado um total de dois tubos (de controlo e semeado com células) para cada concentração de seda. Uma solução de seda a 4% (p/v) (5 mL) foi sonicada numa câmara de fluxo laminar a 50% de amplitude durante 30 segundos, e após 30 min de incubação a solução foi sonicada novamente nas mesmas condições. Após a segunda sonicação, a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente dentro de 5 min-10 min, e depois adicionou-se 50 mL da suspensão de células e misturopu-se com a solução de seda sonicada para atingir uma concentração final de 5 x 105 células/mL. A amostra de controlo foi sonicada da mesma forma, mas adicionou-se 50 mL de DMEM em vez da suspensão de células após a sonicação. Uma aliquota de 1,5 mL das misturas foi rapidamente pipetada para placas de cultura de células com 12 poços, com um total de três poços preparados para cada grupo de amostras. As soluções a 8% e 12% (p/v) foram sonicadas uma vez a 40% e 30% de amplitude, respectivamente, durante 30 s. Uma allquota de 50 mL de suspensão de hMSCs foi adicionada e a mistura foi plaqueada tal como descrito acima. Todas as placas foram então incubadas a 37°C e 5% de CO2.

Uma vez que a seda gelificou nas placas dentro de 0,5 h-2 h, pequenos provetes (diâmetro = 4 mm, altura = 2-3 mm) foram perfurados do gel e colocados nos poços de uma nova placa com 24 poços. Os provetes foram depois cultivados em 1 mL de meio de crescimento contendo DMEM a 90%, FBS a 10%, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, 100 U/mL de penicilina, 1000 U/mL de estreptomicina, 0,2% de antimicótico fungizona a 37°C e 5% de CO2. Para imagiologia por microscopia, os geles de seda com as hMSC encapsuladas com um volume de 0,5 mL foram preparados em placas com 24 poços e cultivados em 1 mL do mesmo meio de crescimento e nas mesmas condições que acima, e as imagens foram tiradas em pontos de tempo desejados.

Exemplo 8. Análises de hMSCs encapsuladas em geles de seda

Microscopia de contraste de fase - Nos dias 2, 6, 14 e 21 de cultura, a morfologia celular foi monitorizada por um microscópio óptico de contraste de fase (Cari Zeiss,

Jena, Alemanha) equipado com uma câmara de vídeo a cores Sony Exwave HAD 3CCD.

Proliferação celular - A proliferação celular foi avaliada por ensaio de DNA. Resumidamente, em cada ponto de tempo, quatro provetes de gel de cada grupo foram lavados com PBS, pH 7,4, pesados (peso húmido) e picado com microtesouras em gelo. 0 teor de DNA (N = 4) foi determinado utilizando o ensaio PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, OR) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram medidas fluorometricamente a um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 528 nm. O teor de DNA foi calculado com base numa curva padrão obtida no mesmo ensaio, e ainda normalizado pelo peso húmido de cada provete de gel.

Viabilidade das células: a viabilidade das hMSCs nos provetes de gel foi examinada por um ensaio vivas/mortas (Molecular Probes, Eugene, OR). Resumidamente, no final da cultura, um provete de gel de cada grupo semeado com hMSCs foram lavados com PBS, cortados em duas metades e incubados em calceína AM 2 mM (coloração das células vivas) e homodímero de etídio 4 mM (EthD-1, colorção das células mortas) em PBS durante 30 min a 37°C. A secção transversal do gel cortado foi visualizada por microscopia confocal (Bio-Rad MRC 1024, Hercules, CA) com software Lasersharp 2000 (excitação/emissão -495 nm/~515 nm) . Micrografias de projecção em profundidade foram obtidas a partir de uma série de secções horizontais, obtidas a várias distâncias umas das outras (incrementos de 1 pm-10 pm) , com base na altura total de uma colónia de células bem definida. Foram captadas imagens estáticas a várias profundidades e uma série de micrografias foram posteriormente combinadas para compilação de imagens "empilhadas em z".

Histologia. Geles de seda semeados com células foram lavados em PBS e fixados em formol a 10% tamponado neutro durante 2 dias antes da análise histológica. As amostras foram desidratadas através de uma série de etanóis graduados, embebidas em parafina e seccionadas a 5 mm de espessura. Para a avaliação histológica, os cortes foram desparafinados, reidratados através de uma série de etanóis graduados, e corados com hematoxilina e eosina (H&E).

Exemplo 9. Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas guando pp0,05 e altamente significativas guando ρρΟ,ΟΙ.

Lisboa, 30 de dezembro de 2014

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de obtenção de gelificação rápida de fibroína de seda, compreendendo a exposição de fibroina de seda a um tratamento compreendendo ultrassonicação durante um período de tempo de cerca de 5 segundos a cerca de 60 segundos para iniciar a gelificação, em gue ocorre gelificação substancial da fibroína de seda menos de 24 horas após o tratamento por ultrassonicação.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em gue a gelificação da fibroína de seda ocorre menos de duas horas após o tratamento por ultrassonicação.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em gue a fibroína de seda sofre gelificação num período de tempo gue varia de cerca de cinco minutos a cerca de duas horas após o tratamento por ultrassonicação.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em gue o tratamento compreende ainda uma solução de sais, em gue a solução de sais opcionalmente compreende iões seleccionados do grupo gue consiste em potássio, cálcio, sódio, magnésio, cobre, zinco e as suas associações.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em gue a fibroína de seda está na forma de uma solução aguosa tendo um pH que é cerca de pH 4 ou inferior, ou é cerca de pH 7,5 ou superior.
6. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que o sal é de potássio, a concentração de sal é inferior a 100 mM e o pH da solução de sal é cerca de pH 4 ou inferior.
7. Método para controlar o tempo de gelificação de fibroina de seda por utilização de um processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que a fibroina de seda sofre gelificação substancial dentro de cerca de duas horas.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o tempo de gelificação é controlado através da amplitude da ultrassonicação e da concentração da solução de fibroina de seda.
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o tempo de gelificação é controlado através concentração da solução de fibroina de seda e da concentração da solução de sais, e opcionalmente, em que a concentração da fibroina de seda é de 4% ou inferior, a solução de sais compreende iões potássio e a concentração da solução de sais de potássio está na gama de 2 0 mM a 10 0 mM.
10. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o tempo de gelificação é controlado através da concentração e do pH da solução de sais e opcionalmente em que a solução de sais compreende iões potássio, a concentração da solução de sal de potássio está na gama de 20 mM a 100 mM e o pH da solução é pH 4 ou inferior.
11. Método de encapsulação de pelo menos um agente em fibroína de seda, compreendendo: a exposição de uma solução de fibroína de seda a um tratamento de ultrassonicação durante um período de cerca de 5 segundos a cerca de 60 segundos para iniciar a gelificação; e a introdução do(s) agente(s) na solução de fibroína de seda antes de ocorrer gelificação substancial na solução de fibroína de seda; para formar um agente encapsulado em fibroína de seda.
12. Método de encapsulação de pelo menos um agente em fibroína de seda, compreendendo: introdução do(s) agente (s) numa solução de fibroína de seda; e exposição de uma solução de fibroína de seda a um tratamento por ultrassonicação durante um período de cerca de 5 segundos a cerca de 60 segundos para iniciar a gelificação; para formar um agente encapsulado em fibroína de seda.
13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o agente é um agente terapêutico ou um material biológico, ou ambos, e/ou em que o agente é pelo menos um material biológico seleccionado do grupo que consiste em células, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, PNA, aptâmeros, anticorpos, hormonas, factores de crescimento, citoquinas, enzimas, compostos antimicrobianos e as suas associações, e/ou em que a referida célula é uma célula estaminal não embrionária, e/ou em que o meio de cultura de células é introduzido na fibroína de seda com o material biológico, e/ou em que o agente é um agente terapêutico seleccionado do grupo que consiste em moléculas pequenas, fármacos e as suas associações.
14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que ocorre gelificação substancial dentro de cerca de 2 horas e/ou em que ocorre gelificação substancial no período de tempo que está na gama de cerca de cinco minutos a cerca de duas horas, e/ou em que o tratamento compreende ainda uma solução de sais, e/ou em que a fibroína de seda está na forma de uma solução aquosa tendo um pH que é cerca de pH 4 ou inferior ou que é cerca de pH 7,5 ou superior.
15. Material biológico encapsulado em fibroína de seda obtenível por um método de acordo com a reivindicação 12 e 13, para utilização como um dispositivo de bioadministração. Lisboa, 30 de dezembro de 2014