WO2011155565A1 - 可逆的な性質を示す温度応答性シートとそれを用いた細胞シートの製造方法 - Google Patents

可逆的な性質を示す温度応答性シートとそれを用いた細胞シートの製造方法 Download PDF

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soluble elastin
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孝二 岡元
絵理香 吉野
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国立大学法人九州工業大学
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    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a temperature-responsive sheet exhibiting reversible properties and a method for producing a cell sheet including cultured cells using the same.
  • the cell sheet can be used for transplanting a single layer sheet, transplanting a uniform tissue by stacking the same cell sheet, transplanting a tissue exhibiting a layered structure by stacking several different cell sheets, etc. Is done.
  • 20 to 30 types of cell sheets have been produced, and clinical applications using epithelial cell systems such as cornea, retina, skin, bladder epithelium, periodontal ligament are being promoted.
  • An object of the present invention is to produce a temperature-responsive sheet that is derived from a living body, has extremely low toxicity, and exhibits reversible properties, and uses the properties to recover the sheet-like cultured cells in their original form. Is to provide.
  • the present inventors focused on water-soluble elastin, which is a biologically-derived material with extremely low toxicity instead of PIPAAm, and reduced the charge of water-soluble elastin by utilizing the coacervation forming ability of water-soluble elastin.
  • An attempt was made to produce a reversible temperature-responsive sheet containing chemically modified water-soluble elastin having a high molecular assembly ability and to use it for the production of cell sheets.
  • an attempt was made to produce a polypeptide having a peptide sequence in elastin that has extremely low toxicity, coacervation, and high molecular assembly ability in a reversible temperature-responsive sheet.
  • the present inventors have found that the above-described problems are specifically achieved by the following aspects of the present invention.
  • At least a part of a primary amine and a secondary amine contained in a molecule of water-soluble elastin is N-acylated, and at least a part of a carboxyl group contained in the molecule is converted to an amino acid. It is a temperature-responsive sheet containing chemically modified water-soluble elastin obtained by coupling with an alkyl ester.
  • the temperature-responsive sheet of the present invention Preferred embodiments of the temperature-responsive sheet of the present invention are listed below.
  • the temperature-responsive sheet it is preferable that at least a part of the primary amine and the secondary amine is N-acetylated and at least a part of the carboxyl group is coupled with a methyl ester of glycine.
  • the modification rate defined by the formula (1) is preferably 80 mol% or more.
  • Modification rate (mol%) (1 ⁇ B / A) ⁇ 100 (1)
  • A represents a value obtained by subtracting the average value of the absorbance of the blank from the average value of the absorbance (wavelength of 345 nm) of the water-soluble elastin
  • B represents the average of the absorbance (wavelength of 345 nm) of the N-acetylated water-soluble elastin. It represents a value obtained by subtracting the average value of the absorbance of the blank from the value.
  • the protection of the carboxyl group it is preferable that 90 mol% or more of the carboxyl group is protected by methyl ester of glycine.
  • the chemically modified water-soluble elastin forms a coacervate at a pH of 7.4 and a temperature of 37 ° C., and the temperature is 20 ° C. or less, preferably 1 to 20 ° C., more preferably 1 to 15 ° C.
  • the coacervate dissolves.
  • the water-soluble elastin is preferably a high-molecular weight water-soluble elastin obtained by removing a low molecular weight fraction by dialysis.
  • the temperature-responsive sheet of the present invention is preferably used for preparing a cell sheet. More preferred is a combination of the above preferred embodiments.
  • Another aspect of the present invention includes a step of culturing specific cells on a temperature-responsive sheet containing the chemically modified water-soluble elastin to produce a cell sheet, and then under conditions below the cell culture temperature.
  • a method for producing a cell sheet comprising a step of separating the temperature-responsive sheet and the cell sheet.
  • the manufacturing method includes a step of forming a gel film serving as a cell scaffold on the temperature-responsive sheet following the step of forming the temperature-responsive sheet.
  • the membrane serving as a scaffold is preferably a gel membrane selected from the group consisting of so-called extracellular matrix.
  • the membrane that serves as a scaffold is preferably a gel membrane selected from the group consisting of collagen, fibronectin, laminin, polylysine, and gelatin, and a gel selected from the group consisting of collagen, polylysine, and gelatin.
  • a membrane is more preferred, and a collagen gel membrane is particularly preferred.
  • the above-mentioned “gel membrane that serves as a cell scaffold” is composed of fibronectin, laminin, vitronectin, tenascin, thrombospondin, entactin, osteopontin, von Fon, which promotes cell adhesion and cell proliferation as a main component of extracellular matrix such as collagen.
  • a small amount of a different extracellular matrix such as Billbrand factor, fibrinogen, chondroitin-6 sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate, heparin, and hyaluronic acid may be contained as an optional component.
  • Still another aspect of the present invention is to chemically synthesize a polypeptide having a peptide sequence in elastin that exhibits coacervation in the same manner as the above chemically modified water-soluble elastin, and a sheet containing this polypeptide as a main component Is used for a reversible temperature-responsive sheet.
  • Constaining as a main component means 90% by weight or more, and is preferably a sheet made of only a polypeptide. This polypeptide will be described in detail later.
  • the present invention by utilizing the reversible temperature responsiveness of chemically modified water-soluble elastin, it can be produced as it is without damaging the cell sheet.
  • a conventional temperature-responsive culture dish using PIPAAm there is a risk that toxic acrylamide monomer remains, but in the present invention, a safe protein or polypeptide derived from a living body is used, The cultured cells can be recovered in a sheet form simply by lowering the value.
  • the figure which shows the coacervation of chemically modified water-soluble elastin and polypeptide The figure which showed typically the coacervation of chemically modified water-soluble elastin and polypeptide.
  • the figure which shows gelatinization of collagen The figure which showed the gelatinization of collagen typically.
  • a collagen gel was prepared on a coacervate of chemically modified water-soluble elastin N-Ac-Ela-O-Gly-OMe, and immediately after seeding fibroblasts on the gel (0 hour) Optical micrograph.
  • a collagen gel was prepared on a coacervate of chemically modified water-soluble elastin N-Ac-Ela-O-Gly-OMe, fibroblasts were seeded on the gel, and the spindle state of fibroblasts after 24 hours of culture Optical micrograph.
  • VPGVG polypeptide poly
  • FIG. 1 is a diagram showing coacervation of chemically modified water-soluble elastin and the above polypeptide.
  • the chemically modified water-soluble elastin or polypeptide is a transparent homogeneous solution at 15 ° C. or lower.
  • B when heated to 20 ° C.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing coacervation of chemically modified water-soluble elastin or polypeptide.
  • the coacervate in the lower layer of C dissolves when cooled, and returns to the original transparent homogeneous solution. Therefore, the coacervate is used as a temperature-responsive material for recovering cells and cell sheets without damaging them.
  • an aqueous solution of chemically modified water-soluble elastin or polypeptide is a transparent homogeneous solution at low temperature, but becomes cloudy when heated, and when left as it is, a transparent equilibrium solution (upper layer) and a pale yellow highly viscous coacervate (lower layer) ).
  • This process is reversible and returns to the original homogeneous solution again upon cooling.
  • the present invention utilizes this reversible property to produce and recover a cell sheet without damaging cells and extracellular matrix.
  • the chemically modified water-soluble elastin in the present invention N-acylates at least a part of the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the water-soluble elastin and at least a part of the carboxyl group contained in the molecule. Is obtained by coupling with an alkyl ester of an amino acid.
  • N-acylation includes N-formylation, N-acetylation, N-benzoylation, etc., and N-acetylation is preferred.
  • a urethane type or an alkyl type may be used.
  • the amino acid used for the coupling is selected from about 20 types such as glycine, valine, and phenylalanine constituting the protein.
  • high molecular weight water-soluble elastin refers to a product obtained by removing a relatively low-molecular component (about 5,000 or less) from water-soluble elastin.
  • the low molecular weight component is preferably removed by dialysis using a dialysis membrane having a compartment molecular weight of 6,000 to 8,000.
  • the main molecular weight of the high molecular weight water-soluble elastin is preferably about 10,000 or more, more preferably about 30,000 to 300,000.
  • water-soluble elastin is obtained by partially hydrolyzing water-insoluble elastin. Specifically, animal biological tissues such as animal aorta, ligament ligament and fish arterial sphere are treated with acid. It is obtained by treatment with a solubilizing solution or an alkaline solubilizing solution. Typical water-soluble elastin is ⁇ -elastin or ⁇ -elastin obtained by heat oxalic acid treatment, and ⁇ -elastin obtained by treating elastin with alkaline ethanol. In addition, elastin digests that have been enzymatically treated with elastase and the like, and tropoelastin that is a precursor in the elastin biosynthesis pathway are included.
  • the solubility of water-soluble elastin in water means that it is about 0.001 mg / ml or more and about 600 mg / ml or less at 5 ° C., and preferably 1 mg / ml or more and 600 mg / ml or less.
  • the body tissue containing elastin Prior to the partial hydrolysis of water-insoluble elastin, the body tissue containing elastin is shredded, treated with hot water, a hot dilute alkaline aqueous solution, degreased by acetone extraction, and extracted with sodium chloride-soluble unwanted protein. It is preferable.
  • a chemically modified water-soluble elastin is obtained by coupling a carboxyl group of an amino acid residue side chain such as glutamic acid and the amino group of an amino acid alkyl ester.
  • a method for producing water-soluble elastin a method for chemically modifying water-soluble elastin, a method for producing a temperature-responsive sheet containing the chemically-modified water-soluble elastin of the present invention, and the obtained temperature-responsive sheet, A specific cell is cultured on the sheet to produce a cell sheet, and then the temperature-responsive sheet and the cell sheet are separated under a condition below the cell culture temperature, and the cell sheet is recovered intact.
  • the method of performing will be described in detail.
  • the first method obtains insoluble elastin by removing collagen and other unwanted proteins from animal living tissue, and then contains the insoluble elastin in an acidic solubilizing solution containing oxalic acid or the like, or sodium hydroxide or the like. It is immersed and dissolved in an alkaline solubilizing solution to produce water-soluble elastin.
  • Collagen and other unwanted protein removal treatment is an alkaline solution containing at least one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and barium hydroxide, and sodium hydroxide added to the alkaline solution.
  • an alkaline solution in which the total amount of potassium hydroxide, calcium hydroxide and barium hydroxide is 0.03 to 0.5 mol, preferably 0.05 to 0.3 mol per liter, 90 to It is preferable to immerse at 105 ° C. for 5 to 60 minutes.
  • animal biological tissue is added to a salt solution containing any one of sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, or barium chloride. It is also preferable to perform an immersion treatment (pretreatment) for immersing the material.
  • the animal living tissue is not particularly limited, but it is preferable to use a ligament or aortic blood vessel obtained from mammals such as pigs, horses, cows, sheep, etc. in view of a high content of elastin. Also, arterial spheres of fish with a high elastin content may be used.
  • Animal biological tissue is preferably homogenized first using a homogenizer. For homogenization, any animal tissue such as a mixer or meat chopper can be shredded, and preferably a tool capable of shredding into 3 mm square or less, more preferably paste-like. It is preferable that the size of the shredded animal biological tissue is smaller because the efficiency of removing collagen and other unnecessary proteins can be increased.
  • the homogenized animal biological tissue may be degreased by boiling it with hot water or a hot dilute alkaline aqueous solution, or treating it with an organic solvent, for example.
  • solubilized solution examples include oxalic acid, formic acid, acetic acid, succinic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, betaine, difluoroacetic acid, trifluoroacetic acid, phosphoric acid, sulfamic acid, perchloric acid, and trichloroacetic acid.
  • An acidic solution containing at least one of them is used.
  • the total amount of acid in this acidic solution is 0.05 to 5 mol, preferably 0.1 to 2 mol per liter, and the liquid temperature is preferably 90 to 105 ° C.
  • the solubilizing solution may be an alkaline solution containing at least one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and barium hydroxide.
  • the total amount of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide and barium hydroxide added to this alkaline solution is 0.05 to 5 mol, preferably 0.05 to 2 mol per liter, and the liquid temperature is 90 to An alkaline solution at 105 ° C. is preferred.
  • the second method includes a pretreatment step including at least one of removal treatment of unnecessary parts of animal biological tissue, degreasing treatment of animal biological tissue, and shredding treatment of animal biological tissue; Repeat the alkaline extraction process of immersing animal biological tissue in an alkaline solution and filtering off collagen and other unwanted proteins, and the alkaline dissolution process of dissolving the residue after the alkaline extraction process with alkali, and filter the solution to make it water-soluble.
  • This is a method for producing water-soluble elastin by sequentially performing a filtrate recovery step for obtaining a filtrate containing elastin and a water-soluble elastin production step for producing water-soluble elastin from the filtrate.
  • the alkali used in the alkali dissolution step is preferably any one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, barium hydroxide, or a mixture.
  • This operation is different from the first method in which collagen and other unwanted proteins are removed from the tissue to obtain insoluble elastin, and then the insoluble elastin is solubilized to obtain water-soluble elastin.
  • This is a method for directly obtaining water-soluble elastin without obtaining insoluble elastin. That is, animal biological tissue that has been degreased, shredded, and salt-treated in an alkaline solution of 0.03 to 0.5 mol, preferably 0.05 to 0.3 mol, and 90 to 105 ° C., for 5 to 60 minutes. Immerse and obtain a treated tissue from which collagen and unnecessary proteins other than elastin have been removed.
  • this treated tissue is 0.05 to 5 mol per liter, preferably 0.05 to 2 mol (the concentration of the alkaline solution is higher).
  • water-soluble elastin is obtained by immersing in an alkaline solution at 90 to 105 ° C. for 5 to 420 minutes, preferably 10 to 240 minutes (longer time).
  • the water-soluble elastin obtained by the first or second method is then subjected to, for example, dialysis treatment to remove a low molecular weight fraction, so that the high molecular weight water soluble preferably used in the present invention is used. Elastin is obtained. By removing the low molecular weight fraction, the advantage of water-soluble elastin with higher coacervation ability is obtained.
  • the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the water-soluble elastin is N-acylated, preferably N-acetylated to form N -Acylated water-soluble elastin is obtained.
  • amino acids having a reactive primary amine or secondary amine include lysine, arginine and histidine, but are included in the molecule of water-soluble elastin.
  • the primary amine include a terminal amino group.
  • the primary amine and the secondary amine contained in the high molecular weight water-soluble elastin molecule is N-acetylated.
  • it is N-acetylated by an acetylating reagent such as acetic anhydride.
  • the degree of N-acetylation is preferably 80 mol% or more in terms of the modification rate represented by the following formula (1). 90 mol% is more preferable, and 95 mol% or more is particularly preferable.
  • Modification rate (mol%) (1 ⁇ B / A) ⁇ 100 (1)
  • A represents a value obtained by subtracting the average value of the absorbance of the blank from the average value of the absorbance (wavelength of 345 nm) of the water-soluble elastin.
  • B represents a value obtained by subtracting the average value of the absorbance of the blank from the average value of the absorbance (wavelength of 345 nm) of the N-acetylated water-soluble elastin.
  • N-acylation other than N-acetylation can be optically quantified under the same conditions.
  • the primary amine and the secondary amine contained in the water-soluble elastin are N-acetylated by 90 mol% or more, it is preferable to use 0.5 to 5 mmol of acetic anhydride per 1 g of the water-soluble elastin.
  • a chemically modified water-soluble compound obtained by coupling at least a part of a carboxyl group contained in the obtained N-acylated, preferably N-acetylated water-soluble elastin molecule, with an alkyl ester of an amino acid. Elastin is obtained.
  • a lower alkyl ester having 1 to 4 carbon atoms is preferable, and a methyl ester is particularly preferable.
  • a benzyl ester or the like may be used.
  • amino acids having a carboxyl group include aspartic acid and glutamic acid, but the carboxyl group contained in the water-soluble elastin molecule also includes a terminal carboxyl group. It is.
  • N-acylated, preferably N-acetylated water-soluble elastin molecules, in which almost all of the carboxyl groups are modified by coupling with an amino acid alkyl ester are preferred.
  • substantially all means that the reaction rate is 90 mol% or more.
  • the reaction rate is preferably 95 mol% or more.
  • a reaction rate of 90 mol% or more can be obtained.
  • a coupling agent such as carbodiimide per 1 g of the raw water-soluble elastin.
  • the amino group may be N-acylated after esterifying the carboxy group of water-soluble elastin.
  • the composition containing chemically modified water-soluble elastin is used as a temperature-responsive sheet.
  • the chemically modified water-soluble elastin other components can be used in combination as long as the function of temperature responsiveness is not inhibited.
  • the temperature-responsive sheet has only a chemically modified water-soluble elastin or a polypeptide having a peptide sequence in elastin. It is preferable to use only.
  • FIG. 3 is a diagram showing the gelation of collagen in a test tube.
  • the collagen solution is in a sol state at 10 ° C. or lower.
  • FIG. 3B when heated to 15 ° C. or higher, the collagen solution becomes cloudy and gels to become a collagen gel. This collagen gel does not return to its original sol state even when cooled.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the gelation of collagen. Collagen gel is used as a cell scaffold for cell sheet production. The scaffold is used to retain the shape of the cell sheet.
  • Cell scaffold refers to the extracellular matrix necessary for normal animal cells (epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells, etc.) to live, as is well known to those skilled in the art. .
  • the types of extracellular matrix are roughly classified into a collagen group, a non-collagenous glycoprotein group, an elastin group, and a proteoglycan group, and collagen, fibronectin, laminin, polylysine, and gelatin are exemplified as preferred specific examples.
  • Collagen suitable for medical use is usually extracted from an animal, which is a raw material, with an enzyme or the like under conditions of acid, alkali, neutrality, etc., and is a viscous collagen solution or a solid state obtained by drying this solution. The method of obtaining is generally used. Furthermore, the antigenic expression site can be removed by pepsin treatment, and collagen (atelocollagen) more suitable for a medical base material that is not antigenic when transplanted into the body or body surface can be obtained.
  • Representative collagens used in the present invention include solubilized collagens such as acid-solubilized collagen, alkali-solubilized collagen, enzyme-solubilized collagen and neutral-solubilized collagen.
  • Atelocollagen which has been subjected to removal of telopeptides that are antigenic determinants, is preferred.
  • the collagen solution is in a sol state at a low temperature, but when heated, it gels and becomes a collagen gel. As shown in FIGS. 10 and 13, since this collagen gel does not return to its original sol state even when cooled, it can be used as a scaffold for cells in the production of a cell sheet.
  • the method for producing a cell sheet according to the present invention includes a step of forming a temperature-responsive sheet containing chemically modified water-soluble elastin on a support, and culturing specific cells on the temperature-responsive sheet to produce a cell sheet. And a step of separating the temperature-responsive sheet and the cell sheet under conditions of 1 to 20 ° C., preferably 5 to 15 ° C., which are not higher than the cell culture temperature.
  • a step of providing a layer such as a collagen gel as a scaffold that is an extracellular matrix on the temperature-responsive sheet is added, and specific cells are cultured on the layer such as the collagen gel. It is preferable to do.
  • the above steps will be described below.
  • the support as a base material for producing the temperature-responsive sheet is not particularly limited, and an inert support that does not adversely affect cell culture is used.
  • a resin such as glass or polystyrene (PS) constituting a normal culture vessel can be exemplified.
  • the temperature-responsive sheet containing chemically modified water-soluble elastin preferably contains chemically modified water-soluble elastin as a main component (90% by weight or more), and more preferably comprises only chemically modified water-soluble elastin.
  • the thickness of the sheet is preferably on the order of nm to ⁇ m, and more preferably 50 nm to 500 ⁇ m. In other words, a dry coating amount of 0.01 to 100 g / m 2 is preferable.
  • the incubation temperature for forming the coacervate is preferably 40 ° C. to 80 ° C., and more preferably 50 ° C. to 70 ° C. Drying is preferably performed at 35 ° C. to 40 ° C. for 5 to 20 minutes.
  • the process of providing a collagen gel layer on a temperature responsive sheet will be described.
  • the thickness of the collagen gel layer is preferably about 1 to 1,000 ⁇ m, and more preferably about 10 to 500 ⁇ m.
  • the incubation temperature for film formation is preferably 30 ° C. to 40 ° C., more preferably around 37 ° C.
  • the concentration of the solution is preferably from 0.1 mg / ml to 10 mg / ml, more preferably from 0.5 mg / ml to 2 mg / ml.
  • a process for producing a cell sheet by culturing specific cells on the temperature-responsive sheet will be described.
  • Specific cells include epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells and the like.
  • Cell culture methods follow standard methods.
  • the cell sheet may be a single layer or multiple layers. In the case of multiple layers, the same cells or different cells may be used.
  • Growth factors such as vascular endothelial growth factor, fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, transforming growth factor, platelet-derived growth factor, etc. that promote cell culture to facilitate the production of cell sheets Can be added to the medium and cultured.
  • This step is a step of separating the temperature-responsive sheet and the cell sheet under the condition below the cell culture temperature.
  • “Culturing temperature or lower” means that when the culture temperature is 37 ° C., it is preferably 1 to 20 ° C., more preferably 10 to 15 ° C.
  • FIG. 10 is a diagram schematically showing a state of a collagen gel in which fibroblasts are seeded on a coacervate of chemically modified water-soluble elastin N-Ac-Ela-O-Gly-OMe.
  • 1 represents a collagen gel
  • 2 represents a coacervate (temperature-responsive sheet) of N-Ac-Ela-O-Gly-OMe
  • 3 represents a fibroblast.
  • the temperature responsive sheet 2 comprising the chemically modified water-soluble elastin and the cell sheet 3 are lowered to a temperature below the culture temperature of the fibroblasts.
  • separating is implemented.
  • FIG. 11 is an optical micrograph showing an example of the spherical state of fibroblasts immediately after seeding on a collagen gel (0 hour), and 3 represents fibroblasts.
  • FIG. 12 is an optical micrograph showing a spindle-like state of fibroblasts cultured for 24 hours after seeding on a collagen gel, and 3 represents fibroblasts.
  • FIG. 13 is a diagram schematically illustrating a state in which a coacervate of chemically modified water-soluble elastin N-Ac-Ela-O-Gly-OMe is dissolved and a cell sheet made of collagen gel and fibroblasts is detached. is there. 1 is a collagen gel, 3 is a fibroblast, 4 is a detached cell sheet, and 5 is a state in which N-Ac-Ela-O-Gly-OMe coacervate (temperature-responsive sheet) is dissolved.
  • a polypeptide obtained by chemically synthesizing the peptide sequence in elastin can be used instead of using chemically modified water-soluble elastin.
  • peptide sequences in elastin include poly (VPGVG) and poly (VPGG). These polypeptides are peptides that are commonly present in elastin of mammals such as humans, pigs, and cows, and are very few problems in terms of toxicity and immunology.
  • poly (PGVGV), poly (GVGVP), poly (GVPGV), poly (PGVV), poly (PGGGV), poly (VPGG) permutation polypeptides poly (PGVGV) GGVP) and poly (GVPG) are also included in the elastin-derived polypeptide.
  • Poly (X 2 X 3 X 4 X 1 P), poly (X 3 X 4 X 1 PX 2 ) which is a substitution of poly (VGVPG), poly (X 4 X which is a substitution of poly (GVPGV) 1 PX 2 X 3 ), poly (VPGG) substitution poly (X 1 PX 2 X 3 ), poly (PGGV) substitution poly (PX 2 X 3 X 1 ), poly (GGVP) Poly (X 2 X 3 X 1 P) which is a substitute and poly (X 3 X 1 PX 2 ) which is a substitute of poly (GVPG) are also included in the polypeptide of the present invention.
  • a polypeptide means one having a molecular weight of about 3,000 or more, preferably 5,000 to 100,000.
  • X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 may be any of about 20 types of amino acids constituting the protein.
  • FIG. 14 is a flowchart showing four types of production (polymerization) methods of poly (VPGVG).
  • ONp is p-nitrophenyl ester
  • TFA is trifluoroacetic acid
  • DMSO is dimethyl sulfoxide
  • NMM is N-methylmorpholine
  • WSCI is water-soluble carbodiimide
  • HOBt ⁇ H 2 O is 1-hydroxybenzotriazole monohydrate
  • Sulfo -NHS represents sulfosuccinimide
  • DW represents distilled water
  • Bis-PNPC represents bis (4-nitrophenol) carbonate.
  • N-Ac-Ela N-acetylated water-soluble elastin
  • Modification rate (mol%) (1 ⁇ B / A) ⁇ 100
  • A represents the average value of the absorbance (wavelength 345 nm) of the elastin aqueous solution minus the average value of the absorbance of the blank
  • B represents the average value of the absorbance (wavelength 345 nm) of the N-Ac-Ela aqueous solution. The average value of the absorbance of the blank is subtracted.
  • -Turbidity measurement Chemically modified water-soluble elastin, elastin-derived polypeptide, and type I collagen are each dissolved in phosphate buffered saline (PBS solution) at 5 ° C. in consideration of physiological conditions.
  • PBS solution phosphate buffered saline
  • the turbidity was measured under the conditions of a wavelength of 400 nm, a temperature change of 0.5 ° C./min, and a nitrogen stream.
  • the measuring instrument was a spectrophotometer with a Peltier temperature controller (JASCO: Ubest-50).
  • porcine aortic tissue living tissue
  • remove the unnecessary part by scraping off the low elastin content such as fat and muscle attached as pretreatment with a blade etc.
  • the shredding process was performed by homogenizing using a homogenizer.
  • the homogenized biological tissue was treated with hot water, a hot dilute aqueous alkali solution or an organic solvent such as acetone, degreased, and then dried.
  • 1M sodium chloride of about 10 times the weight of the defatted dry tissue was added and stirred for 1 hour at room temperature to extract and remove NaCl-soluble unnecessary protein. This operation was repeated 5 times, then washed with distilled water and drained by centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes).
  • porcine-derived high molecular weight water-soluble elastin To porcine-derived insoluble elastin was added 0.5N NaOH of 10 times its dry weight and stirred in an oil bath at 100 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the solution was quickly cooled with ice and neutralized with acetic acid, hydrochloric acid or citric acid. Thereafter, dialysis is performed for 1 week using a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 6,000 to 8,000, and the solution in the dialysis membrane is lyophilized to obtain a high molecular weight water solution derived from pigs having a main molecular weight of about 30,000 to 300,000. Sex elastin was obtained.
  • N-Ac-Ela-O-Gly-OMe The N-acetyl water-soluble elastin (N-Ac-Ela) obtained above was dissolved in a small amount of dimethylformamide and dissolved in water. Sex carbodiimide (100 equivalents) was added and stirred at room temperature for 15 minutes. Thereafter, a small amount of dimethylformamide in which H-Gly-OMe ⁇ HCl (100 equivalents) and triethylamine (100 equivalents) were dissolved was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • N-Ac-Ela-O-Gly-OMe shows that the turbidity curve of N-Ac-Ela-O-Gly-OMe is reversible because the turbidity curve with increasing temperature and the turbidity curve with decreasing temperature almost coincide. From the results of FIG. 6 and FIGS. 1 and 2, N-Ac-Ela-O-Gly-OMe becomes cloudy when heated by coacervation and forms coacervate at 37 ° C. and pH 7.4 under cell culture conditions. It was suggested that it returned to the original transparent solution state at 20 ° C. or lower.
  • the hardness of the coacervate was expressed as a load against indentation (MPa).
  • MPa load against indentation
  • a 1 mg / ml PBS solution of type I collagen was prepared (sterilized), 100 ⁇ l each was added onto the coacervate, and incubated for 1 hour (37 ° C. in 5% carbon dioxide gas) to prepare a collagen gel membrane. .
  • 100 ⁇ l of human skin fibroblasts (2.0 ⁇ 10 4 cells / ml) suspended in DMEM medium supplemented with 10.0% fetal bovine serum were seeded on the collagen gel membrane of each well, and 5% carbon dioxide incubator. The culture was performed at 37 ° C. for 24 hours. The results of observing the state of the cells with an optical microscope are shown in FIGS.
  • FIG. 10 schematically shows a state in which a collagen gel was prepared on N-Ac-Ela-O-Gly-OMe coacervate and fibroblasts were seeded on the gel. In this state, the cells are attached on the gel before adhering.
  • 1 is a collagen gel
  • 2 is a coacervate of N-Ac-Ela-O-Gly-OMe
  • 3 is a fibroblast before adhesion.
  • FIG. 11 is an optical micrograph showing that cells immediately after seeding (0 hour) are present on the collagen gel in an attached state (spherical) before adhesion.
  • FIG. 11, 3 is a fibroblast before adhering.
  • FIG. 12 is an optical micrograph showing that the fibroblasts cultured for 24 hours are present in a spindle-like state on the collagen gel and are adhered, stretched and proliferated.
  • reference numeral 3 denotes fibroblasts that are adhered, spread and proliferate.
  • a collagen gel is prepared on a coacervate of N-Ac-Ela-O-Gly-OMe, fibroblasts are seeded thereon, cultured for 24 hours to prepare a cell sheet, then cooled to 15 ° C. and 30
  • the N-Ac-Ela-O-Gly-OMe coacervate was dissolved by incubating for 5 minutes, and the cell sheet composed of fibroblasts and collagen gel was peeled off. The state in which the cell sheet adhered, stretched and proliferated on the collagen gel peeled off was observed with the naked eye.
  • FIG. 13 is a diagram schematically showing a state in which the N-Ac-Ela-O-Gly-OMe coacervate is dissolved and the cell sheet composed of collagen gel and fibroblasts is peeled off.
  • 1 is a collagen gel
  • 3 is a fibroblast that is adhered, stretched and proliferated
  • 4 is a cell sheet
  • 5 is a coacervate of N-Ac-Ela-O-Gly-OMe dissolved and disappeared. It represents the state.
  • the coacervate of N-Ac-Ela-O-Gly-OMe was dissolved, and a cell sheet composed of fibroblasts and collagen gel was easily produced and collected in an intact state.
  • N-Ac-Ela-O-Gly-OMe is dissolved in PBS solution (pH 7.4) to prepare 10 ml of a 30 mg / ml solution, sterilized through a filter-unit 0.22 ⁇ m sterilizing filter; 6 ml each was dispensed into a 6 cm diameter culture dish (coating amount was 38 g / m 2 ), incubated for 24 hours (in 60 ° C., 5% carbon dioxide gas), and separated into two layers. Thereafter, the upper equilibrium solution was removed, and the surface of the lower coacervate film (100 to 200 ⁇ m thick) was dried at 37 ° C. for about 10 minutes.
  • VPGVG poly(VPGVG)
  • VPGVG Poly (VPGVG) (1) by the active ester method- H-VPGVG-ONp.TFA (0.23 mmol) was dissolved in DMSO (0.5 ml), the pH was adjusted to 9 with NMM, and the mixture was stirred for 7 days to polymerize. Dialyzed using a dialysis membrane with a molecular weight cut off of 3,500, and lyophilized. The yield was 37% and the average molecular weight was about 17,000. In addition, the average molecular weight was calculated
  • VPGVG poly (VPGVG) coacervate- Poly (VPGVG)
  • PBS solution pH 7.4
  • 30 mg / ml sterilized through a filter for sterilization with 0.22 ⁇ m Filter-Unit, and 96 ⁇ l each. It was dispensed into a well culture dish and incubated for 24 hours (60 ° C. in 5% carbon dioxide) to separate into two layers. Thereafter, the upper equilibrium solution was removed, and the surface of the lower coacervate was dried at 37 ° C. for about 10 minutes.
  • a 1 mg / ml PBS solution of type I collagen was prepared (sterilized), 100 ⁇ l each was added onto the coacervate, and incubated for 1 hour (37 ° C. in 5% carbon dioxide gas) to prepare a collagen gel membrane.
  • Human skin fibroblasts (2.0 ⁇ 10 4 cells / ml) suspended in DMEM medium supplemented with 10.0% fetal bovine serum were seeded on the collagen gel membrane of each well in an amount of 100 ⁇ l, and a 5% carbon dioxide incubator. -Cultivation was carried out at 37 ° C for 24 hours.
  • FIG. 16 is an optical micrograph showing that the fibroblasts after 24 hours of culture are present in a spindle-like state on the collagen gel and are adhered, stretched and proliferated.
  • reference numeral 3 denotes fibroblasts that are adhered, spread and proliferate.
  • Any of the above polypeptides can be used as a temperature-responsive sheet.
  • a living tissue or organ basically has a structure made of sheet-like cells, and is folded into various shapes to form three-dimensional tissues such as blood vessels and organs.
  • a technique in which such a cell sheet can be produced by cell culture using an extracellular matrix as a scaffold, peeled off from a culture dish, and stacked is called cell sheet engineering.
  • cell sheet engineering A technique in which such a cell sheet can be produced by cell culture using an extracellular matrix as a scaffold, peeled off from a culture dish, and stacked is called cell sheet engineering.
  • a proteolytic enzyme for detachment, which damages the cells and the extracellular matrix.
  • Chemical modification of water-soluble elastin, derivatives thereof Water-soluble elastin, or coacervates of elastin-derived polypeptides have been found to be useful for recovering intact cell sheets. Polypeptides can be used to recover cells in sheet form, which can be used in cell sheet engineering.

Abstract

　本発明の課題は、生体由来で毒性が極めて低く、可逆的な性質を示す温度応答性のシートを作製し、その性質を利用して、シート状の培養細胞を、そのままの形態で回収する方法を提供することである。　この課題は、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルとカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンからなる温度応答性シート、及び、この温度応答性シート上に動物細胞の足場となる膜を作製し、その膜上で特定の細胞を培養して細胞シートを作製し、次いで、該細胞の培養温度以下の条件で、前記化学修飾水溶性エラスチンからなる温度応答性シートと前記細胞シートとを分離することを特徴とする細胞シートの製造方法により解決された。

Description

可逆的な性質を示す温度応答性シートとそれを用いた細胞シートの製造方法
　本発明は、可逆的な性質を示す温度応答性シート及びそれを用いた培養細胞を含む細胞シートの製造方法に関する。
　近年、細胞シート工学の技術を用いた再生医療が注目されており、各種の細胞シートを移植する試みが多くみられる。移植に際して、細胞シートは、単層のシートの移植、同一の細胞シートの積層化による均一な組織の移植、数種の異なる細胞シートの積層化による層状構造を呈する組織の移植などの方法で利用される。現在では、２０～３０種類の細胞シートが作られ、角膜、網膜や皮膚、膀胱上皮、歯根膜などの上皮細胞系を用いた臨床応用が進められている。
　しかし、細胞シートを製造する上では問題点がある。それは培養した細胞あるいは細胞シートを培養皿から剥がす際、培養皿上の接着タンパク質に細胞が強く接着しているため、タンパク分解酵素を使用せざるを得ず、細胞及び細胞外マトリックスを傷つけてしまう結果となっていた。そこで最近、タンパク分解酵素を使用しない方法、即ち、温度により表面の性質が変化するポリアクリルアミド類のＮ－イソプロピルアクリルアミドポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）を培養皿表面にコーティングし、細胞シートを回収する方法が開発されている。ＰＩＰＡＡｍは、３２℃を境に水との親和性が大きく変化する素材である。このＰＩＰＡＡｍを、培養皿表面にナノオーダーの均一な厚さで固定すると、細胞の培養に適した３７℃では表面が疎水性になり、細胞が接着・増殖する。一方、培養後３２℃以下まで温度を下げると、表面は親水性になって、シート状の細胞を無傷のまま剥がすことができる（例えば、特許文献１及び２参照）。
　しかし、ＰＩＰＡＡｍの様なアクリルアミドポリマー類そのものには、アクリルアミドモノマーのような毒性は認められないものの、アクリルアミドポリマー類の製造過程において、毒性を有する未重合のアクリルアミドモノマーが、ポリマー内に残留する恐れがあり、その問題が指摘されてきた。
国際公開第２００２／１０３４９号パンフレット 国際公開第２００５／１０３２３３号パンフレット
　本発明の課題は、生体由来で毒性が極めて低く、可逆的な性質を示す温度応答性のシートを作製し、その性質を利用して、シート状の培養細胞を、そのままの形態で回収する方法を提供することにある。
　本発明者らは、ＰＩＰＡＡｍの代わりに、毒性が極めて低い生体由来の材料である水溶性エラスチンに着目し、水溶性エラスチンの有するコアセルベーション形成能を利用し、水溶性エラスチンの荷電を低減して高い分子集合能を持つ化学修飾水溶性エラスチンを含む可逆的な温度応答性のシートを作製し、これを細胞シートの製造に利用することを試みた。また毒性が極めて低く、且つコアセルベーションを示し、高い分子集合能を有するエラスチン中のペプチド配列を有するポリペプチドを可逆的な温度応答性シートに用いるために、その製造を試みた。
　本発明者らは、上記課題は、具体的には、下記のような本発明の各態様によって達成されることを見いだした。
　本発明の一態様は、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の少なくとも一部をアミノ酸のアルキルエステルとカップリングさせて得られる化学修飾した水溶性エラスチンを含む温度応答性シートである。
　本発明の温度応答性シートについて以下に好ましい実施態様を列記する。
　温度応答性シートは、第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アセチル化すると共に、カルボキシル基の少なくとも一部をグリシンのメチルエステルとカップリングさせることが好ましい。
　上記のＮ－アセチル化は、式（１）により規定される修飾率が８０モル％以上であることが好ましい。
　修飾率（モル％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００　　　（１）
　ここで、Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表し、Ｂは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
　カルボキシル基の保護は、カルボキシル基の９０モル％以上がグリシンのメチルエステルにより保護されることが好ましい。
　本発明の温度応答性シートは、化学修飾した水溶性エラスチンが、ｐＨ７．４、温度３７℃でコアセルベートを形成し、温度を２０℃以下、好ましくは１～２０℃、より好ましくは１～１５℃に低下させると、該コアセルベートが溶解する性質を持つ。
　また、水溶性エラスチンが低分子量フラクションを透析により除去した高分子量水溶性エラスチンであることが好ましい。
　本発明の温度応答性シートは、細胞シート作製用に好ましく使用される。
　上記の好ましい実施態様の組み合わせはさらに好ましい。
　本発明の他の態様は、前記の化学修飾した水溶性エラスチンを含む、温度応答性シート上で特定の細胞を培養して細胞シートを作製する工程、次いで、該細胞の培養温度以下の条件で、前記温度応答性シートと前記細胞シートとを分離する工程を含む、細胞シートの製造方法である。
　上記の製造方法は、温度応答性シートを形成する工程に引き続いて、前記温度応答性シート上に、細胞の足場となるゲル膜を形成する工程、を含むことが好ましい。足場となる膜は、いわゆる細胞外マトリックスよりなる群から選ばれたゲル膜であることが好ましい。足場となる膜は、具体的には、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリシン、及び、ゼラチン群から選ばれたゲル膜であることが好ましく、コラーゲン、ポリリシン、及び、ゼラチンよりなる群から選ばれたゲル膜がより好ましく、コラーゲンのゲル膜であることが特に好ましい。
　上記の「細胞の足場となるゲル膜」は、コラーゲン等の細胞外マトリックスの主成分に、細胞接着・細胞増殖を促進する、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、フォンビルブランド因子、フィブリノーゲン、コンドロイチン－６硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸等の異種の細胞外マトリックスを任意成分として少量含有していてもよい。
　本発明の更なる他の態様は、前記の化学修飾水溶性エラスチンと同様にコアセルベーションを示すエラスチン中のペプチド配列を有するポリペプチドを化学合成すること、及びこのポリペプチドを主成分として含むシートを可逆的な温度応答性シートに用いることである。主成分として含むとは、９０重量％以上を意味し、ポリペプチドのみからなるシートであることが好ましい。このポリペプチドについては後に詳述する。
　本発明によると、化学修飾した水溶性エラスチンの可逆的な温度応答性を利用して、細胞シートを傷つけることなくそのままの形態で作製することができる。従来のＰＩＰＡＡｍを用いた温度応答性培養皿では、毒性のあるアクリルアミドモノマーが残留するという危険性があったが、本発明においては、生体由来の安全な蛋白質やポリペプチドを用いて、同様に温度を下げるだけで、培養細胞をシート状に回収することができる。
化学修飾水溶性エラスチン及びポリペプチドのコアセルベーションを示す図。 化学修飾水溶性エラスチン及びポリペプチドのコアセルベーションを模式的に示した図。 コラーゲンのゲル化を示す図。 コラーゲンのゲル化を模式的に示した図。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeの各ｐＨ条件下（溶媒：ＰＢＳ）における濁度曲線を示す図。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeの可逆的な濁度曲線を示す図。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeコアセルベートの硬さを示す図。 Ｉ型コラーゲンの不可逆的な濁度曲線を示す図。 Ｉ型コラーゲンゲル上での細胞増殖を示す図。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上にコラーゲンゲルを作製し、そのゲル上に線維芽細胞を播種した状態を模式的に示した図。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上にコラーゲンゲルを作製し、そのゲル上に線維芽細胞を播種した直後（０時間）の線維芽細胞の球状の状態の光学顕微鏡写真。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上にコラーゲンゲルを作製し、そのゲル上に線維芽細胞を播種し、２４時間培養後の線維芽細胞の紡錘状の状態の光学顕微鏡写真。 化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解し、コラーゲンゲル及び線維芽細胞からなる細胞シートが剥離している状態を模式的に示した図。 poly(VPGVG)の４種類の製造（ポリマー化）方法を示す図。 エラスチン由来のポリペプチドpoly(VPGVG)の可逆的な濁度曲線を示す図。 エラスチン由来のポリペプチドpoly(VPGVG)のコアセルベート上にコラーゲンゲルを作製し、そのゲル上に線維芽細胞を播種し、２４時間培養後の線維芽細胞の紡錘状の状態の光学顕微鏡写真。
　以下に本発明の態様を順に説明する。
　図１及び図２を参照しながら、水溶性エラスチン、その誘導体である本発明の化学修飾した水溶性エラスチン（本発明において「化学修飾水溶性エラスチン」ともいう。）、又はエラスチン中のペプチド配列を有するポリペプチドのコアセルベーションについて説明する。
　図１は、化学修飾水溶性エラスチン及び上記ポリペプチドのコアセルベーションを示す図である。図１中、Ａに示すように、化学修飾水溶性エラスチン又はポリペプチドは１５℃以下では透明な均一溶液である。同じく、Ｂに示すように、２０℃以上に加熱すると、相転移を起こして平衡溶液とコアセルベート液滴からなる白濁状態になる。この白濁状態は冷却すると元の透明な均一溶液に戻る。Ｃに示すように、２０℃以上でそのまま放置すると、コアセルベート液滴は互いに融合して大きな液滴になり、淡黄色の高粘性のコアセルベートとして沈層して、平衡溶液とコアセルベートの２層に分離する。この２層分離状態を冷却すると、コアセルベートは溶解して元の透明な均一溶液に戻る。
　図２は、化学修飾水溶性エラスチン又はポリペプチドのコアセルベーションを模式的に示した図である。図２中、Ｃの下層のコアセルベートは冷却すると溶解し、元の透明な均一溶液に戻るため、このコアセルベートは細胞や細胞シートを傷つけずに回収するための温度応答性材料に用いられる。
　例えば、化学修飾水溶性エラスチン又はポリペプチドの水溶液は、低温では透明な均一溶液であるが、加熱すると白濁し、そのまま放置すると、透明な平衡溶液（上層）と淡黄色の高粘性のコアセルベート（下層）の２層に分離する。この過程は可逆的で、冷却すると再び元の均一溶液に戻る。本発明は、かかる可逆的な性質を利用して、細胞及び細胞外マトリックスを傷つけないで、細胞シートを製造し回収するものである。
　本発明における化学修飾水溶性エラスチンは、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の少なくとも一部をアミノ酸のアルキルエステルとカップリングすることにより得られるものである。Ｎ－アシル化にはＮ－ホルミル化、Ｎ－アセチル化、Ｎ－ベンゾイル化などがあるが、Ｎ－アセチル化が好ましい。また、Ｎ－アシル化にはウレタン型やアルキル型を用いてもよい。カップリングに用いられるアミノ酸は、タンパク質を構成するグリシン、バリン、フェニルアラニンなどの約２０種類の中から選ばれる。
　本発明において高分子量の水溶性エラスチンを使用することが好ましい、「高分子量」とは、水溶性エラスチンから比較的低分子（約５，０００以下）の成分を除去したものを言う。区画分子量が、６，０００～８，０００の透析膜を用いた透析により、低分子量成分を除去することが好ましい。高分子量の水溶性エラスチンの主たる分子量は約１万以上であることが好ましく、約３～３０万であることがより好ましい。
　本発明において、「水溶性エラスチン」とは、水不溶性エラスチンを部分加水分解して得られるものであり、具体的には、動物の大動脈や項靱帯、魚の動脈球など動物性生体組織を、酸性可溶化液又はアルカリ性可溶化液により処理して得られる。水溶性エラスチンには、熱シュウ酸処理して得られるα－エラスチン若しくはβ－エラスチン、エラスチンをアルカリエタノール処理して得られるκ－エラスチンが代表的である。この他に、エラスターゼ等により酵素処理したエラスチン消化物及びエラスチン生合成経路における前駆体であるトロポエラスチンなどが含まれる。水溶性エラスチンの水への溶解度は、５℃において約０．００１ｍｇ／ｍｌ以上約６００ｍｇ／ｍｌ以下であることを意味し、１ｍｇ／ｍｌ以上６００ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
　水不溶性エラスチンの部分加水分解に先立って、エラスチンを含む生体組織の細断処理、熱水、熱稀アルカリ水溶液処理、アセトン抽出等による脱脂処理、塩化ナトリウム可溶の不要タンパク質の抽出除去等を行うことが好ましい。
　前記の化学修飾水溶性エラスチンの製造に際しては、水溶性エラスチンのＮ末端及びリジン（lysine）、アルギニン等のアミノ酸残基側鎖のアミノ基等をＮ－アシル化し、引き続き、Ｃ末端及びアスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸残基側鎖のカルボキシル基等とアミノ酸アルキルエステルのアミノ基をカップリングさせて化学修飾水溶性エラスチンが得られる。化学修飾によってアミノ基等とカルボキシル基等が修飾されることにより、エラスチンの荷電が低減又は消失し、その結果、エラスチン分子間の疎水的相互作用が増し、得られた化学修飾水溶性エラスチンは、未修飾エラスチンに比べて高い自己集合性を有するようになるものと考えられる。
　以下、水溶性エラスチンの製造方法、水溶性エラスチンの化学修飾方法、及び本発明の化学修飾水溶性エラスチンを含む温度応答性シートを作製する方法、そして、得られた温度応答性シートを用いて、該シート上で特定の細胞を培養して細胞シートを作製し、次いで、該細胞の培養温度以下の条件で、前記温度応答性シートと前記細胞シートとを分離し、該細胞シートを無傷で回収する方法について詳細に説明する。
　水溶性エラスチンの製造方法は色々と提案されている。好ましいのは、本発明者が提案した下記の方法である（特開２００７－４５７２２号公報参照）。
　第１の方法は、動物性生体組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理を行って不溶性エラスチンを得、次いでこの不溶性エラスチンをシュウ酸等を含む酸性可溶化液、又は水酸化ナトリウム等を含むアルカリ性可溶化液に浸漬・溶解させ、水溶性エラスチンを製造する。コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であって、このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０３～０．５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～０．３ｍｏｌとしたアルカリ性溶液中に、動物性生体組織を、９０～１０５℃において、５～６０分間浸漬して行うのが好ましい。また、コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理に際しては、アルカリ性溶液による処理の前に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は、塩化バリウムのいずれか一つを含む塩溶液に、動物性生体組織を浸漬させる浸漬処理（前処理）を行うのも好ましい。
　動物性生体組織としては、特に制限はないが、エラスチンの含量が多い点で、豚、馬、牛、羊などの哺乳動物から得られた項靱帯や大動脈血管を使用することが好ましい。またエラスチン含量の多い魚類の動脈球などを使用しても良い。動物性生体組織は、先ず、ホモジナイザーを用いてホモジナイズするのが良い。ホモジナイズはミキサー、ミートチョッパーなど動物性生体組織を細断できれば良く、好ましくは３ミリメートル角以下、さらに好ましくはペースト状に細断できる器具を用いると良い。細断した動物性生体組織の粒が小さいほど、コラーゲンやその他の不要なタンパク質の除去効率を上げることができるので好ましい。ホモジナイズした動物性生体組織は、例えば、熱水又は熱希薄アルカリ水溶液で煮沸するか、もしくは有機溶媒で処理することによって脱脂処理を行っても良い。
　前記可溶化液としては、シュウ酸、蟻酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ベタイン、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、スルファミン酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸の少なくともいずれか一つを含む酸性溶液が用いられる。そして、この酸性溶液の酸の総量は、１Ｌあたり０．０５～５ｍｏｌ、好ましくは０．１～２ｍｏｌとし、かつ、液温を９０～１０５℃とするのが好ましい。
　前記可溶化液は、また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であっても良い。このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５～５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～２ｍｏｌとし、かつ、液温が９０～１０５℃のアルカリ性溶液とするのが好ましい。
　第２の方法は、動物性生体組織の不要部分の除去処理、動物性生体組織の脱脂処理、動物性生体組織の細断処理の少なくともいずれか一つを含む前処理工程と、前処理された動物性生体組織をアルカリ性溶液に浸漬してコラーゲンやその他の不要タンパク質を濾別するアルカリ抽出工程と、アルカリ抽出工程後の残渣をアルカリで溶解するアルカリ溶解工程を所定回数繰り返し、濾別により水溶性エラスチンを含む濾液を得る濾液回収工程と、濾液から水溶性エラスチンを生成する水溶性エラスチン生成工程とを順次行って水溶性エラスチンを製造する方法である。前記アルカリ溶解工程で用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムのいずれか一つ又は混合物が好ましい。
　この操作は、前記の、組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質を除去して不溶性エラスチンを得て、次いで、この不溶性エラスチンを可溶化して水溶性エラスチンを得る第１の方法とは異なり、組織から不溶性エラスチンを得ることなく、直接水溶性エラスチンを得る方法である。即ち、１Ｌあたり０．０３～０．５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～０．３ｍｏｌで９０～１０５℃としたアルカリ性溶液中に、脱脂、細断、塩処理した動物性生体組織を５～６０分間浸漬し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去した処理組織を得て、次いで、この処理組織を１Ｌあたり０．０５～５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～２ｍｏｌ（アルカリ液の濃度がより高濃度）で９０～１０５℃のアルカリ性溶液中に５～４２０分間、好ましくは１０～２４０分間（時間がより長い）浸漬して溶解し、水溶性エラスチンを得る方法である。
　前記のごとく第１又は第２の方法で得られた水溶性エラスチンは、次いで、それを、例えば、透析処理することによって低分子量のフラクションを除去して、本発明で好ましく用いられる高分子量水溶性エラスチンが得られる。低分子量のフラクションを除去することにより、より高いコアセルベーション能を有する水溶性エラスチンである利点が得られる。
　本発明の化学修飾水溶性エラスチンの製造においては、先ず、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アシル化、好ましくは、Ｎ－アセチル化してＮ－アシル化水溶性エラスチンを得る。エラスチンを構成するアミノ酸残基の中で、反応性の第１アミン又は第２アミンを有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるが、水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミンとしては、末端アミノ基も含まれる。
　本発明においては、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部がＮ－アセチル化される。好ましくは、無水酢酸等のアセチル化試薬によってＮ－アセチル化されるが、Ｎ－アセチル化の程度は、下記の式（１）で表される修飾率で、８０モル％以上であることが好ましく、９０モル％であることがより好ましく、９５モル％以上であるものが特に好ましい。
　修飾率（モル％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００　　　　（１）
　式中、Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。Ｂは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
　Ｎ－アセチル化以外のＮ－アシル化も同様の条件で光学的に定量することができる。
　水溶性エラスチン中に含まれる第１アミン及び第２アミンが、９０モル％以上Ｎ－アセチル化されるためには、水溶性エラスチン１ｇ当たり無水酢酸を０．５～５ｍｍｏｌ使用することが好ましい。
　本発明においては、得られたＮ－アシル化、好ましくは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチン分子中に含まれるカルボキシル基の少なくとも一部をアミノ酸のアルキルエステルとカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンが得られる。本発明においては炭素数１～４の低級アルキルエステルが好ましいが、特にメチルエステルが好ましい。またベンジルエステルなどのようなものを用いてもよい。エラスチンを構成するアミノ酸残基の中で、カルボキシル基を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸とグルタミン酸があるが、水溶性エラスチンの分子中に含まれるカルボキシル基としては、末端カルボキシル基も含まれる。
　本発明においては、Ｎ－アシル化、好ましくは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチン分子中に含まれるカルボキシル基のほぼ全部が、アミノ酸のアルキルエステルとのカップリングにより修飾されているものが好ましい。ここで、「ほぼ全部」とは、反応率が９０モル％以上であることをいう。反応率は９５モル％以上であることが好ましい。カップリング反応に際しては、水溶性エラスチンの１モル当量に対して、カルボジイミド等のカップリング剤又は縮合剤を過剰に使用することが好ましく、６０～２００モル当量用いるのが好ましく、８０～１２０モル当量用いることがより好ましい。高活性のカップリング剤を６０～２００モル当量用いる場合、９０モル％以上の反応率が得られる。
　水溶性エラスチン中に含まれるカルボキシ基を、９０モル％以上エステル化するためには、原料水溶性エラスチン１ｇ当たり、カルボジイミド等のカップリング剤を０．３～１ｍｍｏｌ使用することが好ましい。
　図５に示すように、ｐＨを５～９の範囲において変化させても濁度曲線が変化しないことから、カルボキシル基のほぼ全部が修飾されていると解釈される。
　水溶性エラスチンのアミノ基をＮ－アシル化した後にカルボキシ基をエステル化する代わりに、水溶性エラスチンのカルボキシ基をエステル化した後にアミノ基をＮ－アシル化してもよい。
　本発明において、化学修飾水溶性エラスチンを含む組成物は温度応答性シートとして使用される。化学修飾水溶性エラスチンの他に、温度応答性の機能を阻害しない限り、他の成分を併用しうるが、温度応答性シートには化学修飾水溶性エラスチンのみ又はエラスチン中のペプチド配列を有するポリペプチドのみを使用することが好ましい。
　図３は、試験管中でコラーゲンのゲル化を示す図である。図３のＡに示すように、１０℃以下ではコラーゲン溶液はゾル状態にある。図３のＢに示すように、１５℃以上に加熱するとコラーゲン溶液は白濁してゲル化し、コラーゲンゲルになる。このコラーゲンゲルは冷却しても元のゾル状態には戻らない。
　図４は、コラーゲンのゲル化を模式的に示した図である。コラーゲンゲルは細胞シート作製のための細胞の足場に用いられる。足場は、細胞シートの形状を保持するために使用される。細胞の足場は、当業者によく知られているように、正常な動物細胞（上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞など）が生きて行くために必要な細胞外マトリックスを意味する。細胞外マトリックスの種類は、コラーゲン群、非コラーゲン性糖タンパク質群、エラスチン群、及び、プロテオグリカン群に大別され、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリシン、及び、ゼラチンが好ましい具体例として例示される。
　本発明の細胞シートの製造で用いられるコラーゲンは、医療用途として知られているどのようなものでも用いることができる。通常、医療用途に適したコラーゲンは、主として原料である動物から、酸、アルカリ、中性等の条件下で酵素などにより抽出し、粘調なコラーゲン溶液又はこの溶液を乾燥させた固体の状態として得る方法が一般的に用いられている。また、更に、ペプシン処理を施すことによって抗原性発現部位を除去し、体内又は体表面に移植した際に抗原性が無い、より医療基材に好適なコラーゲン（アテロコラーゲン）を得ることもできる。本発明で用いられる代表的なコラーゲンとしては、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、中性可溶化コラーゲン等の可溶化コラーゲンが挙げられ、特に、可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドの除去処理が施されている、アテロコラーゲンが好適である。コラーゲン溶液は、低温下ではゾル状態にあるが、加熱するとゲル化してコラーゲンゲルになる。図１０及び１３に示すように、このコラーゲンゲルは冷却しても元のゾル状態に戻らないので、細胞シートの製造において細胞の足場に用いることができる。
　本発明の細胞シートの製造方法は、化学修飾水溶性エラスチンを含む温度応答性シートを支持体上に形成する工程、前記温度応答性シート上で、特定の細胞を培養して細胞シートを作製する工程、次いで、該細胞の培養温度以下の１～２０℃、好ましくは５～１５℃の条件で、前記温度応答性シートと前記細胞シートを分離する工程を含むことを特徴とする。細胞シートを作製する工程の前に、温度応答性シート上に細胞外マトリックスである足場としてコラーゲンゲル等の層を設ける工程を加入して、このコラーゲンゲル等の層の上で特定の細胞を培養することが好ましい。
　以下に上記の各工程を説明する。
　化学修飾水溶性エラスチンを含む温度応答性シートを支持体上に形成する工程について説明する。
　温度応答性シートを作製するための基材である支持体は、特に限定されず、細胞培養に悪影響のない、不活性な支持体が使用される。このような支持体として、通常の培養容器を構成するガラス、ポリスチレン（ＰＳ）等の樹脂が例示できる。
　化学修飾水溶性エラスチンを含む温度応答性シートは、化学修飾水溶性エラスチンを主成分（９０重量％以上）として含むことが好ましく、化学修飾水溶性エラスチンのみからなることがより好ましい。このシートの厚さは、ｎｍ～μｍのオーダーであることが好ましく、５０ｎｍ～５００μｍであることがより好ましい。言い換えると、０．０１～１００ｇ／ｍ2の乾燥塗設量とすることが好ましい。コアセルベートを形成させるためのインキュベート温度は４０℃～８０℃であることが好ましく、５０℃～７０℃であることがより好ましい。乾燥条件は３５℃～４０℃で５分～２０分間乾燥させるのが好ましい。
　温度応答性シート上にコラーゲンゲル層を設ける工程について説明する。
　コラーゲンゲル層の厚さは、約１～１，０００μｍであることが好ましく、約１０～５００μｍであることがより好ましい。膜形成のためのインキュベート温度は３０℃～４０℃であることが好ましく、３７℃付近であることがより好ましい。溶液の濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
　前記温度応答性シート上で、特定の細胞を培養して細胞シートを作製する工程について説明する。特定の細胞には、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞などが例示できる。細胞培養の方法は定法に従う。
　細胞シートは単層でも複層にしてもよい。複層の場合には、同一細胞でも、異種の細胞であってもよい。
　細胞シートの作製を促進するために、細胞の培養を促進する血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子等の成長因子を培地に加えて培養することができる。
　温度応答性シートと前記細胞シートとを分離する工程について説明する。
　この工程は、前記細胞の培養温度以下の条件で、前記温度応答性シートと前記細胞シートとを分離する工程である。「培養温度以下」とは、培養温度が３７℃の場合、好ましくは、１～２０℃、より好ましくは、１０～１５℃をいう。
　図１０は、化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上に、線維芽細胞を播種したコラーゲンゲルの状態を模式的に示した図である。図１０において、1はコラーゲンゲルを表し、２はN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート（温度応答性シート）を表し、３は線維芽細胞を表す。線維芽細胞を培養して細胞シートを作製する工程に続いて、該線維芽細胞の培養温度以下に温度を下げて、前記化学修飾水溶性エラスチンからなる温度応答性シート２と前記細胞シート３とを分離する工程を実施する。
　図１１は、コラーゲンゲル上に播種した直後（０時間）の線維芽細胞の球状の状態の一例を表す光学顕微鏡写真であり、３は線維芽細胞を表す。図１２は、コラーゲンゲル上に播種後、２４時間培養した線維芽細胞の紡錘状の状態を表す光学顕微鏡写真であり、３は線維芽細胞を表す。
　図１３は、化学修飾水溶性エラスチンN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解し、コラーゲンゲル及び線維芽細胞からなる細胞シートが剥離している状態を模式的に例示した図である。１はコラーゲンゲル、３は線維芽細胞、４は剥離している細胞シート、5はN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート（温度応答性シート）が溶解している状態を表す。
　本発明において、化学修飾水溶性エラスチンを使用する代わりに、エラスチン中のペプチド配列を化学合成したポリペプチドを使用することができる。
　エラスチン中のペプチド配列にはpoly(VPGVG)及びpoly(VPGG)が例示できる。これらのポリペプチドはヒト、ブタ、ウシ等の哺乳動物のエラスチンに共通して存在するペプチドであり、毒性や免疫学的等の面で極めて問題が少ないポリペプチドである。またpoly(VPGVG)の順列入れ替えポリペプチドであるpoly(PGVGV)、poly(GVGVP)、poly(VGVPG)及びpoly(GVPGV)、poly(VPGG)の順列入れ替えポリペプチドであるpoly(PGGV)、poly(GGVP)及びpoly(GVPG)もエラスチン由来ポリペプチドに含まれる。さらにpoly(VPGVG)の置換体であるpoly(X1PX2X3X4)、poly(PGVGV)の置換体であるpoly(PX2X3X4X1)、poly(GVGVP)の置換体であるpoly(X2X3X4X1P)、poly(VGVPG)の置換体であるpoly(X3X4X1PX2)、poly(GVPGV)の置換体であるpoly(X4X1PX2X3)、poly(VPGG)の置換体であるpoly(X1PX2X3)、poly(PGGV)の置換体であるpoly(PX2X3X1)、poly(GGVP)の置換体であるpoly(X2X3X1P)、poly(GVPG)の置換体であるpoly(X3X1PX2)も本発明のポリペプチドに含まれる。本発明においてポリペプチドとは、分子量が約３，０００以上、好ましくは５，０００～１００，０００のものを意味する。またX1、X2、X3、X4はタンパク質を構成する約２０種類のアミノ酸のいずれでもよい。
　図１４は、poly(VPGVG)の4種類の製造（ポリマー化）方法を示すフロー図である。ONpはｐ－ニトロフェニルエステル、TFAはトリフルオロ酢酸、DMSOはジメチルスルホキシド、NMMはＮ－メチルモルホリン、WSCIは水溶性カルボジイミド、HOBt・H2Oは1-ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物、Sulfo-NHSはスルホスクシンイミド、DWは蒸留水、Bis-PNPCは炭酸ビス（４－ニトロフェノール）を表す。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明する。各種測定法は以下のとおりである。
－Ｎ－アセチル化の修飾率－
　Ｎ－アセチル化の修飾率は、ＴＮＢＳ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）法より以下のようにして測定し計算される。１ｍｇ／ｍｌのＮ－アセチル化水溶性エラスチン（N-Ac-Ela）水溶液に、４％の炭酸水素ナトリウム溶液、０．１％のＴＮＢＳ水溶液を、それぞれ１ｍｌ加えた。４％の炭酸水素ナトリウム溶液、０．１％のＴＮＢＳ水溶液をそれぞれ１ｍｌ加えただけのものを、ブランクとした（ｎ＝３）。作製した溶液をアルミホイルで遮光し、４０℃で２時間反応させた。反応終了後、作製した溶液０．１７ｍｌに１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）１ｍｌ、１Ｎ　ＨＣｌを０．５ｍｌ加え、３４５ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。また、修飾率は以下の式より求めた。
　修飾率（モル％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００
　式中、Ａは、エラスチン水溶液の吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いたものを表し、Ｂは、N-Ac-Ela水溶液の吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いたものを表す。
－濁度測定－
　化学修飾水溶性エラスチン、エラスチン由来のポリペプチド、及びＩ型コラーゲンをそれぞれ生理的条件下を考慮してリン酸緩衝液生理食塩水（phosphate buffered saline；ＰＢＳ溶液）に５℃において溶解し、その溶液を、波長４００ｎｍ、温度変化０．５℃／分、窒素気流下の条件で濁度測定を行った。測定機器はペルチェ式温度コントローラー付分光光度計(JASCO:Ubest-50)を用いた。
－ブタ由来水溶性エラスチンの作製－
１）ブタ由来不溶性エラスチンの単離
　以下の手順に従ってブタ大動脈脱脂組織からNaCl可溶及びNaOH可溶なエラスチン以外の不要タンパク質やコラーゲンを抽出により除去した。
　ブタ大動脈組織（生体組織）を用い、前処理として付着している脂肪や筋肉などエラスチン含量の低い部分を、刃物などを用いて削ぎ落とすことで不要部分の除去処理を行い、次いで、生体組織をホモジナイザーを用いてホモジナイズすることで細断処理を行った。ホモジナイズした生体組織を熱水、熱希薄アルカリ水溶液又はアセトン等の有機溶媒で処理して脱脂処理を行った後に乾燥させた。ついで脱脂乾燥組織重量の約１０倍容量の１Ｍ塩化ナトリウムを加え、室温で１時間攪拌してNaCl可溶の不要タンパク質を抽出、除去した。この操作を５回繰り返し、その後蒸留水で洗浄し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）により水切りした。
　上記のようにして脱脂及び塩処理した生体組織の重量に対して約１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１００℃で１５分間撹拌し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去する工程を行った。そして、生体組織とアルカリ性溶液とを分離した。分離したアルカリ性溶液を、例えば、ビューレット法にて総タンパク質の定量を行い、アルカリ性溶液中に含まれる総タンパク質量が０．１ｍｇ／ｍＬ以下になるまで、この操作を繰返した。その後、冷却して遠心分離（５，０００ｒｐｍ、２０分）により洗浄し、残渣を乾燥して不溶性エラスチンを得た。
２）ブタ由来高分子量水溶性エラスチンの作製
　ブタ由来不溶性エラスチンに、その乾燥重量の１０倍容量の０．５Ｎ－ＮａＯＨを加え、１００℃の油浴中で３０分撹拌した。反応後、溶液を速やかに氷冷し、酢酸、塩酸又はクエン酸で中和した。その後、分画分子量６，０００～８，０００の透析膜を用いて１週間透析し、透析膜内の溶液を凍結乾燥して、主たる分子量が約３～３０万であるブタ由来の高分子量水溶性エラスチンを得た。
－化学修飾したブタ由来高分子量水溶性エラスチンの作製－
　下記の手順に従って、ブタ由来の高分子量水溶性エラスチンのＮ－アセチル化を行い、次いで、アミノ酸（グリシン）メチルエステルを用いてカップリングを行い、化学修飾したブタ由来の高分子量水溶性エラスチン（N-Ac-Ela-O-Gly-OMe）を作製した。
１）ブタ由来高分子量水溶性エラスチンのＮ－アセチル化
　前記で得られたブタ由来高分子量水溶性エラスチンを少量のトリフルオロエタノールに溶解したものに、ピリジン（１００当量）と無水酢酸（１００当量）を加え、室温で撹拌した。ニンヒドリン試験でアセチル化が定量的に進行したことを確認した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。このＮ－アセチル化は、ＴＮＢＳ法よりアミノ基等の修飾率が９５モル％以上になるまで、数回繰り返し行った。その後、この溶液を１週間透析して溶媒や未反応試薬等を除去し、凍結乾燥してＮ－アセチル水溶性エラスチンを得た。ＴＮＢＳ法による修飾率は９７モル％であった。
２）化学修飾水溶性エラスチン（N-Ac-Ela-O-Gly-OMe）の作製
　前記で得られたＮ－アセチル水溶性エラスチン（N-Ac-Ela）を少量のジメチルホルムアミドに溶解し、水溶性カルボジイミド（１００当量）を加えて室温で１５分間撹拌した。その後、H-Gly-OMe・HCl（１００当量）及びトリエチルアミン（１００当量）を溶かした少量のジメチルホルムアミドを加え、一昼夜室温で撹拌した。次いで真空ポンプで減圧濃縮し、１週間透析して溶媒や未反応試薬等を除去し、凍結乾燥して、化学修飾水溶性エラスチン（N-Ac-Ela-O-Gly-OMe ）を得た。
３）N-Ac-Ela-O-Gly-OMeを用いた濁度測定
　前記で得られたN-Ac-Ela-O-Gly-OMe の１．０ｍｇをｐＨ５．０、ｐＨ７．４、ｐＨ９．０のＰＢＳ溶液にそれぞれに５℃下で溶解して、５～６０℃の温度範囲、０．５℃／分の温度上昇で、波長４００ｎｍでの濁度を測定した。その結果を図５に示した。図５より、N-Ac-Ela-O-Gly-OMe（１．０ｍｇ／ｍｌ）のｐＨ５．０、ｐＨ７．４、ｐＨ９．０での濁度曲線は、酸性、中性、アルカリ性のどの条件でもほとんど同じ曲線を与える結果であった。この結果から、Ｎ－アセチル化によるアミノ基の保護に加えて、H-Gly-OMeとのカップリングによるカルボキシル基の修飾によって、水溶性エラスチンの荷電がなくなったことがわかり、ほぼ定量的にN-Ac-Ela-O-Gly-OMeが合成できたことが確認された。
－N-Ac-Ela-O-Gly-OMeの可逆的な濁度曲線の測定－
　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeを、５℃下でＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解して３０ｍｇ／ｍｌの溶液を作製し、５～２５℃の温度範囲、窒素気流下で０．５℃／分の温度変化で、温度上昇及び温度下降における濁度測定を行った。その結果を図６に示した。図６よりN-Ac-Ela-O-Gly-OMeの濁度曲線は、温度上昇に伴う濁度曲線と温度下降に伴う濁度曲線がほぼ一致し、可逆的であることがわかった。この図６の結果と図１及び２より、N-Ac-Ela-O-Gly-OMeはコアセルベーションにより、加熱すると白濁し、細胞培養条件下の３７℃、ｐＨ７．４でコアセルベートを形成し、２０℃以下で元の透明な溶液状態に戻ることが示唆された。
－N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートに対する押し込み試験－
　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeを５℃においてＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させて、バイアル瓶の中で２００ｍｇ／ｍｌに調製した。次いで、５０℃に加熱すると白濁し、その温度で２４時間静置すると２層に分離した。上層の平衡溶液を取り除き、下層のコアセルベートの表面を約１０分間乾燥させた後、２５℃と３７℃に温度を保持したままRHEONER-II-CREEP-METER- RE2-3305B-YAMADENを用いて押し込み試験を行った。コアセルベートの硬さは押し込みに対する荷重（MPa）で表した。その結果を図７に示した。図７より、N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートは、２５℃に比べて高い温度の３７℃では硬くなることが確認された。即ち、コアセルベートは、細胞培養条件下の３７℃では硬い状態を保持しているが、２５℃にすると柔らかくなり、溶けやすい状態になることが分かった。また１５℃ではコアセルベートが溶解し、測定できなかった。
－コラーゲンの不可逆的な濁度曲線－
　Ｉ型コラーゲンの１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５℃下で作製し、５℃～４０℃の温度範囲において、窒素気流下で０．５℃／分の温度変化で温度上昇及び温度下降における濁度測定を行った。その結果を図８に示した。図８より、Ｉ型コラーゲンの濁度曲線は、温度上昇に伴う濁度曲線と温度下降に伴う濁度曲線が一致しないで、不可逆的であることが分かった。この図８の結果と図３及び４より、Ｉ型コラーゲンは、温度上昇に伴ってゾルからゲルに変化し、細胞培養条件下の３７℃、ｐＨ７．４ではゲルを形成し、冷却しても元のゾル状態に戻らないで、ゲル化したままであることが示された。
－コラーゲンゲル上での細胞増殖実験－
　Ｉ型コラーゲンの０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）の５０μｌずつを、９６ウェル培養皿に加え、１時間インキュベート（３７℃、５％炭酸ガス中）して作製したコラーゲンゲル上に、０．５％ウシ胎児血清を添加したDulbecco's-Modified-Eagle-Medium（ＤＭＥＭ）培地に懸濁した、ヒト皮膚線維芽細胞２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの１００μｌを各々のウェルに播種した。２日間培養（３７℃、５％炭酸ガス中）した後、培地交換を行い、さらに２日間培養を続けて細胞数をカウントした（×４００、３視野）。その結果を図９に示した。図９より、コラーゲンゲル量が多くなるにつれて、細胞数が増加することが分かった。
－細胞シートの作製－
　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeをＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させ３０ｍｇ／ｍｌに調製し、Filter-Unit ０．２２μｍの滅菌用フィルターを通して滅菌し、１００μｌずつ９６ウェル培養皿に分注し、２４時間インキュベート（６０℃、５％炭酸ガス中）して２層に分離させた。その後、上層の平衡溶液を取り除き、下層のコアセルベートの表面を約１０分間、３７℃で乾燥させた。次いで、Ｉ型コラーゲンの１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を作製し（滅菌済み）、１００μｌずつコアセルベート上に加え、１時間インキュベート（３７℃、５％炭酸ガス中）することでコラーゲンゲルの膜を作製した。１０．０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で懸濁した、ヒト皮膚線維芽細胞２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌを各ウェルのコラーゲンゲル膜上に１００μｌずつ播種し、５％炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、２４時間培養を行った。そのときの細胞の状態を光学顕微鏡で観察した結果を図１１～図１２に示した。
　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上に、線維芽細胞を播種したコラーゲンゲルが存在していることは、肉眼観察によって確認できた。図１０に、N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上にコラーゲンゲルを作製し、そのゲル上に線維芽細胞を播種した状態を模式的に示した。この状態では細胞は接着する前のゲル上に付着した状態である。図１０において、１はコラーゲンゲル、２はN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート、３は接着する前の線維芽細胞を表している。図１１は、播種した直後（０時間）の細胞が、接着前の付着した状態（球状）でコラーゲンゲル上に存在していることを示す光学顕微鏡写真である。図１１において、３は接着する前の線維芽細胞である。図１２は、２４時間培養後の線維芽細胞が、コラーゲンゲル上に紡錘状の状態で存在し、接着、伸展、増殖していることを示す光学顕微鏡写真である。図１２において、３は接着、伸展、増殖している線維芽細胞である。
－細胞シートの剥離－
　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート上にコラーゲンゲルを作製し、その上に線維芽細胞を播種し、２４時間培養して細胞シートを作製した後に、１５℃に冷却して３０分間インキュベートすることでN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解し、線維芽細胞・コラーゲンゲルからなる細胞シートを剥離した。コラゲーンゲル上で接着、伸展、増殖した細胞シートが剥離している状態は肉眼で観察できた。図１３は、N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解し、コラーゲンゲル及び線維芽細胞からなる細胞シートが剥離している状態を模式的に示した図である。図１３において、１はコラーゲンゲル、３は接着、伸展、増殖している線維芽細胞、４は細胞シート、５はN-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解して消失している状態を表している。このように温度を下げることにより、N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解し、線維芽細胞・コラーゲンゲルからなる細胞シートが、無傷の状態で容易に製造・回収された。
　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeをＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させて、３０ｍｇ／ｍｌの溶液を１０ｍｌ調製し、Filter-Unit ０．２２μｍの滅菌用フィルターを通して滅菌し、３．６ｍｌずつ直径６ｃｍ培養皿に分注し（塗布量は３８g／ｍ2）、２４時間インキュベート（６０℃、５％炭酸ガス中）して２層に分離させた。その後、上層の平衡溶液を取り除き、下層のコアセルベート膜（１００～２００μｍの厚さ）の表面を約１０分間、３７℃で乾燥させた。次いで、Ｉ型コラーゲンの１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を１０ｍｌ作製し（滅菌済み）、３．６ｍｌずつコアセルベート上に加え（塗布量は１．３g／ｍ2）、１時間インキュベート（３７℃、５％炭酸ガス中）することでコラーゲンゲルの膜（２００～３００μｍの厚さ）を作製した。１０．０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で懸濁した、ヒト皮膚線維芽細胞２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を１０ｍｌ作製し、３．６ｍｌずつをコラーゲンゲル膜上に播種し、５％炭酸ガスインキュベーター中で３７℃、２４時間培養を行って細胞シートを作製した。２４時間後の細胞の状態を光学顕微鏡で観察した結果は図１２と同様であった。
－エラスチン中のペプチド配列を有するポリペプチドの化学合成－
　化学修飾水溶性エラスチンと同様に温度応答性シートに用いることができるエラスチン由来のポリペプチドの製造について、ポリペプチドの一つであるpoly(VPGVG)の製造（ポリマー化）例を説明する(図１４参照)。
－活性エステル法によるpoly(VPGVG)(1)の製造－
　H-VPGVG-ONp・TFA（０．２３ｍｍｏｌ）をDMSO（０．５ｍｌ）に溶解し、NMMでｐＨを９にし、７日間撹拌してポリマー化した。分画分子量３，５００の透析膜を用いて透析し、凍結乾燥した。収率は３７％、平均分子量は約１７，０００であった。なお、平均分子量は、定法により電気泳動法を用いて、分子量マーカーに基づく標準曲線から求めた。
－有機溶媒中のカルボジイミド法によるpoly(VPGVG)(2)の製造－
　H-VPGVG-OH・TFA（０．３７ｍｍｏｌ）をDMSO（０．５ｍｌ）に溶解し、HOBt・H2O（０．３７ｍｍｏｌ）を加え、１０分後に水溶性カルボジイミド（０．７４ｍｍｏｌ）を加え、NMMでｐＨを９にし、７日間撹拌してポリマー化した。分画分子量３，５００の透析膜を用いて透析し、凍結乾燥した。収率は６１％、平均分子量は約２０，０００であった。
－水溶媒中のカルボジイミド法によるpoly(VPGVG)(3)の製造－
　H-VPGVG-OH・TFA（０．３７ｍｍｏｌ）を蒸留水（０．５ｍｌ）に溶解し、Sulfo-NHS（０．３７ｍｍｏｌ）を加え、ついで水溶性カルボジイミド（０．３７ｍｍｏｌ）を加え、NMMでｐＨを９にし、７日間撹拌してポリマー化した。分画分子量３，５００の透析膜を用いて透析し、凍結乾燥した。収率は６．３％、平均分子量は約２２，０００であった。
［炭酸ビス（４－ニトロフェニル）法によるpoly(VPGVG)(4)の製造］
　H-VPGVG-OH・TFA（０．３７ｍｍｏｌ）をピリジン（０．５ｍｌ）に溶解し、Bis-PNPC（０．１１ｍｍｏｌ）を加え、NMMでｐＨを９にし、７日間撹拌してポリマー化した。分画分子量３，５００の透析膜を用いて透析し、凍結乾燥した。収率は１６％、平均分子量は約１４，０００であった。
－poly(VPGVG)の可逆的な濁度曲線の測定－
　前記の活性エステル法によって製造したpoly(VPGVG)(1)を、５℃下でＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解して３０ｍｇ／ｍｌの溶液を作製し、５～６５℃の温度範囲、窒素気流下で０．５℃／分の温度変化で、温度上昇及び温度下降における濁度測定を行った。その結果を図１５に示した。図１５よりpoly(VPGVG)の濁度曲線は、温度上昇に伴う濁度曲線と温度下降に伴う濁度曲線がほぼ一致し、可逆的であることがわかった。この図１５の結果と図１及び２より、poly(VPGVG)はコアセルベーションにより、加熱すると白濁し、細胞培養条件下の３７℃、ｐＨ７．４でコアセルベートを形成し、２０℃以下で元の透明な溶液状態に戻ることが示唆された。
－poly(VPGVG)のコアセルベートを用いた細胞シートの作製－
　前記の活性エステル法によって製造したpoly(VPGVG)(1)をＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶解させ３０ｍｇ／ｍｌに調製し、Filter-Unit ０．２２μｍの滅菌用フィルターを通して滅菌し、１００μｌずつ９６ウェル培養皿に分注し、２４時間インキュベート（６０℃、５％炭酸ガス中）して２層に分離させた。その後、上層の平衡溶液を取り除き、下層のコアセルベートの表面を約１０分間、３７℃で乾燥させた。次いで、Ｉ型コラーゲンの１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を作製し（滅菌済み）、１００μｌずつコアセルベート上に加え、１時間インキュベート（３７℃、５％炭酸ガス中）することでコラーゲンゲル膜を作製した。１０．０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で懸濁した、ヒト皮膚線維芽細胞２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌを各ウェルのコラーゲンゲル膜上に１００μｌずつ播種し、５％炭酸ガスインキュベータ―中で３７℃、２４時間培養を行った。図１６は２４時間培養後の線維芽細胞が、コラーゲンゲル上に紡錘状の状態で存在し、接着、伸展、増殖していることを示す光学顕微鏡写真である。図１６において、３は接着、伸展、増殖している線維芽細胞である。
－poly(VPGVG)のコアセルベートの溶解による細胞シートの剥離－
　前記に示すように細胞シートを作製した後に、１５℃に冷却して３０分間インキュベートすることでpoly(VPGVG)のコアセルベートが溶解し、線維芽細胞・コラーゲンゲルからなる細胞シートを剥離した。コラゲーンゲル上で接着、伸展、増殖した細胞シートが剥離している状態は肉眼で観察できた。その結果は図１３に示した結果と同様の結果であった。このように温度を下げることにより、poly(VPGVG)のコアセルベートが溶解し、線維芽細胞・コラーゲンゲルからなる細胞シートが、無傷の状態で容易に製造・回収された。
　上記のポリペプチはいずれも温度応答性シートとして使用することができる。
　生体の組織や臓器はシート状の細胞からできている構造が基本であり、色々な形状に折り重なって血管や臓器などの立体的な組織ができている。このような細胞シートを、細胞培養により細胞外マトリックスを足場にして作製し、培養皿から剥離し、重ねることができる技術は細胞シート工学と呼ばれている。しかし細胞シート作製の際、接着タンパク質によって細胞が培養皿に強く接着しているため、剥離する際にタンパク質分解酵素を使用せざるを得ず、細胞及び細胞外マトリックスを損なうことが問題となっている。水溶性エラスチン、その誘導体の化学修飾水溶性エラスチン、又はエラスチン由来のポリペプチドのコアセルベートが、無傷の細胞シートを回収するのに有用であることが分かり、本発明によって、生体由来の安全な蛋白質及びポリペプチドを用いて細胞をシート状に回収することができ、これらは細胞シート工学において利用することができる。
１　コラーゲンゲル
２　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベート
３　線維芽細胞
４　細胞シート
５　N-Ac-Ela-O-Gly-OMeのコアセルベートが溶解して消失している状態

Claims (12)

  1. 　水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の少なくとも一部をアミノ酸のアルキルエステルとカップリングさせて得られる化学修飾した水溶性エラスチンを含むことを特徴とする温度応答性シート。
  2. 　第１アミン及び第２アミンの少なくとも一部をＮ－アセチル化すると共に、カルボキシル基の少なくとも一部をグリシンのメチルエステルとカップリングさせて得られる、請求項１に記載の温度応答性シート。
  3. 　式（１）により規定される修飾率が８０モル％以上となるようにＮ－アセチル化された、請求項２に記載の温度応答性シート。
    　修飾率（モル％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００　　　（１）
    　ここで、Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表し、Ｂは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
  4. 　カルボキシル基の９０モル％以上がグリシンのメチルエステルとカップリングした、請求項２又は３に記載の温度応答性シート。
  5. 　化学修飾した水溶性エラスチンが、ｐＨ７．４、温度３７℃でコアセルベートを形成し、温度を１５℃に低下させると、該コアセルベートが溶解する性質を持つ、請求項１～４いずれか１つに記載の温度応答性シート。
  6. 　水溶性エラスチンが低分子量フラクションを透析により除去した高分子量水溶性エラスチンである、請求項１～５いずれか１つに記載の温度応答性シート。
  7. 　細胞培養用である、請求項１～６いずれか１つに記載の温度応答性シート。
  8. 　請求項１～７いずれか１つに記載の温度応答性シートを支持体上に形成する工程、前記温度応答性シート上に細胞の足場となる膜を作製する工程、前記足場となる膜上で特定の細胞を培養して細胞シートを作製する工程、次いで、該細胞の培養温度以下の１～２０℃において、前記温度応答性シートと前記細胞シートとを分離する工程を含むことを特徴とする細胞シートの製造方法。
  9. 　前記足場となる膜が、細胞外マトリックスよりなる群から選ばれたゲル膜である、請求項８に記載の細胞シートの製造方法。
  10. 　前記足場となる膜が、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリシン、及び、ゼラチンよりなる群から選ばれたゲル膜である請求項８又は９に記載の細胞シートの製造方法。
  11. 　エラスチン中のペプチド配列を化学合成したポリペプチド。
  12. 　請求項１１に記載のポリペプチドを主成分として含む温度応答性シート。
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