JP2745343B2 - プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途 - Google Patents
プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途Info
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Description
プチドを必須単位として有する新規なカチオン性プロペ
ンアミド誘導体共重合物とその塩、およびそれを有効成
分とする動物細胞の接着阻害剤、血小板の凝集・粘着抑
制剤、並びにArg-Gly-Asp のトリペプチドを必須単位と
して有するカチオン性プロペンアミド誘導体架橋共重合
物とその塩、およびそれを有効成分とする動物細胞培養
基体に関するものである。
接着に関与するタンパク質であり、血小板凝集やガン転
移にも関与していると考えられている。これらの相互作
用は一連の細胞表面のレセプターにより仲介され、フィ
ブロネクチンは分子量約25万の巨大分子であるにもか
かわらず、これらのレセプターがそのArg-Gly-Asp 配列
を特異的に認識することが明らかにされ、レセプターと
の相互作用に重要なものであることが報告されている
(ネイチャー(Nature) 、第309 巻、30頁、1984年)。
以来、Arg-Gly-Asp 配列を有するオリゴあるいはポリペ
プチドを用いる研究が成されている。
鎖状及び環状のオリゴペプチドを用いて血小板凝集を阻
害する方法(高分子学会予稿集(Polymer Preprints, J
apan)、第38巻、3149頁、1989年、特開平2-174797号)
、Arg-Gly-Asp 配列を有するペプチドを細胞移動抑制
剤として用いる方法(特開平2-4716号) 、Arg-Gly-Asp
を固定化したPMMA膜を細胞接着膜として用いる方法
(高分子学会予稿集(Polymer Preprints, Japan)、第
37巻、705 頁、1988年) が報告されている。さらに、ポ
リマーにArg-Gly-Asp を必須構成単位とするペプチドと
共有結合させ動物細胞培養基体、生体複合人工臓器用基
体として用いる方法(特開平1-309682号、特開平1-3059
60号) 、Arg-Gly-Asp-Ser 配列を有するポリペプチドを
体外血液用血小板保護剤として用いる方法が開示されて
いる(特開昭64-6217 号) 、また、Arg-Gly-Asp 配列を
有するオリゴペプチドあるいはその繰り返し構造を有す
るポリペプチドを用いて、ガン転移を抑制する方法が知
られている((Int. J. Biol. Macromol.)、第11巻、23
頁、1989年、同誌、第11巻、226 頁、1989年、(Jpn. J.
Cancer Res.) 第60巻、722 頁、1989年) 。
し生体との間で示される相互作用も低分子の場合と非常
に異なっている。そこで低分子薬物、生理活性ペプチド
などを高分子に結合させることで、それらの化合物と細
胞との相互作用や生体内における挙動を抑制しようとす
る研究が盛んに行なわれている。この様な、高分子のラ
イフサイエンスへの応用は、医用高分子材料、高分子医
薬、診断用材料、バイオリアクター、バイオアフィニテ
ィー材料などへ幅広く試みられており、これらに関する
高分子材料とその用途については、竹本喜一、砂本順
三、明石満 共編“高分子と医薬”(三田出版会)、千
畑一郎編“バイオテクノロジーシリーズ固定化酵素”
(講談社、山崎誠、石井信一、岩井浩一編“アフィニテ
ィークロマトグラフィー”(講談社)に詳しく記載され
ている。
ミド誘導体はビニル基を有しており、ビニル重合により
各種カチオン性ビニル単量体と容易に共重合物を合成す
ることができ、種々の材料に供することが出来る。水不
溶性のビニル重合体にArg-Gly-Asp を必須単位とするオ
リゴペプチドを高分子反応により高分子に導入した例は
見られるが、Arg-Gly-Asp を必須単位とするオリゴペプ
チドを側鎖に有する重合可能なプロペンアミド誘導体の
水溶性カチオン性共重合物およびハイドロゲルは知られ
ておらず、これらはレセプターとの結合能の増強および
血液中での安定化等が期待できる。
Gly-Asp のトリペプチドを必須単位として有する新規な
カチオン性プロペンアミド誘導体共重合物とその塩、お
よびそれを有効成分とする動物細胞の接着阻害剤、血小
板凝集・粘着抑制剤、並びにArg-Gly-Asp のトリペプチ
ドを必須単位として有する新規なカチオン性プロペンア
ミド誘導体架橋共重合物とその塩、およびそれを有効成
分とする細胞培養基体を提供することである。
〔I〕の側鎖に、下記一般式〔II〕で表される接着性ペ
プチドを必須単位として有するプロペンアミド誘導体
と、下記一般式〔III 〕で表わされるカチオン性単量体
の共重合物又はその塩を提供するものである。
し、R3 は水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原
子又はカルボキシメチル基を表す。
r,Gly,Val,Asn,Proから選択されるア
ミノ酸残基又はペプチド残基を表し、Zは−O−又は−
NH−を示す。R4、R5は炭素数が1〜11の直鎖又
は分岐のアルキレン基、又は炭素数が6〜11のアリー
レン基を表し、置換基を有していてもよい。nは1〜5
の整数を表す。
シル基、アミノ基、ヒドロキシル基、スルホ基、ハロゲ
ン原子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、不飽和基の
2重結合、3重結合等があげられ、同一鎖に2つ以上有
していてもよい。
〜3のアルキル基で置換基を有していてもよい。置換基
としては、カルボニル基、アミノ基、ヒドロキシル基、
ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基等があげられ、同一
鎖に2つ以上有していてもよい。
原子又は炭素数が1〜12の直鎖又は分岐のアルキル
基、又は炭素数が6〜12のアリール基であり、置換基
として少なくともアミノ基、イミノ基、ニトリロ基、ア
ミジノ基、4級アンモニウム、アンモニウムのいずれか
一つを含み、さらに置換基を有していてもよい。置換基
としては、4級アンモニウム、カルボニル基、アミノ
基、イミノ基、ニトリロ基、アミジノ基、ヒドロキシル
基、ハロゲン原子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、
不飽和基の2重結合、3重結合等があげられ、同一鎖に
2つ以上有していてもよい。又、アミド結合、エステル
結合、エーテル結合、尿素結合、カルバミン酸エステル
結合、炭酸エステル結合等を、同一鎖に2つ以上有して
いてもよく、さらにピリジン、イミダゾールの様なヘテ
ロ環を有していてもよい。
〔IV〕において[]は[]内の基が存在するかあるい
は存在しなくてもよいことを示す。
アミド誘導体共重合物およびその塩を有効成分とする動
物細胞の接着阻害剤および血小板凝集・粘着抑制剤を提
供するものである。共重合物中のプロペンアミド誘導体
由来の構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜90モル
%、さらに好ましくは0.5 〜60モル%である。
およびその塩の分子量は好ましくは30万以下、特に3
000−20万の範囲で、室温で水溶性であることが好
ましい。
列を必須単位として共有結合してなるプロペンアミド誘
導体のカチオン性架橋共重合物及びその塩を提供するも
のである。架橋共重合物は水溶液中でハイドロゲル状で
あることが好ましい。架橋共重合物を合成する場合、プ
ロペンアミド誘導体、カチオン性単量体に加え多官能性
単量体を添加する。多官能性単量体としては、トリエチ
レングリコールジメタクリレート、メチレンビスアクリ
ルアミド等のジメタクリレート、ジアクリレート、ジメ
タクリルアミド、ジアクリルアミドやジビニルベンゼン
等の芳香環を有する多官能性単量体、さらに細胞接着剤
フラグメントを有する多官能性単量体等を用いることが
できる。架橋共重合物中、プロペンアミド誘導体由来の
構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜90モル%、さら
に好ましくは0.5 〜60モル%であり、また多官能性単量
体由来の構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜30モル
%、さらに好ましくは0.5 〜20モル%である。本発明は
さらに、この架橋共重合物又はその塩を有効成分とする
動物細胞の培養基体を提供するものである。
るアミノ酸はL体、D体どちらでもよいが、好ましくは
L体である。
量体は通常の重合可能なビニル単量体であればよく、特
に限定されない。
ルメタクリルアミド、スルホトリメチルアンモニオエチ
ルメタクリレート、クロロトリメチルアンモニオエチル
メタクリレート、スルホエチルジメチルアンモニオエチ
ルメタクリレート、クロロエチルジメチルアンモニオエ
チルメタクリレート、ジアリルジメチルアンモニウムク
ロリド、ジアリルジエチルアンモニウムクロリド、クロ
ロトリメチルアンモニオプロピルアクリルアミド、クロ
ロエチルジメチルアンモニオプロピルアクリルアミド、
トリメチルアンモニオエチルアクリルアミド、スルホト
リメチルアンモニオエチルアクリレート、クロロトリメ
チルアンモニオエチルアクリレート、スルホエチルジメ
チルアンモニオエチルアクリレート、クロロエチルジメ
チルアンモニオエチルアクリレート、クロロトリメチル
アンモニオプロピルアクリルアミド、クロロエチルジメ
チルアンモニオプロピルアクリルアミド等の4級アンモ
ニウム基を有するビニルモノマー類が挙げられる。
ゾール類等の複素環を側鎖に有するビニルモノマーが挙
げられ、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチ
ルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピ
ルメタクリレート、ジエチルアミノプロピルメタクリレ
ート、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、ジメチ
ルアミノエチルアクリルアミド等のアミノ基を有するビ
ニルモノマーも使用することができる。
エチルメタクリルアミド、クロロトリメチルアンモニオ
プロピルメタクリルアミド、クロロトリメチルアンモニ
オエチルメタクリレート、クロロトリメチルアンモニオ
プロピルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタク
リルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミ
ド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルア
ミノプロピルメタクリレート等のメタクリル酸誘導体お
よび同様の側鎖を有するアクリル酸誘導体である。
共重合物の塩として例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、
リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリ
フルオロ酢酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、乳
酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩が挙げられ、そのよう
な塩への変換は慣用手段で行なうことができる。
はなく、液相法、固相法、および自動合成装置による合
成方法が挙げられる。これらの合成方法の詳細について
は、生化学実験講座“タンパク質の化学IV”p207−
495(日本生化学会編、東京化学同人)、“続生化学
実験講座タンパク質の化学(下)”(日本生化学会編、
東京化学同人)、泉屋ら編“ペプチド合成の基礎と実
験”(丸善)に記載されている。また、市販されている
合成ペプチドを利用することも可能である。
ン酸および細胞接着性ペプチドの結合方法としては、活
性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、酸塩化物
法、対称酸無水物法、DCC法、DCC−アディティブ
法、カルボニルジイミダゾール法等を利用したアミド結
合合成方法が挙げられる。プロペンアミド誘導体とカチ
オン性単量体の共重合物および架橋共重合物は一般のラ
ジカル重合法、イオン重合法により得られる。水溶性重
合物はゲルろ過法、透析法等により特定の分子量分画を
行なうことが出来る。架橋共重合物は多官能性単量体の
組成を変えることで含水率、ゲル強度等の物性が異なる
ハイバロゲルとして得ることができる。
共重合物およびその塩は、細胞接着性蛋白質のコア配列
Arg-Gly-Asp を有し、該コア配列を介して細胞接着性蛋
白質と同様の機序で細胞に接着する。そのため、細胞接
着性蛋白のアゴニスト又はアンタゴニストとして種々の
生物活性を示し、免疫調整作用、創傷治癒作用、毛細血
管中で起こる癌細胞による血小板凝集抑制作用、神経疾
患治癒作用などの広範な生物活性が認められている。
ド誘導体共重合物およびその塩は、その少なくとも一種
を、場合により慣用の担体又は医薬用助剤とともに、癌
転移抑制剤、創傷治癒剤、免疫調整剤、血小板凝集粘着
抑制剤として患者に投与することが可能である。特に、
動物細胞接着阻害剤又は血小板凝集粘着抑制剤としての
使用が好ましい。その投与量は、0.2μg/kg〜400
mg/kgの範囲で、症状、年齢、体重等に基づいて決定さ
れる。
共重合物およびその塩は、ペプチド系医薬に一般に使用
されている投与方法、即ち非経口投与方法、例えば静脈
内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが
好ましい。そのような注射用製剤を製造する場合、本発
明のカチオン性プロペンアミド誘導体共重合物およびそ
の塩を例えば、後記実施例で示すようにPBS又は生理
食塩水に溶解して、注射用製剤としてもよく、あるいは
0.1N程度の酢酸水等に溶解した後、凍結乾燥製剤とし
てもよい。この様な製剤には、グリシンやアルブミン等
の慣用の安定剤を添加してもよい。さらに、本発明のカ
チオン性プロペンアミド誘導体共重合物およびその塩
は、例えばリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤
あるいはミクロスフェア状、ハイドロゲル状とすれば、
経口投与することも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻ス
プレー剤等の形にすれば、消化管以外の粘膜からも吸収
させることが可能である。
用方法については、通常の方法で行なわれ特に限定され
ない。例えば、接着性ペプチドを共有結合処理したビー
ズ培養液中に浮遊させて低速度で撹拌を行なうことで動
物細胞をマイクロキャリアー表面に接着させ培養する方
法、接着性ペプチドを共有結合処理したシャーレ・ロー
ラーびん等の上で動物細胞を培養する方法、接着性ペプ
チドを共有結合処理した中空糸に培養液を還流させ動物
細胞を中空糸内面に接着させ培養する方法、接着性ペプ
チドを共有結合処理したマイクロキャリアーを充填した
カラムを用いる方法等が挙げられる。
培養に使用することができ、細胞の種類は特に限定され
ず、生体由来細胞、ハイブリドーマ等が挙げられる。
発明はこれに限定されるものではない。
ン反応により合成した。即ち、β−アラニン17.8g
(0.2mol)の水酸化ナトリウム水溶液にメタクリル酸ク
ロリド20.9g(0.2mol)を氷冷下滴下し、4時間撹拌
後、塩酸により中和した。減圧濃縮し、沈澱した塩化ナ
トリウムをろ別した。濃縮液をクロロホルムで抽出し、
乾燥後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。濃縮物を
エーテルで洗浄し製造物1を白色固体として17.6g得
た。(収率56%) 製造物1 CH2=CCH3−CO−NH−C2H4−COOH
リル酸クロリド、エタクリル酸クロリドと4−アミノ酪
酸、5−アミノ吉草酸、6−アミノカプロン酸、12−
アミノラウリン酸、ロイシン、グルタミン、p−アミノ
安息香酸との反応により以下のプロペン酸誘導体を製造
した。 製造物2 CH2=CH−CO−NH−(CH2)3−COOH 収率52% 製造物3 CH2=CC2H5 −CO−NH−(CH2)4−COOH 収率61% 製造物4 CH2=CCH3−CO−NH−(CH2)5−COOH 収率69% 製造物5 CH2=CH−CO−NH−(CH2)11 −COOH 収率71% 製造物6 CH2=CH−CO−NH−CH(CH2CH(CH3)2) −COOH 収率64% 製造物7 CH2=CCH3−CO−NH−CH(C2H4CONH2) −COOH 収率59% 製造物8 CH2=CH−CO−NH−p −C6H4−COOH 収率68%
応により合成した。即ち、エチレンジアミン120g
(2mol)を溶かしたクロロホルム溶液(400ml)へ、
メタクリル酸クロリド20.9g(0.2mol)を氷冷下滴下
し4時間撹拌後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。
濃縮物に5%炭酸水素ナトリウム水溶液50mlを加えク
ロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上で乾燥の後濃
縮し、クロロホルム/メタノール=7/3を溶離液とし
たアルミナカラムクロマトグラフィーにより精製した。
(製造物9) 収量14.8g(57.8%、0.116mol)
ロホルム100mlに溶かし、メタクリル酸クロリド24
g(0.23mol)を氷冷下滴下し4時間撹拌後クロロホル
ムを留去した。これに、0.23mol の水酸化ナトリウム
のメタノール溶液を加えて撹拌し、生じた沈澱物をろ別
した。ろ液を集め、ヨウ化メチル42.6g(0.3mol)の
10mlメタノール溶液を加え室温で2時間反応させた。
溶液を減圧濃縮した後希塩酸中でクロロ型としてから、
水−メタノール系で再結晶し、クロロトリメチルアンモ
ニオエチルメタクリルアミド31.3g(66%)を得
た。 (製造物10)
をPと示す。また保護基、試薬の略号は以下の様であ
る。
溶かし、DCC20.6g(0.1mol)、HOBt15g(0.1
1mol)を氷冷下添加した後、製造例9のアミノエチルメ
タクリルアミド12.8g(0.1mol)を加え5℃で終夜撹
拌した。DCureaをろ別してから減圧濃縮してDMFを除
いた。これを酢酸エチル溶液とした後、NaHCO3水溶液、
1Mクエン酸、水で洗浄しNa2SO4上で乾燥し減圧乾固し
た。生成物は1Mトリフルオロメタンスルホン酸−チオ
アニソール−m−クレゾールのTFA溶液中で氷冷下1
時間反応させた後、エーテル中に投入し、生じたオイル
状の沈澱物を蒸留水に溶解し、酢酸エチルで洗浄後、陰
イオン交換樹脂カラム(アンバーライトIRA−40
0;CI型)に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固
体14.3g(収率40%)が得られた。
ルメタクリルアミド(製造物10)をラジカル重合によ
り重合した。
リルアミド2gを20mlのDMFに溶解し、和光純薬製
のラジカル開始剤V65(2,2−アゾビス(2,4−ジ
メチルバレロニトリル))10mgを加え窒素気流下65
℃で4時間重合した。重合物は酢酸エチルで沈澱させた
後、スペクトラポア7(分子分画量3000)を用い純
水に対して透析し、低分子量画分を除いた後、凍結乾燥
した。収量1.08g(製造物12)
カラムを用い、移動相は0.2Mリン酸緩衝液(pH7.4)
とし、流速1.0ml/min で測定した。PEG換算分子量
は約28000であった。
ルメタクリルアミドをラジカル重合により重合しハイド
ロゲルを作成した。
cm)2枚とガスケットを用意した。カルボキシエチルメ
タクリルアミド2gとメチレンビスアクリルアミド10
0mg(5wt%)を蒸留水12mlに溶解し1N NaOH でpH
7.4に合わせた。これに過硫酸アンモニウム10mgを加
え充分窒素置換をした後、ガラス板の間に注入した。万
力でガラス板を押え、60℃で20時間重合させた。生
成したハイドロゲルを蒸留水で洗浄し未反応単量体を除
いた。(紫外線ランプにより滅菌処理した後細胞培養実
験に供した)(製造物13)
行なった。α−アミノ酸の保護には、Bco基を用いArg-
Gly-Asp を必須単位として含むオリゴペプチドを合成
し、その末端に製造例1−8に示したプロペン酸誘導体
およびアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸を縮合
させた。トリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂か
らの切断及び側鎖保護基の除去を行ない、分取用HPL
C(高速液体クロマトグラフィー)で精製し、単一ピー
クを示すプロペンアミド誘導体を得た。これを、陰イオ
ン交換樹脂カラム(アンバーライトIRA−400;C
l型)を通し塩酸塩とした。
成した。 (1) BocSer(Bzl)OBzl の合成 BocSer(Bzl) 60g(0.2mol)を400mlの酢酸エチル
に加え、さらにトリエチルアミン21g(0.2mol)、臭
化ベンジル35.4g(0.2mol)を加えて還流下4時間反
応させた。冷却後、塩をろ別し、NaHCO3水溶液、NaCl水
溶液で洗浄した。これをNa2SO4で乾燥した後減圧乾固
し、白色粉末54g(収率68%)を得た。
=1/1 200mlを加え室温で1時間撹拌した後、T
FAとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解
しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗浄した。Na
2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
(78mmol)をCH2Cl2500mlに溶解し終夜撹拌した。
減圧下CH2Cl2を留去してから酢酸エチルに溶解した。Na
HCO3水溶液、1Mクエン酸水溶液、NaCl水溶液の順に洗
浄し、Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を4
1g(収率89%)得た。
A:CH2Cl2=1:1200mlを加え室温で1時間撹拌し
た後、TFAとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エチ
ルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗浄
した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去し
た。
をCH2Cl2に溶解し、DCC12.2g(59mmol)を氷冷
下加え3時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌し
た。DCureaをろ別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解
した。NaHCO3水溶液、1Mクエン酸水溶液、NaCl水溶液
の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色
粉末を30.5g(収率75%)得た。
FA:CH2Cl2=1:1200mlを加え室温で1時間撹拌
した後、TFAとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エ
チルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗
浄した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去し
た。
mmol)をDMF400mlに溶解し、DCC8.0g(39
mmol)、 HOBt 6.8g(45mmol)を氷冷下加え3時間
撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。DCureaをろ
別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。NaHCO3水
溶液、1Mクエン酸水溶液、NaCl水溶液の順に洗浄し、
Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を19.5g
(収率50%)得た。
mol)にTFA:CH2Cl2=1:1を100ml加えて室温
で1時間撹拌した後、TFAとCH2Cl2を減圧濃縮した。
これを酢酸エチルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後、
NaCl水溶液で洗浄した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチ
ルを減圧留去した。
アミド2.4g(15mmol)をCH2Cl2200mlに溶解しD
CC3.1g(15mmol)を氷冷下加え3時間撹拌してか
ら、さらに室温で終夜撹拌した。減圧濃縮してからアセ
トンを加え、生じたDCureaをろ別した。減圧濃縮後、酢
酸エチルに続いてエーテルで洗浄し、減圧乾燥して白色
粉末を10.0g(収率65%)得た。
液に、1M−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニ
ソール−m−クレゾールのTFA溶液を氷冷下加えて1
時間反応させ、ペプチド側鎖および末端の保護基の脱保
護を行なった。反応液をエーテル中に投入しオイル状の
沈澱物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで洗浄した後、陰イ
オン交換樹脂カラム(アンバーライトIRA−400;
Cl型)に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固体4.
8g(収率80%)が得られた。
長した。以下にその概略を示す。
2mol)、臭化p−ニトロベンジル43.2g(0.2mol)を
酢酸エチル400mlに加えて5時間還流した後、室温で
1晩放置した。沈澱物をろ別しろ液をNaHCO3水溶液で洗
浄した後、水洗し、Na2SO4で乾燥、ろ液を減圧濃縮し酢
酸エチル−ヘキサンより再結晶させた。52.7g(収率
85%)。
を延長した。以下に、その概略を示す。 (2) BocAsp(OBzl)GlyONbの合成 (1) の生成物 :46.5g(0.15mol) TFA/CH2Cl2 :200ml/200ml BocAsp(OBzl) :48.5g(0.15mol) CH2Cl2 :750ml DCC :30.9g(0.15mol) (2) の収量 64.0g(収率80%)
mlに溶かし、Zn 末32.7g(0.5mol)を加え、0℃で
3時間撹拌した。Zn 末をろ別し、ろ液を減圧濃縮、こ
れにクエン酸を加えて酸性にし酢酸エチルで抽出した。
Na2SO4で乾燥し減圧濃縮してからエーテルを加えて白色
粉末6.26g(収率79%)を得た。
−m−クレゾールのT FA溶液 :250ml
O−CCH3=CH2 (配列番号10)
を行なった後、以下の合成により合成物18を得た。 (1) BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Gly-NH-C2H4-NH-CO-CCH3=
CH2 BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Gly :5.19g(6.7mmol) アミノエチルメタクリルアミド:0.86g(6.7mmol) DMF :60ml DCC :1.4g(6.7mmol) HOBt :0.95g(7mmol) (1) の収量4.7g(収率80%) マススペクトル M+ : 885
l) DMF :50ml DCC :1.03g(5mmo
l) HOBt :0.68g(5mmo
l) 1Mトリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−
m−クレゾールのTF A溶液 :250ml アンバーライトIRA−400 :CI型処理 合成物18 2.41g(収率70%) アミノ酸分析(nmol/50μl)
た。 合成物15 500mg(0.82mmol)と製造例10の単
量体677mg(3.3mmol)を水10mlに溶解し1N NaO
H でpH7.4に調整した後開始剤として、過硫酸カリウム
6.0mgと亜硫酸水素ナトリウム2.4mgを加え窒素気流下
20℃で20時間重合した。
を用いて純水に対して透析し低分子量分を除いた後凍結
乾燥させた。収量243mg(合成物19)
めたところ合成物15が18%導入されていることがわ
かった。 元素分析N値: 15.46%
り分子量分画を行なった。分子量は、製造例12と同様
の方法で測定した。 画分1 分子量約50000 (合成物19−1) 画分2 分子量約23000 (合成物19−2) 画分3 分子量約11000 (合成物19−3)
と同様の方法で開始剤量を変えて行なった。
なった。
7と各種カチオン性単量体との共重合を行なった。
ラジカル重合法により合成した。シラン処理したガラス
板(5cm×6cm×1cm)2枚とガスケットを用意した。
合成物15 0.23g(0.4mmol)と合成物18 0.2
8g(0.4mmol)と製造物10 1.49g(7.2mmol)
を蒸留水に溶解し、10wt%のモノマー溶液とした。1
N NaOH でpH7.4に合わせてから、過硫酸アンモニウム
11mgを加え充分窒素置換をした後、ガラス板の間に注
入した。万力でガラス板を押え、60℃で40時間重合
させた。生成したハイドロゲルを蒸留水で洗浄し未反応
モノマーを除いた。合成物39中の合成物15・合成物
18の単量体比は約12%であった。(元素分析N値
15.68%)生成したゲルは紫外線ランプにより滅菌処
理した後、細胞培養実験に供した。
のフィブロンネクチンやビトロネクチンに対する接着を
阻害する。その活性の測定方法を以下に示す。本実験例
で用いられた競争法は基本的に生化学分野では広く用い
られているものであり、例えば“Methods in Enzymolog
y"、82、803−831(1981)、特開平1−3
09682号、同2−174797号に開示されてい
る。
トの作製市販のフィブロネクチン(ヒト由来:生化学工
業(株)より購入)あるいはビトロネクチン(ヒト由来
フナコシ薬品(株)より購入)をPBSで各々1.0μ
l/ml、2.0μl/mlに希釈しその希釈液0.5mlを24
穴のプラスチックプレートに入れ37℃で一晩保温しコ
ーティングした。次に非特異的吸着を防ぐ目的で牛血清
アルブミン(BSA1%)を加え37℃で1時間保温
し、その後通常の洗浄操作(PBS)を加え充分に水切
りしてフィブロネクチン吸着プレートを作製した。同様
の操作によりビトロネクチン吸着プレートを作製した。
塩をDulbecco's Modified Eagles Medium(以下DMEM
と略記する)に溶解し、0、0.25、0.5、1.0、1.5
mg/mlの各濃縮の溶液とした。この溶液0.25mlを上記
方法で作製したプレートに入れ、そこへ血管内皮細胞
(4×106 cells /ml)の懸濁液を0.25ml加え、3
7℃で1時間保温し細胞を接着させた。DMEM培地で
3回洗浄し、未接着の細胞を剥離し、2%トリパンブル
ーで染色して細胞数を計測した。結果を表1及び表2に
示す。
物の塩のin vitro系での血小板凝集阻害作用をヒト多血
小板血漿を用いて検討した。以下にその実験方法を示
す。
を加え遠心分離(1000rpm 、10分)し、上層を多
血小板血漿として分取した。凍結乾燥より得たプロペン
アミド誘導体の共重合物の塩を0−1.5mg/mlの種々の
濃度となる様に生理食塩水に溶解した。この塩溶液25
μlを血漿200μlに加え、37℃で3分間インキュ
ベートしたのち、50μMアデノンシ二リン酸(AD
P)溶液あるいは200μg/mlのコラーゲン溶液を2
5μl加え凝集の様子をアグリゴメーターを用いて透過
度を測定することにより検定した。結果を表3に示す。
の透過度 T =プロペンアミド誘導体の共重合物の塩、添加時の
透過度
いて細胞培養を行なった。細胞は血管内皮細胞を用い、
培養液はDMEMおよび10%ウシ胎児血清(FCS)
を含むDMEMを用いた。この培養液に細胞を1×10
4 個/mlの割合となるように浮遊させ、予め架橋共重合
物を入れておいたプラスチックシャーレの中に、1×1
04 個/cm2 となる割合で加えた。これを37℃、5%
の炭酸ガス雰囲気下にて培養した。培養後、位相差顕微
鏡にて接着性および増殖性の観察を行った。結果を表4
に示した。
いDMEM培地において細胞接着性および増殖性は、実
施例の合成物39の基体に比べ劣っていた。
いる 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1 5
Claims (8)
- 【請求項1】 下記一般式〔I〕の側鎖に、下記一般式
〔II〕又は〔III〕で表される接着性ペプチドを必
須単位として有するプロペンアミド誘導体と、下記一般
式〔IV〕で表されるカチオン性単量体との共重合物又
はその塩。 一般式〔I〕 R1R2C=CR3−CO−[NH]− 式中、R1、R2は水素原子又はカルボキシル基を表
し、R3は水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原
子又はカルボキシメチル基を表す。 一般式〔II〕 −(R 4 )−[CO]−([X]−Arg−Gly−Asp−[Y])n− [Z]−H 一般式〔III〕 H−[CO]−([X]−Arg−Gly−Asp−[Y])n−[Z]− (R 5 )− 一般式〔II]、〔III〕において 、X、YはSe
r,Gly,Val,Asn,Proから選択されるア
ミノ酸残基又はペプチド残基を表し、Zは−O−又は−
NH−を示す。R4、R5は炭素数が1〜11の直鎖又
は分岐のアルキレン基、又は炭素数が6〜11のアリー
レン基を表し、置換基を有していてもよい。nは1〜5
の整数を表す。 一般式〔IV〕 H2C=CR6−[CO]−[W]−R7 一般式〔IV〕において 、R6は水素原子又は炭素数1
〜3のアルキル基で置換基を有していてもよい。Wは−
O−又は−NH−を示す。R7は水素原子又は炭素数が
1〜12の直鎖又は分岐のアルキル基、又は炭素数が6
〜11のアリール基であり、置換基として少なくともア
ミノ基、イミノ基、ニトリロ基、アミジノ基、アンモニ
ウム、4級アンモニウムのいずれか一つを含み、さらに
置換基を有していてもよい。一般式〔I〕、〔II〕、
〔III〕、〔IV〕において[]は[]内の基が存在
するかあるいは存在しなくてもよいことを示す。 - 【請求項2】 分子量が約3,000 〜200,000 の範囲であ
る、請求項1記載のプロペンアミド誘導体共重合物又は
その塩。 - 【請求項3】 プロペンアミド誘導体由来の構成単位の
含有量が0.1 〜90モル%である、請求項1記載のプロペ
ンアミド誘導体共重合物又はその塩。 - 【請求項4】 請求項1記載のプロペンアミド誘導体と
カチオン性単量体との架橋共重合物又はその塩。 - 【請求項5】 プロペンアミド誘導体由来の構成単位及
び多官能性単量体由来の構成単位の含有量が、それぞれ
0.1 〜90モル%及び0.1 〜30モル%である請求項4記載
の架橋共重合物又はその塩。 - 【請求項6】 請求項1、2又は3記載のプロペンアミ
ド誘導体共重合物又はその塩を有効成分とする動物細胞
の接着阻害剤。 - 【請求項7】 請求項1、2又は3記載のプロペンアミ
ド誘導体共重合物又はその塩を有効成分とする血小板凝
集・粘着抑制剤。 - 【請求項8】 請求項4又は5記載のプロペンアミド誘
導体とカチオン性単量体との架橋共重合物又はその塩を
有効成分とする動物細胞培養基体。
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-
1991
- 1991-03-29 JP JP3066160A patent/JP2745343B2/ja not_active Expired - Fee Related
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第11回日本バイオマテリアル学会大会予稿集1989第82頁 |
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