JPH02191629A - グラフト化ペプチド共重合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野〕 本発明は強力な結合に活性を持ったアミノ酸および又は
ペプチドを含有するグラフト化　ペプチド共重合体の新
規物質に関するもので生医学への広い利用に適するもの
である。これらの共重合体は生体内外の生組織を細胞の
代謝、成長と機部に適合する。 ［従来の技術１ 高分子物質は例えばコラーゲンの様な生体組織と近似し
ているため直接結合が可能のため、移植又はその他の生
医学的な応用に広く用いられている。ここ１０年来、ペ
プチドに関する研究で生医学的に多方面に有用なポリペ
プチドが見出された。 然し、これらは不融性、高可とう性の直鎖と側鎖の多機
能性に起因する機械的強度と結合能力という性質に関し
ては評価が低く又用途性も低い。 近年、コラーゲン、ラミニン、フィブリン、フィブロネ
クチンが抽出２精製され１組織及び細胞結合促進剤とし
て市販されている０合成ポリＤリシン、ポリＬリシンは
この目的のための商品でもある。 然し、これらのポリマーは明らかに不適当な点があり、
その用途が制限される。それは、　ａ）これらは限られ
た種類の基質にのみ機１おするか又は特定の細胞にのみ
有効である。　ｂ）フィブリン、フィブロネクチンの場
合１人体の血液を通じて軽康障害を起す可能生がある。 近年、Ｗａｉｔｓ　ａｎｄ　Ｔａｎｚｅｒは、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２１２．　ｐｐ、ｌ０３８−！０
４０　（１９１１１）において、海水に生息し２波と潮
せきの力にたえずもまれているイガイの中から、自然界
で最も結合力の強い生物活性ポリフェノールタンパクを
同定した。この自然に出来る生物活性ポリフェノールタ
ンパクはイガイのフェノール分泌腺で作られ貯蔵されて
おり、新しい生物活性プラークが作られている間にイガ
イの足によって水面上に放出される。この天然の生物活
性ポリフェノールタンパクの抽出、精製法はＪｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　８ｉｏ１ｏｇｔｃａｌ　Ｃｈｅｗ。 Ｖａｌ、２５８．　ｐｐ、２９１ｔ−１５（１８３８）
に記載されている。 このイガイから抽出される自然の生物活性ポリフェノー
ルタンパクの用途は得られる量から制限される。低収量
に対する両を増やすこと及び確立した医学的応用法の研
究が目下望まれる。 生物活性ポリフェノールタンパクの反復単位を形成して
いるデカペプチドは、米国特許Ｎｏ、４，４９８．３８
７号に述べられた方法で重合調整することが出来る。 合成誘導された生物活性ポリフェアノールタンパクは結
合能力をもっているが、得られる物質の分子量が僅か１
０，０００から２０，０００程度に限られているため、
その結合ＩＬ力にも限度がある。これに加えて、デカペ
プチドの重合は制御出来ない副反応と保護されたアミノ
酸の効率的な′ｉ露が難しいことのため、その反応は複
雑になる。 よってこれらの合成品は、よりすぐれた結合能力が要求
される用途には使用出来ない。 ポリＤリシンとポリＬリシンを除いては、生物活性ポリ
ペプチドは生物源から抽出しなければならない０合成ポ
リマーは生物学的に誘導される場合のほんのわずかの然
し有害な不純物をさけられる点ですぐれている。 手頃なコストのもとで、高分子量をもつ様に合成された
ポリＤリシン、ポリＬリシンにはそれ程有効な組織結合
性はみられない、同様に生物活性ポリフェノールタンパ
クのデカペプチドオリゴマーは、充分な結合能力を持た
ず、又イガイから抽出した自然の生物活性ポリフェノー
ルタンパクに匹敵する結合能力をもったデカペプチドポ
リマーを得ようとして段階的な重合を試みたが、充分な
程度の重合度は？５られなかった。 、ａ外なことに、デカペプチドオリゴマーの立体構造が
生物活性ポリフェノールタンベクの結合性能に有効では
ないということが最近ｆ４明した。叉、ａＭなことにポ
リマーにはすぐれた接合特性を顕わすためには完全なデ
カペプチド配列よりも適μの３．４−ジヒドロキシフェ
ニルアラニン（Ｄａｐａ）を含む必要があることが判っ
た。更にポリマーの分子量は、基質のポリマー及び最終
のグラフト共重合体のカチオン特性と同様に臨界的に重
要であることが判った。 従って本発明は２強力な結合能力を備えたアミノ酸およ
び又はペプチドを含むグラフト共重合体を得るのが１衣
な目的である。 更に本発明は、特定な分子量、ジヒドロキシフェニルア
ラニン（Ｄｏｐａ）含有証、結合性能を備えたグラフト
共重合体の再現性のある合成を目的とするものである。 ［発明の要約］ 水溶性で、約３０．０００乃至５００．０００の分子量
を持つカチオン性アミノ酸および又はペプチドを含むグ
ラフト共重合体は次のような組成からなる。 （ａ）アミノ酸及びペプチドとグラフト反応を行う遊離
第１級又は第２級アミン官応基を持っている。又は変化
可能で分子量が約１０，０００乃至２５０゜０００のポ
リマー２＆質。 （ｂ）ポリマー基質の第１級又は第２級アミン官応基の
最小限５％から約１００％をグラフト反応化したアミノ
酸又はペプチド、ここでグラフト化したアミノ酸又はペ
プチドには少なくとも１分子の３．４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン（口ｏｐａ）　７ミノ酸又はＤａｐａ型
にヒドロキシ化可能な前躯体を含む。 この発明のアミノ酸および又はペプチドをもつグラフト
共重合体は、（ａ）分子量、カチオン度。 ポリマー基質に対するアミノ酸又はペプチドの単位グラ
フト化置換％、（ｂ）アミノ酸又はペプチドをもつグラ
フト共重合体自体の化学的及び物理的構造を調整するも
ので１組成上種々変更可能である。 ［発明の４１ｊｊ＆］ グラフト共重合体は１ヶ以上の側鎖がグラフト化された
ポリマー又は共重合体から出来ている。 グラフト共重合体は通常同じ七ツマ−から成り立ってい
る普通の共重合体と幾分異なる性質を示す、普通の共重
合体は２種の単独重合体の中間の性質を通常の場合示す
が、グラフト共重合体は構成部分の夫々の性質をもって
いる。 本発明に於ては、ペプチドという言葉は広義に解釈する
。このペプチドには、１種以上の天然及び合成ペプチド
を含む、どんな場合でもペプチドにはＤｏｐａ又は容易
にＤｏｐａｆｆｉにヒドロキシル化出来る前駆体を１群
以上もっている必要がある。これらのグループは結合力
を形成するのに必要である０本発明のペプチドをもった
グラフト共重合体のポリマーの基質は水溶性であること
が望ましい。 そうであれば、生成されたグラフト共重合体も又水溶性
である。又１本発明はポリマーが水溶性でない場合でも
官応基に適当な反応をグーえ、水溶性にすることもその
範囲に含まれている。グラフト共重合体の水に対する溶
解度は、生体組織、細胞、その他の生物活性部へは有機
溶媒を使用することが出来ないため、水溶液に溶解する
とき１要である。 ポリマー基質は、生体面が負にｆｊ電１．ているので、
静電的相互作用が働くためにカチオン性かカチオン性に
改質出来ねばならない、一般にポリマー基質としての制
限上必要な遊離第１級及び第２級アミン類はポリ−１−
基質に水溶性とカチオン性という２つの性質を付与する
。遊離第１級又は第２級アミン類をもったグラフト共重
合体の基質はｐＫが少なくとも約８、望ましい値は約８
．５から１０を示すであろう。 更に、ポリマー基質は！ｈ督する生物活性１ｋをもった
ペプチドをもったグラフト共重合体を得られる様、グラ
フトペプチドと反応するのに充分な第級又は第２級遊離
アミンをもっていなくてはならない。 然し、すべての場合、含まれている単量体又は遊離第１
級又は第２級アミン群を含む様に改質された単量体に対
しては、ペプチドのグラフト反応に必要な′ｉｉ離アミ
ン証はポリマーｇ当り少なくとも約１乃至２５ミリモル
存在してなくてはならない分子量は生物活性能を左右す
る鍵の一つであるここで使用したように、分子量の全て
の基準値は平均分子間に等しい。 ペプチドをもったグラフト共重合体は分子間結合が充分
にそなわり、活性面と基質が充分に結合するためには充
分に高分子門であらねばならない分子量が約３０，００
０以下ではペプチドをもったグラフト共重合体は結合力
を生むのに充分な全分子ｌではない、約５００．０００
以上の分子量ではベブチドタもったグラフト共重合体は
ろ過するのには粘度が高すぎ、溶液外に沈殿する。 然って基質の応用は難しい、高分子基質は分子量が約ｔ
ｏ、ｏｏｏ乃至２５０，０００　、更に望ましくは約３
０．０００乃至１５０．（１（１０であるべきである。 商業り有用な基質ポリブーとしては、ポリリシン、ポリ
７リルアミン、ポリエチレニミン、キトサン、ポリビニ
ルアミン、ｆｆｌ酸フンドロイチン。 ポリデキストラン、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸、ザ
リアクルロニトリルとポリ（１，テＳ、↑ｙｒ）ポリ（
Ｌｙｓ、　５ｅｔ）の様な共重合体及び必要な分子量を
示す類似物質等が含まれる。 生医学的応用に対しては、ポリマー基質はグラフト化ペ
プチドに結び付く充分に反応性な部分からなるモノマー
である必要がある。これに適するモノマーとしては、ア
ミノ酸、炭水化物、ペプチド、脂質、糖脂質、アクリル
酸、アリルアミン及び類似物質と以上の物質のさまざま
な組み合わせ等である。 ポリマー基質は技術的に熟練した周知の重合法で合成さ
れる。ポリマー基質はカチオン性の充分な単量体か又は
必要なカチオン度に改質出来る中量体から成っていなけ
ればならない０合成されたホＩＪ　−７−は、ｐＫ約８
であるのが望ましい。 適当な水溶性のカチオン性単量体としては、リジン、オ
ルニチン、アミノ糖類、アリルアミン。 ビニルアミン及び類似物質等である。又、ポリマーは水
溶性であるか又は水溶性に改質可虎であるべきで、又出
来たポリマーが水溶性である様に非反応性の共単量体を
選ばねばならない、非反応性の共単量体として適当なも
のは中性又は酸性アミノ酸、砂詰及びヒドロキシ酸及び
類似物質である更に、グラフトペプチドの基質ポリマー
との反応はどんな場合にでもグラフトペプチドの反応グ
ループと基質ポリマーの反応グループの間で共有結合が
生まれる。 いくつかの例では、グラフト化したジ又はトリペプチド
に遊離のグラフトペプチドとすでに固定されたグラフト
ペプチド間に反応の結果としてこれが生成されることが
認められる。 グラフト化ペプチドは少なくとも１ケの３．４−ジヒド
ロキシフェニールアラニン（Ｄａｐａ）又は１９８［１
年５月２５０出願の米国特許出願第８５８．５９４号で
明らかにした方法でＤａｐａ型にヒドロキシ化出来る曲
部物質を含んでいなければならない、ヒドロキシ化によ
ってＤａｐａ型に出来る前駆物質の例としては、チロシ
ン、フェニルアラニンがある。　Ｄａｐａ群の存在は強
力な水素結合を生じ、水相で使用するとき充分に水と競
合出来るので表面を置換出来る。　Ｄａｐａ群は又接着
治療中に金属キレートを作り又ミカエル型の求核性縮合
体を与える。 リジン、アラニン、プロリン、セリン、スレオニン、グ
リシン、ヒドリキシプロリン、グルタミン酸、アスパラ
ギン酸、アルギニン、ヒスチジン及びこれらの類似物質
のアミノ酸類はその上、相異なる性質のペプチドをもっ
たグラフト共重合体を希望する比率で得られる。 プロリンは構造奢破壊することで知られているが表面分
子の大部分を露出させ、グラフト玉舎部を開放構造とす
る。その結果、吸着作用が増える、　ｐＫの高いリジン
は生理的条件では強いイオン相互作用を生じる。 ペプチドグラフトの特別の実施例としては、　Ｄ。 ｐａ、　　Ｄｏｐａ−Ｌｙ＋−Ａｌａ−Ｌｙｓ、　　Ｈ
ｙｐ−Ｈｙｐ−Ｔｂｒ−ｒＪｏｐａ−Ｌｙｓ。 Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｂａｒ−Ｄｏｐａ、　Ｄｏｐ
ａ−）１ｙｐ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ、　Ｈｙｐ−丁ｈｒ−Ｄ
ｏｐａ−Ｌｙｓ、　　Ｄｏｐａ−Ｈｙｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅ
ｒ、　　Ｄｏｐａ−Ｌｙｇ−Ａｌａ−１ｙｓ−Ｈ７ｐ−
５ｅｒ−〒７ｒ、　　Ｄｏｐａ−Ｈ２ｐ−Ｌｙｓ−９ｅ
ｔ、　　Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌ２ｓ−Ｈｙｐ−
ＳｆＡｒ−丁ｙｒ−Ｈｙｐ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ、　　Ｌｙ
ｔ−Ｈｙｐ−９ｅｒ−Ｄｏｐａ−Ｈｙｐ−）１７ｐ−Ｔ
ｈｒ−Ｄｏｐａ−Ｌ２Ｓ、　Ｄｏｐａ−ＬｙＳ−［１ｉ
１ｕ−５ｅｒ−）１）ｐ、　Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ−Ｃ７０
（ＳＯ３）１）−Ｌｙｓ、　Ｃ７５（ＳＯ３）−ＬｙＳ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔ７ｒ−Ｈ７ｐ−Ｈｙｐ−↑ｈｒ−
Ｄｏｐａ、−ＬｙＳ、　　）ｌｙｐ−Ｈｙｐ−丁ｈｒ４
ｂｒ−Ｌｙｇ、　　Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−
Ｔｙｒ、　　Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｌｓ−Ｓｅｒ、　ＨＹ
Ｐ−ＨＩＰ−Ｔｂｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｘ等を含むものであ
る。 Ｄｏｐａを含むグラフトペプチドの例は、Ｄｏｐａ−Ｌ
７ａ・＾１ａ・Ｌｙｓ、・・及びこれらの類似物質であ
る。 在貞 得られるペプチドをもつグラフト共重合体の全分子輩は
約３０，０００乃至５００，０００．望ましい値は約７
０．０００乃至３５０，０００．最も望ましい値は約１
００．０００である。 必要な分子量の達成は勿論ポリマー基質の分子量、グラ
フトペプチドの分子量及びｔ換度に左右される。前記の
条件は最耕用途によってポリマーの選定を変えることに
なる。 ペプチドをもったグラフト共重合体は遊離第１級又は第
２級アミン官応基の最低的５％から約１００％グラフト
化されたペプチドを含んでいなければならない、（以下
の本文では％置換度とすることがある。ペプチドをもつ
グラフト共重合体の蛙低％置換度は勿論ポリマー基質の
性質により変わる。然し、すべての例では最低％２２換
度は必要とする生物接着性と同様、必要な分子鷲、溶解
度。 カチオン特性を示すペプチドをもったグラフト共重合体
を得るのに充分でなければならない。 望ましい実施例としては、少なくとも５％の遊離アミン
基が、望ましい生物ｍ着性を得るためペプチドグラフト
と反応しなければならないことが判明した。好ましくは
１％置換度は約７％乃至３０％、最も好ましい値は約１
０％乃至２０％がよい、このタイプの実施例としてポリ
リシンとポリアリルアミンな含んだポリマー基質があり
、反復モノマーは、リシンとアリラミンである。 ポリマー基質は異なる七ツマー群から成る共重合体で、
そのどれもＭ継部１級又は第２級アミンを必ずしも含ん
でいる必要はない。 このタイプの共重合体基質では、希望する生物接着性を
期待するためにはより大きな％置換度が必要である。極
端な例として、ポリマー、基質中の遊継部ｉＭ又は第２
級アミンの数が充分に少なくて１００％置換を要したペ
プチドをもったグラフト共重合体は希望する特性を示し
た。　Ａｇａｉｎ、・・・？本発明の１ケ以上のアミノ
酸から成るペプチドについて、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｔｈｅ＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃ
ｉｅｔｙ、　Ｖｏｌ、８５．　ｐｐ、２１４９−２１５
４　（１９８３）において、研究者）Ｉｓｒｒｉｒｉｅ
ｌｄが述べている手法で調製したこの合成は保護されて
いるアミノ酸がペプチドの釦で生長し、次々に結合して
いくことからなりこれは共有結合によって固体樹脂ビー
ズの様な個体支持剤に結合する。本誌の概念は鎖の１番
口のアミノ酸の結合がその共有結合により固体ポリマー
＃１１指ビーズに結合し、続く１ケが１回毎に結合され
、必要な配列が組み合わせられるまで順々に続けられる
。最終的にペプチドを固体支持剤から除き、保護剤を除
去する。この方法は延びてゆくペプチド鎖は完全に不溶
性の固体粒子に接合されているからろ過、洗詐が簡単で
あり、使用する薬品、副生物を含んでいない。 アミノ酸は使用する溶媒に不溶の適当なポリマービ・−
ズに結合することがｕｒ　ｉｔで、容易にろ過出来る物
理的に安定な状態をとる。この様なポリマービーズは１
版１１のアミノ酸が共有結合により強固に連結出来る様
な官応基をもっていな０ればならない、この［１的のた
めにはポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリデキス
トラン、キトサン及びこれらの類似物質のポリマービー
ズが適当である。 このポリペプチドを合成する手法では活性であるが、反
応系に入らないアミノ酸上の楠々の官応基は反応の間中
、便利な保護剤が使用される。 アミノ酸のα−アミノ群は第３級ブチルオキシカーボニ
ル基（８０Ｃ）又はフルオレニルメトオキシカーボニル
（ＦＩＩＩＯＣ：）又はその等価物により保護される。 ヒドロキシル基はベンジル又は４−メトキシベンジル、
４−メチルベンジル、３．４−ジメチルベンジル、４〜
クロロベンジル、２．６−ジクロロベンジル、４−ニト
ロベンジル、ベンジルヒドリルの様なベンジル誘導体及
びその等価物で保護される。 シスチンの千オール基は上述のベンジル又はベンジル誘
導体かメチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピル千オ、ｎ
−ブチルチオ又はその等価物によって保護される。フル
ギニンのグアニジノ基はニトロ基、トシル基又はその等
価物によって保護される。リシンのε−アミ７基はベン
ジルオキシカーボニル基又は２−グロロベンジルオキシ
カーポニル、２−プロモベンジルオキシカーポ；、ル、
３．４−ジメチルベンジルオキシカーボニル及びその等
価物の様なベンジルオキシカーボニル誘導体により保護
される。 ヒスチジンのイミドゾールＮは、ベンジル基トシル基、
ベンジルオキシカーボニル基又はリシ：／の項で記した
様なベンジルオキシカーボニル誘導体が保護剤として１
１４いられる。一端望んだペプチドが得られたら、グラ
フト共重合体を形成させるためポリマー基質と反応させ
る。この工程の第１段階はペプチドの末端のブロック基
を切り割ることである。それからペプチドを二官応性架
橋剤と反応させる。 この目的に適当な架橋剤としては、ジコハク酸イミドス
ペリン酎、ジコハク酸イミドセバシン酸ジコハク酸イミ
ド酒石酸、ジチオビス（コハク酸イミジルプロピオン酸
塩）、エチレングリコールビス（フハク酸イミジルコハ
ク＃ｉｊりと類似品がある。 末端に活性基をもったペプチドは、その後トリフルオロ
酢酸、メタンスルフォン醜、フッ化水素の様なペプチド
の合成手法で周知の切開剤で固体支持剤から切り離す、
保護基、固体支持剤、切開剤の適当な組み合わせを選ぶ
と最終的に水溶性の［目的のポリマー基買上の遊離第１
級又は第２級アミン基に対し反応性のある活性基をもっ
たペプチドが得られる。ペプチドとポリマー基質は、ト
リエチルアミンホウ酸、ホウ酸ソー・ダ等の緩衝液中で
混合し、ペプチドを含むグラフト共重合体を得られる。 本発明のグラフト共重合体はそれだけで充分な接合能力
を示し、細胞の固定、タンパク、生体組織をプラスチッ
ク、ガラスの様な不活性の基体上への植えつけ及び植皮
・１人工血管の様な生体２！ｉ質への接合の用途に用い
られる。 ペプチド含有グラフト共重合体の接合力は、さらに架橋
剤で処理することにより増大する。 この架橋剤はグラフト共重合体自身及び基質の間の部分
的又は全面的架橋が期待出来る。架橋剤の役目はよく判
らないが、共有結合が役立つものと思われる３架橋剤の
明確な使用址％はこれの純度とペプチド含有グラフト共
重合体の分子証によって変わってくる。 架橋剤の適当な例をあげると、カテコールオキシダーゼ
、マツシュルームチロシナーゼの様な酵素酸化剤が反応
性の官応基をいくつが持った化学的架橋剤でグルタルア
ルデヒド、フォルムアルデヒド、ビス（スルフすコハク
酸イミジル）スペリン酸塩、３．３−ジチオビス（スル
フォコハク酸イミジルプロピオン酸塩）等か又は酸素、
過酸化物の様な単なる化学的酸化剤か又は鉄、アルミニ
ューム、マンガンの様な金属の錯体がある。 以ドの実Ｍ例は本発明のペプチド含有グラフト共重合体
の合成法とこの用途について説ＩＪ１シたものである。 　Ｔｈｅｓｅ　ａｒｅ　・’１．　Ａｓ　ｏｎｅ　・’
？［実施例］ 実施例Ｉ　　ＰＡ＾−ＳＡ−Ｌｙｇ−Ｐｒｏ−９ｅｒ−
Ｔｙｒ−）ＩＨｐ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ
−ＯＨの合成 実施例１のペプチド含有グラフト共重合体の合成に用い
た方Ｕ；の摘要はＦｉｇ、１に図示した。 １．０＋＋ｎ当量のヒドロキシル基を含んだＩｇのρ−
ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂をメチレンクロ
ライドで数回洗浄する。　Ｆ）ＩＯＣ−Ｌｙｇ（ＢＯＣ
）−ＤＨ（ｌ　ｍｍ　０．１２４ｇ）と１ｍｓ＋のＩＮ
ジシクロヘキシカルボジイミド（ＩＩｃｃＮ）（ｌ　ａ
ｍ）メチレンクロライド溶液とρ−ジメチルアミノピリ
ジン（１，、（ｌｓ＋ｅ、　０．１２４ｇ）を加え、こ
の懸濁液を６ｈｒｓ、振とうする。このカップリングを
再度繰返し０．５ｍｆｌの塩化ベンゾイルと０．５ｍ、
Ｑピリジンで３０ｍ１ｎ、振とぅ処理する。 エタノール２ジメチルアセトアミド（ｎ＋ｕｃ）とメチ
レンクロライドで充分に洗浄し、真空乾燥する、樹脂ｇ
当りのＦＩＩＩＯｃニーＬｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨ含有醍
は分光光度分析で０．８−０．８ｍｍ、７ｇであった。 ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＧ）−ρベンジルオ午ジベンジ
ルエステル樹脂（ｒ）を反応容器（ＡＣＴ型式２００．
ｊ″１妨ペプチド合成器）に入れる。洗顔１灰応はすべ
て１５〜２０＋ｓｌの溶媒で行う、操作サイクルの計画
表は１、ジメチルアセトアミド（ＤＩＩＩＡＣ）で洗Ｍ
１２．１５％ピペリジン／ジメチルスルフォオキサイド
で（Ｉ　Ｘ　５　ｇｉｎ、、　　Ｉ　Ｘ　１５ｍ１ｎ、
）で保ｊ＃基の除去 ３　、　［１ＭＡｌ１１：で洗浄 ４、メチレンクロライドで洗浄 ５、予め３Ｊ製しておいたｌ−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール（ＨＯＯＴ）のＦＭＯＣニーアミノ酸エステルと
のカップリング ６、エタノール、　Ｄ）ＩＡＣ，メチレンクロライドで
洗ｎ− ベンゾトリアゾールエステルはメチレンクロライド中で
ＦＭＯＣ−アミｚ＠、）ＩＯＢＴとジシクロへキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣＩ）の各々３当量を予付活橘中で
２０分間混合する。 カップリングはメチレンクロライド中で３０ｍ１ｎ。 その後、メチレンクロライド／ジメチルスルフォオキサ
イド（２：１比）中で１．５ｈｒｓ行われる。カップリ
ングの進行度はＫｅｉｓｅｒ方法（Ａ＋ａｌｙＬｉｃａ
ｌ　Ｂｉａｃｈｅｍｉａｔｒｙ　Ｖｏｌ、３４．　ｐｐ
、５９５−５９８　（ｌＥ１７０）におけるにｅ：ｓｅ
ｒ　ａｔ　ａｌによる研究）を利用してモニターした。 適当量の７ミノ＆１誘導体の保護基が出来る様９サイク
ル行った（ＦｉＨ，Ｉ　、　ＩＩＩ）−最後のサイクル
のカシプリングはジコハク酸イミドスペリンｍ　（ＰＳ
Ｓ）又はジコハク酸イミドセバシンｆｉ　（ＵＳＡ）で
行った。 ペプチド合成の糾った反応生成物は反応容器から取り出
し、トリフルオロ酢ｆｆ＃／カテコールで４５ｓｉｎ、
処理する（Ｆｉｇ、Ｉ　、　ｆｆ）　。 樹脂はる過１７て取り除き、ろ液を蒸発させる。 エーテルを加え２ペプチドコハク酸イミドエステルフル
オロ酢酸塩を沈殿させる。 ペプチドコハク酸イミドエステルフルオロ詐酸ルを４Ｈ
のポリアリルアミン塩酸塩の水溶液に加え、トリエチル
アミンホウ酸緩衝液（ｌ　Ｍ　ＰＨ９，５）をはげしく
攬はんしながら加え、ｐＨを８．５にすル（Ｆｉｇ、Ｉ
　、　■）　、　３０分後、混合物は福塩１％Ｉ（ＨＣ
旦）でｐＨ２にしてカットオフ分子量８，０００−１２
，０００の透析袋で低温室中で４立の０．００１Ｎ　Ｈ
ＣＱを３回取りかえて３８ｈｒｓ、透析する。液を凍結
乾燥してポリアリルアミンペプチドを塩酸塩として得る
（Ｆｉｇ、ｒ　、　Ｖｌ）　、これはＨＰＬＣの部分に
単独のピークと夫々のアミノ酸の存在を示す、ポリアリ
ルアミン上のアミ７基の１０％がペプチドによってアシ
ル化された。 実施例２Ｈ−＾１ａ−Ｌｙｇ−Ｐｔｏ−５ｅｒ−Ｔｙｒ
−）１ｙｐ−）１ｙＰ−丁ｈｒ−Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ−Ｐ
Ｉルの合成 実施例２のペプチド含有グラフト共重合体の合成に用い
た方法の要約はＦｉｇ、２に図示する。 ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ρベンジルオキシベ〉・
ジルエステル樹脂は実施例１と同じ様にして調製し、９
ケの７ミ／＃のカップリングサイクルは同様に実施例１
と同じ手法で行った（Ｆｉｇ、２　、　Ｉ　）　、末端
のＮ−アラニンはＢＯＣ−、ｌ導体として、又Ｄｏｐａ
はＦ）ＩＯＣ−Ｄｏｐａ（ＣＱ２　Ｂ　ｚ　ｌ）２−０
８丁として添加した。 ペプチド合成の終った反応生成物は反応容器から取り出
され、トリフルオロ酢酸／力天コールで４５ｍ１ｎ、処
理される（Ｆｉｇ、２　、■）、樹脂をろ過で除きろ液
を蒸発させる。エーテルを加えてデカペプチドトリフル
オロ＃酸塩を沈殿させる。　　（Ｆｉｇ。 ２１１）。 デカペプチドトリフルオロ酢酸塩をジオキサン／水（１
：　ｌ）に溶解し２各４島量のトリエチルアミンとジ−
ｔ−ブチルジカルボン酸で処理する、ろ紙トの二〉・ヒ
ドリンテストがマイナスになれば反応が終ったことにな
る。混合物は貴塩酸でｐＨ３にし、エーテルと共に摩砕
し、沈殿したＢＯＣ−デカ２ペプチドをろ過により取り
除く、その後、ｌ■履のＢＯＣ−デカペプチドを　１．
１露閣とジシクロヘキシルカルボジイミドと２履曹のペ
ンタ７ルオａ７エノールでテトラヒドロフラン中で処理
する。　４５ｍ１ｎ、攪拌後、沈殿したジシクロヘキシ
ル尿素ろ過して取り除き、ろ液を蒸発させる残差をエー
テルと摩砕して、ろ過、真空乾燥を行うとＢＯＣ−デカ
ペプチド−ρフルオロフェニールエステルが得られる（
Ｆｉｇ、２　、　Ｘ）　− ＢＯＣ−デカペプチドペンタフルオロフェニールエステ
ルはトリフルオロ酢Ｍ／カテコールで４５腸ｉＩｌ＋。 処理される。蒸発後、エーテルを加え、沈殿したデカペ
プチド−ペンタ酢酸塩ロフェニール−エステルトリフル
オロ酢醸塩（Ｆｉｇ、２　、　ＸＩ）をガラスろ器に集
め、エーテルで洗詐し、デシケータ−中で減圧、下で乾
燥する。 １ｍｍのデカペプチドペンタフルオロフェニールエステ
ルトリフルオロ酢酸塩を４１のポリＬリシン臭化水素塩
の水溶液に加え、トリエチルアミンホ’）ｍＭ衝液（Ｉ
　Ｍ　、　ｐＨ８，５）ｔ　ハげシく攪拌シナがらカロ
え、ｐＨ８，５にする。　３０ｖｉｎ、後、混合物を福
ｉ！！酸でｐｉ（２にし、凍結乾燥して部分的にブロッ
クされたペプチド含有グラフト共重合体が得られる（Ｆ
ｉ３．２　、■）。 部分的にブロックされたペプチド含有グラフト共重合体
（Ｘｉ）をトリフルオロ酢酸に溶解し、エタンジチオー
ル、チオアニソール溶液及びトリプルオロメタンスルフ
ォン酸で処理する。２０膳ｉｎ、ｉエーテルを加える。 沈殿物をガラスろ器でろ過し、エーテルと酢酸エチルで
洗浄する。ペプチド含有グラフト共重合体は木に溶解し
、カットオフ分子証約３０，０００の透析袋で低温室中
に４ｆＬの０．００１　ＮＨＣｆＬを３回取りかえテ３
８ｈｒｓ、１ｌｉｉ析する。その後、溶液を凍結乾燥し
てポリーＬ−リシンペプチドグラフト共重合体を塩酸塩
として得られる（Ｆｉｇ、２　、　ＸＩ）　、これはＨ
ＰＬＣの単独のピークを示しアミノ醜分析で期待（−が
得られた。ポリーＬ−リシン上の７ミノ基の約１０％が
デカペプチドによってアシル化されていることが判った
。 実に例３　　Ｈ−Ｄｏｐａ−ＰＡＡの合成１膳濡の

【−
ブチルオキシカルボニル ａをテトラヒドロフラン中で２■のＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミドと１１のジシクロへキシルカルボジイミドで
処理する．１ｈｒｓ．攪拌後、沈殿したジシクロへキシ
ルカルボジイミドをろ過して除きろ液を蒸発乾固する．
乾燥物をＥ丁ＯＨ　（エタノール）に溶解し、２０のポ
リアリルアミン塩酸塩の水溶液を加え，トリエチルアミ
ノホウ酸緩衝液（１Ｍ　、　ｐＨ９．５　）を加え、ｐ
Ｈ８．５にする，　３０ｍｉｎ．［伴後、混合物を稀塩
酸でｐＨ２にしてから溶剤を蒸発させる．残さをｔ−ブ
チルオキシカルボニル基を除くため，トリ２ルオロ酢酸
で処理する．エーテルを加え．　７４発して沈殿したＤ
ｏｐａポリマーをガラスろ器でろ過する。 １１ｏｐａ含有グラフト共重合体を水に溶解し２力ツト
オフ分子量約８，０００ー１２，０００の透析袋を使用
して低温室中４見の０．ＯＯＩＮ　Ｈ　Ｃ　ｌを３回取
りがえて３［１ｂｒｓ．透析する．透析乾燥後、ロｏｐ
ａーポリアリルアミングラフト共重合体は粉末として得
られ．　ＨＰＬＣの単独ピークが現れる。ポリ７リルア
ミン上の７ミノ基の約４０％がＤｏｐａによりアシル化
され１分子輩７０，０００のものが得られた。 実施例４〜１０ 実施例１に記述した手法を使って以下のペプチド含有グ
ラフト共重合体を調製した。 実施例ｌｌＮ１？ 実施例２に説明した方法で以下のペプチド含有グラフト
共重合体を調製した。 実施例１８ 実施例３に説明した手法でアミノ酸含有グラフト共重合
体Ｈ−ロｏｐａ−ＰＬＬを調製した。得られたダラト共
重合体は分子１３７，０００でポリリシン土の７ノ基の
１０％が口ｏｐａによってアシル化された。 施例１８〜２０ 実施例３と同じ手法で次の７ミノ醜含有グラフ共重合体
を調製した。 穀実ｋＩＭ アミノ酸 骨格 ｌ損％ 分子菫 １ｇ Ｈ−５＠ｔｉｎ＠ ＡＡ ２０％ ４１に Ｈ−↑ｙｒｏｓ１ｎ＊ ＡＡ １０％ ４０に 比４１１２実施例２１〜２３ 以下の合成ポリマーをペプチド合成方法において周知の
標準的手性でＩＢ製した。 コ〕 ＾１ａ−Ｌｙａ−Ｐｒｏ−５１１ｒ−丁ｙｒ−ｏｙｐ−
ｏｙｐ−丁ｈｒ−Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ１２１０Ｐ１　　　
　　１１９８（ＩＯＰＩ　　　Ｉ　　Ｄｏｐａ、　　２
　　Ｈｙｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ｆｌｙ）ｉｌ＋　　＜２０ＫＨ−Ｄ
ｏｐａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−５＊ｒ−丁
ｙｒ−ＯＲ７８５コｌ　（ｉｏに実施例２１のデカペプ
チドの調製に利用した技術は１例えば、　Ｂａｒａｎと
Ｍｅｒｒｉｆｉｇｌｄの“ペプチド、　Ｖｏｌ、２．　
ｐｐ、１−２８４．１９８０．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｔｈｅ　Ａｓ−ａｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５
ｏｃｉｅｔｙ、　Ｖｏｌ、９５．　ｐｐ、ｌ３Ｈ−３３
（１９７３）及びにｅｉｅｎｈｏｆｂａｒ　ｅｔ　ａｌ
の研究Ｉｎ　ｔｅ　ｒｎａ　ｔ　１−ｏｎａｌ　Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ
ｅｇｅａｃｈ、　Ｖａｔ、１３．　ｐｐ、３５−４２　
（１９７９）に説ＩＪされている。比較実施例２２と２
３のデカペプチドの低分子ｍｆｊ：ボリマーは２例えば
、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｃｈｅｓｉｃａｉ
　５ａｃｉｅｔｙ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、　Ｖ
ｏｌ、Ｉ　、、　ｐｐ、Ｂ１３−８１７　ｃｒ）山本氏
の論文で、ペプチド化学の線形心合化の標準方法によっ
て得られた。 実に例２３ 本実施例では１本発明のペプチド含有グラフト共重合体
の細胞固着に対する接合機能について説明する。イガイ
から抽出した純粋な生物接合性ポリフェノールタンパク
はにｙｔｉ＋ｉａが生物活性物質（Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ接
合剤、　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、　Ｔｌ１ｌｃ、　７
　ｙ−ミントン、（Ｔにより製造））として固定し、単
一４１１成の不活性な基質として導き、］ｊらかにして
いる。 これを対象ｕｊＪＩｆｉとした。 Ｃｅ１ｌ−Ｔａｋ接合剤とペプチド含有グラフト共重合
体は５％（’　／ｖ　）酢酸中に約４℃で保存した。 ３種類のは乳類の細胞を用いて未塗布の組織培養プラス
チック容器に対する接着１本発明のペプチド含有グラフ
ト共重合体を塗布したプラスチック容器に対する接合を
ＣＥＬ−ＴＡＫでの接合を１を較した。基質依存性の子
供のハムスターの腎臓細胞（ＯＨ）［−２１、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ　１Ｇ）は１０％の子牛血清と燐酸トリプトーゼ
とのブイヨン先金んだＢａ５ａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａ
ｇｌｅの中で生育させた０人体の組織マクロファージ　
リンパ細胞（Ｕ−９３７；ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９３）
は、　１０％の子牛の血清を含んだＲＰＭＩ　１６４０
　＠に基中で生長させた。リンパ球細胞（Ｐ３Ｘ　６３
　　＾ｇ８、８５３．　ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）は
２０％の非抗熱性の胎児牛血清を除いて同様の方法で成
育させた。あとの２種の細胞の型は基質非依存性である
ので懸濁培養を行った。 すべてのタンパクは溶液キャスティング法で組織培養プ
ラスチック容器に塗布した。すべての実施例では１０ｍ
ｇ／１文溶液鉢ｆＬｆ＆Ｌを直径３５■」二に塗！ジし
、乾燥した。１．Ｏｅ膳２プラスチック皿の場合の最終
密度は０，５〜５　ｍｇ／ｃｍ’であった身空気中で乾
燥したのち、１部エタノール（９５％ν／ｖ）と２部の
純水を入れ洗った。 接着試験は約３７℃で２０■ｉｎ、の培養後に定植的に
行った。　Ｂ）ＩＫ細胞はトリプシン処理をし、遠心分
離により新鮮な培養基で洗浄し、１０％の子牛血清を含
んだ新鮮なＲＰＭ　Ｉ　１８４０中に２　Ｘ　１０’ｃ
ｅｌｌｓ／ｊ文の密度で懸濁しておく、＠濁状態で培養
したＵ−９３７とＰ３Ｘ細胞は遠心分離で洗浄し、回−
・の密度で再懸濁させる。懸濁物は未処理の組織培五皿
と生物接着ポリフェノールタンパクと本発明グラフト共
重合体で処理した皿に２０ｍ１ｎ、静かに攪拌して固着
していない細胞を除き、ヘマセトメータで計数する。デ
ータは塗布した細胞の全数から培養後固着しない細胞数
を差し引き固着している細胞数の％で計算する。 この分析法の条件は、Ｃｅ１ｌ−Ｔａｋ接着剤を塗布し
た皿から得られた最適に次ぐ条件により確立される、ポ
リマー被覆の観察の結果、純粋ポリフェノールタンパク
の容量を超過していることが判明した。　丁ａｂｌｅ　
　１に調製した種々のタンパクから得られた効率範囲を
示す１本実施例で使用したポリリシンチロシンポリマー
は分子ｌ１ｔ１００，０００のｌ：１の洗浄ランダム共
重合体である。比較実施例２２と２３の合成ポリマーは
生物接着性のポリフェノールタンパクよりも分子門は小
さいので細胞ｔａ着の媒体としてはこれに対応して低効
率である３分子Ｕがｋきくなれば接着効率は増加する。 実施例３及び５の合成グラフト共重合体は生物接漬゛性
ボリフェ・・−ルタンパクに分子−鼾が近接しているの
で接着効率は低分子量の合成ポリマーの結果よりもよい
様に思われる。実施例４の合成グラフト共重合体は生物
接着性ポリフェノールタンパクよりも分（、（武が火き
く、接着効率は同程度である。 実験例全部からみて実施例３と５の合成グラフト共重合
体は生物接着性ポリフェノールタンパクよりも結果は良
い。 生物ｍＥ性デポリフエノールタンパクペプチド含゛右グ
ラフト共重合体の存在丁のは乳類の生長速度はべ／チド
含有グラフト共玉合体による潜在的な対抗効果を評価し
て表わす、子供のハムスターの腎＋１１１ｍ胞（Ｂ！（
Ｋ）を１０％の子牛直情と１０％の燐酸リブトーゼ　ブ
イヨンを加えたＢｅＩＥ中で集密的に生長させ、トリプ
シン処理をして遠心分離でＢ）ＩＥで数回洗炸する。懸
濁物（５Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ｉｉ副）を未処理の３
５ｍｍ皿（対照）とＣｅ１ｌ−Ｔａｋ接着剤とペプチド
含４１グラフト共玉合体で処理した皿の１０％子牛血清
を含んだＢ）ＩＥ中に接種する。　３７．５℃で５％Ｃ
Ｏ２気流中で培養し５時間を変えて１組３皿をとり出す
、固着している細胞はトリプシン処理をし２洗炸してｈ
ｅｍａｃ４ｔｏｍｅｔｅｒにて計数する。 Ｅｌ）ＩＫ−２１細胞の生長速度は骨格ポリマーがポリ
アリルアミンとポリＬリシンのペプチド含有グラフト共
重合体及び生物接着性ポリフェノールタンパクともに対
照にして影響されなかった。生長速度はどんなポリマー
が存在しても増したり、遅れたりすることがないという
ことは重要である。 実施例２４ 本実施例では本発明のペプチド含有グラフト共重合体を
使用したスライドガラス上の組織片の保持について説明
する。パラフィンで埋めた肝臓切片をＩＯ譜場に切断し
、Ｃε１ｌ−Ｔａｋ接谷剤又はペプチド含有グラフト共
重合体のスライド当り５ｇの密度で塗布した顕微鏡スラ
イドグラスに置く、２つの切片を置いた３枚のスライド
を各検体毎に作る。 ペプチド含有グラフト共重合体は実施例５のＦＡＡ−５
Ａ・・ＯＨと７セヂルーロｏｐａ・ＰＡＡをテストした
アセチル−Ｄａｐａ　−ＦＡＡは実施例３に記述した方
法で以下の除外・ド項と共にｉＡ製した。１ｎｓのＥ−
ブチオキシカルボニル（ＢＯＣ）　−Ｄｏｐａの代りに
ｉｔｓの７セチルーＤｏｐａを４最初、テトラヒドロフ
ラン中テ２１１（７）　Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
で次にｌｓｍのジシクロへキシルカルボジイミドで処理
する。ＢＯＧ−Ｏｏｐａでなくてアセチル−Ｄｏｐａを
使用したので、トリフルオロ酢酸での脱保護基は行わな
い、得られたグラフト共重合体は分子ｕ４２，０００で
ポリアリルアミン上のアミノ基の１０％がアセチル−Ｄ
ａｐａニよって７シル化されていた。 更につけ加えて、分子−縫約３０，０００の線状ポリア
リルアミンポリ？　−（ＰＡＡ）と分′ＦｉＪ約１００
，０００　ノ線状ポリリシンポリマーもテストした。 加熱テーブル器Ｊ二で４５℃に１　ｈｒ、乾繰したのち
スライドはキシレ゛／中で５分間の洗浄を２回、次に９
５％エタノール中で３回１次に７０％エタノール中で１
回、水で３分洗浄、１回の脱ワツクス処理を行う。 スライドはその後４次の連続処理に処せられる１、　　
ｌｏｏ關　Ｐ門、　　ｐＨ８，１５ｍ１ｎ、　　　６２
）１．ＱｃｏＭ　　ｐａｓ、　　ｐＨＬ　　Ｏ，３％Ｈ
２０，，０，２５１丁ｒｉＬ＋ｎ Ｘ−１００，２ｈｒ、　　　　　　　　　　　６３１　
　給水　　　　＊　ｉｓ　ｏｌｉｎ、　　　６４、　　
ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥｏｔＡ　（、Ｏ５ｔ／、０２％１３
０　　ｍ１ｎｓ、　　３１”Ｃ６ ５、↑ｒｙｐｓｉｎ／εば＾（、ＱＳ％／、０２ｍ１１
〕０　毘１０．３７會Ｃ６ ６・　給水　　　　、　ｉｓ曙１ｎ１６フ、　０．１％
　ｓｏｓ　　ｉｎ　　ｗａｔｔ。 １．５．Ｓ　　ｈｒ。 ａ、給水　　　　　ｒ　２５　ａｊ、ｎ。 ９、　　Ｐ會ｐｓＬｎｔ　　（Ｓ１０ＯＯＬＩ／ｌ１ｌ
）／２０　　ｍＬｎ、、　　１フ１１Ｃ １０、給水路 Ｉｓ　ｍｉｎ＋ 】 実施例５のペプチド含有グラフト共重合体のＦＡＡ・と
Ｃｅ１ｌ〜丁ａｋ接着剤はすべての処理に残った。アセ
チル−Ｄｏｐａ　−ＦＡＡグラフト共重合体では９と１
０の処理後に切片が１悦落した。ポリーＬ−リジンでは
処理７の時点ですべて脱落した。 実施例２５ 本実施例では本発明のペプチド含有グラフト共重合体の
フルミニラムに対する接Ｒａ能について説明する。 ペプチド含イ１グラフト共重合体の何種類かと生物接着
ボリフェ、ノールタンパクを第ｕ表で選定しアルミニウ
ム箔片を接着し、その結合強度をテストした。　１．３
　ｅ＠Ｘ　４ｃｍの箔片をエタノールで清浄にして乾燥
した。一定容閂のポリマー水溶液を−・つの箔片の端に
付け、直ちにもう一つの箔片をその上に１．３　ｃｍ玉
ねる。結合面聞出りのポリマー礒は４ｙＬｕの純水に４
から２０ｙＬｇの間である。１ｈｒ、放置する。箔片を
圧力計（Ｏ〜５００又は０〜５０００ｇ範囲）と３５ｇ
／秒の割合で引っ張るギヤートモ−ター駆動のピストン
の間に固定し、結合強度を測定する。すべて室温で測定
した。５回のテストの平均をｇ／ｃｍ２／　ｐ、　ｇで
表わした。 Ｔａｂｌｅ（表）　　　ＩＩ ポリマー 接着箔せん断力テスト 純粋生物接着性 ポリフェノール蛋白 ポリアリルアミン ポリーＬ−リジン ポリーＬ−リシン　チロシン 実施例　３ 実施例　４ 実施例　５ 実施例　７ 実施例　１１ 実施Ｍ　　１２ 実施例　１３ 実施１１ｉ１　１４ 比較実施例　１９ 比較実施Ｉ！Ａ２０ 比較実施Ｍ　　２１ 比較実施例　２２ 比較実ｊ＆例　２３ アセチル−ドパ−ＦＡＡ ＰＡＡ−１０Ｐ　　ＯＤｏｐａ　　　　　　　　　４８
０ｆ−１ｙｏρ０ 生物接着性ポリフェノールタンパクは６．４〜９゜８・
ｔｔｇでせん断カフ３４／ｃ麿２／ｇｇのピークを示し
たＩＪ、ｇポリマー基準ではペプチド含有グラフト共重
合体の多くのものと線状ポリアリルアミンポリマー（Ｆ
ＡＡ）がポリフェノールタンパク同程度か又は越えてい
る。 実施例２Ｂ 未実施例は未発用のグラフト共重合体の水相における有
用性について説明する。 ポリフェノールタンパクと分子量の異るグラフト共重合
体の接着特性の水相での適合性をテストした８分子量を
増加させ、凝集結合力を増加するため酵素作用的又は化
学的分子内架橋剤を使用した。　Ｈ７ｐａｎポリアクリ
ロニトリル（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ　Ｔｅａｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ　［ｎｃ、）の少なくとも８０％の水を含むヒドロ
ゲルは、基質を接合するのに使用される。 Ｈｙ　ｐａｎ−Ｂｙ　ｐａｎヒドロゲル結合を酸浴（０
，５ＭＨＣＪＩ）での抵抗を架橋剤を加えたものと加え
ない各ポリマーの接着特性を指標としてテストした架橋
剤を添加しない生物接着性ポリフェノールタンパクで結
合した小片は水中で２ｈｒｓ、で分離するが、酸の中で
はｌ　ｓｉｎ、もたたぬ内に分離する。 架橋剤を加えたポリフェノールタンパクの場合は水中で
も癩の中でも少なくとも１週間はそのままの状態で残っ
ている。 ■ｐａｎルミｎヒドロゲルに先立ってｌＸ２０ｍの小片
に切り、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）でＰ）１７．０にした生
理的食塩水に浸しておく、ポリフェノールタンパクベブ
チド含共重合体を１〜１５ｐｇ　／ｅ脂２と濃度をかえ
て使用する。生物接着性又はポリフェノールタンパクと
分子量の大きいペプチド含有グラフト共重合体は低温度
でも充分な接着性能を示す、マツシュルームチロシナー
ゼは接着剤路ｇ当り５．５〜１１単位使用される。化学
的架橋剤としては共有結合に２ケの遊離アミンを含むビ
ス（スルフォコハク酸イミジル）スペリンＭ　（ＢＳ−
３）　、！：３　、３−ジチオビス（スルフォコハク酸
イミジルプロピオン酸）　（ＤＴＳＳＰ）を生理的ｐ！
−［における水溶解性と官応基のために選んだ。 接着剤と架橋剤か緩衝剤のどちらかをＨ！　ｐａｎヒド
ロゲルの１片の上に直接置き、混合して１　ｃｍ２に広
げる。もう１ケの小片を直ちに処理した小片のににｔ＜
、重ね合わせた小片は３０秒間放置したのち、Ｃｏａｒ
ｓ　Ｍに入れた０、５塩＃　ａｏｏμＪ　ｉ中におく、
結果はＴａｂｌｅＤＩに集めた。 ｆ！Ｉ！作用架橋剤としてのマツシュルームチロシナー
ゼの結果は、結合したＨｙ　ｐａｎヒドロゲルテストで
すべてのポリマーに対し良好であった。 架橋類似物は全て、架橋純粋生物接着性ボリフェ／−ル
タンパクと同じように酸中に保持した。 骨格のテストからはポリリシンチロシンとポリアリルア
ンミンの結合は良好であったが、架橋剤を添加した場合
の酸の中では両者とも分離してしま−）た、ポリーＬ−
リシンはどの場合でも結合しなかった。 ＢＳ３とＤＴＳＳＰの化学的架橋剤の場合は少り、の例
外を除いて結合状態は良かった。 イオン的に接合可能な帯電した（プロトン化した）アミ
ンの数に対するこれら架橋剤に使用可能な遊離アミンと
、陰電気的に帯電したヒドロゲルの比率は、この方式お
よびアミン含有合成物にとって重大であるように思われ
る。この比率は、ＰＨの機能である。 最も注目すべきことは、実施例１５の高分子量ポリマー
は、追加の架橋なしに耐酸接合剤を形成した。 ３７５に分子址は、１分に耐酸結合力を得ることができ
た。 比穀実に例２０〜２２の合成した低分子延のペプチドと
ポリマーは１架橋剤の添加のあるなしに拘らず結合しな
かった。 Ｔａｂｌｅ（Ｊｔ）　　ＩＩＩ ヒドロタル結合テスト Ｐｏ１ｙｉｌＬｙｌａａｉｒｉｅ Ｐｏｌｙ−Ｌ−１ｙｓｉｎ＠ 【翼−＋＋＋ｐｌｅ　　Ｚ １−ｐｈａ　４ １罵１−ρ［・　＄ １冨ＭＧＩＩ瞳） ！ｘａａｐｌ＊　　１１ 寥罵−ｐＬ・　１２ ｇＸ錦ｐｉｅ　１３ ０錦ｐ１・１４ Ｅｘ赫ψ１＠１ｓ ｔｍａｓｐｌ＠１１ 水に不溶 ＾ｃ＊ｔｙｉ−ｏｏｐａ−ｐＭ＋＋＋ 実ＡＭ２７ 生体組織の大小の孔を本発明のペプチド含４ノグラフト
共重合体奢使って月じることが出来るかを証明するため
に眼部組織を使用した。牛の１ｌｌ１１部の上皮細胞を
１５〜２０＋ｆＬｕの角膜からメスを使用して取り除く
、削りとった角膜の中心をメスで切り、穴をあける。生
理的食塩水を入れたｌ（ｌ　ｍ文の江射器に１８ゲージ
の針をつけ、前面のくぼみに挿入し、角膜の刺入を通し
ても洩れがあるのを確認する。 引きかいた部分を脱イオン水で洗い５余分の水をスポン
ジでｔＩｔすとる。生物接着性ポリフェノールタンパク
とグラフト化ペプチド共重合体を穴のあいた外面へ５０
ｇｇ　／ｃｇｅ２の割合に塗る。 治療用ヒドロゲルコンタクトレンズ（Ｈマｐａｎヒドロ
ゲル、　Ｋｉｎｇｓｔｏｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、　Ｉｎｃ、）　ｃ７）予め燐酸塩緩衝生理的食塩水
（ＰＢＳ）に３０ｍ１ｎ、浸しておいたものを損傷部に
置き、レンズ角膜の界面で組織のつぎ当てが一体化する
様静かに押す、木を充した透析袋を接合部の上に置き、
２０ｍ１ｎ、放置する、接着強１ハ“は前に前面くぼみ
に挿入しておいた注射針に圧力計を着けて用足する。 透析袋を取り除き、圧力計を取りつけた注射器で洩れと
圧力をみながら約１２０”／ｍｉｎ、（１２０ｉｎｅｂ
／ｍｉｎ、）で加圧する。Ａ４初に洩れが起きた時の水
圧の読みを記録する。記録した圧力を０．５３５で割っ
てｍ５ｌｌＨに変換する。データは少なくとも２回以上
の用足（ｔｊの平均を採った。Ｔａｂｌａ　ＩＶにおい
ては耐圧力が３７〜７５ｍｄｇの場合は＋：洩れる前に
７５又はそれ以りに耐えた場合は÷◆とじた。 ＼８、 ゛＼ ’Ｉ”ａＬ）ｌｅ（＾＞　　　ＩＶ ｌｌに対するＩＩ　ｙ　ｐ　ｒ＋、　ｒ＋　ｌ認６能力
ボリマー Ｏｘ Ｐｏｌｙａｌｌｙｌ−ロー Ｐｏ１ｙ−Ｌ−１２ｓｉｎｓ ム−ｐｌ＊　３ εｗａｓｐ鐘　４ Ｅｘａａｐｌｓ　５ を菖ａｍｐｌ・） εｔａｍｐＬ・１１ Ｅｘａａｐｌｓ　１２ εｘａｍｐｌ・　１１ ムａａｐｌ・　１４ ＥＸ綿ｐ１・　ｌ５ ＡＣ＠ｔｙｌ−ＤＯｐ＆−ＦＡＡ ＦＡＡ−１０，ｔｏ　Ｄｏｐａ、　　ＯＨｙｐｒｏ）実
施例の結果はグラフト化ペプチド共重合体が大小の組織
の傷を封じるのに使用できる可能性があることが判った
。これに対してポリマー骨格物質のみ、又は比較実施例
１８−２３のポリマーは少なくとも３７１１１Ｈ＆の圧
力において接、ｎ力を失った。 実施例２８ 未実施例は本発明のグラフト化ペプチド共重合体の皮膚
移植の応用について説明する。 豚の皮膚を１８着力の評価に用いた。 脱Ｉ指２凍結した豚皮を２Ｃ−の片に切りとり、湿った
ガーゼで覆い、完全に解凍し、水和作用が起きる様に冷
蔵した。約２ｂｒｓ、後エタノールで拭きガーゼで乾か
す。 実施例５のグラフト化ペプチド共重合体（５−ｇ／ｌ立
木）を１す４１，０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７）を
４μ見、３０ｍＭ　（１７，１８５ｇ／　ａｎ水）ビス
（スＪ／７ｔコハク酸イミジル）スペリン酸（ＢＳ３）
の水溶液２ド文を用意する。 清浄なポリスチレン皿で上記を混ぜて２以下の接着性の
テストを行う。 １４層文の混合した接着剤を１つの豚皮片の端に１０ｍ
７　に塗！Ｉｊする。もう１つの豚皮をこの］二に玉ね
、２９５ｇの重しを入れたプラスチックの皿をｌ０ｓｉ
ｉｎ、２ｔいておく。 接着した試験片を垂直に吊し、Ｆ部に錘りを加えてい！
接着部がはがれる迄テストした。 実施例５のグラフト化ペプチド共重合体の平均せん断力
は９３ｇ／ｅｍ２であった。 実施例２９ 本実施例ではグラフト化ペプチド共重合体１′架橋剤と
緩衝剤を組み合わせると角膜の接着に効果があること奎
証明するために牛の角膜でテストを行った。 牛の角膜を服核を備えた眼から−Ｌ皮及び内皮細胞層を
含めてかさ取り２切片（２Ｘｌｃ膳２）に切る。この角
膜片を１００　ｆｉＬ文の燐酸１！！緩衝生理的食塩水
で洗い、直ちに乾燥する。この前面層と後面層の１１着
をテストする。 ８ル交の実施例５のグラフト化共用合体奢燐酸塩Ｗ衝液
又は木に溶解したものを５４１の０．０２５Ｍ燐酸塩緩
衝液と１．１６層文のビス（スルフォコハク酸ジイミジ
ル）スペリン酸（ＢＳ３）の１５層に水溶液を混合する
。グラフト化ペプチド共瓜合体の安定度は大息いが、水
溶液として保存する場合は、１週間を超えない様にする
。各テストでは８η文の混合液を０．８４層ｍ２　に塗
り、もう−・っの角膜片をその１−に置く。 約１５厳交の木の入った小袋をおもしとして置き２０ｍ
１ｎ、放ｔする。それからせん断力をテストする接着し
た角膜の一端を架台にクリップし、もう反対の他の片に
氷袋をクリップする＊　　２００　ａｎ　／ｓｉｎ、の
定速度で水を袋の中に注ぎ、接着部が引き離れる迄つづ
ける。 水のｍＭｔを秤すせん断力に直す、結果をＴａｂｌｅＶ
に示す。 ′ｌ″；ｈ　ｈ　ｌ　ｃ　（表） ■ 接着剤の溶媒　　　　　水の重装（ｇｍ）　　　　ぜん
断力（ｇ　／’　ｃ　ｍ　）水　　　　　　　　　　　
　　　５８　　　　　　　　　　　００水　　　　　　
　　　　　　　４２　　　　　　　　　　　６６０．０
２５Ｍ　　＋”’０４．．　　２１０　　　　　　　３
２８前述の濃度でのテストでは、架橋剤を添加し５たグ
ラフト化ペプチド共屯合体は軟質な組織で、少なくとも
８８ｇ／ｃ霞２の接着力を示した。この組織は均質では
ないので、正確なイｔｉで数値が得られる再現性はない
が、本結果は接着が確実にできていることを示Ｌ５てい
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の第１実施例に係るペプチド含有グ
ラフト化共重合体の合成工程図、第２ＬＮは、この発明
の第２実施例に係るペプチド含有グラフト共重合体の合
成工程図である。 Ｆ／Ｇ、！ Ｆ加（’Ｌ７＄１ｂＣｌ’ＣＭ　＋　ｘ＋２ｃｍｒｅｓ
１ｎＦＩＧ、２ １　↓９　ｃｙｃｌｅ！

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）水溶カチオン性のグラフト化ペプチド共重合体で
   分子量が３０，０００乃至５００，０００であり、（ａ
   ）アミノ酸又はグラフト化ペプチドと反応する遊離の第
   １級又は第２級アミン官応基をもっているか又はこれに
   改質可能な基をもっている骨格のポリマー、この骨格ポ
   リマーの分子量は約１０，０００乃至２５０，０００で
   （ｂ）アミノ酸又はグラフト化ペプチドは、前記骨格ポ
   リマーの前記第１級又は第２級アミン官応基の少なくと
   も５％乃至約１００％と反応し、この中でアミノ酸又は
   グラフト化ペプチドは少なくとも１ヶの３，４−ジヒド
   ロキシフェニルアラニン（ドパ）アミノ酸又はヒドロオ
   キシル化でドパ型に改質出来る前駆体から成る水溶カチ
   オン性ペプチド共重合体。 （２）特許請求の範囲第１項において、共重合体の分子
   量が約５０，０００乃至約３５０，０００の範囲にある
   グラフト化ペプチド共重合体。 （３）特許請求の範囲第１項において、共重合体の分子
   量が約７０，０００乃至約３５０，０００の範囲にある
   グラフト化ペプチド共重合体。 （４）特許請求の範囲第１項において、共重合体の分子
   量が約１００，０００であるグラフト化ペプチド共重合
   体。 （５）特許請求の範囲第１項において、遊離第１級又は
   第２級アミン官応基をもつ骨格ポリマーのｐＫ値が少な
   くとも約８を示すグラフト化ペプチド共重合体。 （６）特許請求の範囲第１項において、遊離第１級又は
   第２級アミン官応基をもつ骨格ポリマーのｐＫ値が約８
   ．５乃至約１０であるグラフト化ペプチド共重合体。 （７）特許請求の範囲第１項において、前記の骨格は遊
   離第１級又は第２級アミン官応基をもつモノマーから成
   り、アミン基の量が前記アミノ酸又はグラフト化ペプチ
   ドと反応する前記アミン基をもつポリマーｇ当り少なく
   とも約１〜２５ミリモル遊離アミン基であるグラフト化
   ペプチド共重合体。 （８）特許請求の範囲第１項において、前記骨格の分子
   量が約１０，０００乃至約２５０，０００であるグラフ
   ト化ペプチド共重合体。 （９）特許請求の範囲第１項において、骨格ポリマーは
   ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、
   キトサン、ポリビニルアミン、硫酸コンドイロイチン、
   ポリデキストランヒアルロン酸、ポリアクリル酸及びこ
   れらの共重合体のグループから選定されたものであるグ
   ラフト化ペプチド共重合体。 （１０）特許請求の範囲第１項において、前記骨格ポリ
   マーがポリリシンであるグラフト化ペプチド共重合体。 （１１）特許請求の範囲第１項において、前記骨格ポリ
   マーがポリアリルアミンであるグラフト化ペプチド共重
   合体。 （１２）特許請求の範囲第１０項において、前記遊離第
   １級又は第２級アミン基の少なくとも約５％乃至約３０
   ％が前記アミノ酸又はグラフト化ペプチドと反応してい
   るグラフト化ペプチド共重合体。 （１３）特許請求の範囲第１０項において、前記遊離第
   １級又は第２級アミン基の約１０％乃至２０％が前記ア
   ミノ酸又はグラフト化ペプチドと反応しているグラフト
   化ペプチド共重合体。 （１４）特許請求の範囲第１１項において、前記遊離第
   １級又は第２級アミン基の少なくとも約５％乃至約３０
   ％が前記アミノ酸又はグラフト化ペプチドと反応してい
   るグラフト化ペプチド共重合体（１５）特許請求の範囲
   第１１項において、前記遊離第１級又は第２級アミン基
   の約１０％乃至２０％が前記アミノ酸又はグラフト化ペ
   プチドと反応しているグラフト化ペプチド共重合体。 （１６）特許請求の範囲第１項において、前記アミノ酸
   又はグラフト化ペプチドが３，４−ジヒドロキシフェニ
   ルアラニン（ドパ）アミノ酸を含んでいるグラフト化ペ
   プチド共重合体。 （１７）特許請求の範囲第１項において、前記アミノ酸
   又はグラフト化ペプチドがヒドロキシル化により、Ｄｏ
   ｐａ型に改質可能の３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
   ニンの前駆体を含んでいるグラフト化ペプチド共重合体
   。 （１８）特許請求の範囲第１７項において、前記前駆体
   はチロシン及びフェニルアラニンから成るグループから
   選定されたグラフト化ペプチド共重合体。 （１９）特許請求の範囲第１項において、前記アミノ酸
   又はグラフト化ペプチドが【遺伝子配列があります】か
   ら成るグループから選定されたグラ フト化ペプチド共重合体。 （２０）特許請求の範囲第１項において、骨格ポリマー
   がポリリシンでかつ前記アミノ酸又はグラフト化ペプチ
   ドが【遺伝子配列があります】から成るグループから選
   定されたグラフト化ペプチド共重合体。 （２１）特許請求の範囲第１項において、前記骨格ポリ
   マーがポリアリルアミンで、かつ前記アミノ酸又はグラ
   フト化ペプチドが【遺伝子配列があります】から成るグ
   ループから選定されたグラフト化ペプチド共重合体。 （２２）特許請求の範囲第１項において、前記骨格ポリ
   マーがポリアリルアミンで、前記アミノ酸又はグラフト
   化ペプチドがＤｏｐａであるグラフト化ペプチド共重合
   体。 （２３）特許請求の範囲第１項において、前記骨格ポリ
   マーがポリアリルアミンで、かつ前記アミノ酸又はグラ
   フト化ペプチドがＳＡ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｈｙ
   ｐ−Ｈｙｐ−Ｔｈｒ−Ｄｏｐａ−Ｌｙｓ−ＯＨであるグ
   ラフト化ペプチド共重合体。 （２４）水溶性でカチオン性のグラフト化ペプチド共重
   合体で分子量が約３０，０００乃至約５０００，０００
   であり、 （ａ）骨格ポリマーはモノマーの反復単位から成り、各
   モノマーの反復単位はアミノ酸又はグラフト化ペプチド
   と反応するための遊離第１級又は第２級アミン官応基を
   含むか又は含む様に改質でき、この骨格ポリマーの分子
   量は約１０，００乃至２５０，０００である。そして又
   、（ｂ）アミノ酸又はグラフト化ペプチドは前記骨格ポ
   リマーの第１級又は第２級アミン官応基の少なくとも５
   ％と反応し、前記アミノ酸又はグラフト化ペプチドは少
   なくとも１ケの３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン
   （Ｄｏｐａ）アミノ酸又はヒドロキシル化でＤｏｐａ型
   に改質できる前駆体を有する水溶カチオン性のグラフト
   化ペプチド共重合体。 （２５）特許請求の範囲第２４項において、前記モノマ
   ーの反復単位がリシン及びアリルアミンから成るグルー
   プから選定されたものである。 （２６）特許請求の範囲第２４項において、遊離第１級
   又は第２級アミン官応基が前記アミノ酸又はグラフト化
   ペプチドと反応するポリマーｇ当り少なくとも約１〜２
   ５ミリモルアミンの量がある水溶性カチオン性のグラフ
   ト化ペプチド共重合体。