JPWO2019189786A1 - 細胞培養用シート並びに三次元組織体及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シートを提供する。

Description

本発明は、細胞培養用シート並びに三次元組織体及びその製造方法に関する。
近年、生体外で細胞の三次元組織体を構築する技術が開発されている。例えば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、ポリ乳酸等を材料とした足場に細胞を播種して三次元組織体を製造する方法（非特許文献１）等が提案されている。また、本発明者らはこれまで、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献２）、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び被覆細胞を三次元に配置することを含む三次元組織体の製造方法であって、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び浸漬させた細胞と被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法（特許文献３）等を提案している。このような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。
特開２０１２−１１５２５４号公報 国際公開第２０１５／０７２１６４号 国際公開第２０１６／０２７８５３号 特開２００７−２２８９２１号公報
Nature Biotechnology, 2005, Vol.23, NO.7, p.879-884 Biomaterials, 2007, Vol.28, p4378-98 Circulation Research, 2002, Vol.90, issue3
ところで、三次元組織化技術の発展により、生物の有する様々な組織をインビトロで再現する試みが盛んとなっている。実際の生体内の組織はその種別毎に多様な形態的パターン及び機能を呈するため、上述した数々の三次元組織化技術を用いてもその再現は必ずしも容易ではない。例えば、大動脈血管壁においては動脈の内側から内皮細胞(内膜)―平滑筋細胞(中間層)―繊維芽細胞(外膜)といった構成を有するが、それぞれの細胞が存在する領域内及び領域間において固有の形態及び組成で細胞外マトリックス成分が介在しているために、単にこれらの細胞からなる層を３層積層しただけでは十分にその形態を模倣できているとは言えない。例えば、上述の大動脈血管壁モデルの平滑筋細胞を含む細胞集団の層等においては、平滑筋細胞からなる細胞集団の層と細胞外マトリックスを主成分とする層が交互に重ねられて層状構造が形成されている。層状構造の三次元組織化技術としては、例えば細胞集団の層の上に、細胞外マトリックス成分を含む物質をコートし、更にその上に新たな細胞集団の層を形成していく方法（特許文献４）、細胞シートを形成しそれを積層していく手法（非特許文献３）等がある。
しかしながら、上記いずれの技術においても、細胞集団の間に形成される層は、組織形成に応用できるほど充分な膜厚で形成できていなかった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、充分な厚さを有する細胞培養用シート及び当該細胞培養用シートを用いて構成された三次元組織体の提供を目的とする。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下に示す発明によって、上記課題が解決できることを見出した。
本発明は、細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シートに関する。本発明は細胞外マトリックス成分を含んでいるため、充分な厚さを有する細胞培養用シートが提供される。
細胞外マトリックス成分は、断片化細胞外マトリックスを含んでいてよい。この場合、充分な厚さを有する細胞培養用シートがより形成されやすくなると共に、耐屈曲性及び加工性、並びに水の透過性がより優れたものとなる。
細胞培養用シートの厚さは、５μｍ以上であってよい。細胞外マトリックス成分は、天然由来であってよい。
細胞外マトリックス成分は、エラスチン、コラーゲン、断片化エラスチン及び断片化コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。この場合、充分な厚さを有する細胞培養用シートがより形成されやすくなる。
細胞外マトリックス成分は、エラスチン及び断片化エラスチンからなる群より選択される少なくとも１種のエラスチン成分を含んでいてよい。この場合、エラスチン成分の含有量は、細胞外マトリックス成分全量に対して、５０質量％以上であってよい。細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、架橋されていてよい。
本発明はまた、細胞外マトリックス成分を含む複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）層と、ＥＣＭ層の間に存在する細胞と、を含み、ＥＣＭ層の厚さが５μｍ以上である、三次元組織体に関する。細胞は、血管上皮細胞及び平滑筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。
本発明はまた、細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シート上に細胞を播種することを含む、三次元組織体の製造方法に関する。当該製造方法は、細胞培養用シート上に播種された細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シートを更に積層することを含んでいてよく、細胞培養用シート上に播種された細胞を培養することを含んでいてよい。
本発明によれば、充分な厚さを有する細胞培養用シート及び当該細胞培養用シートを用いて構成された三次元組織体の提供が可能となる。
図１（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、細胞培養用シートの製造方法を説明するための図である。 図２は、ヘマトキシリン・エオシン染色した断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの断面図を示す顕微鏡写真である。 図３は、動脈由来平滑筋細胞（ＡＯ−ＳＭＣ）の１日間培養後の観察結果を示す写真である。図３（Ａ）は、断片化エラスチン（ＥＭＦ）及びコラーゲンの混合物（Ｍｉｘ）を含むシートを用いて細胞培養した結果を示す写真である。図３（Ｂ）は、断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートを用いて細胞培養した結果を示す写真である。 図４は、動脈由来平滑筋細胞（ＡＯ−ＳＭＣ）の２日間培養後の観察結果を示す写真及び当該写真の簡略図である。図４（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ細胞培養後の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの上面及び側面を示す図並びにそれらの簡略図であり、図４（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ細胞培養後の断片化エラスチン（ＥＭＦ）及びコラーゲンの混合物（Ｍｉｘ）を含むシートの上面及び側面を示す写真並びにそれらの簡略図である。 図５は、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１日間培養後の観察結果を示す写真である。図５（Ａ）は、細胞培養後の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの上面を示す写真であり、図５（Ｂ）は、細胞培養後のＥＭＦ及びコラーゲンの混合物（Ｍｉｘ）を含むシートの上面を示す写真である。 図６は、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１日間培養後の観察結果を示す写真及び当該写真の簡略図である。図６（Ａ）及び（Ｃ）は、細胞培養後の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの上面を示す写真及びその簡略図であり、図６（Ｂ）は、細胞培養後の断片化エラスチン（ＥＭＦ）及びコラーゲンの混合物を含むシートの上面を示す写真及びその簡略図である。 図７は、実施例における三次元組織体の製造方法を説明するための図である。 図８（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ実施例における三次元組織体を示す写真及びその部分的な拡大写真である。 図９（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、実施例における耐屈曲性及び加工性の評価結果を示す写真である。 図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例における透明性の評価結果を示す写真であり、図１０（Ｃ）は、実施例における透明性の評価結果を示すグラフである。 図１１（Ａ）及び（Ｂ）は、実施例における接触角（疎水性）の評価結果を示す写真であり、図１１（Ｃ）は、実施例における接触角（疎水性）の評価結果を示す写真である。 図１２は、断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシート及び断片化コラーゲン（ＣＭＦ）を含むシートのＳＥＭ写真である。図１２（Ａ）は、靭帯由来の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの写真であり、図１２（Ｂ）は、血管由来の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの写真であり、図１２（Ｃ）は、断片化コラーゲン（ＣＭＦ）を含むシートの写真である。 図１３は、断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの光学顕微鏡位相差画像である。図１３（Ａ）は、靭帯由来の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの写真であり、図１３（Ｂ）は、血管由来の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの写真であり、図１３（Ｃ）は、血管由来の断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシートの写真（図１３（Ｂ）の拡大写真）である。 図１４（Ａ）は、断片化エラスチンを含むシート（ＥＭＦシート）を示す写真であり、図１４（Ｂ）は、細胞を播種したＥＭＦシートを積層した三次元組織体を示す写真である。 図１５は、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）により染色した三次元組織体の顕微鏡観察結果を示す顕微鏡写真である。 図１６は、作製した三次元組織体の上面（ｔｏｐ）、及び側面（ｓｉｄｅ）の顕微鏡写真並びに３Ｄ構築写真（３Ｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｍａｇｅ）を示す。 図１７は、作製した三次元組織体の細胞生存性の評価結果を示すグラフである。 図１８は、非架橋の細胞外マトリックス成分又は一部が架橋された細胞外マトリックス成分を含むシートの形状を示す写真である。 図１９は、細胞外マトリックス成分を含むシートの重量の時間変化を示すグラフである。 図２０は、細胞外マトリックス成分を含むシートの引張強度及び延伸比の測定方法を説明するための写真である。 図２１は、細胞外マトリックス成分を含むシートを用いて測定した引張強度及び延伸比の結果を示すグラフである。 図２２はリン酸緩衝生理食塩水に浸漬させた細胞外マトリックス成分を含むシートを示す写真である。 図２３は、リン酸緩衝生理食塩水に浸漬させた細胞外マトリックス成分を含むシートを用いて測定した引張強度及び延伸比の結果を示すグラフである。 図２４は、リン酸緩衝生理食塩水に浸漬させた細胞外マトリックス成分を含むシートを示す顕微鏡写真である。 図２５は、コラーゲン（ＳＣ）を含むシート（２ｍｇ／ｃｍ２）を示す顕微鏡写真である。 図２６は、細胞外マトリックス成分を含むシートの写真及び当該シートのエラスチカ・ワンギーソン染色による観察結果を示す顕微鏡写真である。 図２７（Ａ）は、細胞外マトリックス成分を含むシート上で細胞を１〜７日間培養したときの細胞数の計測結果を示すグラフであり、図２７（Ｂ）は、細胞外マトリックス成分を含むシート上で培養した細胞の観察結果を示す顕微鏡写真である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
〔細胞培養用シート〕
本実施形態に係る細胞培養用シートは、細胞外マトリックス成分を含む。細胞培養用シートは、その上で細胞培養（細胞生育）可能なシートである。細胞培養用シートは、細胞培養用の足場材として利用することができる。また、細胞培養用シートは、細胞外マトリックス成分を含んでいるため、三次元組織体（詳細は後述する）の構成成分として、好適に利用することができる。
細胞外マトリックスは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックス成分は、１種又は２種以上の細胞外マトリックスを含むものであり、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の成分を用いることができる。細胞外マトリックス成分は、動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。細胞外マトリックス成分は、天然由来であってよい。天然由来である細胞外マトリックス成分は、天然の細胞外マトリックス成分そのもの、及び天然の細胞外マトリックス成分を機械的又は熱的に処理したものを意味する。天然由来の細胞外マトリックス成分には、化学的処理により天然の細胞外マトリックス分子の構造を改変した成分は含まれない。化学的処理としては、例えば、アルカリ処理による加水分解等が挙げられる。天然由来の細胞外マトリックス成分を用いることにより、細胞との相互作用がより自然の状態に近い細胞培養用シートを形成させることができる。そのため、天然由来の細胞外マトリックス成分を含む細胞培養用シートは、生体組織モデルを作製するための細胞培養用シートとして好適である。
細胞外マトリックスの具体例としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞外マトリックスは、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
エラスチンは、血管壁、靭帯等の弾性組織の成分をなす硬タンパク質である。エラスチンは、デスモシンとイソデスモシンというピリジン誘導体により橋かけ結合がつくられ、そのためにゴム弾性を示すタンパク質である。細胞外マトリックス成分にエラスチンを用いる場合、水中でも形状を保つ細胞培養用シートが得られやすくなる。
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン又は非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。細胞外マトリックス成分にコラーゲンを用いる場合、水に対する溶解性の高い細胞培養用シートの作製が可能となる。
プロテオグリカンとしては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書における「細胞外マトリックス成分」には、天然の細胞外マトリックスに加えて、断片化細胞外マトリックスも含まれる。断片化細胞外マトリックスとは、細胞外マトリックス分子の結合を切断することなく、細胞外マトリックスを解繊して得られるものであってよい。すなわち、断片化細胞外マトリックスは、解繊された細胞外マトリックス（解繊細胞外マトリックス）ということもできる。
細胞外マトリックス成分は、断片化細胞外マトリックスを含むことが好ましい。細胞外マトリックス成分が断片化細胞外マトリックスを含む場合、厚みのある細胞培養用シートの作製がより一層容易になる。天然由来の断片化細胞外マトリックスを用いる場合には、天然由来成分でありながら、より厚いシートの作製が可能となる。
断片化細胞外マトリックスの由来となる細胞外マトリックスは、一種類であってもよいし、複数種の細胞外マトリックスを併用してもよい。一般に、細胞外マトリックスは、化学的処理を施さない自然に近い状態では水に対して不溶性であり、高濃度の細胞外マトリックスを水溶媒中に溶解することは必ずしも容易ではないが、下記の様に断片化した細胞外マトリックスであれば、細胞外マトリックス自体に特段の化学的改変を加えなくとも水溶媒中により多量に分散可能となる。
断片化細胞外マトリックスの平均長は、１００ｎｍ〜４００μｍであることが好ましく、４μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、９μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化細胞外マトリックスの平均直径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、０．５μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、１μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。
断片化細胞外マトリックスは、断片化エラスチンであってよい。「断片化エラスチン」とは、線維性エラスチン等のエラスチンを断片化したものを意味する。
断片化エラスチンの由来となるエラスチンが平行繊維束由来である場合、断片化エラスチンの平均長は、１００ｎｍ〜４００μｍであることが好ましく、２２μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化エラスチンの由来となるエラスチンが平行繊維束由来である場合、断片化エラスチンの平均直径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。このような平行繊維束由来のエラスチンとしては、例えば靭帯由来のエラスチンが挙げられる。
断片化エラスチンの由来となるエラスチンが網状薄膜由来である場合、断片化エラスチンの平均長は、１００ｎｍ〜８０μｍであることが好ましく、４μｍ〜４０μｍであることがより好ましく、９μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化エラスチンの由来となるエラスチンが網状薄膜由来である場合、断片化エラスチンの平均直径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、０．５μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、１μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。このような網状薄膜由来のエラスチンとしては、例えば血管由来のエラスチンが挙げられる。
断片化細胞外マトリックスは断片化コラーゲンであってもよい。「断片化コラーゲン」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲンの平均長は、１００ｎｍ〜４００μｍであることが好ましく、２２μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲンの平均直径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。
断片化細胞外マトリックスの平均直径及び平均長は、電子顕微鏡又は光学顕微鏡等によって個々の断片化細胞外マトリックスを解析することによって求めることが可能である。
細胞外マトリックス成分を断片化する方法（細胞外マトリックス成分を解繊する方法）は、特に制限はなく、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等のホモジナイザーを用いて細胞外マトリックスを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックスをそのままホモジナイズしてもよいし、水、エタノール等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化された細胞外マトリックスを得ることも可能である。また、凍結融解により、細胞外マトリックスを断片化してもよい。
細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が、架橋されている場合、細胞培養用シートの安定性をより一層向上させることができる。
架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。細胞外マトリックス成分が天然由来であることが好ましいため、物理架橋が好ましい。架橋は、共有結合を介した架橋であってよい。
細胞外マトリックス成分がコラーゲンを含む場合、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）が好ましい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。エラスチン又はコラーゲンの熱架橋を行う場合、細胞外マトリックス成分のアミノ基が、同一分子内又は他の分子のカルボキシ基とペプチド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）を形成することにより、架橋されていてよい。
細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋することができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
架橋度の定量は、細胞外マトリックス成分の種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。
細胞外マトリックス成分中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，２０１５，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．１３１−１４２等に記載されているＴＮＢＳ法に基づき定量することが可能である。
架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。
細胞外マトリックス成分は、エラスチン、コラーゲン、断片化エラスチン及び断片化コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
細胞外マトリックス成分は、エラスチン及び断片化エラスチンからなる群より選択される少なくとも１種のエラスチン成分を含んでいてよく、また、コラーゲン及び断片化コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種のコラーゲン成分を含んでいてよい。細胞外マトリックスは、上記エラスチン成分と、上記コラーゲン成分と、を含んでいてよい。細胞外マトリックス成分が、上記エラスチン成分と、上記コラーゲン成分とを共に含む場合、細胞外マトリックス成分は、断片化エラスチンと、上記コラーゲン成分とを含んでいてよく、断片化エラスチンと、コラーゲンと、を含むことが好ましい。
細胞外マトリックス成分が上記エラスチン成分を含む場合、上記エラスチン成分の含有量は、細胞外マトリックス成分全量に対して、３０質量％以上、４０質量％以上、５０質量％以上、５５質量％以上、６０質量％以上、又は６５質量％以上であってよく、９０質量％以下、又は８０質量％以下、７５質量％以下であってよい。
細胞外マトリックス成分が上記コラーゲン成分を含む場合、上記コラーゲン成分の含有量は、細胞外マトリックス成分全量に対して、１０質量％以上、１５質量％以上、２０質量％以上、又は２５質量％以上であってもよく、９０質量％以下、７０質量％以下、５０質量％以下、又は３５質量％以下であってもよい。
細胞外マトリックス成分中のエラスチン成分及びコラーゲン成分の含有量は、既存のタンパク質定量方法を適用して測定することができる。例えば、当該細胞外マトリックス成分を水溶媒中に分散させた分散液を用いて、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイ等により、測定することができる。
一実施形態において、細胞培養用シートは、細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよく、エラスチン成分及びコラーゲン成分のどちらか一方のみからなっていてもよく、エラスチン成分及びコラーゲン成分からなっていてもよい。また、一実施形態に係る細胞培養シートは、細胞外マトリックス成分以外の成分（他の成分）を含んでいてもよい。
細胞培養用シートの厚さは、その用途に応じて適宜定めることが可能であり、例えば、１μｍ以上、３μｍ以上、５μｍ以上、８μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、又は３０であってもよく、２５０μｍ以下、又は２２０μｍ以下であってもよい。細胞培養用シートの厚さは、例えば、デジタルノギスにより測定することができる。また、高い測定精度を必要とする場合には、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等によって細胞培養用シートの厚さを測定してもよい。
細胞培養用シートは、図１に示すように、例えば、細胞外マトリックス成分と水性媒体とを含む液状組成物を準備する準備工程、液状組成物を収容可能な基材に、液状化合物を添加する添加工程（図１Ａ参照）、添加工程の後に、液状組成物の水性媒体を揮発させる揮発工程（図１Ｂ参照）と、を含む方法により製造することができる。添加工程及び揮発工程は、この順で繰り返して実施してよい（図１Ｃ参照）。液状組成物中の細胞外マトリックス成分の含有量、並びに、添加工程及び揮発工程を繰り返す回数を調整すること等により、得られる細胞培養用シートの厚さを調整することができる。
水性媒体とは、水、水と相溶し得る溶媒、又はこれらの混合物を意味する。水と相溶し得る溶媒としては、例えば、エタノールが挙げられる。
液状組成物を収容可能な基材は、その材質を適宜設計の範囲で選択することができる。液状組成物を収容可能な基材は、例えば、細胞外マトリックス成分の吸着度の低さ、加工性及びシートへの基材成分混入のリスクが低い等の観点から、シリコーンゴム等のシリコーン基材であってよい。
細胞培養用シートは、その上で細胞培養可能である。したがって、本実施形態に係る細胞培養用シートは、三次元組織体における細胞外マトリックス成分を含む細胞外マトリックス層（ＥＣＭ層）として利用することができる。
〔三次元組織体〕
本実施形態に係る三次元組織体は、細胞外マトリックス成分を含む複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）層と、ＥＣＭ層の間に存在する細胞と、を含む。ＥＣＭ層の厚さは５μｍ以上であることが好ましい。ＥＣＭ層としては、上述の細胞培養用シートを用いることができる。
本明細書における「三次元組織体」とは、細胞外マトリックス成分を含む層と細胞とが、三次元的に配置されている組織体であり、細胞培養によって人工的に作られる組織体を意味する。三次元組織体の形状としては、例えば、シート状、中空の円筒状、球状、培養容器等の形状に依存したブロック状、又はそれらの組み合わせによる形状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
三次元組織体は、実験動物の代替品等として利用することができる。例えば、本実施形態に係る三次元組織体は、細胞外マトリックス成分を含む層及び細胞を含む層が交互に積層された組織（大動脈血管壁等）を模倣する材料として利用可能である。すなわち、本実施形態に係る三次元組織体は、人工血管、動脈硬化モデル等として好適に用いることができる。
細胞外マトリックス成分として、上記例示した成分を用いることができる。ＥＣＭ層の厚さはその用途に応じて適宜定めることが可能であり、例えば１μｍ以上、３μｍ以上、５μｍ以上、８μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、２５μｍ以上、又は３０であってもよく、２５０μｍ以下、又は２２０μｍ以下であってもよい。例えば、前述した大動脈血管壁モデルにおけるＥＣＭ層を再現したい場合等は、５μｍ以上の厚さを持つＥＣＭ層を形成することが好ましい。ＥＣＭ層の厚さは、例えば、三次元組織体を形成させた後（三次元組織化後）、通常の組織切片の作成及び観察により測定することができる。組織切片の観察により、ＥＣＭ層の厚さを測定する場合、ＥＣＭ層の厚さは必ずしも完全に均一ではない可能性があるが、ＥＣＭ層全体のうち少なくとも一部が上記厚さの下限値以上であることが好ましい。
三次元組織体において、複数のＥＣＭ層の間には、細胞が存在する。ＥＣＭ層の間に存在する細胞は、例えば、三次元的に配置されていてよい。
細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。また、細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。一種類の細胞を用いてもよいし、複数種類の細胞を組み合わせて用いてもよい。細胞としては、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、好ましくは、線維性コラーゲン等の細胞外マトリックス成分を分泌する細胞外マトリックス成分分泌細胞を含む。細胞外マトリックス成分分泌細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。
細胞は、血管上皮細胞及び平滑筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい。
ＥＣＭ層は、２層以上であればよく、例えば、３層以上、５層以上、又は１０層以上であってもよく、例えば、５０層以下、又は２０層以下であってもよい。
ＥＣＭ層が２層以上である場合、それぞれのＥＣＭ層上に存在する細胞の種類は、同種であってもよく、異種であってもよい。
〔三次元組織体の製造方法〕
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、細胞外マトリックス成分を含む細胞培養用シート（細胞外マトリックス（ＥＣＭ）層）上に細胞を播種することを含む。本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、細胞培養用シート上に播種された細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シートを更に積層することを含んでいてよく、細胞培養用シート上に播種された前記細胞を培養することを含んでいてよい。
一実施形態に係る三次元組織体は、例えば、ＥＣＭ層（一つの細胞培養用シート）上で細胞を培養する工程（培養工程）と、ＥＣＭ層上の細胞が存在する側に、細胞外マトリックス成分を含む、別のＥＣＭ層を積層する工程（積層工程）と、を含む方法により、製造することができる。別のＥＣＭ層とは、別途製造されたＥＣＭ層であればよい。
培養工程では、ＥＣＭ層の主面上で細胞を培養する。細胞は、ＥＣＭ層の片面又は両面上で培養してよい。培養工程は、通常の方法により、ＥＣＭ層上に細胞を播種及び培養することにより、実施することができる。細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、一般的な細胞培養用シャーレ等の培養基材上に、前述した細胞培養用シート等のＥＣＭ層を載置し、そのＥＣＭ層上に細胞を播種し、培養基材を培地で満たすことにより培養することができる。また、細胞培養は、培養容器内（リアクター中）で行ってよい。ＥＣＭ層の両面上での細胞培養は、例えば、培養容器にＥＣＭ層の両面が接しない状態（培養容器からＥＣＭ層の両面を離した状態）で培養することにより、実施することができる。培養温度は、例えば、２０℃〜４０℃であってもよく、３０℃〜３７℃であってもよい。培地のｐＨは、例えば、６〜８であってもよく、７．２〜７．４であってもよい。培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。培養時間は、例えば、１日〜２週間であってもよく、１週間〜２週間であってもよい。この培養時間は、培養工程において、細胞を播種した時点から、細胞上にＥＣＭ層を積層するまでの時間である。培養工程において、播種する細胞数は、培養する細胞の種類、培養空間の容積、組織中に占める細胞の割合、ＥＣＭ層の細胞を培養する面の面積及び細胞培養の目的等に応じて、適宜設定することができる。例えば、播種する細胞数は、３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２個以上であってよく、７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２個以下であってよい。
積層工程では、ＥＣＭ層上の細胞が存在する側に、別のＥＣＭ層を積層する。ＥＣＭ層上で、細胞からなる細胞集団の層が形成されている場合、細胞集団の層上に、別のＥＣＭ層を積層してよい。細胞集団の層は、細胞核同士が重ならないようにして、水平方向に配置された複数の細胞から構成される細胞層を含んでいる。細胞集団の層は、複数の細胞層で構成されていてもよい。
ＥＣＭ層の積層は、例えば、培地を除去した後、ピンセット等でＥＣＭ層（細胞培養用シート）を積層することにより実施することができる。これにより、ＥＣＭ層と、ＥＣＭ層間に存在する細胞と、を含む三次元組織体を製造することができる。積層後、遠心してから、培地を添加することにより、ＥＣＭ層間に存在する細胞を更に培養してもよい。また、ＥＣＭ層の積層は、例えばＥＣＭ層を略円筒状の原反等に巻き取っていくことで積層してもよい。この様な積層方法の場合、先に巻き取られる方から後に巻き取られる方にかけて細胞の種類及び／又は分布を変えることにより、内側から外側にかけて層構成の異なる積層組織を形成することができる。原反は、細胞外マトリックス成分、生分解性物質等の生体適合性材料を用いて積層組織の一部としてもよいし、巻き取り工程の途中もしくは最後において積層組織から除外してもよい。この様な方法でＥＣＭ層を積層する場合には、ＥＣＭ層には巻き取りに耐え得る程度の基材としての一定の強度及び厚みを有することが好ましい。
また、細胞が存在する、１又は複数のＥＣＭ層を、上記別のＥＣＭ層として、ＥＣＭ層間に細胞が存在するように積層してもよい。
〔細胞培養用シートの用途〕
本実施形態に係る細胞培養用シートは、その上で細胞培養可能であり、かつ、水の透過性に優れていることから、細胞培養用の足場材として好適に利用することができる。
また、本実施形態に係る細胞培養用シートは、耐屈曲性及び加工性に優れている。したがって、当該細胞培養用シートは、例えば、培養基材、培養容器等の形状に応じた所望の形状に加工することも容易であるし、細胞を曲面上で培養するための基材や、逆に、培養した細胞を曲面上に積層するための基材としても好適に利用することができる。また、本実施形態に係る細胞培養用シートは、透明性が低いことから、例えば、光の遮蔽を必要とする条件下での細胞培養に用いられるシート、又は光保護用シートに利用することもできる。
以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の準備〕
ＥＣＭ成分として、以下の材料を準備した。
エラスチンＡ（ウシ靭帯由来エラスチン、Elastin Products Company製、商品名：Elastin E60）
エラスチンＢ（ウシ血管由来エラスチン、Elastin Products Company製、商品名：Bovine AorticElastin SB87）
コラーゲン（ブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン、日本ハム株式会社製、凍結乾燥品）
（断片化繊維（マイクロファイバー（ＭＦ））の調製）
断片化エラスチン（エラスチンマイクロファイバー、以下「ＥＭＦ」ともいう。）の分散液を以下の方法により製造した。
エラスチンＢをＭｉｌｌｉＱに１質量％の濃度となるように加えた後、ホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズすることにより、断片化エラスチンＢを含む分散液を得た。
断片化エラスチンＢの平均長は、５９．９μｍ±４４．０μｍであり、断片化エラスチンＢの平均直径は、１０．１±２．７μｍであった（サンプル数：５０）。
エラスチンＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１質量％の濃度となるように加えた後、ホモジナイザーを用いて３分間ホモジナイズした。得られた分散液をＭｉｌｌｉＱで遠心置換した後、ホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズした。これにより、断片化エラスチンＡを含む分散液を得た。
断片化エラスチンＡの平均長は、９．４７±４．７７μｍであり、断片化エラスチンＡの平均直径は、１．２７±０．４０μｍであった（サンプル数：５０）。
断片化コラーゲン（コラーゲンマイクロファイバー、以下「ＣＭＦ」ともいう。）の分散液を以下の方法により製造した。
コラーゲン（凍結乾燥体）を７０体積％エタノール溶液に１質量％の濃度となるように加えた後、ホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズした。得られた分散液を１００％エタノールによる遠心置換を２回行い、断片化コラーゲンを含む分散液を得た。
断片化コラーゲンの平均長は、２２．５μｍ（最小：９．９μｍ、最大７８．６μｍ、標準偏差１１．０）であり、断片化コラーゲンの平均直径は、４．４μｍ（最小：０．９５μｍ、最大：１６．８μｍ、標準偏差：２．６）であった（サンプル数：３９１）。
断片化繊維（断片化エラスチン及び断片化コラーゲン）の平均長及び平均直径は、電子顕微鏡によって個々の断片化繊維を解析することで求めた。
〔シートの作製〕
シートの作製には、ＥＣＭ成分を含む分散液として、断片化繊維を含む分散液、又は、断片化エラスチン（靭帯由来）及びコラーゲン（非断片化繊維）の混合物を含む分散液を用いた。断片化エラスチン及びコラーゲンの混合物（質量比１：１）を含む分散液は、断片化エラスチンを含む分散液と、コラーゲン（非断片化繊維）の溶解液とを、質量比１：１となるように混合することにより、調製した。尚、「非断片化繊維」とは、上述した断片化処理を行わないという点においての記述であって、コラーゲン繊維が一切溶解しないか、または分散せずにコラーゲン繊維の塊として存在することを意味するものではない。
コラーゲン（非断片化繊維）の溶解液は、以下の方法で調製した。まず、コラーゲンを７０体積％エタノール溶液に１質量％となるように加えて、１０分間攪拌し、遠心沈降後、上澄みを除去した。風乾により、エタノール及び水を揮発させ、ＭｉｌｌｉＱをコラーゲンが１質量％となるように加えた。その後、氷冷とボルテックスを繰り返して、コラーゲンを溶解させた。これにより、コラーゲン（非断片化繊維）の溶解液を得た。
シートの作製には、シリコーン枠が設けられたシリコーン基材を用いた。シートの作製は、水平に保たれたガラス台上で実施した。シリコーン枠及びシリコーン基材としては、アズワン株式会社のシリコーンゴムシート １ｔ ３００角を用いた。
それぞれ４ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ又は４０ｍｇ／ｍＬの濃度でＥＣＭ成分を分散させた溶液を用いて、以下の操作１及び２を行うことにより、単位面積当たりのＥＣＭ成分量（理論値、単位：ｍｇ／ｃｍ２）が、１ｍｇ／ｃｍ２、２．５ｍｇ／ｃｍ２、５ｍｇ／ｃｍ２又は１０ｍｇ／ｃｍ２である、ＥＣＭ成分を含むシートを作製した（図１（Ａ）〜（Ｂ）参照）。
１：シリコーン枠内に、ＥＣＭ成分を含む分散液を、滴下量２５０μｌ／ｃｍ２で、滴下する（図１（Ａ）参照）。
２：３７℃での乾燥により、滴下した分散液の溶媒を揮発させる（図１（Ｂ）参照）。
作製した各シートについて、ＦＴ−ＩＲにより、適切なピークの存在を確認した。これにより、ＥＣＭ成分に性質変化が起きていないこと及び不純物（シリコーン等）の混入がないことを確認した。
〔シートの厚さの測定〕
表１に、ＥＣＭ成分量２．５ｍｇ／ｃｍ２、５ｍｇ／ｍ２又は１０ｍｇ／ｃｍ２に調整した各種シートの厚さの測定結果を示す。シートの厚さは、デジタルノギス（MITUTOYO製、Absolute digimatic）を用いて測定した。断片化エラスチン（血管由来）については、ＥＣＭ成分量１ｍｇ／ｃｍ２であるシートの厚さも測定した。
Figure 2019189786
図２は、ヘマトキシリン・エオシンにより染色（ＨＥ染色）した断片化エラスチン（血管由来）を含むシート（ＥＣＭ成分量：１ｍｇ／ｃｍ２）の断面図を示す顕微鏡写真である。図２に示すとおり、断片化エラスチンを含むシートは、ＥＣＭ成分量２．５ｍｇ／ｃｍ２以上において、いずれのシートも厚さ１０μｍ以上であり、充分な厚さを有していた。
〔細胞生育の確認〕
まず、得られた各種シート上で、動脈由来平滑筋細胞（ＡＯ−ＳＭＣ）が生育可能であるかを評価した。断片化エラスチン（靭帯由来）を含むシート（ＥＣＭ成分量：２．５ｍｇ／ｃｍ２）又は断片化エラスチン（靭帯由来）及びコラーゲンの混合物（Ｍｉｘ）を含むシート上に、ＡＯ−ＳＭＣを、２×１０４cells又は１×１０４cells播種した。ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で１日間培養後、１０％ホルムアルデヒドで固定後、各種染色試薬（蛍光標識試薬）で染色した。培養は、６ｍｍ（直径）の円形シートを用いた。培地として、平滑筋細胞用培地（Lonza CC-3182 smooth muscle growth medium 2）を用いた。
エラスチンファイバー（ＥＭＦ）は、エラスチン（elastin）に由来する自家蛍光を有する。したがって、ＥＭＦの存在は、エラスチン由来の自家蛍光により、観察した。なお、コラーゲンは、蛍光を発しないため観察できていないが、図３（Ａ）並びに図４（Ｃ）及び（Ｄ）では、観察した細胞培養用シート中にコラーゲンは存在している。
平滑筋細胞マーカーとしては、αＳＭＡを用いた。蛍光標識試薬として、αＳＭＡ一次抗体（抗α平滑筋アクチン抗体、BioLegend社製）、二次抗体（Goat anti-Mouse IgG (H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546、Invitrogen）、及びTO-PROTM-3 Iodide（製品番号:T3605、Invitrogen）、CellTrackerTM Red CMTPXDye（製品番号:C34552、Invitrogen）を用いた。
図３は、ＡＯ−ＳＭＣ（播種細胞数２×１０４cells）の１日間培養後の蛍光測定による観察結果を示す。図４は、ＡＯ−ＳＭＣ（播種細胞数１×１０４cells）の２日間培養後の蛍光測定による観察結果を示す。図４（Ａ）〜（Ｄ）は、観察結果を示す写真（左）及び当該写真の簡略図である。図４の簡略図中、白抜きの領域はＥＭＦ（エラスチンの自家蛍光）、斜線の領域はαＳＭＡ（平滑筋細胞マーカー）、点描で記載した領域は細胞核を示す。
図３〜４に示すとおり、断片化エラスチン（ＥＭＦ）を含むシート並びに断片化エラスチン及びコラーゲンの混合物を含むシートにおいて、シート上で細胞の接着が見いだされたことから、各種シート上での細胞生育が可能であると判断した。
次に、得られた各種シート上で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が生育可能であるかを評価した。細胞として、ＨＵＶＥＣ、培地として内皮細胞増殖培地（Lonza CC-3162 Endothelial cell growth medium 2）を用い、播種細胞数２×１０４cells、培養期間１日間の条件下、ＥＣＭ成分を含むシート上で、上記と同様にして、細胞培養を行った。
図５及び６は、細胞培養後の各種シートを抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した写真である。図６（Ａ）〜（Ｃ）は、観察結果を示す上面写真及び当該写真の簡略図である。図６の簡略図中、白抜きの領域はＥＭＦ（エラスチンの自家蛍光）、点描で記載した領域はＨＵＶＥＣ（ＣＤ３１による染色部分）を示す。
図５及び６に示すとおり、細胞としてＨＵＶＥＣを用いた場合においても、断片化エラスチンを含むシート並びに断片化エラスチン及びコラーゲンの混合物を含むシート上で、細胞生育可能であることを確認した。
〔三次元組織体の製造１〕
図７は、三次元組織体の製造方法の概略図を示す。３つの断片化エラスチン（ＥＭＦ）（ＥＣＭ成分量：２．５ｍｇ／ｃｍ２）を含むシート（ＥＭＦ ｓｈｅｅｔ）を準備し、これらのシート上に、細胞（ＡＯ−ＳＭＣ）を、１×１０５ｃｅｌｌｓで播種した。細胞を平滑筋細胞用培地で、３７℃で１日間、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養後、ＥＭＦを含むシートを積層させた。積層後、遠心（条件：１０００ｒｐｍ、５分間）してから、平滑筋細胞用培地で、２日間培養した。培養後に、得られた試料を顕微鏡観察に供した。図８は、ＨＥ染色した試料の顕微鏡観察結果を示す。
図８に示すとおり、ＥＭＦを含む層と、層間に存在する細胞を含む三次元組織体が得られた。
〔耐屈曲性及び加工性の評価〕
ＥＣＭ成分を含むシート（図９（Ａ）参照）の屈曲性及び加工性を評価した。屈曲性及び加工性の評価では、ＥＭＦ（血管由来）を含むシート（ＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）を用いた。図９（Ｂ）に示すとおり、ＥＭＦを含むシートは、屈曲可能であった。図９（Ｃ）に示すとおり、ＥＭＦを含むシートは、パンチによる加工が可能であった。以上より、ＥＭＦを含むシートが、耐屈曲性及び加工性に優れることが示された。
〔透明性の評価〕
ＥＣＭ成分を含むシートの透明性を目視及び顕微鏡並びに紫外可視赤外分光光度計（Ｖ−６７０ 日本分光社製）を用いて取得した透過率のパラメータにより評価した。透明性の評価では、ＥＭＦ（ウシ靭帯由来）を含むシート（ＥＣＭ成分量：２．５ｍｇ／ｃｍ２、又はＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）、及びＣＭＦを含むシート（ＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）を用いた。
図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれＣＭＦを含むシート及びＥＭＦを含むシート（ＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）の目視画像及び顕微鏡画像を示す写真である。図１０（Ｃ）は、各シートにおける透過率（縦軸）を示す。横軸は、波長（ｎｍ）を表す。
図１０（Ａ）〜（Ｃ）に示すとおり、断片化繊維を含むシートは透明性が低いことが示された。
〔接触角（疎水性）の評価〕
ＥＭＦを含むシートと、ＥＭＦ及びコラーゲンの混合物（Ｍｉｘ）を含むシートの水の接触角の測定を行った。結果を図１１に示す。図１１中、縦軸は接触角を示し、横軸は時間（単位：秒（ｓ））を示す。なお、水の接触角は、協和界面科学株式会社製のDrop Master（商品名）により測定した。
図１１（Ａ）〜（Ｃ）から、ＥＭＦを含むシートは、水の透過性が高い（水の接触角が小さく変化する）ことが示された。また、ＥＭＦとコラーゲンとを混合することにより、得られるシートの疎水性が変化することが示された。
〔ＥＭＦを含むシートの顕微鏡観察結果〕
図１２は、ＥＭＦを含むシート（ＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）及びＣＭＦを含むシート（ＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）のＳＥＭ写真である。図１２（Ａ）は、靭帯由来のＥＭＦを含むシートの写真であり、図１２（Ｂ）は、血管由来のＥＭＦを含むシートの写真であり、図１２（Ｃ）は、ＣＭＦを含むシートの写真である。
図１３は、ＥＭＦを含むシート（ＥＣＭ成分量：５ｍｇ／ｃｍ２）の光学顕微鏡位相差画像を示す写真である。図１３（Ａ）は、靭帯由来のＥＭＦを含むシートの写真であり、図１３（Ｂ）は、血管由来のＥＭＦを含むシートの写真であり、図１３（Ｃ）は、図１３（Ｂ）の拡大写真である。
図１２（Ａ）及び（Ｂ）並びに図１３のとおり、断片化繊維を含むシートには、隙間（ポア）が存在していた。図１２（Ａ）に示すＥＭＦ（靭帯由来）を含むシート中のＥＭＦの平均直径（太さ）は１０〜２０μｍであり、図１２（Ｂ）に示すＥＭＦ（血管由来）を含むシート中のＥＭＦの平均直径（太さ）は１〜２μｍであった。図１３（Ａ）に示すＥＭＦ（靭帯由来）を含むシートの平均直径（太さ）は１０μｍであり、図１３（Ｃ）に示すＥＭＦを含むシートの平均直径（太さ）は１．１±０．１μｍであった。以上のとおり、ＥＭＦは、シート化前後で繊維径に大きな変化はみられなかった。
図１２及び１３に示すような構造を有していることから、断片化繊維を含むシートは、溶液に対する透過性を示す、生体の状態に比較的近い等の利点があると考えられた。
〔三次元組織体の製造２〕
３つの断片化エラスチン（ＥＭＦ）（ＥＣＭ成分量：１ｍｇ／ｃｍ２）を含むシート（ＥＭＦシート）を準備し、各シート上に、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、２×１０５ｃｅｌｌｓで播種した。図１４（Ａ）は、ＥＭＦシートを示す写真である。ＥＭＦシート上のＮＨＤＦを３７℃で２日間、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養後、ＥＭＦを含むシートを積層させた。図１４（Ｂ）は、ＥＭＦシートを積層したときの写真である。積層後、遠心（条件：１１００ｒｐｍ、５分間）してから、２日間培養した。培養後に、クローニングリングで、得られた三次元組織体を囲み、測定用試料とした。得られた試料は、固定化してから顕微鏡観察に供した。図１５は、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）により染色した試料の顕微鏡観察結果を示す。
図１５に示すように、ＥＭＦシートを用いれば、ＥＭＦを含む層を有する多層構造の三次元組織体が形成できることが示された。
〔細胞の生存性の評価〕
３つの断片化エラスチン（ＥＭＦ）（ＥＣＭ成分量：２ｍｇ／ｃｍ２）を含むシート（ＥＭＦシート）を準備し、各シート上に、ＮＨＤＦを、１×１０５ｃｅｌｌｓで播種した。次いで、ＥＭＦシート上のＮＨＤＦを３７℃で２日間、４日間、又は６日間ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養後に得られた試料は、１０％パラホルムアルデヒド水溶液（ｐ−ＰＦＡ）を用いて固定化した後に、共焦点顕微鏡で観察した。図１６に測定した試料の上面図及び側面図並びに３Ｄイメージを示す。図１６では、ＥＭＦを含むシート上に細胞が存在している。
細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、及び細胞数の時間変化は、次の方法により測定した。ＥＭＦシート上にＮＨＤＦを播種した後、当日（すなわち０日目）、２日目、４日目、６日目にシートを回収した。細胞数の時間変化は、それぞれの回収したシートからＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＤＮＡを抽出することにより、抽出されたＤＮＡ量によって評価した。また、シート上に播種していない１×１０５ｃｅｌｌｓのＮＨＤＦからも同様にＤＮＡを抽出し、コントロールとした。また、細胞生存率は、２日目に回収したシートからトリプシン溶液によって細胞を剥離し、トリパンブルーによって死細胞を染色したのちに、生存している細胞数を数えることにより算出した。また、シート上に播種していない１×１０５ｃｅｌｌｓのＮＨＤＦを２日間培養したものをコントロールとした。
図１７に示すとおり、ＥＭＦシート上に播種された細胞の生存性が十分に長いことが示された。また、細胞の生存性はコントロールと比較しても同程度であったことから、ＥＭＦシートが細胞の生育に悪影響を与えないことが示された。
［細胞外マトリックスシートの熱架橋］
断片化エラスチン（ＥＭＦ）、コラーゲン（ＳＣ）、又は断片化コラーゲン（ＣＭＦ）を含むシートを準備した。これらのシートを減圧下、２００℃、１２時間の条件で加熱することにより、熱架橋を行った。図１８に得られた熱架橋前後のシートの写真を示す。熱架橋を行ったことによる外観上の変化はなかった。
図１９（Ａ）は、熱架橋を行っていないＥＭＦシート、ＳＣシート及びＣＭＦシートの重量の時間変化を示すグラフであり、図１９（Ｂ）は熱架橋を行ったＥＭＦシート、ＳＣシート及びＣＭＦシートの重量の時間変化を示すグラフである。
シートに含まれる細胞外マトリックスを熱架橋することにより、シートの長期安定性が増し、重量の時間変化がより抑制しやすくなることが示された。
〔機械特性の評価〕
サイズ１ｃｍ×１ｃｍ、厚さ２０μｍの正方形状の断片化エラスチン（ＥＭＦ）、断片化コラーゲン（ＣＭＦ）、コラーゲン（ＣＳ）、又はＥＭＦ及びＣＳを１：１の質量比で含むシート（Ｍｉｘシート）と、これらのシートそれぞれを上記同様の方法で熱架橋したシートを評価用シートとして準備した。熱架橋されていない評価用シート（ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と、熱架橋された評価用シート（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）の引張強度（ｔｅｎｓｉｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ、単位：ＭＰａ）を測定した。引張強度は、室温で、小型卓上試験機（島津製作所製、ＥｚＴｅｓｔ／ＣＥ、負荷容量：５００Ｎ）を用いて、小型平面掴み具により０．５ｍｍの間隔をあけて評価用シートの両端を固定し、試験速度１ｍｍ／ｍｉｎで測定した。引張強度の測定結果を図２１（Ａ）に示す。破断するまでに評価用シートが伸びた割合を示す延伸比（Ｓｔｒｅｃｈ ｒａｔｉｏ）を図２１（Ｂ）に示す。引張強度及び延伸比は、機械特性評価用のシートを図２０で示す方向に引っ張ることにより評価した。
断片化エラスチンのシートでは、ヒト大動脈に近い引張強度を有していた（ヒト大動脈の引張強度：２．５〜５ＭＰａ程度）。
引張強度の測定の前に、図２２に示すように評価用シートをリン酸緩衝食塩水に浸漬させたこと以外は、上記同様にして、引張強度及び延伸比を測定した。リン酸緩衝食塩水に浸漬させた後に測定した評価用シートの引張強度及び延伸比の試験結果を図２３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図２２（Ａ）は、ＣＭＦのシートをリン酸緩衝食塩水に浸漬させたときの写真であり、図２２（Ｂ）は、熱架橋したＣＭＦのシートをリン酸緩衝食塩水に浸漬させたときの写真である。図２４は、リン酸緩衝食塩水に浸漬させた各種評価用シートの走査型電子顕微鏡による写真を示す。
熱架橋された評価用シートは、乾燥した状態では引張強度と延伸比が小さかったが、リン酸緩衝食塩水に浸漬させたことにより、乾燥した状態では引張強度と延伸比が増大した。シートに用いる細胞外マトリックスの種類の選択、架橋の実施、リン酸緩衝食塩水への浸漬等により、引張強度及び延伸比が調整できることが示された。
〔コラーゲンを含むシートの顕微鏡観察〕
断片化していないコラーゲン（ＳＣ）を含むシート（２ｍｇ／ｃｍ２）の顕微鏡観察結果を図２５に示す。断面観察に厚さを測定した結果、ＳＣを含むシートの厚さは約５μｍであり、断片化したコラーゲンを含むシートの厚さよりも明らかに薄かった。
〔細胞吸着率の評価〕
基材上に、ＥＭＦシート、ＣＳシート、又はＥＭＦ及びＣＳを１：１の質量比で含む混合物（Ｍｉｘ）を含むシートを作製し、３７℃、２４時間の条件でインキュベーションした。図２６は、ＥＭＦシート、ＣＳシート、又はＥＭＦ及びＣＳを１：１の質量比で含む混合物（Ｍｉｘ）を含むシートの写真及びエラスチカ・ワンギーソン染色による観察結果を示す顕微鏡写真である。各シートにおいて、エラスチカ・ワンギーソン染色により、エラスチン及び／又はコラーゲンを示す染色が確認された。
基材上に配置された上記シート上に、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）１×１０５ｃｅｌｌｓ播種した。各シートのサイズは１ｃｍ２とした。各シート上に播種された細胞を３７℃、５％ＣＯ２の条件で、１〜７日間培養した。培養後の各試料に対し、蛍光観察及びＤＮＡアッセイを実施した。
図２７（Ａ）は、培養後の試料の細胞数の計測結果を示す。図２７（Ｂ）は、ＮＨＤＦを播種された各シートの蛍光観察結果である。図２７（Ａ）に示すように、培養７日目においても高い細胞吸着率が維持されていた。ＥＭＦシート、ＣＳシート、又はＥＭＦ及びＣＳを１：１の質量比で含む混合物（Ｍｉｘ）を含むシートは、長期的に高い細胞吸着率で細胞培養可能であるため、細胞培養用シートとして優れた機能を有している。図２７（Ｂ）において、各シート上にＮＨＤＦが存在することが確認された。

Claims (12)

  1. 細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シート。
  2. 前記細胞外マトリックス成分が、断片化細胞外マトリックスを含む、請求項１に記載の細胞培養用シート。
  3. 前記シートの厚さが５μｍ以上である、請求項１又は２に記載の細胞培養用シート。
  4. 前記細胞外マトリックス成分が天然由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養用シート。
  5. 前記細胞外マトリックス成分が、エラスチン、コラーゲン、断片化エラスチン及び断片化コラーゲンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養用シート。
  6. 前記細胞外マトリックス成分が、エラスチン及び断片化エラスチンからなる群より選択される少なくとも１種のエラスチン成分を含み、かつ、前記エラスチン成分の含有量が、前記細胞外マトリックス成分全量に対して、５０質量％以上である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養用シート。
  7. 前記細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が架橋されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養用シート。
  8. 細胞外マトリックス成分を含む複数の細胞外マトリックス層と、前記細胞外マトリックス層の間に存在する細胞と、を含み、
    前記細胞外マトリックス層の厚さが５μｍ以上である、三次元組織体。
  9. 前記細胞が、血管上皮細胞及び平滑筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項８に記載の三次元組織体。
  10. 細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シート上に細胞を播種することを含む、三次元組織体の製造方法。
  11. 前記細胞培養用シート上に播種された細胞上に、細胞外マトリックス成分を含む、細胞培養用シートを更に積層することを含む、請求項１０に記載の三次元組織体の製造方法。
  12. 前記細胞培養用シート上に播種された前記細胞を培養することを含む、請求項１０又は１１に記載の三次元組織体の製造方法。
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