NO175006B - Syntetisk aminosyre- og/eller peptidpodete kopolymere - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører vannoppløselig kationisk peptid-inneholdende podet kopolymer med en molekylvekt på 30 000 til 500 000 som omfatter

en polymerisk hovedkjede inneholdende, eller som kan bli modifisert til å omfatte, frie primære eller sekundære aminfunksjonelle grupper for omsetning med en aminosyre eller peptidpodning og er egnet for anvendelse innen biomedisin. Disse podete kopolymerene er kompatible med metabolismen, veksten og funksjonen til levende vev og/eller celler in vitro eller in vivo.

Polymermaterialer er blitt anvendt for implantater eller andre biomedisinske anvendelser pga. at de er nær knyttet til naturlige vevskomponenter så som kollagen, som muliggjør direkte binding til andre stoffer. Årtider med peptid-forskning har ført til mange biomedisinske nyttige poly-peptider. Det er derimot enda de mest undergraderte og lite anvendte polymerene tatt i betraktning av deres imponerende egenskaper, som omfatter ikke-smeltbarhet, mekanisk styrke og adhesivevne forårsaket av en meget fleksibel hovedkjede og mange funksjonelle sidekjeder.

I de senere år har kollagen, laminin, fibrin og fibronektin blitt ekstrahert, renset og forhandlet som vevs- og cellulær adhesjonsfremmere. Syntetisk poly-D-lysin og poly-L-lysin er også blitt solgt pga. dette. Mange ulemper eksisterer derimot og dette begrenser anvendelsen av slike polymerer pga.: (a) de er bare aktive med begrensede typer substrater eller er effektive med spesifikke celletyper; og (b) betraktelige helsefarer eksisterer når det gjelder fibrin og fibronektin fra humant blod.

I den senere tid har Waite og Tanzer, Science, Vol. 212, s. 1038 - 1040 (1981) identifisert noen av naturens mest virkningsfulle adhesiver, bioadhesive polyfenoliske proteiner, utskilt av marine muslinger som lever under vann og rutinemessig er utsatt for krefter fra brenninger og tide-vann. Det naturlig-forekommende bioadhesive polyfenoliske proteinet blir produsert og lagret i den eksokrine fenol-kjertelen til muslingen og blir avsatt på marine overflater ved hjelp av foten til muslingen i løpet av dannelsen av nye adhesive plakk. Det nye bioadhesive polyfenoliske proteinet kan bli ekstrahert og renset ifølge fremgangsmåtene beskrevet i Journal of Biological Chemistry, Vol. 258, s. 2911 - 15

(1983) eller US-patent nr. 4 496 397.

Anvendelsen av det naturlige bioadhesive polyfenoliske proteinet ekstrahert fra muslingen er begrenset av mengdene som kan bli tilveiebrakt. Mengder tilstrekkelig for forskning med lavt volum og visse medisinske anvendelser er nå tilgjengelige.

Consensusdekapeptidet, som danner den repeterende enheten av det bioadhesive polyfenoliske proteinet, kan bli tilveiebrakt og polymerisert ifølge prosedyren beskrevet i US-patent nr. 4 585 585. De syntetisk tilveiebrakte bioadhesive polyfenoliske proteinene har adhesive karaktertrekk, men lider under begrensningen av at den tilveiebringbare molekylvekten bare er omtrent 10 000 til 20 000, som dermed begrenser adhesivstyrken derav. I tillegg kan polymerisasjonen av dekapeptidene bli gjort vanskelig ved ukontrollerte bi-reaksjoner og vanskeligheten med effektiv de-blokkering av de beskyttede aminosyrene. Derfor kan slike syntetiske materialer ikke bli anvendt i mange anvendelser hvor det er nødvendig med større adhesivstyrke.

Med unntakelse av poly-D-lysin og poly-L-lysin må polypeptid-adhesivene bli ekstrahert fra biologiske kilder. Syntetiske polymerer er vanligvis foretrukket for å unngå den mulige introduksjonen av biologisk avledede spor, men allikevel farlige forurensende stoffer.

Poly-D-lysin og poly-L-lysin, som kan bli syntetisert for å tilveiebringe forbindelser med høy molekylvekt til en rimelig pris, ble funnet å ikke være meget effektiv for vevsadhesjon. Dekapeptidoligomeren til det bioadhesive polyfenoliske proteinet har heller ikke tilfredsstillende adhesive egenskaper, og flere forsøk på å polymerisere dekapeptidet ved anvendelse av klassisk sekvenspolymerisasjon kunne heller ikke produsere en høy nok grad av polymerisasj on for å tilveiebringe en dekapeptidpolymer med adhesive egenskaper som er sammenlignbar med det naturlige bioadhesive polyfenoliske proteinet ekstrahert fra musling.

Det er nå overraskende blitt oppdaget at stereokjemien til dekapeptidoligomeren ikke er essensiell for den adhesive atferden til det bioadhesive polyfenoliske proteinet. Det er nå overraskende blitt oppdaget at en polymer bare behøver å inneholde en viss mengde 3,4-dihydroksyfenylalanin (Dopa) istedenfor hele dekapeptidsekvensen for å utvise meget god adhesivitet. Det er nå videre blitt oppdaget at molekylvekten til polymeren, den kationiske karakteren til hovedkjedepolymeren og den endelige podete kopolymeren, har avgjørende betydning.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en vannoppløselig kationisk peptid-inneholdende podet kopolymer med en molekylvekt på 30 000 til 500 000 som omfatter

en polymerisk hovedkjede inneholdende, eller som kan bli modifisert til å omfatte, frie primære eller sekundære aminfunksjonelle grupper for omsetning med en aminosyre-eller peptidpodning og

en aminosyre-eller peptidpodning, kjennetegnet ved at nevnte podning blir omsatt med fra 5 % til 100 % av nevnte primære eller sekundære aminfunksjonelle grupper av nevnte polymeriske hovedkjede, hvori aminosyre- eller peptidpodningen omfatter minst en 3,4-dihydroksyfenylalanin-(Dopa)-aminosyre

eller en forløper derav som kan bli hydroksylert til Dopa-formen, og at den polymeriske hovedkjeden har en molekylvekt på 10.000 til 250.000.

Oppfinnelsen vedrører også en vann-oppløselig kationisk peptid-inneholdende podet kopolymer med en molekylvekt på fra 30 000 til 500 000, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) en polymerisk hovedkjede av polylysin idet hver av de repeterende monomerenhetene omfatter, eller kan bli modifisert til å omfatte, frie primære eller sekundære aminfunksjonelle enheter for omsetning med en aminosyre-eller peptidpodning, idet nevnte polymeriske hovedkjede har en molekylvekt på fra omtrent 10 000 til omtrent 250 000; og (b) en aminosyre eller peptidpodning omsatt med minst 5 # av nevnte primære eller sekundære aminfunksjonelle enheter av nevnte polymeriske hovedkjede, hvori nevnte aminosyre-eller peptidpodning omfatter minst en 3,4-dihydroksyfenylalanin-(Dopa)-aminosyre eller forløper derav som kan bli hydroksylert til Dopa-formen.

Hovedhensikten med foreliggende oppfinnelse er dermed å tilveiebringe aminosyre- og/eller peptid-inneholdende podete kopolymerer som har sterk adhesiv aktivitet.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fleksibel tilnærming mot syntese av skredder-sydde aminosyre- og/eller peptid-inneholdende podete kopolymerer egnede for spesifikke anvendelser og/eller overflater .

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er å synteti-sere en podet kopolymer med en bestemt molekylvekt, dihydroksyfenylalanin-(Dopa)-innhold og adhesivitet på en reproduserbar måte.

Aminosyre og/eller peptid-inneholdende podete kopolymerer i henhold til foreliggende oppfinnelse kan varieres ved dannelsen derav for å tilveiebringe kontroll av (a) molekylvekten, kationisiteten, prosentsubstitusjonen av aminosyren eller peptidenheten podet til polymerhovedkjeden og (b) den kjemiske og fysiske strukturen til aminosyren eller selve peptid-inneholdende podete kopolymeren, som dermed muliggjør spesifikk skreddersying av polymerene i foreliggende oppfinnelse for bestemte anvendelser derav.

For en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen, refereres det til utførelsesformene illustrert i de vedlagte tegningene og beskrevet nedenfor med eksempler på oppfinnelsen. Fig. 1 er en skjematisk representasjon av fremgangsmåten anvendt for syntese av den peptid-inneholdende podete kopolymeren PAA-SA-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-OH, beskrevet i detalj i eksempel 1. Fig. 2 er en skjematisk representasjon av fremgangsmåtene anvendt ved syntese av den peptid-inneholdende podete kopolymeren H-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Eyp-Thr-Dopa-Lys-PLL beskrevet i detalj i eksempel 2.

En podet kopolymer har en hovedkjede bestående av en polymer eller kopolymer hvorpå en eller flere sidekjeder er podet. Podete kopolymerer har vanligvis egenskaper som er be-traktelig forskjellig fra de vanlige kopolymerene dannet ut i fra de samme monomerenhetene, men distribuert tilfeldig i en rett kjede. Ordinære kopolymerer har vanligvis egenskaper som ligger midt i mellom de til de to homopolymerene, mens podete kopolymerer kan ha noen egenskaper fra hver av komponentene.

Betegnelsen "peptid" skal forstås i videste forstand i foreliggende oppfinnelse. Betegnelsen omfatter en eller flere aminosyrer og naturlige og syntetiske peptider. Peptidet omfatter vanligvis minst en Dopa-gruppe eller en forløper derav som hydroksylatbar til Dopa-formen, pga. at denne gruppen er funnet nødvendig for adhesjon.

Den polymeriske hovedkjeden til den peptid-inneholdende podete kopolymeren ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis vannoppløselig slik at den dannede podete kopolymeren også vil være vannoppløselig. Polymerer, som til tross for at de ikke er vannoppløselige, kan bli gjort vann-oppløselige ved omsetting med hensiktsmessig funksjonelle grupper er også innbefattet innenfor foreliggende oppfinnelse. Oppløselighet av den podete kopolymeren i vann er vesentlig for oppløsning i en vandig oppløsning for anvendelse med vev, celler og andre biologiske aktive deler, idet anvendelse av organiske oppløsningsmidler er utelukket.

Den polymeriske hovedkjeden kan også være kationisk eller kan bli gjort kationisk, for å utvikle sterke elektrostatiske interaksjoner med de negativt ladete biologiske overflatene. Modifikasjon av den polymeriske hovedkjeden for å omfatte de nødvendige frie primære og sekundære aminogruppene vil gjøre den polymeriske hovedkjeden både vannoppløselig og kationisk. Hovedkjeden til den podete kopolymeren inneholdende de frie primære eller sekundære aminogruppene bør ha en pK på minst 8, fortrinnsvis fra 8,5 til 10.

I tillegg må den polymeriske hovedkjeden inneholde til-strekkelige primære eller sekundære frie aminfunksjonelle grupper for reaksjon med peptidpodningen for å danne en peptid-inneholdende podet kopolymer med de ønskede bioadhesive egenskaper. Igjen, innbefattet innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, er polymeriske hovedkjeder som til tross for at de ikke inneholder nevnte aminogrupper kan bli modifisert for å inneholde de nevnte gruppene. I en foretrukket utførelsesform består den polymeriske hovedkjeden av monomerrepeterende enheter som hver inneholder eller som er modifisert til å inneholde en fri primær eller sekundær aminfunksjonell gruppe. Alternativt kan hovedkjeden bære en kopolymer bestående av monomerenheter hvori hver ikke nødvendigvis inneholder en fri amingruppe. I alle tilfellene, for de monomeriske enhetene som inneholder, eller er modifisert til å inneholde, fri primære eller sekundære amingrupper, må de nødvendige frie amingruppene derimot være tilstede i en mengde på minst omtrent 1 til 25 millimol pr. gram polymer for reaksjon med peptidpodningen.

Molekylvekt er en nøkkelegenskap til disse adhesivene. Alle referansene angitt heri til molekylvekt omfatter antalls-midlere molekylvekt.

Den peptid-inneholdende podete kopolymeren må ha en tilstrekkelig høy molekylvekt for å tilveiebringe en tilstrekkelig mengde intermolekylære bindinger og binding mellom substratet og adhesivet for å adherere substratet til adhesivet. Under molekylvekt på omtrent 30 000 vil den peptid-inneholdende kodete kopolymeren ikke inneholde en tilstrekkelig helhetlig molekylvekt for å produsere et adhesiv. Over en molekylvekt på omtrent 550 000 er den peptid-inneholdende kodete kopolymeren for viskøs for å filtrere eller presipiteres ut av oppløsningen og anvendelse derav på et substrat blir vanskelig. Den polymeriske hovedkjeden bør ha en molekylvekt på fra omtrent 10 000 til omtrent 250 000, fortrinnsvis fra omtrent 30 000 til omtrent 150 000.

Egnede kommersielt tilgjengelige hovedkjedepolymerer omfatter polylysin, polyallylamin, polyetylenimin, kitosan, poly-vinylamin, kondroitinsulfat, polydekstran, hyaluronsyre, polyakrylsyre, polyakrylnitril og kopolymerer så som poly-(Lys,Tyr), poly (Lys,Ser) og lignende med den nødvendige molekylvekten.

For anvendelse innen biomedisinske anvendelser er det nødvendig at den polymeriske hovedkjeden består av monomerer inneholdende tilstrekkelig reaktive seter for binding til peptidpodningsgruppen. Egnede monomerer omfatter aminosyrer, karbonhydrater, peptider, lipider, glykolipider, akrylsyre, allylamin og lignende, samt forskjellige kombinasjoner av disse materialene.

I tillegg kan polymerhovedkjeden bli syntetisert ved anvendelse av polymerisasjonsteknikker som er velkjent for fagmannen innenfor området. Hovedkjedepolymerene må inneholde tilstrekkelig kationiske monomeriske konstituenter, eller monomeriske konstituenter som kan bli gjort kationiske, for å danne den nødvendige kationisiteten; den produserte polymeren bør fortrinnsvis ha en pK på omtrent 8. Egnede vann-opp-løselige kationiske monomerer omfatter lysin, ornitin, aminosukkerforbindelser, allylamin, vinylamin og lignende. Polymeren må også være vann-oppløselig eller måtte kunne bli gjort vannoppløselig, og de ikke-reaktive komonomerene må bli valgt slik at den resulterende polymeren er vannoppløselig. Egnede ikke-reaktive komonomerer omfatter nøytrale eller sure aminosyrer, sukkerforbindelser og hydroksysyrer og lignende.

Det er videre nødvendig for hovedkjeden/peptidkombinasjonene at aktiviteten til den bundne peptidpodningen bør bli bevart så mye som mulig og at kombinasjonen bør, i samsvar med bruken, være vannoppløselig og lett kunne bli filtersterili-sert.

Reaksjonen mellom peptidpodningen med hovedkjedepolymeren bør i ethvert tilfelle tillate dannelsen av en kovalent binding mellom en reaktiv gruppe av peptidpodningen og en reaktiv gruppe på hovedkjedepolymeren. I noen tilfeller vil dublette eller triplette peptidpodninger bli dannet som et resultat av reaksjoner som oppstår mellom frie peptidpodninger og de som allerede er immobilisert.

Peptidpodningen må inneholde minst en 3,4-dihydroksyfenylalanin-(Dopa)-aminosyre eller en forløper derav som kan bli hydroksylatbehandlet til Dopa-formen ved metoder som beskrev et i patentsøknad serienr. 856 594, inngitt 25. mai 1986. Eksempler på forløpere som kan hydroksylatbehandles til Dopa-formen omfatter tyrosin og fenylalanin. Tilstedeværelse av Dopa-grupper tilveiebringer sterk hydrogenbinding og konkurrerer dermed godt med vann og fortrenger det fra overflatene når det blir anvendt i vandige omgivelser. Dopa-gruppene tilveiebringer også metallskjellaterende og Michael-type nukleofil i ske kondensasjonsprodukter i løpet av herding av adhesivet.

Aminosyrer, så som lysin, alanin, prolin, serin, treonin, glysin, hydroksyprolin, glutaminsyre, aspartinsyre, arginin, histidin og lignende, kan i tillegg bli innbefattet i peptidpodningen i hvilke som helst ønskede proporsjoner for å tilveiebringe peptid-inneholdende podete kopolymerer med forskjellige egenskaper.

Prolin, en kjent strukturbryter, tilveiebringer en åpen konformasjon til podningen og utsetter store deler av molekylet til overflaten og dette forsterker adsorpsjon. Lysin, med en høy pH, kan ha sterke ioniske interaksjoner under fysiologiske betingelser.

Spesifikke eksempler på peptidpodningen omfatter Dopa, Dopa-Lys-Ala-Lys, Eyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys, Ala-Lys-Pro-Ser-Dopa, Dopa-Hyp-Hyp-Thr, Hyp-Thr-Dopa-Lys, Dopa-Eyp-Lys-Ser, Dopa-Lys-Ala-Lys-Eyp-Ser-Tyr, Dopa-Lys-Ala-Lys-Eyp-Ser-Tyr-Eyp-Eyp-Thr, Lys-Eyp-Ser-Dopa-Eyp-Eyp-Thr-Dopa-Lys, Dopa-Lys-Glu-Ser-Eyp, Dopa-Lys-Cys(SC>3E)-Lys, Cys(S03 )-Lys-Pro-Ser-Tyr-Eyp-Eyp-Thr-Dopa-Lys, Eyp-Eyp-Thr-Tyr-Lys, Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr, Phe-Tyr-Lys-Ser,Eyp,-Eyp-Thr-Phe-Lys og lignende.

Syntese

Den helhetlige molekylvekten til den resulterende peptid-inneholdende podete kopolymeren varierer fra 30 000 til 500 000, fortrinnsvis fra 70 000 til 350 000, og mest foretrukket er 100 000. Opprettholdelse av den nødvendige molekylvekten er selvfølgelig avhengig av molekylvekten til hovedkjedepolymeren, molekylvekten til peptidpodningen og substitusjonsgraden. Variasjoner i de foregående parametrene tilveiebringer skreddersying av polymerene for spesielle sluttproduktanvendelser.

De peptid-inneholdende podete kopolymerene må inneholde peptidenheter podet til et minimum på fra minst 5 % til omtrent 100 % av de frie primære eller sekundære aminfunksjonelle gruppene. (Enkelte ganger referert til som %-substitusjon nedenfor). Minimum ^-substitusjon av den peptid-inneholdende podete kopolymeren vil selvfølgelig variere av naturen til den polymeriske hovedkjeden. I alle tilfeller må derimot minimum ^-substitusjonen være tilstrekkelig for å tilveiebringe peptid-inneholdende podete kopolymerer med nødvendig molekylvekt, oppløselighet og kationisitetstrekk, samt ønskede bioadhesive egenskaper.

I en foretrukket utførelsesform hvor den polymeriske hovedkjeden omfatter, eller er modifisert slik at den omfatter, gjentatte monomeriske enheter som hver inneholder frie primære eller sekundære aminenheter, er det oppdaget at minst 5 % av de frie amingruppene må omsettes med peptidpodningen for å oppnå de ønskede bioadhesive egenskapene, ^-substitusjonen i denne foretrukne utførelsesformen er fortrinnsvis fra omtrent 7 % til omtrent 30 %, og mest foretrukket fra omtrent 10 % til omtrent 20 %. Eksempler på denne type av polymerisk hovedkjede omfatter polylysin og polyallylamin, hvori de repeterende monomeriske enhetene er lysin og allylamin.

Den polymeriske hovedkjeden kan alternativt være kopolymerer omfattende forskjellige monomeriske enheter, hvor hver ikke nødvendigvis omfatter frie primære eller sekundære aminenheter. For denne type hovedkjedekopolymer kan et større minimumsnivå av substitusjon være nødvendig for å oppnå de ønskede bioadhesive egenskapene. Som et ekstremt eksempel kan antallet frie primære eller sekundære amingrupper i den polymeriske hovedkjeden være tilstrekkelig lavt slik at det krever 100 % substitusjon via peptidpodningen for å tilveiebringe en peptid-inneholdende podet kopolymer med de ønskede egenskapene. Igjen må minimal prosentsubstitusjon av peptidpodningen være stor nok for å tilveiebringe en peptid-inneholdende podet kopolymer med en molekylvekt innenfor det kritiske området fra 30 000 til 500 000 og med de nødvendige oppløselighetstrekkene og de kationiske trekkene.

Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter mere enn en aminosyre kan bli preparert ved anvendelse av teknikk-er så som de beskrevet av Journal of The American Chemical Society, Vol. 85, s. 2149-2154, (1963). Syntesen omfatter trinnvis tilsetning av beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede som er bundet med kovalente bindinger til en fast bærer så som faste harpikskuler. Det generelle konseptet ifølge denne metoden avhenger av kobling av den første aminosyren i kjeden til de faste polymeriske harpikskulene med en kovalent binding og tilsetning av de etterfølgende aminosyrene en av gangen på en trinnvis måte helt til den ønskede sekvensen er oppstilt. Til slutt blir peptidet fjernet fra den faste bæreren og de beskyttende gruppene blir deretter fjernet. Denne metoden tilveiebringer en voksende peptidkjede til en fullstendig uoppløselig fast partikkel slik at den er i en hensiktsmessig form for å bli filtrert og vasket fri for reagenser og biprodukter.

Aminosyrene kan bli koblet til hvilke som helst egnede polymerkuler som er uoppløselige i de anvendte oppløsnings-midlene og som er i en stabil fysisk form som muliggjør enkel filtrering. Slike polymerkuler må inneholde en funksjonell gruppe som den første beskyttede aminosyren kan bli koblet fast til med en kovalent binding. Forskjellige polymerkuler er egnede, så som polystyren, polyakrylamid, polydekstran, kitosan og lignende.

De forskjellige funksjonelle gruppene på aminosyrene som er aktive, men som ikke inngår i reaksjonene, er beskyttet gjennom reaksjonen med konvensjonelle beskyttende grupper som anvendes innenfor polypeptidfagområdet.

a-aminogruppen til aminosyrene blir beskyttet med en tertiær butyloksykarbonylgruppe (BOC) eller fluorenylmetyoksykarbonyl (FMOC) eller et ekvivalent derav. Hydroksylfunksjonene blir beskyttet med en benzyl eller benzylderivatgruppe så som 4-metoksybenzyl, 4-metylbenzyl, 3,4-dimetylbenzyl, 4-klor-benzyl, 2,6-diklorbenzyl, 4-nitrobenzyl, benzylhydryl eller en ekvivalent derav.

Tiolfunksjonen til cystein kan bli beskyttet med benzyl eller benzylderivatbeskyttede grupper beskrevet ovenfor eller med en n-alkyltiogruppe så som metyltio, etyltio, n-propyltio, n-butyltio eller ekvivalenter derav. Guanidinofunksjonen til arginin kan bli beskyttet med en nitrogruppe, tosylgruppe eller en ekvivalent derav, e-aminofunksjonen til lysin kan bli beskyttet med en benzyloksykarbonylgruppe eller et benzyloksykarbonylderivat så som 2-klorbenzyloksykarbonyl 2-brombenzyloksykarbonyl, 3,4-dimetylbenzyloksykarbonyl eller ekvivalenter derav. De beskyttende gruppene som kan bli anvendt på imidozolnitrogenet til histidin er benzylgruppen, tosylgruppen eller benzyloksykarbonylgruppen eller benzyl-oksykarbonylderivatene som beskrevet ovenfor for lysin.

Når ønskede peptid er tilveiebrakt, blir det omsatt med den polymeriske hovedkjeden for å danne den podete kopolymeren. Det første trinnet i denne prosessen er å spalte den terminalt blokkerende gruppen til peptid. Peptidet blir deretter omsatt med et bifunksjonelt kryssbindende reagens. Egnede kryssbindende reagenser omfatter disuccinimido korksyre, disuccinimido sebasinsyre, disuccimido vinsyre, ditiobis (succinimidyl propionat) etylenglykol bis(succinimidyl succinat) og lignende. Peptidet, som inneholder en aktivert gruppe ved en terminal ende, blir deretter spaltet fra den faste bæreren ved anvendelse av spaltningsreagenser som er velkjent innenfor peptidsyntesefagområdet så som trifluoreddiksyre, metansulfonsyre, hydrogenfluorid og lignende. Dersom riktig kombinasjon av blokkerende grupper, faste bærere og spaltningsreagenser er blitt valgt, tilveiebringer dette siste trinnet en vannoppløselig, fri peptid inneholdende en aktivert gruppe tilgjengelig for omsetting med de frie primære eller sekundære amingruppene til den valgte polymeriske hovedkjeden. Dette frie peptidet kan bli omsatt med den polymeriske hovedkjeden for å danne den peptid-inneholdende podete kopolymeren ved blanding av peptidet og hovedkjeden i en hensiktsmessig bufferoppløsning, så som trietylaminborat, natriumborat og lignende.

De peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse har alene tilstrekkelig adhesivitet for visse anvendelser så som immobilisering av celler, proteiner og vevsdeler til inerte substrater så som plast og glass eller til biologiske substrater så som hudpodning eller kunstige vevsmaterialer og lignende.

Adhesivstyrken til de peptid-inneholdende podete kopolymerene kan økes ved tilsetning av et kryss-bindende middel. Det kryss-bindende midlet fremmer delvis eller fullstendig kryssbinding av de peptid-inneholdende podete kopolymerene mellom substratene og kopolymerene og mellom selve kopolymerene. Hvilken type kryss-binding som inngår er ikke klarlagt, men det antas å være kovalente bindinger. Nøyaktig vekt-# av kryssbinder som blir anvendt avhenger av molekylvekten til den peptid-inneholdende podete kopolymeren og renheten til det kryssbindende midlet.

Egnede kryss-bindende midler omfatter f.eks. enzymatisk oksyderende midler så som katekoloksydase, sopptyrosinase eller kjemiske kryss-bindende midler med et hvilket som helst antall reaktive funksjonelle grupper, idet midlene omfatter glutaraldehyd, formaldehyd, bis(sulfosuccinimidyl)-suberat og 3,3-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionat), eller til og med kjemiske oksyderingsmidler så som oksygen eller peroksyd, eller kompieksdannende midler så som jern, aluminium, mangan og lignende.

I de forskjellige anvendelsene kan det i tillegg tilsettes overflateaktive midler, fyllstoffer, fargestoffer, anti-biotika, terapeutiske midler og lignende.

Følgende eksempler er tilveiebrakt for å illustrere syntesen av de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse, anvendelsen av disse som adhesiver og adhesivstyrken til de peptid-inneholdende podete kopolymerene .

Eksempel 1

Fremstilling av PAA- SA- Lys- Pro- Ser- Tyr- Hyp- Hyp- Thr- Dopa- Lys-OH

En oppsummering av fremgangsmåten anvendt for fremstilling av peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge eksempel 1 er illustrert i fig.l.

p-benzyloksybenzylalkoholharpiks (1 g) inneholdende 1,0 milliekvivalent hydroksylgrupper blir vasket flere ganger med metylenklorid. FM0C-Lys(B0C )-0H (1 mm 0,465 g), 1 ml av IN oppløsning av dicykloheksylkarbodimid (DCCI) (1 mm) i metylenklorid og p-dimetylaminopyridin (1,0 mm 0,124 g) ble tilsatt og suspensjonen ble ristet i 6 timer. Koblingen ble gjentatt og deretter ble harpiksen behandlet med 0,5 ml benzoylklorid og 0,5 ml pyridin og ristet i 30 minutter. Harpiksen ble deretter vasket grundig med etanol, dimetylacetamid (DMAC) og metylenklorid og tørket under vakuum. FM0C-Lys(B0C)-OH-innholdet pr. gram harpiks ble bestemt til å være 0,6-0,8 mm/g ved spektrofotometrisk bestemmelse.

FMOC-Lys(BOC )-p-benzyloksybenzylesterharpiks (I) ble plassert i en reaksjonsbeholder (ACT-modell 200, automatisk peptid-synteseapparat). Alle vaskingene og reaksjonene ble utført med 15-20 ml porsjoner oppløsningsmidler. Protokollen for en brukbar syklus består av:

1. Vasking med dimetylacetamid (DMAC)

2. Deblokkering med 15 # piperidin/dimetylsulfoksyd (lx 5 min., 1x15 min.)

3. Vasking med DMAC

4. Vasking med metylenklorid

5. Kobling med fordannet 1-hydroksybenzotriazol (EOBT) ester av FMOC-aminosyrer 6. Vasking med etanol, DMAC, metylenklorid.

Benzotriazolestere ble fremstilt ved blanding av tre ekvivalenter av hver av FMOC-aminosyrene, HOBT og dicykloheksylkarbodiimid (DCCI) i metylenklorid i 20 minutter i en preaktiveringsbeholder. Kobling ble utført i 30 minutter i metylenklorid og deretter 1,5 timer i metylenklorid/dimetyl-sulfoksyd i et 2:1 forhold. Fullført kobling ble registrert ved anvendelse av Keiser-testen, som beskrevet i Keiser et al, Analytical Biochemistry Vol. 34, s. 595-598 (1970). Ni sykluser ble utført med hensiktsmessige blokkerte aminosyre-derivater (fig. 1, III). Den siste syklusen ble utført ved kobling med disuccinimido korksyre (DSS) eller disuccinimido sebasinsyre (DSA).

Reaksjonsproduktet ved fullført peptidsyntese ble overført fra reaksjonsbeholderen og behandlet med trifluoreddiksyre/katekol i 45 minutter (fig. 1, IV). Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet avdampet. Tilsetning av eter førte til utfelling av peptidsuccinimidestertrifluor-acetatsaltet.

Peptidsuccinimidesterfluoracetatsaltet ble satt til en vandig oppløsning bestående av 4 mm polyallylamin-hydroklorid og brakt til pH 8,5 ved tilsetning av trietylaminoboratbuffer (IM pH 9,5) med omfattende røring (fig. 1, V). Etter 30 minutter ble blandingen surgjort til pH 2 med fortynnet saltsyre (EC1) og dialysert i 36 timer mot 3 skift bestående av 4 liter 0,001 N HC1 i et kaldt rom ved anvendelse av en dialysepose med en molekylvekt-avkutting på omtrent 8 000-12 000. Oppløsningen ble frysetørret og dannet polyallylamin-peptidet som HCl-saltet (fig. 1, VI), som dannet en enkelt topp på HPLC og utviste riktig aminosyreanalyse. 10 % av aminogruppene på polyallylaminet ble funnet å være acylert av peptidet.

Eksempel 2

Fremstilling av H- Ala- Lys- Pro- Ser- Tyr- Hyp- Hyp- Thr- Dopa- Lys-PLL

En oppsummering av fremgangsmåten anvendt for fremstilling av den peptid-inneholdende podete kopol<y>meren i eksempel 2 er illustrert i fig. 2.

FMOC-Lys(BOC)-p-benzyloksybenzylesterharpiksen ble fremstilt som eksempel 1 og ni aminosyrekoblingssykluser ble utført ved anvendelse av samme fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 1 (fig.2, I). N-terminalt alanin ble koblet som dets BOC-derivat og Dopa ble tilsatt som FMOC-Dopa (Cl2Bzl)2"0BT.

Reaksjonsproduktet ved fullført peptidsyntese ble overført fra reaksjonsbeholderen og behandlet med trifluoreddiksyre/katekol i 45 minutter (fig. 2, VII). Harpiksen ble fjernet ved filtrering og filtratet avdampet. Tilsetting av eter felte ut dekapeptidtrifluoracetatsaltet (fig. 2, VIII). Dekapeptidtrifluoracetatsaltet ble løst opp i dioksan/vann (1:1) og behandlet med fire ekvivalenter av hver av trietyl-amin og di-t-butyldikarbonat. En negativ ninhydrintest på filterpapir indikerte at reaksjonen var fullført. Blandingen ble deretter surgjort med fortynnet saltsyre til Ph 3, avdampet, triturert med eter og det utfelte BOC-dekapeptidet ble fjernet ved filtrering. 1 mm BOC-dekapeptidet ble deretter behandlet med 1,1 mm dicykloheksylkarbodiimid og 2 mm pentafluorfenol i tetrahydrofuran. Etter omrøring i 45 minutter ble det utfelte dicykloheksylurea fjernet ved filtrering og filtratet ble avdampet. Resten ble triturert med eter, filtrert og tørket under vakuum for å tilveiebringe BOC-dekapeptid-p-fluor-fenylester (fig. 2, X).

BOC-dekapeptidpentafluorfenylesteret fremstilt på denne måten ble deretter behandlet med trifluoreddiksyre/katekol i 45 minutter. Avdamping etterfulgt av tilsetning av eter felte ut dekapeptid-pentafluorfenylestertrifluoracetatsaltet (fig. 2, XI), som ble oppsamlet på et sintret glass, filtrert, vasket med eter og tørket under vakuum i en eksikator. 1 mm dekapeptidpentafluorfenylester-trifluoracetatsalt ble tilsatt til en vandig oppløsning av 4 mm poly-L-lysin hydrobromid og brakt til pH 8,5 ved tilsetning av trietylaminoboratbuffer (IM, pH 9,5) med omfattende omrøring. Etter 30 minutter ble blandingen surgjort til pH 2 med fortynnet saltsyre og frysetørket for å tilveiebringe en delvis blokkert peptid-inneholdende podet kopolymer (fig. 2, XII).

Den delvis blokkerte peptid-inneholdende podete kopolymeren XII ble løst opp i trifluoreddiksyre og behandlet med etanditiol, tioanisoloppløsning og trifluormetansulfonsyre. Etter 20 minutter ble eter tilsatt. Det utfelte produktet ble filtrert ved anvendelse av en sintret glasstrakt og vasket med eter og etylacetat. Den peptid-inneholdende podete kopolymeren ble deretter løst opp i vann og dialysert i 36 timer mot 3 skift av 4 liter 0.001N HC1 i et kaldt rom ved anvendelse av en dialysepose med et molekylvekt-avkutt på omtrent 30 000. Oppløsningen ble deretter frysetørket og dannet poly-L-lysin-peptidpodet kopolymer som HCL-saltet, (fig. 2, XIII) som utviste en enkelt topp på HPLC og dannet ventet aminosyreanalyse. Omtrent 10 % av aminogruppene på poly-L-lysin ble funnet å være acylert av dekapeptidet.

Eksempel 3

Fremstilling av E- Dopa- PAA

1 mm t-butyloksykarbonyl (BOC)-Dopa ble behandlet med 2 mm N-hydroksysuccinimid og 1 mm dicykloheksylkarbodiimid i tetrahydrofuran. Etter omrøring i 1 time ble det utfelte dicykloheksylkarbodiimid fjernet ved filtrering og filtratet avdampet til tørrhet. Det tørkede filtratet ble deretter på ny løst opp i ETOE og satt til en vandig oppløsning av 2 mm polyallylaminhydroklorid og brakt til pE 8,5 ved tilsetning av trietylaminoboratbuffer (IM, pE 9,5). Etter omrøring i 30 minutter ble blandingen surgjort til pE 2 med fortynnet saltsyre og oppløsningsmidlene ble avdampet og resten ble behandlet med trifluoreddiksyre for å fjerne t-butyloksy-karbonylgruppen. Avdamping, etterfulgt av tilsetning av eter, utfelte Dopa-polymeren som ble filtrert ved anvendelse av en sintret glasstrakt.

Den Dopa-inneholdende podete kopolymeren ble deretter løst opp i vann og dialysert i 36 timer mot 3 skift av 4 liter 0,001N ECL i et kaldt rom ved anvendelse av en dialysepose med et molekylvekt-avkutt på omtrent 8 000-12 000.

Den Dopa-polyallylamin-podete kopolymeren, tilveiebrakt som et pulver etter lyofilisering, vist en enkelt topp ved EPLC. Omtrent 40 % av aminogruppene på polyallylaminet ble funnet å være acylert av Dopa og resulterte i en molekylvekt på 70 000.

Eksempel 18

Ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3, ble den aminosyre-inneholdende podete kopolymeren H-Dopa-PLL fremstilt. Den resulterende podete kopolymeren hadde en molekylvekt på 37 000 og 10 io av aminogruppene på polylysinet ble funnet å være acylert av Dopa.

Sammenlignende eksempler 19 til 20

Ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 3, ble følgende aminosyre-inneholdende podete kopolymerer fremstilt:

Sammenlignende eksempler 21 til 23

Følgende syntetiske polymerer ble fremstilt ved anvendelse av standardmetoder som er velkjente for fagfolk innen peptid-synteseområdet:

Teknikkene anvendt ved fremstilling av dekapeptidet i eksempel 21 er beskrevet f.eks. av Baran og Merrifield i The Peptides, Vol. 2, s. 1-284, (1980), Journal of the America Chemical Society, Vol. 95, s. 1328-33 (1973), og av Meien- hoffer et al, International Journal of Peptide Protein Research Vol. 13, s. 35-42 (1979). Lav-molekylvektpolymerene til dekapeptidene ifølge sammenlignende eksempler 22 og 23 ble tilveiebrakt ved standardmetoder for lineær polymerisa-sjon innen peptidkjemien som f.eks. beskrevet av Yamamoto i Journal of the Chemical Society, Perkin Trans Vol I., s. 613-617 (1987).

Eksempel 23

Dette eksemplet illustrerer adhesivfunksjonen til de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse med celletilkobling."

De rene bioadhesive polyfenoliske proteinet ekstrahert fra muslingen, Mytil is edulis er blitt spesifikt formulert for avgivelse til et inert substrat i enkel komponentform for immobilisering av biologisk aktive materialer (CELL-TAK® adhesiv tilgjengelig fra BioPolymers, Inc., Farmington, CT) og ble anvendt som en kontroll. CELL-TAK®-adhesivet og de peptid-inneholdende podete kopolymerene ble lagret ved omtrent 4°C i 5 % (v/v) eddiksyre.

Tre pattedyrcelletyper ble anvendt for å sammenligne tilkobling til Cell-Tak®-adhesivet i forhold til tilkobling til ubelagte vevskulturplastmaterialer i forhold til tilkobling til plastmaterialer belagt med de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse. Forankrings-avhengig babyhamster-nyreceller (BHK-21; ATCC CCL 10) ble dyrket i Eagle's Basal Medium (BME) inneholdende 10 % kalveserum og 10 ia tryptosefosfatmedium. Humane histiocytiske lymfomceller (U-937; ATCC CRL 1593) ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10 % kalveserum. Lymfocyttiske celler (P3X63-Ag8.853; ATCC CRL 1580) ble dyrket på lignende måte med unntakelse av 20 % hveteinaktivert føtalt bovinserum. Disse sistnevnte to celletypene er forankringsuavhengige og kan derfor manipuleres i suspensjonskulturer.

Alle proteinene ble belagt på vevskulturplastmateriale ved bruk av en oppløsningsbeleggingsmetode. I alle eksperimenter ble mikrolitervolumer på 10 mg/ml oppløsninger spredt utover og tørket på 35 mm diameter, 10 cm<2>plastskåler i en final-tetthet på 0,5 til 5 jjg/cm<2>. Etter lufttørking ble platene tilført en etanol (95 % v/v) og to destillerte vannskylling-er.

Tilkoblingsanalysene ble konstruert for å kvantifisere tilkoblede celler etter 20 min. Inkubasjonsperioder ved omtrent 37°C. BHK-cellene ble trypsinert fra stokkplatene, vasket i friskt medium ved sentrifugering og suspendert i friskt RPMI 1640 med 10 % kalveserum i en tetthet på 2 x IO<5>celler/ml. U-937 og P3X-cellene, som ble dyrket i suspensjon, ble vasket ved sentrifugering og resuspendert til lignende tettheter. Suspensjonene ble sådd ut på ubehandlede vevs-kulturskåler som en ytterligere kontroll og skåler behandlet med rent bioadhesivpolyfenolisk protein og podete kopolymerer ifølge foreliggende oppfinnelse. Ved 20 minutter ble de ikke-tilkoblede cellene fjernet fra skålene etter forsiktig risting og telt på et hemacytometer. Dataene ble beregnet som prosentceller tilkoblet ved subtrahering av antallet ikke-tilkoblede celler høstet fra skålene (gjennomsnittet av tre) fra det totale antallet utsådde celler, ved å dele resultatet med det totale antall utsådde celler, og multiplisering av kvotienten med 100

Betingelsene for denne analysen ble etablert slik at sub-optimal binding ville bli tilveiebrakt for Cell-Tak®-adhesiv-belagte skåler. Dette muliggjorde observasjon av om et polymerbelegg overskred kapasiteten av det rene bioadhesiv-polyf enoliske proteinet. Tabell I viser området for effektiv-itetene tilveiebrakt for forskjellige proteinpreparater. Polylysintyrosinpolymeren anvendt i dette eksempel var en 1:1 lineær tilfeldig kopolymer med en molekylvekt på 100 000. De syntetiske polymerene i sammenligningseksemplene 22 og 23, som har lavere molekylvekt enn det rene bioadhesivpoly fenoliske proteinet, demonstrerer korresponderende lavere effektiviteter som mediatorer for celletilkobling. Med økende molekylvekt økte effektiviteten av tilkoblingen. De syntetiske podete kopolymerer ifølge eksemplene 3 og 5 er nærmere i molekylvekt til det rene bioadhesivpolyfenoliske proteinet og oppnår tilkoblingseffektiviteter som er mye høyere enn de lavmolekylvekt-syntetiske polymerene. Den syntetisk podete kopolymeren ifølge eksempel 4 har høyere molekylvekt enn det rene bioadhesivpolyfenoliske proteinet og har lignende effektiv tilkobling.

I alle dosene er de syntetiske podete kopolymerene i eksemplene 3 og 5 bedre enn det rene bioadhesivpolyfenoliske proteinet.

Veksthastigheten av pattedyrcellene i nærvær av rent bio-adhesivpolyf enolisk protein og peptid-inneholdende podete kopolymerer ble analysert for å evaluere eventuelle potensi-elle negative effekter forårsaket av den peptid-inneholdende podete kopolymeren. Babyhamster-nyrecelle(BEK)-lageret ble dyrket til konfluens i BME pluss 10 % kalveserum og 10 % tryptosefosfatmedium, trypsinert og vasket flere ganger ved sentrifugering i BME. Suspensjoner (5 x IO<4>celler/ml) ble sådd ut på ubehandlede 35 mm skåler (kontroll) og skåler med Cell-Tak®-adhesiv og peptid-inneholdende podete kopolymerer (5jjg/cm<2>) i BME med 10 % kalveserum. Ved forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjonen ved 37,5° C med 5 jo CO2ble triplikate skåler fjernet. De tilkoblede cellene ble deretter trypsinert fra overflaten, vasket og telt i et hemacytometer.

Veksthastighetene til BHK-21 cellene blir ikke påvirket av alle de peptid-inneholdende podete kopolymerene som blir undersøkt, eller rent bioadhesivpolyfenolisk protein, inkludert hovedkjedepolymerene polyallylamin og poly-L-lysin, når sammenlignet med ubelagte kontroller eller rene bio-adhesivpolyf enoliske proteinkontroller. Det er viktig å bemerke at veksthastighetene ikke blir fremmet eller hemmet i nærvær av noen av disse polymerene.

Eksempel 24

Dette eksempelet illustrerer retensjon av vevsseksjoner på objektglass ved anvendelse av de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Deler av paraf in-omgitt levervev ble kuttet til 10 mm og plukket opp på glassmikroskop-objektglass belagt med Cell-Tak®-adhesiv eller peptid-inneholdende podete kopolymerer ved en tetthet på 5 jjg pr. objektglass. Tre objektglass inneholdende hver to deler ble preparert for hver variabel.

De peptid-inneholdende podete kopolymerene som "ble undersøkt var PAA-SA-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys-OH i en peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge eksempel 5, og Acetyl-Dopa-PAA. Acetyl-Dopa-PAA anvendt i dette og de følgende eksemplene hie fremstilt i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 3, med følgende unntakelse. 1 mm Acetyl-Dopa, istedenfor 1 mm t-butoksykarbonyl (BOC)-Dopa, ble opprinnelig behandlet med 2 mm N-hydroksysuccinimid og 1 mm dicykloheksylkarbodiimid i tetrahydrofuran. I tillegg, pga. at Acetyl-Dopa ble anvendt istedenfor BOC-Dopa, ble det ikke utført deblokkering med trifluoreddiksyre. Den resulterende podete kopolymeren hadde en molekylvekt på 42 000 og 10 % av de frie aminogruppene på polyallylaminet ble funnet å være acylert av Acetyl-Dopa.

I tillegg ble en lineær polyallylaminpolymer (PAA) med en molekylvekt på omtrent 30 000 og en lineær poly-L-lysin-polymer med en molekylvekt på omtrent 100 000 testet.

Etter tørking i en time på et varmt bord innstilt på 45° C, ble objektglassene avvokset ved to 5-minutters vaskinger i xylen, etterfulgt av 3 vaskinger i 95 % etanol, en vask i 70 1o etanol, og en vasking i 3 minutter med vann. Objektglassene ble deretter utsatt for følgende sekvensielle behandlinger:

PÅÅ, den i eksempel 5 peptid-inneholdende podete kopolymer og Cell-Tak®-adhesivet, virket på lignende måte gjennom alle disse behandlingene. Deler ble mistet fra Acetyl-Dopa-PAA-podet kopolymer etter behandlingene 9 og 10. Poly-L-lysin immobiliserte deler ble alle mistet ved eller før behandling 7.

Eksempel 25

Dette eksempel illustrerer den adhesive funksjonen til de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse på aluminium.

Kontrollerte mengder av peptid-inneholdende podete kopolymerer angitt i tabell II og rent bioadhesivt polyfenolisk protein ble applisert på aluminiumsfolie og bindingsstyrken ble undersøkt. 1,3 cm x 4 cm strimler ble vasket med etanol og tørket. Konstante volumer av vandige polymerer ble applisert på enden av en strimmel og en annen strimmel ble med en gang overlappet med 1,3 cm. Totalt polymer pr. bindingsareal ble variert mellom 4 og 20 jjg avgitt i 4 pl destillert vann. Bindingene ble herdet i en time. Bindingsstyrken ble deretter målt ved hefting av strimlene mellom en trykkinnretning (pressure guage) (0-500 eller 0-5000 gm-område) og en giret motor med et stempel produserte en belastning i en hastighet på 25 gm pr. sekund. Alle fremgangsmåtene ble utført ved romtemperatur. Dataene betyr gjennomsnittet av 5 analyser pr. formulering og er re-presentert som gm/cm<2>/jjg.

Rent bioadhesivt polyfenolisk protein utviser toppbindings-styrke for 6,4 og 9,6 jig ved 73 gm skjærfasthet pr. cm<2>/jjg protein. På en pr. jig polymerbasis tilnærmet eller overskred mange av de peptid-inneholdende podete kopolymerene og det lineære polyallylaminpolymeren (PAA) styrkene vist for rent bioadhesivt polyfenolisk protein.

Eksempel 26

Dette eksempelet demonstrerer anvendelsen av peptid-inne holdende podete kopolymerer ifølge oppfinnelsen i vandige miljø.

Rent bioadhesivt polyfenolisk protein og peptid-inneholdende podete kopolymerer med forskjellig molekylvekt ble testet for vann-kompatible adhesive karaktertrekk. Enzymatiske eller kjemiske inter-molekylaere kryss-bindende midler ble anvendt for å øke molekylvekten til komponentene, og dermed øke den kohesive bindingsstyrken. Hypan®-polyakrylnitril (Kingston Technologies, Inc.), en hydrogel som inneholder minst 80 i vann, ble anvendt som substratet som skulle bli bundet. Hypan®-Hypan® hydrogelbindingen ble testet for motstand ovenfor et syrebad (0,5 M HC1) som en måte for å angi de adhesive karaktertrekkene til hver polymer med eller uten tilsetning av et kryssbindende middel. Eypan®-hydrogel-strimler bundet med rent bioadhesivt polyfenolisk protein uten kryss-bindende middel vil separere i vann i løpet av to timer, men vil separere i mindre en ett minutt i syren. Rent bioadhesivt polyfenolisk protein med kryss-bindende middel vil forbli intakt i vann eller syre i minst den første uken.

Hypan®-hydrogel ble kuttet til strimler på 1 x 2 cm og bløtgjort i fosfatbuffret saltvann pH 7,0 (PBS) før anvendelse. Forskjellige konsentrasjoner av rent bioadhesivt polyfenolisk protein eller peptid-inneholdende kopolymerer ble anvendt, varierende fra 1 til 15 jig pr. cm<2>. Med rent bioadhesivt polyfenolisk protein og de høymolekylvektpeptid-inneholdende podete kopolymerene, var de lavere konsentra-sjonene tilstrekkelig for å danne en tilstrekkelig binding. Sopptyrosinase ble anvendt i et område fra 5,5 til 11 enheter pr. jjg adhesiv. Kjemiske kryss-bindende midler som binder to frie aminer på en kovalent måte ble anvendt. Bis(sulfo-succinimididyl)suberat (BS-3) og 3,3-ditiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP) ble valgt pga. deres vannoppløselig-het og funksjonalitet ved fysiologisk pH.

Adhesivet og enten kryss-binderen eller bufferen ble plassert direkte på en del av Hypan®-hydrogelen, blandet og spredt over et 1 cm^-område. En annen strimmel ble plassert rett på toppen av den behandlede strimlen. De overlappende strimlene ble inkubert i 30 sekunder før de ble plassert i 300 pl 0,5 N saltsyre i en Coors-skål. Resultatene er oppsummert i tabell

III.

Resultatene for enzymatisk kryss-binding med sopptyrosinase viste at alle polymerene som ble testet bandt Hypan®-hydrogel godt. De kryss-bundne analogene ble alle holdt sammen i syre og det samme gjorde kryss-bundet rent bioadhesivt polyfenolisk protein. Av hovedkjedene som ble undersøkt bandt polylysintyrosin og polyallylamin godt, men begge falt fra hverandre i syre i den kryss-bundne tilstand. Poly-L-lysin bandt ikke i noen av tilstandene.

Kjemiske kryss-bindere, så som BS3 og DTSSP, bandt alle analogene som ble undersøkt bortsett fra noen få unntakelser. Andel fri-aminer tilgjengelig for disse kryss-binderne relativt til antallet ladede (protonerte) aminer tilgjengelig for ionisk binding med den negativt ladede hydrogelen ser ut til å være kritisk for dette systemet og for en hvilken som helst amin-inneholdende forbindelse. Denne proporsjonen er en funksjon av pH.

Det var overraskende at høymolekylvektpolymeren ifølge eksempel 15 tilveiebrakte en syre-resistent binding uten tilsetning av kryss-binding. 375 K molekylvekt var tilstrekkelig for å tilveiebringe syre-resistent kohesiv styrke.

De syntetiske lavmolekylvektpeptidene og polymerene ifølge sammenligningseksemplene 20 til og med 22 bandt ikke i det hele tatt, hverken med eller uten tilsatt kryss-bindere.

Eksempel 27

Et øyemode11system ble anvendt for å demonstrere muligheten av å anvende de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse ved forsegling av små eller store vevsperforeringer. Epitelceller fra bovinøyner ble fjernet med en skalpell fra en 15-20 mm diameterregion av hornhinnen. En perforering ble utført ved å lage en flenge i midten av hornhinnen med en skalpell. En 18-gauge nål festet til en 10 ml sprøyte inneholdende saltvann ble injisert inn i det fremre kammeret for å bestemme om det var lekkasje gjennom perforeringen av hornhinnen. Det skrapte området ble deretter skylt med deionisert vann, og vann i overskudd ble. fjernet. Rent bioadhesivt polyfenolisk protein og peptid-inneholdende podete kopolymerer (50 jjg/cm<2>) ble deretter applisert rett perifert for perforeringsstedet. En hydrogel terapeutisk kontaktlinse (Hypan® hydrogel, Kingston Technologies, Inc.), som på forhånd var dynket i 30 minutter i fosfat-buffret saltvann (PBS), ble lagt over det skadede området og et forsiktig trykk ble ført på 1inse-hornhinne-mellomfasen for å forsikre direkte hosstilling av stykket til vevene. En vannfylt dialysepose ble påført over bindingen i 20 min. i løpet av herdingen. Styrken til bindingen ble målt ved anvendelse av et manometer koblet til nålen som tidligere var satt inn i det fremre kammeret.

Dialyseposen ble fjernet og øyet ble trykkbelastet ved omtrent 120"/min. med en sprøyte festet til manometeret, som registrerte lekkasje og trykk. Det registrerte vanntrykket var avlesningen oppnådd ved første tegn på lekkasje. Trykket ble omdannet til mm Hg ved deling med 0,535. Dataene var gjennomsnittet av minst to målinger. I tabell IV er bindinger som motstår 37 til 75 mm Hg trykk angitt med +; de som motstår 75 eller mer mm Hg blir gitt ++.

De eksperimentelle resultatene viser muligheten av anvendelse av peptid-inneholdende podete kopolymer i foreliggende system ved forsegling av stor og små vevsperforeringer. I kontrast til dette viste de polymeriske hovedkjedekomponentene alene og polymerene ifølge sammenligningseksemplene 19-23 generelt ikke bindinger som motstod minst 37 mm Hg trykk.

Eksempel 28

Dette eksemplet demonstrerer anvendelsen av peptid-inneholdende podete kopolymerer ifølge oppfinnelsen for podning av hud. Grisehud ble anvendt for å beregne binding.

Frossen, avfettet grisehud ble kuttet i to cm strimler, dekket med vått gasbind og nedfrosset for å muliggjøre fullstendig tining og hydrering. Etter omtrent to timer ble grisestrimlene dekket med etanol og tørket med gasbind.

Ådhesivformuleringen inneholder 14 pl av en ifølge eksempel 5 peptid-inneholdende podet kopolymer (5 mg/ml i vann); 4 pl 0,05 M P04buffer (pH=7) og 2 pl av en 30 mM (17,18 mg/ml) vandig oppløsning av Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3). Ådhesivf ormuleringen som ble testet ble blandet på en ren' polystyrenskål i angitt rekkefølge. 14 pl av ådhesivformuleringen ble applisert på bindingsstedet (1cm<2>) på en grisestrimmel. En annen grisestrimmel ble overlappet ved bindingsstedet og en plastskål inneholdende 295 gm vekt ble plassert derpå i en periode på 10 minutter.

Skjærfastheten til bindingen ble deretter undersøkt ved vertikal henging av det bundne vevet og ved tilsetning av vekt på bunnen helt til bindingen ble brutt.

Peptid-inneholdende podet kopolymer, ifølge eksempel 5 i foreliggende oppfinnelse, dannet en gjennomsnittlig skjære-fasthet på 93 g/cm<2>.

Eksempel 29

I dette eksemplet ble bovine hornhinner anvendt for å bekrefte at de peptid-inneholdende podete kopolymerene ifølge foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med et kryss-bindende middel og buffer vil danne en effektiv formulering for binding av hornhinnevev. Bovine hornhinner, inkludert hele epitelet og endotelet, ble fjernet fra avkjernede (en-nucleated) øyner ved skraping og kuttet i to strimler (2x1 cm<2>). Strimlene av bovine hornhinner ble deretter vasket med 100 pl fosfatbuffret saltvannsoppløsning og tørket omgående. Forreste til bakre bindinger (1 cm<2>i areal) ble testet.

På en separat ren overflate ble 8 pl av en eksempel 5 peptid-inneholdende podet kopolymer i PO4buffer vann blandet sammen med 5 pl 0,025 M PO4buffer og 1,16 pl Bis(sulfosuccinimi-dyl)suberat (BS3) ved en 15 mM konsentrasjon i vann. Det er å bemerke at stabiliteten til peptid-inneholdende podete kopolymerer er større dersom vann blir anvendt som opp-løsningsmiddel og bør bli anvendt hvis det er planer om lagring av oppløsningen i mer enn en uke. I hvert eksperiment ble 8 pl av formuleringen applisert på øyet omfattende et 0,64 cm<2>areal. En annen strimmel av bovin hornhinne ble deretter forsiktig plassert på toppen av den første, med dekking av bare det samme 0,64 cm<2>arealet.

Bindingen ble vektbelastet nedover med en liten vannpose inneholdende omtrent 15 ml vann og bindingen ble satt i 20 minutter. Skjærfastheten til bindingen ble deretter testet.

En ende av de bundne hornhinnestrimlene ble festet til en ringholder og en pose med vann ble festet mot motsatt ende. Vann ble deretter ført inn i posen med konstant hastighet på 200 ml/minutt helt til en separasjon av det bundne arealet hadde oppstått. Vekten av vannet ble deretter målt etter at det ble omdannet til en skjærfasthetsmåling. Resultatene er angitt i tabell V.

De eksperimentelle resultatene viser at overnevnte konsentrasjoner, formuleringen inneholdende den peptid-inneholdende podete kopolymeren og kryss-bindingsmidlet, produ-serer en binding som utviser en skjærfasthet på minst 66 g/cm<2>på bløtt vev. Pga. at vevet ikke er homogent er de numeriske verdiene som ble tilveiebrakt ikke reproduserbare når det gjelder nøyaktige verdier, men resultatene er forenlige med det faktum at en binding blir dannet.

Claims (10)

1. Vannoppløselig kationisk peptid-inneholdende podet kopolymer med en molekylvekt på 30 000 til 500 000 som omfatter en polymerisk hovedkjede inneholdende, eller som kan bli modifisert til å omfatte, frie primære eller sekundære aminfunksjonelle grupper for omsetning med en aminosyre-eller peptidpodning og en aminosyre- eller peptidpodning,karakterisertved at nevnte podning blir omsatt med fra 5 % til 100 % av nevnte primære eller sekundære aminfunksjonelle grupper av nevnte polymeriske hovedkjede, hvori aminosyre- eller peptidpodningen omfatter minst en 3,4-dihydroksyfenylalanin-(Dopa)-aminosyre eller en forløper derav som kan bli hydroksylert til Dopa-formen, og at den polymeriske hovedkjeden har en molekylvekt på 10.000 til 250.000.

2. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat molekylvekten av kopolymeren varierer fra 70 000 til 350 000.

3. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat den polymeriske hovedkjeden inneholdende frie primære eller sekundære aminfunksjonelle enheter har en pK på minst 8.

4 . Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte hovedkjede omfatter monomerenheter inneholdende frie primære eller sekundære aminfunksjonelle grupper, idet amingruppene er tilstede i en mengde på minst 1-25 millimol fri amingruppe/- gram polymer inneholdende nevnte amingrupper for omsetning med aminosyre eller peptidpodningen.

5. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat hovedkjeden har en molekylvekt på fra 10 000 til 250 000.

6. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte polymeriske hovedkjede blir valgt fra gruppen bestående av polylysin, polyallylamin og kopolymerer derav.

7. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte aminosyre-eller peptidpodning omfatter 3,4-dihydroksyfenylalanin (Dopa) aminosyre.

8. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte aminosyre-eller peptidpodning omfatter en forløper av 3,4-dihydroksyfenylalanin som kan bli hydroksylert til Dopa-formen.

9. Peptid-inneholdende podet kopolymer ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte aminosyre-eller peptidpodning velges fra gruppen bestående av Dopa, Dopa-Lys-Åla-Lys, Eyp-Hyp-Thr-Dopa-Lys, Eyp-Thr-Dopa-Lys, Lys-Hyp-Ser-Dopa-Eyp-Eyp-Thr-Dopa-Lys, Cys(S03)-Lys-Pro-Ser-Tyr-Eyp-Eyp-Thr-Dopa-Lys og Lys-Dopa-Thr-Eyp-Eyp-Tyr-Ser-Pro-Lys-Ala.

10. Vann-oppløselig kationisk peptid-inneholdende podet ko polymer med en molekylvekt på fra 30 000 til 500 000,karakterisert vedat den omfatter: (a) en polymerisk hovedkjede av polylysin idet hver av de repeterende monomerenhetene omfatter, eller kan bli modifisert til å omfatte, frie primære eller sekundære aminfunksjonelle enheter for omsetning med en aminosyre-eller peptidpodning, idet nevnte polymeriske hovedkjede har en molekylvekt på fra 10 000 til 250 000; og (b) en aminosyre-eller peptidpodning omsatt med minst 5 % av nevnte primære eller sekundære aminfunksjonelle enheter av nevnte polymeriske hovedkjede, hvori nevnte aminosyre— eller peptidpodning omfatter minst en 3,4-dihydroksyfenylalanin-(Dopa)-aminosyre eller forløper derav som kan bli hydroksylert til Dopa-formen.