JP6967210B2 - 細胞外マトリックス含有組成物、三次元組織体形成用仮足場材及び三次元組織体形成剤並びに三次元組織体から細胞を回収する方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞外マトリックス含有組成物、三次元組織体形成用仮足場材及び三次元組織体形成剤に関する。本発明はまた、三次元組織体から細胞を回収する方法にも関する。

近年、生体外で細胞の三次元組織体を構築する技術が開発されている。例えば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、ポリ乳酸等を材料とした足場に細胞を播種して三次元組織体を製造する方法（非特許文献１）等が提案されている。また、本発明者らはこれまで、コラーゲン成分、フィブロネクチン成分等の細胞外マトリックス成分を含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献２）、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び被覆細胞を三次元に配置することを含む三次元組織体の製造方法であって、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び浸漬させた細胞と被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法（特許文献３）等を提案している。このような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。

細胞の三次元培養の手法には、上述した通り細胞が接着可能な足場材料を使った手法、足場材料を用いずに細胞を積層させる手法等、様々な手法が検討されているが、いずれの細胞培養手法においても、コラーゲン成分等の細胞外マトリックス成分の共存化で細胞と培養することが一般的に行われている。これは、細胞外マトリックス成分が細胞間質において組織構造を物理的に支持する材料として機能していることに加え、細胞の発生、分化、形態形成等において生物学的に重要な役割を担っていると考えられているためである。

特開２０１２−１１５２５４号公報 国際公開第２０１５／０７２１６４号 国際公開第２０１６／０２７８５３号 特許６０２９１０２号公報 特許５８７０４０８号公報

Nature Biotechnology, 2005,Vol.23, NO.7, p.879-884

外部から細胞外マトリックス成分を供給して、細胞を培養する場合、構築された三次元組織体には必然的に、外部から供給された細胞外マトリックス成分（外因性細胞外マトリックス成分）が含まれることになる。外因性細胞外マトリックス成分と、細胞とを共存させることは、in vitroで細胞の三次元培養を行う段階では、有用な側面がある一方、構築された三次元組織体について各種分析、解析、評価等を行う段階においては、自然な状態であれば本来存在しない外因性細胞外マトリックス成分が、三次元組織体本来の機能に影響を与える可能性がある。

このような影響を回避する方法としては、例えば三次元組織体の形成後に、外因性成分だけを取り除く方法が考えられる。例えば、特許文献４では、２５℃以上の温度でゲル状態となり０℃以上１５℃以下の温度ではゾル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す担体材料が用いられている。特許文献４では、ゲル化させた担体材料上で三次元組織体を形成し、その後、当該担体材料を冷却することによりゾル化させ、ゾル化させた担体材料を取り除くことで三次元組織体を回収する手法が行われている。

しかしながら、特許文献４の手法では、熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す担体材料が人工的に作製された材料であるため、培養過程において三次元組織体に与える影響が懸念される。加えて、特許文献４では別途、外因性細胞外マトリックス成分としてコラーゲン成分が投入されているため、回収された三次元組織体には依然として外因性細胞外マトリックス成分が含まれていることになる。

また、例えば外因性の細胞外マトリックス成分としてコラーゲン成分が投入されている場合には、コラーゲンを分解するためにコラゲナーゼで処理を行えば外因性のコラーゲン成分を溶解することは可能であるが、細胞自身及び当該細胞により分泌された内因性のコラーゲン成分に基づく組織構造にもダメージを与える可能性がある。

本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す細胞外マトリックス含有組成物の提供を目的とする。

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下に示す発明によって、上記課題が解決できることを見出した。

すなわち、本発明は、例えば以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）断片化された細胞外マトリックス成分と水性媒体とを含む、細胞外マトリックス含有組成物。
（２）断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含む、（１）に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
（３）断片化された細胞外マトリックス成分は、少なくとも一部が繊維状である、（１）又は（２）に記載の細胞外マトリックス含有組成物。
（４）断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１００ｎｍ〜４００μｍである、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
（５）細胞外マトリックス成分の含有量が、前記細胞外マトリックス含有組成物全量を基準として、１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下である、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
（６）断片化された細胞外マトリックス成分が天然由来である、（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
（７）３５．５℃±２℃でゾル状態からゲル化し、４．５℃±２℃でゲル状態からゾル化する、（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成用仮足場材。
（９）細胞外マトリックス成分含有率の高い三次元組織体の形成剤であって、（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤。
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体。
（１１）断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含む、三次元組織体から細胞を回収する方法であって、三次元組織体を冷却して、断片化された細胞外マトリックス成分をゾル化させる工程と、ゾル化させた断片化された細胞外マトリックス成分を除去する工程と、を含む、方法。

本発明によれば、熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す細胞外マトリックス含有組成物の提供が可能となる。本発明の細胞外マトリックス含有組成物を用いて形成された三次元組織体は、培養開始後一定期間経過後に、冷却することにより、外因性細胞外マトリックス成分をゾル化させることができるため、三次元組織体自身にダメージを与えることなく、三次元組織体から外因性細胞外マトリックス成分を除去することが可能である。

図１は、断片化コラーゲン成分の顕微鏡写真である。 図２は、断片化コラーゲン成分及びリン酸緩衝生理食塩水を含む組成物の４℃における５００ｎｍの透過率（ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ）の測定結果を示すグラフである。 図３（Ａ）は、断片化コラーゲン含有液及び市販のコラーゲン含有液の３７℃における５００ｎｍの透過率の測定結果を示すグラフであり、図３（Ｂ）は、断片化コラーゲン含有液及び市販のコラーゲン含有液の４℃における５００ｎｍの透過率の測定結果を示すグラフである。 図４は、４℃又は３７℃における断片化コラーゲン含有液を示す写真である。 図５（Ａ）は、３７℃及び４℃における市販のコラーゲン含有液を示す写真であり、図５（Ｂ）は、３７℃及び４℃における断片化コラーゲン含有液を示す写真である。 図６（Ａ）〜（Ｃ）は、断片化コラーゲン成分及び細胞を含む三次元組織体を示す顕微鏡写真である。 図７（Ａ）〜（Ｂ）は、細胞の回収結果を示す顕微鏡写真である。 図８は、２質量％、３質量％、又は５質量％の断片化コラーゲン成分を含有する液のゾル−ゲル転移を示すグラフである。 図９（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれブタ由来、ウシ由来、又はヒト由来の断片化コラーゲン含有液のゾル−ゲル転移を示す写真である。 図１０は、断片化コラーゲン成分のＣＤスペクトル測定結果を示すグラフである。 図１１は、断片化コラーゲン成分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

＜細胞外マトリックス含有組成物＞
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、断片化された細胞外マトリックス成分（以下、「断片化細胞外マトリックス成分」ともいう。）と水性媒体とを含む。本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す。

例えば、外因性細胞外マトリックス成分としてコラーゲン成分（外因性コラーゲン成分）を用いて、三次元組織体を形成する場合、生理的条件下で培養を行うと、外因性コラーゲン成分のゲル化が進行する。ゲル化した外因性コラーゲン成分は、三次元培養の開始初期段階においては、細胞が接着する支持体として機能すると共に、細胞に対して生物学的な影響を与える。一方、このような生理的条件下での外因性コラーゲン成分のゲル化は一般的に熱不可逆的であることが実験的事実により知られている（例えば特許文献５）。そのため、ゲル化して一定期間培養した後に外因性コラーゲン成分だけを除去することは通常容易ではない。これに対し、本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、一度ゲル化した後も、冷却することによりゾル化するため、三次元組織体の形成後に、外因性細胞外マトリックス成分を除去することが可能となる。これにより外因性細胞外マトリックス成分の一部又は全部が除去された三次元組織体を回収することができる。

細胞外マトリックス成分は、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックス分子とは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらを１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよい。

コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。

プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲン成分を用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。コラーゲンは、テロペプチドが除去されたコラーゲンであるアテロコラーゲンであることが好ましい。アテロコラーゲンは、例えば、トロポコラーゲンをペプシン処理することにより得ることができる。コラーゲンがアテロコラーゲンであることによって、細胞外マトリックス含有組成物がより優れた感熱応答性を示すため、好ましい。

細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、哺乳類、鳥類、爬虫類、又は魚類等であってよく、哺乳類であることが好ましい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、哺乳類であってよく、感熱応答性が特に優れたものとなる観点から、ブタであることが好ましい。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、三次元組織化する細胞の由来と同じであっても異なっていてもよい。

断片化細胞外マトリックスは、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により細分化した成分である。断片化細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス分子の結合を切断することなく、細胞外マトリックス成分を解繊して得られる解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分が、解繊された細胞外マトリックス成分である場合、ゾル−ゲル転移能がより一層優れたものとなり、足場材料としてより効果的に用いることが可能となる。

細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を断片化（又は解繊）してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。断片化細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで断片化することにより得ることもできる。

断片化細胞外マトリックス成分の由来となる細胞外マトリックス成分は、一種類であってもよいし、複数種の細胞外マトリックス成分を併用してもよい。

断片化細胞外マトリックス成分は、断片化されたコラーゲン成分（断片化コラーゲン成分）を含むことが好ましい。

断片化細胞外マトリックス成分は、天然由来であってよい。天然由来である断片化細胞外マトリックス成分は、天然の細胞外マトリックス成分を断片化したものであり、天然由来である断片化細胞外マトリックス成分には、化学的処理により天然の細胞外マトリックス分子の構造を改変した成分は含まれない。化学的処理としては、例えば、アルカリ処理による加水分解等が挙げられる。

断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状の細胞外マトリックス成分で構成される形状、又は複数の糸状の細胞外マトリックス成分が集合して構成される形状を意味する。例えば、断片化コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造（繊維状）を維持していることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、少なくとも一部が繊維状である断片化コラーゲン成分であることが好ましい。

一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ〜４００μｍであることが好ましく、厚い組織が形成しやすくなる観点から、より好ましくは、５μｍ〜４００μｍ、１０μｍ〜４００μｍ、２２μｍ〜４００μｍ又は１００μｍ〜４００μｍである。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ〜１００μｍであってよく、好ましくは１００ｎｍ〜５０μｍ、１００ｎｍ〜３０μｍ、１００ｎｍ〜２５μｍ、１００ｎｍ〜２０μｍ、１００ｎｍ〜１５μｍ、１００ｎｍ〜１０μｍ又は１００ｎｍ〜１μｍである。この場合、組織形成が安定しやすく好ましい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましい。

細胞外マトリックス成分の平均径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましい。

断片化細胞外マトリックス成分の平均直径及び平均長は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。なお、本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。

断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。三次元組織体形成用の足場としての期待される効果をより一層高め、形成される三次元組織体の厚みをより厚くする観点から、断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、細胞外マトリックス含有組成物全量基準で、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、１５ｍｇ／ｍＬ以上、又は２０ｍｇ／ｍＬ以上であってよく、２００ｍｇ／ｍＬ以下、１００ｍｇ／ｍＬ以下、９０ｍｇ／ｍＬ以下、又は８０ｍｇ／ｍＬ以下であってよい。断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、細胞外マトリックス含有組成物全量基準で、１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。

「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、細胞外マトリックス成分が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、水性媒体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられるがこれに制限されない。また、水性媒体は、エタノールを含有する水溶液であってもよい。

水性媒体のｐＨは細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない範囲が好ましい。水性媒体のｐＨは、細胞に投入した際の細胞への負荷を軽減する観点から、７．０以上であってよく、８．０以下であってよい。水性媒体のｐＨは、例えば、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０である。水性媒体は、上記ｐＨの範囲において緩衝能を有することが好ましく、より好ましくは液体培地である。液体培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。当該培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞外マトリックス含有組成物のｐＨは、上記水性媒体のｐＨと同様であってもよい。

細胞外マトリックス含有組成物を三次元組織体形成のために用いる場合、細胞外マトリックス含有組成物に対し、ろ過滅菌を行った上で、保管又は組織形成に用いることが好ましい。コラーゲン等の細胞外マトリックス成分（断片化されていない細胞外マトリックス成分）は、ゾル−ゲル転移しないため、高濃度にすると滅菌フィルターによるろ過滅菌が通常困難である。これに対し、本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、冷却してゾル状態にすることが可能であるため、滅菌フィルターによるろ過滅菌を容易に行うことができる。

本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、低温下ではゾル状態であり、高温下ではゲル状態である。例えば、当該細胞外マトリックス含有組成物は、少なくとも０℃以上１５℃以下の温度範囲ではゾル化、少なくとも２５℃以上の温度範囲ではゲル化の進行を呈していてよい。水性媒体がリン酸緩衝生理食塩水である場合、細胞外マトリックス含有組成物は、３７℃でゲル状態であってよく、４℃でゾル状態であってよい。ゾル状態であること及びゲル状態であることは目視により確認することができる。

細胞外マトリックス含有組成物がゾル状態からゲル化する際の温度（ゲル転移温度）は、例えば、２５〜４０℃であってよく、好ましくは３０〜３８℃であり、より好ましくは３３．５〜３７．５℃である。細胞外マトリックス含有組成物がゲル状態からゾル化する際の温度（ゾル転移温度）は、例えば、２〜２０℃であってよく、好ましくは２〜１８℃であり、より好ましくは２．５〜６．５℃である。ゲル転移温度は、細胞外マトリックス含有組成物を４℃から４０℃に段階的に昇温した場合に、５００ｎｍにおける透過率が最大値と最小値の中間値となるときの温度である。段階的な昇温の条件は、０．５℃／ｍｉｎでもよく、１℃／ｍｉｎでもよい。ゾル転移温度は、細胞外マトリックス含有組成物を４０℃から４℃に段階的に降温した場合に、５００ｎｍにおける透過率が最大値と最小値の中間値となるときの温度である。段階的な降温の条件は、０．５℃／ｍｉｎでもよく、１℃／ｍｉｎでもよい。ゲル転移温度及びゾル転移温度を測定する際の細胞外マトリックス含有組成物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、例えば、細胞外マトリックス含有組成物の全質量を基準として、２〜５質量％であってよく、２質量％、３質量％又は５質量％であってよい。

細胞外マトリックス含有組成物は、３５．５℃±２℃でゾル状態からゲル化するものであってよく、４．５℃±２℃でゲル状態からゾル化するものであってよい。

ゾル状態又はゲル状態であることの判定は、５００ｎｍの透過率を測定することにより行うこともできる。例えば、５００ｎｍの透過率が４０％以上である場合にゾル状態、５００ｎｍの透過率が４０％未満である場合にゲル状態と判定できる。５００ｎｍの透過率は、後述する実施例に記載の方法により測定することができる。透過率を測定する波長は、５００ｎｍに限定されず、他の波長でもよい。例えば、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍでもよい。また、ゲル状態では、ゾル状態に比べて粘度が高い。

＜細胞外マトリックス含有組成物の用途＞
本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、三次元組織体を形成するために用いられる仮足場材（三次元組織体形成用仮足場材）として好適に用いることができる。したがって、本発明の一実施形態として、上述の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成用仮足場材が提供される。なお、仮足場材とは、三次元組織体の形成後に除去可能な足場材を意味する。ここで、「三次元組織体の形成後に除去可能」とは、細胞外マトリックス含有組成物中の断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が除去可能であることを意味する。

本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、断片化細胞外マトリックス成分（好ましくは断片化コラーゲン成分）を高濃度で含むことができる。具体的には、細胞外マトリックス含有組成物中の断片化細胞外マトリックス成分の含有率は、２質量％以上とすることができる。そのため、細胞外マトリックス成分含有率の高い三次元組織体の製造に好適に利用することができる。すなわち、本実施形態に係る細胞外マトリックス含有組成物は、細胞外マトリックス成分含有率の高い三次元組織体の形成剤として好適に利用することができる。したがって、本発明の一実施形態として、細胞外マトリックス成分含有率の高い三次元組織体の形成剤であって、上述の細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤が提供される。

細胞外マトリックス成分含有率の高い三次元組織体とは、三次元組織体を基準として、細胞外マトリックス成分の含有率が１０質量％以上である三次元組織体をいう。当該三次元組織体における細胞外マトリックス成分の含有率は、三次元組織体を基準として、３０質量％以上、４０質量％以上又は５０質量％以上であってもよい。なお、細胞外マトリックス成分の含有率は、断片化細胞外マトリックス成分を含む細胞外マトリックス成分の含有率である。また、細胞外マトリックス成分の含有率は、三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。

＜三次元組織体＞
一実施形態に係る三次元組織体は、上述の細胞外マトリックス含有組成物を含む。三次元組織体は、細胞を更に含む。細胞外マトリックス含有組成物中の断片化細胞外マトリックス成分は、外因性細胞外マトリックス成分である。細胞の少なくとも一部は、断片化細胞外マトリックス成分に接着していてよい。断片化細胞外マトリックス成分については上述のとおりであってよい。

「三次元組織体」とは、線維性コラーゲン成分等の細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。

細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。具体的には、細胞として、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ−ＳＭＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、一種単独で用いてもよいし、複数種類の細胞を組み合わせて用いてもよい。

細胞として、線維性コラーゲン等のコラーゲンを分泌するコラーゲン分泌細胞を含むことが好ましい。コラーゲン分泌細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。

三次元組織体が細胞としてコラーゲン分泌細胞を含む場合、三次元組織体は内因性コラーゲンを含んでいてよい。「内因性コラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲンを意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。

三次元組織体が細胞としてコラーゲン分泌細胞を含む場合、三次元組織体は、コラーゲン分泌細胞を含む細胞と、断片化コラーゲン成分と、内因性コラーゲン成分とを含んでいてよい。この場合、コラーゲン分泌細胞を含む細胞の少なくとも一部は断片化細胞外マトリックス成分及び／又は内因性コラーゲン成分に接着していてよい。

従来の三次元組織体は、コラーゲンの濃度が低く、且つ細胞密度が高いものであった。そのため、培養中又は培養後に細胞のけん引力によって三次元組織体が収縮したり、培養中又は培養後に細胞が産生する酵素によって三次元組織体が容易に分解される等の問題があった。一実施形態に係る三次元組織体は、コラーゲンの濃度が従来のものより高く、収縮が起きにくく安定である。

三次元組織体は、細胞として、コラーゲン分泌細胞と、コラーゲン分泌細胞以外の細胞と、を含んでいてよい。コラーゲン産生細胞以外の細胞としては、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ−ＳＭＣ））等が挙げられる。好ましくは、上記三次元組織体を構成する細胞が、血管内皮細胞、がん細胞及び心筋細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む。

三次元組織体におけるコラーゲンの含有率は、三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１〜９０質量％であってよく、１０〜９０質量％であることが好ましく、１０〜８０質量％であることが好ましく、１０〜７０質量％であることが好ましく、１０〜６０質量％であることが好ましく、１〜５０質量％であることが好ましく、１０〜５０質量％であることが好ましく、１０〜３０質量％であることがより好ましく、２０〜３０質量％であることがより好ましい。

ここで、「三次元組織体におけるコラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲンを意味し、内因性コラーゲンであってもよいし、断片化コラーゲン成分に由来するコラーゲン（外因性コラーゲン）であってもよい。すなわち、三次元組織体が内因性コラーゲン及び外因性コラーゲンを含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲンの濃度は、内因性コラーゲン及び外因性コラーゲンの合計濃度を意味する。上記コラーゲンの濃度は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。

三次元組織体におけるコラーゲンの量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。

コラーゲンの量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。

（サンプルの調製）
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を塩酸（６ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ）と混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように塩酸（６ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ）で適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。

（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ ｉｎ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と、１２５μＬの塩酸（１２ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ）を加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。塩酸（４ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ）９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。

（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ｒｅａｇｅｎｔ Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷で室温まで冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。

また、三次元組織体中に占めるコラーゲンを、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲンを既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲンの存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。

例えば、三次元組織体中のコラーゲンを面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１〜９９％であり、１〜９９％であることが好ましく、５〜９０％であることが好ましく、７〜９０％であることが好ましく、２０〜９０％であることが好ましく、５０〜９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン」については、上述したとおりである。三次元組織体が断片化コラーゲン成分に由来する外因性コラーゲンを含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲンの面積の割合は、内因性コラーゲン及び上記外因性コラーゲンを合わせた面積の割合を意味する。上記コラーゲンの面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲンの面積の割合として算出することが可能である。

上記三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。

上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。

上記三次元組織体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。三次元組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。

ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。

また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。

断片化細胞外マトリックス成分及び細胞を含む三次元組織体は、例えば、（１）断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体（第１の水性媒体）を含む細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる工程（工程（１））、並びに（２）上記細胞外マトリックス含有組成物が接触した細胞を培養する工程（工程（２））を備える方法により製造することができる。

三次元組織体の製造方法において、細胞は、コラーゲン産生細胞を含む細胞であることが好ましい。コラーゲン分泌細胞を含む細胞を用いることで、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。このような三次元組織体が得られるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推測される。

従来の足場を利用した三次元組織体の製造方法では、予め用意された足場に目的の細胞を注入するため、足場の内部にまで均一に細胞を分布させることが困難であった。細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である場合、まず、細胞が断片化細胞外マトリックス成分上に接触して接着する。その後、細胞は自分自身で細胞外マトリックス成分を構成するタンパク質（例えば、線維性コラーゲン等のコラーゲン）を産生する。産生されたタンパク質は断片化細胞外マトリックス成分上に接触して接着することで、断片化細胞外マトリックス成分間の架橋剤として働き、細胞が均一に存在する環境下で細胞外マトリックス成分を構成するタンパク質等の構造化が進む。その結果、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。ただし、上記推測は本発明を限定するものではない。

また、特許文献１〜３に記載の製造方法では、三次元組織体を製造するための工程数が多く、１時間程度の作業時間が必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、短い作業時間で三次元組織体を製造できる。さらに、本実施形態に係る製造方法によれば、簡便に三次元組織体を製造できる。特許文献２に記載の製造方法では、厚さが１ｍｍ程度の三次元組織体を製造するために、細胞が少なくとも１０^６ｃｅｌｌｓ必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造できる。

工程（１）では、断片化細胞外マトリックス成分及び第１の水性媒体を含む細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる。これにより、細胞外マトリックス含有組成物中の断片化細胞外マトリックス成分と細胞とが接触する。細胞外マトリックス含有組成物と細胞とを接触させる方法は特に制限されず、例えば、第２の水性媒体中において、接触させてよい。例えば、細胞を含む培養液に、細胞外マトリックス含有組成物を加える方法、細胞外マトリックス含有組成物に、細胞と、必要に応じて第２の水性媒体とを加える方法、又は予め用意した第２の水性媒体に、細胞外マトリックス含有組成物及び細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。第１及び第２の水性媒体は同種であってもよく、異種であってもよい。

工程（１）においては、コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を含む細胞を用いてよい。コラーゲン産生細胞、及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞としては、上述した細胞をそれぞれ用いることができる。コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を共に用いて三次元組織体を製造することで、種々のモデル組織を製造することが可能になる。例えば、ＮＨＣＦ及びＨＵＶＥＣを用いた場合、内部に毛細血管を有する三次元組織体を得ることが可能になる。ＮＨＣＦ及び大腸がん細胞を用いた場合、大腸がんのモデル組織を得ることが可能になる。また、ＮＨＣＦ及びｉＰＳ−ＣＭを用いた場合、同期拍動を示す心筋のモデル組織を得ることが可能になる。

工程（１）における断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、水性媒体中の断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、細胞外マトリックス含有組成物全量基準で、０．１〜９０質量％であってもよいし、１〜３０質量％であってもよい。

工程（１）における断片化細胞外マトリックス成分の量は、１×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１〜１００ｍｇであってもよいし、１〜５０ｍｇであってもよい。

工程（１）において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞との質量比（細胞外マトリックス成分／細胞）は、１／１〜１０００／１であることが好ましく、９／１〜９００／１であることがより好ましく、１０／１〜５００／１であることがさらに好ましい。

コラーゲン産生細胞とその他の細胞とを共に用いる場合、その他の細胞の比率に対する工程（１）におけるコラーゲン産生細胞の細胞数の比（工程（１）におけるコラーゲン産生細胞／その他の細胞の比）は、９／１〜９９／１であってもよく、５０／５０〜８０／２０であってもよく、２０／８０〜５０／５０であってもよく、１０／９０〜５０／５０であってもよい。

工程（１）及び工程（２）の間に、水性媒体中における断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における断片化細胞外マトリックス成分及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。

工程（１）は、水性媒体（第２の水性媒体）中で細胞の層を形成させた後、断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体（第１の水性媒体）を含む細胞外マトリックス含有組成物を接触させることにより行われてもよい。細胞の層を細胞外マトリックス含有組成物と接触させる前に形成することで、下層部の細胞密度が高い三次元組織体を作製することができる。また、コラーゲン産生細胞を含む細胞の層を断片化細胞外マトリックス成分と接触させる前に形成することで、コラーゲン産生細胞を含む細胞の下層部の細胞密度が高い三次元組織体を作製することができる。用いる細胞の種類（例えば、大動脈平滑筋細胞）によっては、この方法により、より生体に近い組織を作製することができる。

工程（２）では、細胞外マトリックス含有組成物が接触した細胞を培養する。これにより、三次元組織体が形成される。工程（２）の後、工程（３）として、さらに細胞を接触させ、細胞を培養する工程を含んでもよい。上記細胞は、工程（１）で用いた細胞と同種であってよく、異種であってもよい。例えば、工程（１）で用いる細胞がコラーゲン産生細胞以外の細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞はコラーゲン産生細胞を含んでもよい。また例えば、工程（１）で用いる細胞がコラーゲン産生細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞はコラーゲン産生細胞以外の細胞を含んでもよい。工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方がコラーゲン産生細胞を含んでもよく、工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方がコラーゲン産生細胞以外の細胞を含んでもよい。上記工程（３）により、二層構造の三次元組織体を作製することができる。例えば、大動脈平滑筋細胞及び血管内皮細胞を用いた場合、並びにヒト皮膚由来線維芽細胞及びヒト表皮角化細胞を用いた場合には、この方法により、より生体に近い組織を作製することができる。また、例えば、ヒト歯肉線維芽細胞と歯肉上皮細胞を用いた場合には、この方法により、組織収縮及び組織割れのない二層構造の三次元組織体を作製することができる。

細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃〜４０℃であってもよく、３０℃〜３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６〜８であってもよく、７．２〜７．４であってもよい。培養時間は、１日〜２週間であってもよく、１週間〜２週間であってもよい。

培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。

工程（２）における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（２）における培地中の細胞密度は、１〜１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０^３〜１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。また、工程（２）における培地中の細胞密度は、工程（１）における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。

上記三次元組織体は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の三次元組織体のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。
収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００

上述の製造方法により例えば、細胞と、細胞外マトリックス成分とを含む三次元組織体であって、上記コラーゲンの含有率が、上記三次元組織体を基準として１０質量％〜９０質量％である、三次元組織体を製造することができる。

三次元組織体を製造する方法は、（４）形成された三次元組織体を冷却して、断片化細胞外マトリックス成分をゾル化させる工程（工程（４））と、工程（４）の後に、（５）ゾル化させた断片化細胞外マトリックス成分を除去する工程（工程（５））とを備えていてもよい。三次元組織体の冷却は、水性媒体中で行ってもよい。

三次元組織体の製造方法が工程（４）及び（５）を備えることにより、三次元組織体の形成後に断片化細胞外マトリックス成分に由来する細胞外マトリックス（外因性細胞外マトリックス）の少なくとも一部を除去することが可能となる。

工程（４）では、三次元組織体を冷却して、断片化細胞外マトリックス成分をゾル化させる。三次元組織体の冷却は、水性媒体中で行ってもよい。三次元組織体の冷却は、三次元組織体及び水性媒体を含む培養液の温度を降下させることにより、実施してよい。三次元組織体を冷却する際の温度（冷却温度）は、水性媒体の種類等に応じて、適宜設定することができる。冷却温度は、例えば、１５℃以下、又は４℃であってよく、０℃超であってよい。

工程（５）では、ゾル化させた（ゾル状態の）断片化細胞外マトリックス成分を除去する。これにより、三次元組織体から外因性の細胞外マトリックス成分である、断片化細胞外マトリックス成分の一部又は全部を除去することができる。

ゾル状態の断片化細胞外マトリックス成分の除去は、例えば、一部又は全部の断片化細胞外マトリックス成分がゾル状態である三次元組織体を水性媒体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、遠心して上清を除去することにより実施することができる。

熱可逆的なゾルーゲル転移を示す細胞外マトリックス含有組成物を用いて形成した三次元組織体は、水性媒体中において、通常の生理条件下（ｐＨ７〜８、３７℃）で一定期間培養したときに、細胞を含んだ形である程度ゲル化が進行している。当該三次元組織体を水性媒体中において、冷却することで、外因性細胞外マトリックス成分である断片化細胞外マトリックス成分をゾル化させ、除去することができる。三次元組織体の構成成分中の外因性細胞外マトリックス成分を除去することによって、外因性成分を含まないよりｉｎ ｖｉｖｏに近い組織体を得ることができる。

また、断片化細胞外マトリックス成分と水性媒体とを含む細胞外マトリックス含有組成物は、冷却することにより、断片化細胞外マトリックス成分がゾル状態になる。そのため、例えば、上述の製造方法により、三次元組織体を形成した後に、断片化細胞外マトリックス成分をゾル化させて、ゾル状態の断片化細胞外マトリックス成分を除去することにより、三次元組織体から容易に細胞を回収することができる。したがって、本発明は一態様において、断片化細胞外マトリックス成分及び細胞を含む三次元組織体から細胞を回収する方法であって、形成された三次元組織体を冷却して、断片化細胞外マトリックス成分をゾル化させる工程と、ゾル化させた断片化細胞外マトリックス成分を除去する工程とを含む方法が提供される。

三次元組織体からの細胞の回収を目的として断片化細胞外マトリックス成分を除去する場合には、外因性成分を除去した後に、細胞な生存率に著しく多大な影響を与えない濃度範囲でコラゲナーゼを含む溶液に組織体を懸濁することで、より効率的に細胞の回収を行うことができる。

以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
ペプシン処理ブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン（日本ハム株式会社製）の凍結乾燥体５０ｍｇを１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）５．０ｍＬに分散させ、この分散液をホモジナイザー（ＶＩＯＬＡＭＯ）により６分間ホモジナイズすることで、断片化コラーゲン成分（ＣＭＦ）の懸濁液を得た。断片化コラーゲン成分の懸濁液に対し、洗浄、遠心分離を行った。図１は、得られた断片化コラーゲン成分の顕微鏡写真である。断片化コラーゲン成分は、平均直径が１６μｍ±４．７μｍであり、平均長（長さ）が２４８μｍ±５５．３μｍであった（サンプル数１０）。

得られた断片化コラーゲン成分を１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水に希釈して、２、３、又は５質量％の断片化コラーゲン成分を含む液（断片化コラーゲン含有液）を各５．０ｍＬ調製した。各断片化コラーゲン含有液を４℃保存で３日間保存し、その間の断片化コラーゲン含有液の透過率(transmittance(%T))の変遷を一日置きに観察した。結果を図２に示す。図２に示すとおり、いずれの濃度の断片化コラーゲン含有液においても４℃保存下で十分な透過率を有しており、ゾル化が確認された。２、３及び５質量％の断片化コラーゲン含有液の４℃保存開始から３日間経過時点の透過率の平均値は、それぞれ９４．９％、９０．４％及び８６．１％であった。透過率の測定は、５００ｎｍの波長で、V-670 spectrophotometer（Jasco）を用いて実施した。

２、３、又は５質量％の断片化コラーゲン含有液、及び市販のコラーゲン溶液（０．１質量％、ニッピ株式会社製）を、２４００秒ごとに、３７℃と４℃に保持するように温度変化を繰り返して、波長５００ｎｍの光の透過率の変化を確認した。結果を図３Ａ及びＢに示す。その結果、２、３及び５質量％のいずれの断片化コラーゲン含有液も可逆的な熱応答性を示した。すなわち、断片化コラーゲン含有液は、３７℃ではゲル状態であり、４℃ではゾル状態であった。一方、市販のコラーゲン溶液ではそのような熱応答性は示さず、ゲル化したままであった。

また、２、３及び５質量％の断片化コラーゲン含有液を、４℃から４０℃まで１℃／ｍｉｎで昇温させると、それぞれ３０℃、３２℃及び３０℃（ゲル転移温度）で、ゾル状態からゲル状態に転移した。２、３及び５質量％の断片化コラーゲン含有液を４０℃から４℃まで１℃／ｍｉｎで降温させると、それぞれ１０℃、１３℃及び１５℃（ゾル転移温度）で、ゲル状態からゾル状態に転移した。

なお、市販のコラーゲン溶液は、ニッピ株式会社のプロトコルに則り調製したものである。ニッピ株式会社製ｔｙｐｅ Ｉ ｂｏｖｉｎｅ ｓｋｉｎ （ａｃｉｄ ｓｏｌｕｂｌｅ）の０．３質量％酢酸溶液（１０００μＬ）に対し、５ｘ Ｄ−ＭＥＭ（６００μＬ）、ＦＢＳ（３００μＬ）及び滅菌水（１１００μＬ）を添加して、３倍希釈することにより調製した。

図４は、２質量％の断片化コラーゲン含有液（２％ＣＭＦ溶液）を用いた場合の熱応答性を目視で観察結果を示す。このように、３７℃では断片化コラーゲン含有液はゲル化し、透過率の著しい低下が確認された。断片化コラーゲン含有液は、４℃下で保存すると再び溶液がゾル化し、透過率が上昇することが確認された。

日本ハム株式会社製のペプシン処理ブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体５０ｍｇを７０体積％エタノール水溶液５．０ｍＬに分散させ、この分散液をホモジナイザーにより、２分間ホモジナイズした後、１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水に希釈することで、断片化コラーゲン成分（ＣＭＦ）及びリン酸緩衝生理食塩水を含む断片化コラーゲン含有液を得た。７０体積％エタノール水溶液に分散させてから、調製することによっても、断片化コラーゲンを作製することができた。

（実施例２）
実施例１で用いた断片化コラーゲン含有液を市販のコラーゲン溶液と同様の条件下でゲル化した場合に熱応答性を発揮するか確認した。具体的には、酢酸０．５ｍＭ、１０％ ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ溶液中に０．１質量％の断片化コラーゲン成分を懸濁し、ＮａＯＨを添加してｐＨを７．３に調整した。この状態で３７℃でゲル化させた。その後、４℃下で一日保存し、断片化コラーゲン含有液がゾル化するか確認した。その結果、市販のコラーゲン溶液では、一度ゲル化すると４℃下で保存してもゲル状態を維持していた（図５Ａ参照）。これに対し、断片化コラーゲン含有液では、４℃下で保存することにより、ゾル化が確認された（図５Ｂ参照）。

（実施例３：正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を用いた三次元組織体の製造）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（Ｘ１０ ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて６分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン成分を得た。血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて、分散液（細胞外マトリックス含有組成物）全量基準の含有量が２０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、又は６０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲン成分を分散させた。得られた分散液１００μＬ（それぞれ断片化コラーゲン成分約２ｍｇ、４ｍｇ、又は６ｍｇを含有する）に、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）５．０ｘ１０^５ｃｅｌｌを懸濁し、２４ウェルセルカルチャーインサート（コーニング製）に添加し、５日間培養した。その後、得られた三次元組織体をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した。その結果を図６に示す。図６のとおり、各断片化コラーゲン分散液に懸濁して形成した組織において、コラーゲン濃度に応じた厚みでの組織形成が確認できた。また、インサート上での凝集も確認されなかった。

（実施例４：三次元組織体からの断片化コラーゲン成分の除去及び細胞の回収）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（Ｘ１０ ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて６分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン成分を得た。血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて、分散液（細胞外マトリックス含有組成物）全量基準の含有量が４０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲン成分を分散させた。得られた分散液１００μＬ及び２００μＬ（それぞれ断片化コラーゲン成分を約４ｍｇ、又は８ｍｇ含有する）それぞれに対して、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）５．０ｘ１０^５ｃｅｌｌ、及び２．０ｘ１０^５ｃｅｌｌを懸濁し、２４ウェルセルカルチャーインサートに添加し、５日間培養した。その後、氷冷により４℃以下で３０分放置した後、組織体を２００μＬのＰＢＳに懸濁して遠心（３５００ｒｐｍ、１分間）し、上清を除去した。更に沈降成分に対して、ＤＭＥＭを１ｍＬ加え、１ｍｇ／ｍＬ コラゲナーゼ溶液３００μＬを加えた後、セルカウントを行い、生存細胞率、及び初期播種量を起算とした回収率を算出した。図７は、回収後の細胞を示す写真である。本実施例によって回収された画分における生細胞率は７５％（断片化コラーゲン成分４ｍｇを含有する場合：７５％、断片化コラーゲン成分８ｍｇを含有する場合：８８％）を超え、初期播種量から換算して３０〜４０％程度（断片化コラーゲン成分４ｍｇを含有する場合：３１％、断片化コラーゲン成分８ｍｇを含有する場合：４３％）の生細胞が回収できることが確認できた。なお、コラゲナーゼ溶液は、より正確なセルカウントを実施するために加えた。

（実施例５：断片化コラーゲン濃度による転移温度の変化）
濃度２質量％、濃度３質量％、又は濃度５質量％の断片化コラーゲン含有液を準備した。上記濃度は、水溶液の全質量を基準とする断片化コラーゲン成分の濃度である。各濃度の断片化コラーゲン含有液の温度を４℃から４０℃、又は４０℃から４℃に、変化させたときの波長５００ｎｍの透過光を測定した。温度は、０．５℃／分で上昇又は下降させた。

図８に示すように、ゲルからゾル化する際の温度は３４〜３７℃であり、ゲルからゾル化する際の温度は３〜６℃であった。断片化コラーゲン成分における、ゲル化温度は３５．５℃±２℃、ゾル化温度は４．５℃±２℃であった。

（実施例６：コラーゲンの由来による効果）
ブタ由来、ウシ由来、又はヒト由来の皮膚コラーゲン（Ｉ型）を用いて、濃度２質量％の断片化コラーゲン含有液を準備した。当該濃度は、水溶液の全質量を基準とする断片化コラーゲン成分の濃度である。ゾル状態の断片化コラーゲン含有液を３７℃まで昇温させて、ゲル化させた。ゲル化後、断片化コラーゲン含有液の４℃まで冷却して、ゾル化させた。ブタ、ウシ及びヒトのいずれの動物に由来する断片化コラーゲン成分であっても、熱可逆的なゾル−ゲル転移が起こることを確認した。図９中、（Ａ）はブタ由来、（Ｂ）はウシ由来、（Ｃ）はヒト由来の断片化コラーゲン含有液の熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す。

ウシ由来に比べ、ブタ由来又はヒト由来の断片化コラーゲン成分がより溶解性に優れており、ブタ由来の断片化コラーゲン成分は、特に顕著に溶解性に優れていた。ブタ由来の断片化コラーゲンの感熱応答性は、ウシ由来又はヒト由来に比べて優れていた。

（実施例７：ＣＤスペクトルによる三重らせん構造の確認）
断片化コラーゲン成分をＣＤスペクトルによって分析した。結果を図１０に示す。ＣＤスペクトルの測定は、円二色性分散計（日本分光株式会社，Ｊ−７２５）を用いて、メーカー推奨の手順により行った。断片化コラーゲン成分０．０５ｍｇ／ｍＬ（終濃度）を５０ｍＭ酢酸に溶解させ、測定した。

図１０に示すとおり、三重らせん構造を示す２２０ｎｍ付近のピークが、断片化コラーゲン成分に存在していることを確認した。ゾル−ゲル転移によって、波形に変化が見られないことから、ゾル−ゲル転移が、断片化コラーゲン成分の構造に影響を与えていないことを確認した。断片化コラーゲン成分が、三重らせん構造を維持していることにより、ゾル−ゲル転移特性が高くなっていたと推測される。

（実施例８：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる断片化コラーゲン成分の分子量の確認）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、断片化コラーゲン成分と、コラーゲン成分（非断片化コラーゲン成分）との分子量を比較した。アクリルアミド濃度が４−２０％のグラジエントゲルを用い、それぞれの断片化コラーゲン成分の泳動サンプルには２．１５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して泳動を行った。断片化コラーゲン成分は、分子１つ当たりの分子量はコラーゲン成分と差異がないことが確認された（図１１）。実施例１に記載の方法により得られる断片化コラーゲン成分は、分子構造が破壊されて小さくなっているのではなく、コラーゲン成分が解繊して小さくなっていることが確認された。

Claims (10)

1. 断片化された細胞外マトリックス成分と水性媒体とを含み、
   前記断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含み、
   前記断片化された細胞外マトリックス成分の由来となる動物種が、ヒト、ブタ、又はウシであり、
   ｐＨが７．０以上８．０以下であり、
   ４．５±２℃でゾル状態である、ゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
2. 前記断片化された細胞外マトリックス成分が、前記水性媒体中でホモジナイズしたものである、請求項１に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
3. 前記断片化された細胞外マトリックス成分は、少なくとも一部が繊維状である、請求項１又は２に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
4. 前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１００ｎｍ〜４００μｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
5. 前記細胞外マトリックス成分の含有量が、前記ゾル状細胞外マトリックス含有組成物全量を基準として、１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
6. 前記断片化された細胞外マトリックス成分が天然由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
7. ３５．５℃±２℃でゾル状態からゲル化し、４．５℃±２℃でゲル状態からゾル化する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成用仮足場材。
9. 細胞外マトリックス成分含有率の高い三次元組織体の形成剤であって、
   請求項１〜７のいずれか一項に記載のゾル状細胞外マトリックス含有組成物を含む、三次元組織体形成剤。
10. 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含む、三次元組織体から細胞を回収する方法であって、
    前記三次元組織体を冷却して、前記断片化された細胞外マトリックス成分をゾル化させる工程と、ゾル化させた前記断片化された細胞外マトリックス成分を除去する工程と、を含み、
    前記断片化された細胞外マトリックス成分が断片化されたコラーゲン成分を含み、
    前記断片化された細胞外マトリックス成分の由来となる動物種が、ヒト、ブタ、又はウシである、方法。

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