JP2745343B2 - プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途 - Google Patents
プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Arg-Gly-Asp のトリペ
プチドを必須単位として有する新規なカチオン性プロペ
ンアミド誘導体共重合物とその塩、およびそれを有効成
分とする動物細胞の接着阻害剤、血小板の凝集・粘着抑
制剤、並びにArg-Gly-Asp のトリペプチドを必須単位と
して有するカチオン性プロペンアミド誘導体架橋共重合
物とその塩、およびそれを有効成分とする動物細胞培養
基体に関するものである。
プチドを必須単位として有する新規なカチオン性プロペ
ンアミド誘導体共重合物とその塩、およびそれを有効成
分とする動物細胞の接着阻害剤、血小板の凝集・粘着抑
制剤、並びにArg-Gly-Asp のトリペプチドを必須単位と
して有するカチオン性プロペンアミド誘導体架橋共重合
物とその塩、およびそれを有効成分とする動物細胞培養
基体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】フィブロネクチンは細胞−細胞外基質の
接着に関与するタンパク質であり、血小板凝集やガン転
移にも関与していると考えられている。これらの相互作
用は一連の細胞表面のレセプターにより仲介され、フィ
ブロネクチンは分子量約２５万の巨大分子であるにもか
かわらず、これらのレセプターがそのArg-Gly-Asp 配列
を特異的に認識することが明らかにされ、レセプターと
の相互作用に重要なものであることが報告されている
（ネイチャー（Nature) 、第309 巻、30頁、1984年）。
以来、Arg-Gly-Asp 配列を有するオリゴあるいはポリペ
プチドを用いる研究が成されている。
接着に関与するタンパク質であり、血小板凝集やガン転
移にも関与していると考えられている。これらの相互作
用は一連の細胞表面のレセプターにより仲介され、フィ
ブロネクチンは分子量約２５万の巨大分子であるにもか
かわらず、これらのレセプターがそのArg-Gly-Asp 配列
を特異的に認識することが明らかにされ、レセプターと
の相互作用に重要なものであることが報告されている
（ネイチャー（Nature) 、第309 巻、30頁、1984年）。
以来、Arg-Gly-Asp 配列を有するオリゴあるいはポリペ
プチドを用いる研究が成されている。
【０００３】例えば、Arg-Gly-Asp 配列を有する種々の
鎖状及び環状のオリゴペプチドを用いて血小板凝集を阻
害する方法（高分子学会予稿集（Polymer Preprints, J
apan）、第38巻、3149頁、1989年、特開平2-174797号)
、Arg-Gly-Asp 配列を有するペプチドを細胞移動抑制
剤として用いる方法（特開平2-4716号) 、Arg-Gly-Asp
を固定化したＰＭＭＡ膜を細胞接着膜として用いる方法
（高分子学会予稿集（Polymer Preprints, Japan）、第
37巻、705 頁、1988年) が報告されている。さらに、ポ
リマーにArg-Gly-Asp を必須構成単位とするペプチドと
共有結合させ動物細胞培養基体、生体複合人工臓器用基
体として用いる方法（特開平1-309682号、特開平1-3059
60号) 、Arg-Gly-Asp-Ser 配列を有するポリペプチドを
体外血液用血小板保護剤として用いる方法が開示されて
いる（特開昭64-6217 号) 、また、Arg-Gly-Asp 配列を
有するオリゴペプチドあるいはその繰り返し構造を有す
るポリペプチドを用いて、ガン転移を抑制する方法が知
られている((Int. J. Biol. Macromol.)、第11巻、23
頁、1989年、同誌、第11巻、226 頁、1989年、(Jpn. J.
Cancer Res.) 第60巻、722 頁、1989年) 。
鎖状及び環状のオリゴペプチドを用いて血小板凝集を阻
害する方法（高分子学会予稿集（Polymer Preprints, J
apan）、第38巻、3149頁、1989年、特開平2-174797号)
、Arg-Gly-Asp 配列を有するペプチドを細胞移動抑制
剤として用いる方法（特開平2-4716号) 、Arg-Gly-Asp
を固定化したＰＭＭＡ膜を細胞接着膜として用いる方法
（高分子学会予稿集（Polymer Preprints, Japan）、第
37巻、705 頁、1988年) が報告されている。さらに、ポ
リマーにArg-Gly-Asp を必須構成単位とするペプチドと
共有結合させ動物細胞培養基体、生体複合人工臓器用基
体として用いる方法（特開平1-309682号、特開平1-3059
60号) 、Arg-Gly-Asp-Ser 配列を有するポリペプチドを
体外血液用血小板保護剤として用いる方法が開示されて
いる（特開昭64-6217 号) 、また、Arg-Gly-Asp 配列を
有するオリゴペプチドあるいはその繰り返し構造を有す
るポリペプチドを用いて、ガン転移を抑制する方法が知
られている((Int. J. Biol. Macromol.)、第11巻、23
頁、1989年、同誌、第11巻、226 頁、1989年、(Jpn. J.
Cancer Res.) 第60巻、722 頁、1989年) 。
【０００４】一般に高分子物質は多様な性状、機能を有
し生体との間で示される相互作用も低分子の場合と非常
に異なっている。そこで低分子薬物、生理活性ペプチド
などを高分子に結合させることで、それらの化合物と細
胞との相互作用や生体内における挙動を抑制しようとす
る研究が盛んに行なわれている。この様な、高分子のラ
イフサイエンスへの応用は、医用高分子材料、高分子医
薬、診断用材料、バイオリアクター、バイオアフィニテ
ィー材料などへ幅広く試みられており、これらに関する
高分子材料とその用途については、竹本喜一、砂本順
三、明石満 共編“高分子と医薬”（三田出版会）、千
畑一郎編“バイオテクノロジーシリーズ固定化酵素”
（講談社、山崎誠、石井信一、岩井浩一編“アフィニテ
ィークロマトグラフィー”（講談社）に詳しく記載され
ている。
し生体との間で示される相互作用も低分子の場合と非常
に異なっている。そこで低分子薬物、生理活性ペプチド
などを高分子に結合させることで、それらの化合物と細
胞との相互作用や生体内における挙動を抑制しようとす
る研究が盛んに行なわれている。この様な、高分子のラ
イフサイエンスへの応用は、医用高分子材料、高分子医
薬、診断用材料、バイオリアクター、バイオアフィニテ
ィー材料などへ幅広く試みられており、これらに関する
高分子材料とその用途については、竹本喜一、砂本順
三、明石満 共編“高分子と医薬”（三田出版会）、千
畑一郎編“バイオテクノロジーシリーズ固定化酵素”
（講談社、山崎誠、石井信一、岩井浩一編“アフィニテ
ィークロマトグラフィー”（講談社）に詳しく記載され
ている。
【０００５】プロペン酸誘導体から合成したプロペンア
ミド誘導体はビニル基を有しており、ビニル重合により
各種カチオン性ビニル単量体と容易に共重合物を合成す
ることができ、種々の材料に供することが出来る。水不
溶性のビニル重合体にArg-Gly-Asp を必須単位とするオ
リゴペプチドを高分子反応により高分子に導入した例は
見られるが、Arg-Gly-Asp を必須単位とするオリゴペプ
チドを側鎖に有する重合可能なプロペンアミド誘導体の
水溶性カチオン性共重合物およびハイドロゲルは知られ
ておらず、これらはレセプターとの結合能の増強および
血液中での安定化等が期待できる。
ミド誘導体はビニル基を有しており、ビニル重合により
各種カチオン性ビニル単量体と容易に共重合物を合成す
ることができ、種々の材料に供することが出来る。水不
溶性のビニル重合体にArg-Gly-Asp を必須単位とするオ
リゴペプチドを高分子反応により高分子に導入した例は
見られるが、Arg-Gly-Asp を必須単位とするオリゴペプ
チドを側鎖に有する重合可能なプロペンアミド誘導体の
水溶性カチオン性共重合物およびハイドロゲルは知られ
ておらず、これらはレセプターとの結合能の増強および
血液中での安定化等が期待できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Arg-
Gly-Asp のトリペプチドを必須単位として有する新規な
カチオン性プロペンアミド誘導体共重合物とその塩、お
よびそれを有効成分とする動物細胞の接着阻害剤、血小
板凝集・粘着抑制剤、並びにArg-Gly-Asp のトリペプチ
ドを必須単位として有する新規なカチオン性プロペンア
ミド誘導体架橋共重合物とその塩、およびそれを有効成
分とする細胞培養基体を提供することである。
Gly-Asp のトリペプチドを必須単位として有する新規な
カチオン性プロペンアミド誘導体共重合物とその塩、お
よびそれを有効成分とする動物細胞の接着阻害剤、血小
板凝集・粘着抑制剤、並びにArg-Gly-Asp のトリペプチ
ドを必須単位として有する新規なカチオン性プロペンア
ミド誘導体架橋共重合物とその塩、およびそれを有効成
分とする細胞培養基体を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、下記一般式
〔Ｉ〕の側鎖に、下記一般式〔II〕で表される接着性ペ
プチドを必須単位として有するプロペンアミド誘導体
と、下記一般式〔III 〕で表わされるカチオン性単量体
の共重合物又はその塩を提供するものである。
〔Ｉ〕の側鎖に、下記一般式〔II〕で表される接着性ペ
プチドを必須単位として有するプロペンアミド誘導体
と、下記一般式〔III 〕で表わされるカチオン性単量体
の共重合物又はその塩を提供するものである。
【０００８】 一般式〔Ｉ〕 R1R2C ＝CR3 −CO−［NH］− 式中、Ｒ1 、Ｒ2 は水素原子又はカルボキシル基を表
し、Ｒ3 は水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原
子又はカルボキシメチル基を表す。
し、Ｒ3 は水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原
子又はカルボキシメチル基を表す。
【０００９】 一般式〔ＩＩ〕 −（Ｒ ４ ）−［ＣＯ］−（［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−［Ｙ］）ｎ− ［Ｚ］−Ｈ 一般式〔ＩＩＩ〕 Ｈ−［ＣＯ］−（［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−［Ｙ］）ｎ−［Ｚ］− （Ｒ ５ ）− 一般式〔ＩＩ〕、〔ＩＩＩ〕において 、Ｘ、ＹはＳｅ
ｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓｎ，Ｐｒｏから選択されるア
ミノ酸残基又はペプチド残基を表し、Ｚは−Ｏ−又は−
ＮＨ−を示す。Ｒ４、Ｒ５は炭素数が１〜１１の直鎖又
は分岐のアルキレン基、又は炭素数が６〜１１のアリー
レン基を表し、置換基を有していてもよい。ｎは１〜５
の整数を表す。
ｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓｎ，Ｐｒｏから選択されるア
ミノ酸残基又はペプチド残基を表し、Ｚは−Ｏ−又は−
ＮＨ−を示す。Ｒ４、Ｒ５は炭素数が１〜１１の直鎖又
は分岐のアルキレン基、又は炭素数が６〜１１のアリー
レン基を表し、置換基を有していてもよい。ｎは１〜５
の整数を表す。
【００１０】置換基としては、カルボニル基、カルボキ
シル基、アミノ基、ヒドロキシル基、スルホ基、ハロゲ
ン原子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、不飽和基の
２重結合、３重結合等があげられ、同一鎖に２つ以上有
していてもよい。
シル基、アミノ基、ヒドロキシル基、スルホ基、ハロゲ
ン原子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、不飽和基の
２重結合、３重結合等があげられ、同一鎖に２つ以上有
していてもよい。
【００１１】 一般式〔ＩＶ〕 Ｈ２Ｃ＝ＣＲ６−［ＣＯ］−［Ｗ］−Ｒ７ 一般式〔ＩＶ〕において 、Ｒ６は水素原子又は炭素数１
〜３のアルキル基で置換基を有していてもよい。置換基
としては、カルボニル基、アミノ基、ヒドロキシル基、
ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基等があげられ、同一
鎖に２つ以上有していてもよい。
〜３のアルキル基で置換基を有していてもよい。置換基
としては、カルボニル基、アミノ基、ヒドロキシル基、
ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基等があげられ、同一
鎖に２つ以上有していてもよい。
【００１２】Ｗは−Ｏ−又は−NH−を示す。Ｒ7 は水素
原子又は炭素数が１〜１２の直鎖又は分岐のアルキル
基、又は炭素数が６〜１２のアリール基であり、置換基
として少なくともアミノ基、イミノ基、ニトリロ基、ア
ミジノ基、４級アンモニウム、アンモニウムのいずれか
一つを含み、さらに置換基を有していてもよい。置換基
としては、４級アンモニウム、カルボニル基、アミノ
基、イミノ基、ニトリロ基、アミジノ基、ヒドロキシル
基、ハロゲン原子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、
不飽和基の２重結合、３重結合等があげられ、同一鎖に
２つ以上有していてもよい。又、アミド結合、エステル
結合、エーテル結合、尿素結合、カルバミン酸エステル
結合、炭酸エステル結合等を、同一鎖に２つ以上有して
いてもよく、さらにピリジン、イミダゾールの様なヘテ
ロ環を有していてもよい。
原子又は炭素数が１〜１２の直鎖又は分岐のアルキル
基、又は炭素数が６〜１２のアリール基であり、置換基
として少なくともアミノ基、イミノ基、ニトリロ基、ア
ミジノ基、４級アンモニウム、アンモニウムのいずれか
一つを含み、さらに置換基を有していてもよい。置換基
としては、４級アンモニウム、カルボニル基、アミノ
基、イミノ基、ニトリロ基、アミジノ基、ヒドロキシル
基、ハロゲン原子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、
不飽和基の２重結合、３重結合等があげられ、同一鎖に
２つ以上有していてもよい。又、アミド結合、エステル
結合、エーテル結合、尿素結合、カルバミン酸エステル
結合、炭酸エステル結合等を、同一鎖に２つ以上有して
いてもよく、さらにピリジン、イミダゾールの様なヘテ
ロ環を有していてもよい。
【００１３】一般式〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、〔ＩＩＩ〕、
〔ＩＶ〕において［］は［］内の基が存在するかあるい
は存在しなくてもよいことを示す。
〔ＩＶ〕において［］は［］内の基が存在するかあるい
は存在しなくてもよいことを示す。
【００１４】本発明はさらに、上記カチオン性プロペン
アミド誘導体共重合物およびその塩を有効成分とする動
物細胞の接着阻害剤および血小板凝集・粘着抑制剤を提
供するものである。共重合物中のプロペンアミド誘導体
由来の構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜90モル
％、さらに好ましくは0.5 〜60モル％である。
アミド誘導体共重合物およびその塩を有効成分とする動
物細胞の接着阻害剤および血小板凝集・粘着抑制剤を提
供するものである。共重合物中のプロペンアミド誘導体
由来の構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜90モル
％、さらに好ましくは0.5 〜60モル％である。
【００１５】カチオン性プロペンアミド誘導体共重合物
およびその塩の分子量は好ましくは３０万以下、特に３
０００−２０万の範囲で、室温で水溶性であることが好
ましい。
およびその塩の分子量は好ましくは３０万以下、特に３
０００−２０万の範囲で、室温で水溶性であることが好
ましい。
【００１６】本発明はまた、Arg-Gly-Asp のペプチド配
列を必須単位として共有結合してなるプロペンアミド誘
導体のカチオン性架橋共重合物及びその塩を提供するも
のである。架橋共重合物は水溶液中でハイドロゲル状で
あることが好ましい。架橋共重合物を合成する場合、プ
ロペンアミド誘導体、カチオン性単量体に加え多官能性
単量体を添加する。多官能性単量体としては、トリエチ
レングリコールジメタクリレート、メチレンビスアクリ
ルアミド等のジメタクリレート、ジアクリレート、ジメ
タクリルアミド、ジアクリルアミドやジビニルベンゼン
等の芳香環を有する多官能性単量体、さらに細胞接着剤
フラグメントを有する多官能性単量体等を用いることが
できる。架橋共重合物中、プロペンアミド誘導体由来の
構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜90モル％、さら
に好ましくは0.5 〜60モル％であり、また多官能性単量
体由来の構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜30モル
％、さらに好ましくは0.5 〜20モル％である。本発明は
さらに、この架橋共重合物又はその塩を有効成分とする
動物細胞の培養基体を提供するものである。
列を必須単位として共有結合してなるプロペンアミド誘
導体のカチオン性架橋共重合物及びその塩を提供するも
のである。架橋共重合物は水溶液中でハイドロゲル状で
あることが好ましい。架橋共重合物を合成する場合、プ
ロペンアミド誘導体、カチオン性単量体に加え多官能性
単量体を添加する。多官能性単量体としては、トリエチ
レングリコールジメタクリレート、メチレンビスアクリ
ルアミド等のジメタクリレート、ジアクリレート、ジメ
タクリルアミド、ジアクリルアミドやジビニルベンゼン
等の芳香環を有する多官能性単量体、さらに細胞接着剤
フラグメントを有する多官能性単量体等を用いることが
できる。架橋共重合物中、プロペンアミド誘導体由来の
構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜90モル％、さら
に好ましくは0.5 〜60モル％であり、また多官能性単量
体由来の構成単位の含有量は、好ましくは0.1 〜30モル
％、さらに好ましくは0.5 〜20モル％である。本発明は
さらに、この架橋共重合物又はその塩を有効成分とする
動物細胞の培養基体を提供するものである。
【００１７】本発明に係わる接着性ペプチドに用いられ
るアミノ酸はＬ体、Ｄ体どちらでもよいが、好ましくは
Ｌ体である。
るアミノ酸はＬ体、Ｄ体どちらでもよいが、好ましくは
Ｌ体である。
【００１８】本発明に用いることのできるカチオン性単
量体は通常の重合可能なビニル単量体であればよく、特
に限定されない。
量体は通常の重合可能なビニル単量体であればよく、特
に限定されない。
【００１９】例えば、クロロトリメチルアンモニオエチ
ルメタクリルアミド、スルホトリメチルアンモニオエチ
ルメタクリレート、クロロトリメチルアンモニオエチル
メタクリレート、スルホエチルジメチルアンモニオエチ
ルメタクリレート、クロロエチルジメチルアンモニオエ
チルメタクリレート、ジアリルジメチルアンモニウムク
ロリド、ジアリルジエチルアンモニウムクロリド、クロ
ロトリメチルアンモニオプロピルアクリルアミド、クロ
ロエチルジメチルアンモニオプロピルアクリルアミド、
トリメチルアンモニオエチルアクリルアミド、スルホト
リメチルアンモニオエチルアクリレート、クロロトリメ
チルアンモニオエチルアクリレート、スルホエチルジメ
チルアンモニオエチルアクリレート、クロロエチルジメ
チルアンモニオエチルアクリレート、クロロトリメチル
アンモニオプロピルアクリルアミド、クロロエチルジメ
チルアンモニオプロピルアクリルアミド等の４級アンモ
ニウム基を有するビニルモノマー類が挙げられる。
ルメタクリルアミド、スルホトリメチルアンモニオエチ
ルメタクリレート、クロロトリメチルアンモニオエチル
メタクリレート、スルホエチルジメチルアンモニオエチ
ルメタクリレート、クロロエチルジメチルアンモニオエ
チルメタクリレート、ジアリルジメチルアンモニウムク
ロリド、ジアリルジエチルアンモニウムクロリド、クロ
ロトリメチルアンモニオプロピルアクリルアミド、クロ
ロエチルジメチルアンモニオプロピルアクリルアミド、
トリメチルアンモニオエチルアクリルアミド、スルホト
リメチルアンモニオエチルアクリレート、クロロトリメ
チルアンモニオエチルアクリレート、スルホエチルジメ
チルアンモニオエチルアクリレート、クロロエチルジメ
チルアンモニオエチルアクリレート、クロロトリメチル
アンモニオプロピルアクリルアミド、クロロエチルジメ
チルアンモニオプロピルアクリルアミド等の４級アンモ
ニウム基を有するビニルモノマー類が挙げられる。
【００２０】さらに、ビニルピリジン類、ビニルイミダ
ゾール類等の複素環を側鎖に有するビニルモノマーが挙
げられ、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチ
ルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピ
ルメタクリレート、ジエチルアミノプロピルメタクリレ
ート、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、ジメチ
ルアミノエチルアクリルアミド等のアミノ基を有するビ
ニルモノマーも使用することができる。
ゾール類等の複素環を側鎖に有するビニルモノマーが挙
げられ、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエチ
ルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピ
ルメタクリレート、ジエチルアミノプロピルメタクリレ
ート、ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、ジメチ
ルアミノエチルアクリルアミド等のアミノ基を有するビ
ニルモノマーも使用することができる。
【００２１】好ましくは、クロロトリメチルアンモニオ
エチルメタクリルアミド、クロロトリメチルアンモニオ
プロピルメタクリルアミド、クロロトリメチルアンモニ
オエチルメタクリレート、クロロトリメチルアンモニオ
プロピルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタク
リルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミ
ド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルア
ミノプロピルメタクリレート等のメタクリル酸誘導体お
よび同様の側鎖を有するアクリル酸誘導体である。
エチルメタクリルアミド、クロロトリメチルアンモニオ
プロピルメタクリルアミド、クロロトリメチルアンモニ
オエチルメタクリレート、クロロトリメチルアンモニオ
プロピルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタク
リルアミド、ジメチルアミノプロピルメタクリルアミ
ド、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルア
ミノプロピルメタクリレート等のメタクリル酸誘導体お
よび同様の側鎖を有するアクリル酸誘導体である。
【００２２】本発明のカチオン性プロペンアミド誘導体
共重合物の塩として例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、
リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリ
フルオロ酢酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、乳
酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩が挙げられ、そのよう
な塩への変換は慣用手段で行なうことができる。
共重合物の塩として例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、
リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリ
フルオロ酢酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、乳
酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩が挙げられ、そのよう
な塩への変換は慣用手段で行なうことができる。
【００２３】ペプチド合成方法は特に限定されるもので
はなく、液相法、固相法、および自動合成装置による合
成方法が挙げられる。これらの合成方法の詳細について
は、生化学実験講座“タンパク質の化学IV”ｐ２０７−
４９５（日本生化学会編、東京化学同人）、“続生化学
実験講座タンパク質の化学（下）”（日本生化学会編、
東京化学同人）、泉屋ら編“ペプチド合成の基礎と実
験”（丸善）に記載されている。また、市販されている
合成ペプチドを利用することも可能である。
はなく、液相法、固相法、および自動合成装置による合
成方法が挙げられる。これらの合成方法の詳細について
は、生化学実験講座“タンパク質の化学IV”ｐ２０７−
４９５（日本生化学会編、東京化学同人）、“続生化学
実験講座タンパク質の化学（下）”（日本生化学会編、
東京化学同人）、泉屋ら編“ペプチド合成の基礎と実
験”（丸善）に記載されている。また、市販されている
合成ペプチドを利用することも可能である。
【００２４】プロペン酸誘導体とアミノアルキルカルボ
ン酸および細胞接着性ペプチドの結合方法としては、活
性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、酸塩化物
法、対称酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ
法、カルボニルジイミダゾール法等を利用したアミド結
合合成方法が挙げられる。プロペンアミド誘導体とカチ
オン性単量体の共重合物および架橋共重合物は一般のラ
ジカル重合法、イオン重合法により得られる。水溶性重
合物はゲルろ過法、透析法等により特定の分子量分画を
行なうことが出来る。架橋共重合物は多官能性単量体の
組成を変えることで含水率、ゲル強度等の物性が異なる
ハイバロゲルとして得ることができる。
ン酸および細胞接着性ペプチドの結合方法としては、活
性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、酸塩化物
法、対称酸無水物法、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ
法、カルボニルジイミダゾール法等を利用したアミド結
合合成方法が挙げられる。プロペンアミド誘導体とカチ
オン性単量体の共重合物および架橋共重合物は一般のラ
ジカル重合法、イオン重合法により得られる。水溶性重
合物はゲルろ過法、透析法等により特定の分子量分画を
行なうことが出来る。架橋共重合物は多官能性単量体の
組成を変えることで含水率、ゲル強度等の物性が異なる
ハイバロゲルとして得ることができる。
【００２５】本発明のカチオン性プロペンアミド誘導体
共重合物およびその塩は、細胞接着性蛋白質のコア配列
Arg-Gly-Asp を有し、該コア配列を介して細胞接着性蛋
白質と同様の機序で細胞に接着する。そのため、細胞接
着性蛋白のアゴニスト又はアンタゴニストとして種々の
生物活性を示し、免疫調整作用、創傷治癒作用、毛細血
管中で起こる癌細胞による血小板凝集抑制作用、神経疾
患治癒作用などの広範な生物活性が認められている。
共重合物およびその塩は、細胞接着性蛋白質のコア配列
Arg-Gly-Asp を有し、該コア配列を介して細胞接着性蛋
白質と同様の機序で細胞に接着する。そのため、細胞接
着性蛋白のアゴニスト又はアンタゴニストとして種々の
生物活性を示し、免疫調整作用、創傷治癒作用、毛細血
管中で起こる癌細胞による血小板凝集抑制作用、神経疾
患治癒作用などの広範な生物活性が認められている。
【００２６】従って、本発明のカチオン性プロペンアミ
ド誘導体共重合物およびその塩は、その少なくとも一種
を、場合により慣用の担体又は医薬用助剤とともに、癌
転移抑制剤、創傷治癒剤、免疫調整剤、血小板凝集粘着
抑制剤として患者に投与することが可能である。特に、
動物細胞接着阻害剤又は血小板凝集粘着抑制剤としての
使用が好ましい。その投与量は、0.２μｇ／kg〜４００
mg／kgの範囲で、症状、年齢、体重等に基づいて決定さ
れる。
ド誘導体共重合物およびその塩は、その少なくとも一種
を、場合により慣用の担体又は医薬用助剤とともに、癌
転移抑制剤、創傷治癒剤、免疫調整剤、血小板凝集粘着
抑制剤として患者に投与することが可能である。特に、
動物細胞接着阻害剤又は血小板凝集粘着抑制剤としての
使用が好ましい。その投与量は、0.２μｇ／kg〜４００
mg／kgの範囲で、症状、年齢、体重等に基づいて決定さ
れる。
【００２７】本発明のカチオン性プロペンアミド誘導体
共重合物およびその塩は、ペプチド系医薬に一般に使用
されている投与方法、即ち非経口投与方法、例えば静脈
内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが
好ましい。そのような注射用製剤を製造する場合、本発
明のカチオン性プロペンアミド誘導体共重合物およびそ
の塩を例えば、後記実施例で示すようにＰＢＳ又は生理
食塩水に溶解して、注射用製剤としてもよく、あるいは
0.１Ｎ程度の酢酸水等に溶解した後、凍結乾燥製剤とし
てもよい。この様な製剤には、グリシンやアルブミン等
の慣用の安定剤を添加してもよい。さらに、本発明のカ
チオン性プロペンアミド誘導体共重合物およびその塩
は、例えばリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤
あるいはミクロスフェア状、ハイドロゲル状とすれば、
経口投与することも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻ス
プレー剤等の形にすれば、消化管以外の粘膜からも吸収
させることが可能である。
共重合物およびその塩は、ペプチド系医薬に一般に使用
されている投与方法、即ち非経口投与方法、例えば静脈
内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが
好ましい。そのような注射用製剤を製造する場合、本発
明のカチオン性プロペンアミド誘導体共重合物およびそ
の塩を例えば、後記実施例で示すようにＰＢＳ又は生理
食塩水に溶解して、注射用製剤としてもよく、あるいは
0.１Ｎ程度の酢酸水等に溶解した後、凍結乾燥製剤とし
てもよい。この様な製剤には、グリシンやアルブミン等
の慣用の安定剤を添加してもよい。さらに、本発明のカ
チオン性プロペンアミド誘導体共重合物およびその塩
は、例えばリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤
あるいはミクロスフェア状、ハイドロゲル状とすれば、
経口投与することも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻ス
プレー剤等の形にすれば、消化管以外の粘膜からも吸収
させることが可能である。
【００２８】動物細胞の培養における細胞培養基体の使
用方法については、通常の方法で行なわれ特に限定され
ない。例えば、接着性ペプチドを共有結合処理したビー
ズ培養液中に浮遊させて低速度で撹拌を行なうことで動
物細胞をマイクロキャリアー表面に接着させ培養する方
法、接着性ペプチドを共有結合処理したシャーレ・ロー
ラーびん等の上で動物細胞を培養する方法、接着性ペプ
チドを共有結合処理した中空糸に培養液を還流させ動物
細胞を中空糸内面に接着させ培養する方法、接着性ペプ
チドを共有結合処理したマイクロキャリアーを充填した
カラムを用いる方法等が挙げられる。
用方法については、通常の方法で行なわれ特に限定され
ない。例えば、接着性ペプチドを共有結合処理したビー
ズ培養液中に浮遊させて低速度で撹拌を行なうことで動
物細胞をマイクロキャリアー表面に接着させ培養する方
法、接着性ペプチドを共有結合処理したシャーレ・ロー
ラーびん等の上で動物細胞を培養する方法、接着性ペプ
チドを共有結合処理した中空糸に培養液を還流させ動物
細胞を中空糸内面に接着させ培養する方法、接着性ペプ
チドを共有結合処理したマイクロキャリアーを充填した
カラムを用いる方法等が挙げられる。
【００２９】この発明の細胞培養基体は、種々の細胞の
培養に使用することができ、細胞の種類は特に限定され
ず、生体由来細胞、ハイブリドーマ等が挙げられる。
培養に使用することができ、細胞の種類は特に限定され
ず、生体由来細胞、ハイブリドーマ等が挙げられる。
【００３０】
【実施例】以下実施例により本発明を更に説明するが本
発明はこれに限定されるものではない。
発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】 製造例１ カルボキシエチルメタクリルアミドをショッテンバウマ
ン反応により合成した。即ち、β−アラニン１7.８ｇ
（0.２mol)の水酸化ナトリウム水溶液にメタクリル酸ク
ロリド２0.９ｇ（0.２mol)を氷冷下滴下し、４時間撹拌
後、塩酸により中和した。減圧濃縮し、沈澱した塩化ナ
トリウムをろ別した。濃縮液をクロロホルムで抽出し、
乾燥後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。濃縮物を
エーテルで洗浄し製造物１を白色固体として１7.６ｇ得
た。（収率５６％） 製造物１ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−COOH
ン反応により合成した。即ち、β−アラニン１7.８ｇ
（0.２mol)の水酸化ナトリウム水溶液にメタクリル酸ク
ロリド２0.９ｇ（0.２mol)を氷冷下滴下し、４時間撹拌
後、塩酸により中和した。減圧濃縮し、沈澱した塩化ナ
トリウムをろ別した。濃縮液をクロロホルムで抽出し、
乾燥後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。濃縮物を
エーテルで洗浄し製造物１を白色固体として１7.６ｇ得
た。（収率５６％） 製造物１ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−COOH
【００３２】 製造例２〜８ 製造例１と同じ方法によりアクリル酸クロリド、メタク
リル酸クロリド、エタクリル酸クロリドと４−アミノ酪
酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、１２−
アミノラウリン酸、ロイシン、グルタミン、ｐ−アミノ
安息香酸との反応により以下のプロペン酸誘導体を製造
した。 製造物２ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)3−COOH 収率５２％ 製造物３ CH2＝CC2H5 −CO−NH−(CH2)4−COOH 収率６１％ 製造物４ CH2＝CCH3−CO−NH−(CH2)5−COOH 収率６９％ 製造物５ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)11 −COOH 収率７１％ 製造物６ CH2＝CH−CO−NH−CH(CH2CH(CH3)2) −COOH 収率６４％ 製造物７ CH2＝CCH3−CO−NH−CH(C2H4CONH2) −COOH 収率５９％ 製造物８ CH2＝CH−CO−NH−p −C6H4−COOH 収率６８％
リル酸クロリド、エタクリル酸クロリドと４−アミノ酪
酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、１２−
アミノラウリン酸、ロイシン、グルタミン、ｐ−アミノ
安息香酸との反応により以下のプロペン酸誘導体を製造
した。 製造物２ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)3−COOH 収率５２％ 製造物３ CH2＝CC2H5 −CO−NH−(CH2)4−COOH 収率６１％ 製造物４ CH2＝CCH3−CO−NH−(CH2)5−COOH 収率６９％ 製造物５ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)11 −COOH 収率７１％ 製造物６ CH2＝CH−CO−NH−CH(CH2CH(CH3)2) −COOH 収率６４％ 製造物７ CH2＝CCH3−CO−NH−CH(C2H4CONH2) −COOH 収率５９％ 製造物８ CH2＝CH−CO−NH−p −C6H4−COOH 収率６８％
【００３３】 製造例９ アミノエチルメタクリルアミドをショッテンバウマン反
応により合成した。即ち、エチレンジアミン１２０ｇ
（２mol)を溶かしたクロロホルム溶液（４００ml）へ、
メタクリル酸クロリド２0.９ｇ（0.２mol)を氷冷下滴下
し４時間撹拌後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。
濃縮物に５％炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlを加えク
ロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上で乾燥の後濃
縮し、クロロホルム／メタノール＝７／３を溶離液とし
たアルミナカラムクロマトグラフィーにより精製した。
（製造物９） 収量１4.８ｇ（５7.８％、0.１１６mol)
応により合成した。即ち、エチレンジアミン１２０ｇ
（２mol)を溶かしたクロロホルム溶液（４００ml）へ、
メタクリル酸クロリド２0.９ｇ（0.２mol)を氷冷下滴下
し４時間撹拌後減圧濃縮してクロロホルムを留去した。
濃縮物に５％炭酸水素ナトリウム水溶液５０mlを加えク
ロロホルムで抽出した。硫酸ナトリウム上で乾燥の後濃
縮し、クロロホルム／メタノール＝７／３を溶離液とし
たアルミナカラムクロマトグラフィーにより精製した。
（製造物９） 収量１4.８ｇ（５7.８％、0.１１６mol)
【００３４】 製造例１０ トリメチルアンモニオエチルメタクリルアミドの合成 ジメチルエチレンジアミン２0.２ｇ（0.２３mol)をクロ
ロホルム１００mlに溶かし、メタクリル酸クロリド２４
ｇ（0.２３mol)を氷冷下滴下し４時間撹拌後クロロホル
ムを留去した。これに、0.２３mol の水酸化ナトリウム
のメタノール溶液を加えて撹拌し、生じた沈澱物をろ別
した。ろ液を集め、ヨウ化メチル４2.６ｇ（0.３mol)の
１０mlメタノール溶液を加え室温で２時間反応させた。
溶液を減圧濃縮した後希塩酸中でクロロ型としてから、
水−メタノール系で再結晶し、クロロトリメチルアンモ
ニオエチルメタクリルアミド３1.３ｇ（６６％）を得
た。 （製造物１０）
ロホルム１００mlに溶かし、メタクリル酸クロリド２４
ｇ（0.２３mol)を氷冷下滴下し４時間撹拌後クロロホル
ムを留去した。これに、0.２３mol の水酸化ナトリウム
のメタノール溶液を加えて撹拌し、生じた沈澱物をろ別
した。ろ液を集め、ヨウ化メチル４2.６ｇ（0.３mol)の
１０mlメタノール溶液を加え室温で２時間反応させた。
溶液を減圧濃縮した後希塩酸中でクロロ型としてから、
水−メタノール系で再結晶し、クロロトリメチルアンモ
ニオエチルメタクリルアミド３1.３ｇ（６６％）を得
た。 （製造物１０）
【００３５】 以下、ＡrgをＲ、ＧlyをＧ、ＡspをＤ、ＳerをＳ、Ｐro
をＰと示す。また保護基、試薬の略号は以下の様であ
る。
をＰと示す。また保護基、試薬の略号は以下の様であ
る。
【００３６】 Ｂoc ：ｔ−ブトキシカルボニル ＯＢzl ：ベンジルエステル ＨＯＢｔ ：ヒドロキシベンゾトリアゾール ＯＳｕ ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＯＮｂ ：ニトロベンジルエステル ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＣ urea ：シクロヘキシルウレア Ｍts ：メシチレンスルホニル ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド
【００３７】 製造例１１ 製造物１１ BocArg(Mts) ４5.６ｇ（0.１mol)をＤＭＦ１リットルに
溶かし、ＤＣＣ２0.６ｇ（0.１mol)、HOBt１５ｇ（0.１
１mol)を氷冷下添加した後、製造例９のアミノエチルメ
タクリルアミド１2.８ｇ（0.１mol)を加え５℃で終夜撹
拌した。DCureaをろ別してから減圧濃縮してＤＭＦを除
いた。これを酢酸エチル溶液とした後、NaHCO3水溶液、
１Ｍクエン酸、水で洗浄しNa2SO4上で乾燥し減圧乾固し
た。生成物は１Ｍトリフルオロメタンスルホン酸−チオ
アニソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液中で氷冷下１
時間反応させた後、エーテル中に投入し、生じたオイル
状の沈澱物を蒸留水に溶解し、酢酸エチルで洗浄後、陰
イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４０
０；ＣＩ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固
体１4.３ｇ（収率４０％）が得られた。
溶かし、ＤＣＣ２0.６ｇ（0.１mol)、HOBt１５ｇ（0.１
１mol)を氷冷下添加した後、製造例９のアミノエチルメ
タクリルアミド１2.８ｇ（0.１mol)を加え５℃で終夜撹
拌した。DCureaをろ別してから減圧濃縮してＤＭＦを除
いた。これを酢酸エチル溶液とした後、NaHCO3水溶液、
１Ｍクエン酸、水で洗浄しNa2SO4上で乾燥し減圧乾固し
た。生成物は１Ｍトリフルオロメタンスルホン酸−チオ
アニソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液中で氷冷下１
時間反応させた後、エーテル中に投入し、生じたオイル
状の沈澱物を蒸留水に溶解し、酢酸エチルで洗浄後、陰
イオン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４０
０；ＣＩ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固
体１4.３ｇ（収率４０％）が得られた。
【００３８】 製造例１２ 製造例１０で合成したクロロトリメチルアンモニオエチ
ルメタクリルアミド（製造物１０）をラジカル重合によ
り重合した。
ルメタクリルアミド（製造物１０）をラジカル重合によ
り重合した。
【００３９】クロロトリメチルアンモニオエチルメタク
リルアミド２ｇを２０mlのＤＭＦに溶解し、和光純薬製
のラジカル開始剤Ｖ65（２，２−アゾビス（２，４−ジ
メチルバレロニトリル））１０mgを加え窒素気流下６５
℃で４時間重合した。重合物は酢酸エチルで沈澱させた
後、スペクトラポア７（分子分画量３０００）を用い純
水に対して透析し、低分子量画分を除いた後、凍結乾燥
した。収量1.０８ｇ（製造物１２）
リルアミド２ｇを２０mlのＤＭＦに溶解し、和光純薬製
のラジカル開始剤Ｖ65（２，２−アゾビス（２，４−ジ
メチルバレロニトリル））１０mgを加え窒素気流下６５
℃で４時間重合した。重合物は酢酸エチルで沈澱させた
後、スペクトラポア７（分子分画量３０００）を用い純
水に対して透析し、低分子量画分を除いた後、凍結乾燥
した。収量1.０８ｇ（製造物１２）
【００４０】分子量は東ソー（株）製 TSKgel G3000SW
カラムを用い、移動相は0.２Ｍリン酸緩衝液（pH7.４）
とし、流速1.０ml／min で測定した。ＰＥＧ換算分子量
は約２８０００であった。
カラムを用い、移動相は0.２Ｍリン酸緩衝液（pH7.４）
とし、流速1.０ml／min で測定した。ＰＥＧ換算分子量
は約２８０００であった。
【００４１】 製造例１３ 製造例１０で合成したクロロトリメチルアンモニオエチ
ルメタクリルアミドをラジカル重合により重合しハイド
ロゲルを作成した。
ルメタクリルアミドをラジカル重合により重合しハイド
ロゲルを作成した。
【００４２】シラン処理したガラス板（５cm×６cm×１
cm）２枚とガスケットを用意した。カルボキシエチルメ
タクリルアミド２ｇとメチレンビスアクリルアミド１０
０mg（５wt％）を蒸留水１２mlに溶解し１Ｎ NaOH でpH
7.４に合わせた。これに過硫酸アンモニウム１０mgを加
え充分窒素置換をした後、ガラス板の間に注入した。万
力でガラス板を押え、６０℃で２０時間重合させた。生
成したハイドロゲルを蒸留水で洗浄し未反応単量体を除
いた。（紫外線ランプにより滅菌処理した後細胞培養実
験に供した）（製造物１３）
cm）２枚とガスケットを用意した。カルボキシエチルメ
タクリルアミド２ｇとメチレンビスアクリルアミド１０
０mg（５wt％）を蒸留水１２mlに溶解し１Ｎ NaOH でpH
7.４に合わせた。これに過硫酸アンモニウム１０mgを加
え充分窒素置換をした後、ガラス板の間に注入した。万
力でガラス板を押え、６０℃で２０時間重合させた。生
成したハイドロゲルを蒸留水で洗浄し未反応単量体を除
いた。（紫外線ランプにより滅菌処理した後細胞培養実
験に供した）（製造物１３）
【００４３】 合成例１〜１４ 接着性ペプチドの固相法による合成 Merrifield方式によるペプチド合成装置を用いて合成を
行なった。α−アミノ酸の保護には、Ｂco基を用いArg-
Gly-Asp を必須単位として含むオリゴペプチドを合成
し、その末端に製造例１−８に示したプロペン酸誘導体
およびアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸を縮合
させた。トリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂か
らの切断及び側鎖保護基の除去を行ない、分取用ＨＰＬ
Ｃ（高速液体クロマトグラフィー）で精製し、単一ピー
クを示すプロペンアミド誘導体を得た。これを、陰イオ
ン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃ
ｌ型）を通し塩酸塩とした。
行なった。α−アミノ酸の保護には、Ｂco基を用いArg-
Gly-Asp を必須単位として含むオリゴペプチドを合成
し、その末端に製造例１−８に示したプロペン酸誘導体
およびアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸を縮合
させた。トリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂か
らの切断及び側鎖保護基の除去を行ない、分取用ＨＰＬ
Ｃ（高速液体クロマトグラフィー）で精製し、単一ピー
クを示すプロペンアミド誘導体を得た。これを、陰イオ
ン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃ
ｌ型）を通し塩酸塩とした。
【００４４】 合成物１ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)3−CO−RGD （配列番号１） 収率３５％
【００４５】 合成物２ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−CO−(RGD)2 （配列番号２） 収率２４％
【００４６】 合成物３ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−CO−(RGD)3 （配列番号３） 収率１７％
【００４７】 合成物４ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−CO−(RGD)5 （配列番号４） 収率１０％
【００４８】 合成物５ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)3−CO−RGDS （配列番号５） 収率３３％
【００４９】 合成物６ CH2＝CC2H5 −CO−NH−(CH2)4−CO−RGDS （配列番号６） 収率３１％
【００５０】 合成物７ CH2＝CCH3−CO−NH−(CH2)5−CO−RGDS （配列番号７） 収率３０％
【００５１】 合成物８ CH2＝CH−CO−NH−(CH2)11 −CO−RGDS （配列番号８） 収率２７％
【００５２】 合成物９ CH2＝CH−CO−NH−CH(CH2CH(CH3)2) −CO−RGDS （配列番号９） 収率３１％
【００５３】 合成物１０ CH2＝CCH3−CO−NH−CH(C2H4CONH2) −CO−RGDS （配列番号１０） 収率３３％
【００５４】 合成物１１ CH2＝CH−CO−NH−p −C6H4−CO−RGDS （配列番号１１） 収率３１％
【００５５】 合成物１２ CH2＝CC2H5 −CO−NH−(CH2)4−CO−GRGDS （配列番号１２） 収率３５％
【００５６】 合成物１３ CH2＝CCH3−CO−GRGDSP （配列番号１３） 収率２６％
【００５７】 合成物１４ CH2＝CH−CO−GGGRGDS （配列番号１４） 収率３０％
【００５８】 合成例１５ 合成物１５ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−CO−RGDS （配列番号１５）
【００５９】合成物１５を逐次延長法により液相法で合
成した。 (1) BocSer(Bzl)OBzl の合成 BocSer(Bzl) ６０ｇ（0.２mol)を４００mlの酢酸エチル
に加え、さらにトリエチルアミン２１ｇ（0.２mol)、臭
化ベンジル３5.４ｇ（0.２mol)を加えて還流下４時間反
応させた。冷却後、塩をろ別し、NaHCO3水溶液、NaCl水
溶液で洗浄した。これをNa2SO4で乾燥した後減圧乾固
し、白色粉末５４ｇ（収率６８％）を得た。
成した。 (1) BocSer(Bzl)OBzl の合成 BocSer(Bzl) ６０ｇ（0.２mol)を４００mlの酢酸エチル
に加え、さらにトリエチルアミン２１ｇ（0.２mol)、臭
化ベンジル３5.４ｇ（0.２mol)を加えて還流下４時間反
応させた。冷却後、塩をろ別し、NaHCO3水溶液、NaCl水
溶液で洗浄した。これをNa2SO4で乾燥した後減圧乾固
し、白色粉末５４ｇ（収率６８％）を得た。
【００６０】 (2) BocAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzlの合成 BocSer(Bzl)OBzl ３０ｇ（７８mmol）にＴＦＡ／CH2Cl2
＝１／１ ２００mlを加え室温で１時間撹拌した後、Ｔ
ＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解
しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗浄した。Na
2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
＝１／１ ２００mlを加え室温で１時間撹拌した後、Ｔ
ＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エチルに溶解
しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗浄した。Na
2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。
【００６１】この化合物と、BocAsp(OBzl)OSu ３2.８ｇ
（７８mmol）をCH2Cl2５００mlに溶解し終夜撹拌した。
減圧下CH2Cl2を留去してから酢酸エチルに溶解した。Na
HCO3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、NaCl水溶液の順に洗
浄し、Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を４
１ｇ（収率８９％）得た。
（７８mmol）をCH2Cl2５００mlに溶解し終夜撹拌した。
減圧下CH2Cl2を留去してから酢酸エチルに溶解した。Na
HCO3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、NaCl水溶液の順に洗
浄し、Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を４
１ｇ（収率８９％）得た。
【００６２】 (3) BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl の合成 BocAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl ３５ｇ（５９mmol）にＴＦ
Ａ：CH2Cl2＝１：１２００mlを加え室温で１時間撹拌し
た後、ＴＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エチ
ルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗浄
した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去し
た。
Ａ：CH2Cl2＝１：１２００mlを加え室温で１時間撹拌し
た後、ＴＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エチ
ルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗浄
した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去し
た。
【００６３】この化合物とBocGly 9.８ｇ（５９mmol）
をCH2Cl2に溶解し、ＤＣＣ１2.２ｇ（５９mmol）を氷冷
下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌し
た。DCureaをろ別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解
した。NaHCO3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、NaCl水溶液
の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色
粉末を３0.５ｇ（収率７５％）得た。
をCH2Cl2に溶解し、ＤＣＣ１2.２ｇ（５９mmol）を氷冷
下加え３時間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌し
た。DCureaをろ別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解
した。NaHCO3水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、NaCl水溶液
の順に洗浄し、Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色
粉末を３0.５ｇ（収率７５％）得た。
【００６４】 (4) BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl の合成 BocGlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl ２５ｇ（３９mmol）にＴ
ＦＡ：CH2Cl2＝１：１２００mlを加え室温で１時間撹拌
した後、ＴＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エ
チルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗
浄した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去し
た。
ＦＡ：CH2Cl2＝１：１２００mlを加え室温で１時間撹拌
した後、ＴＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。これを酢酸エ
チルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後NaCl水溶液で洗
浄した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去し
た。
【００６５】この化合物とBocArg(Mts) １7.８ｇ（３９
mmol）をＤＭＦ４００mlに溶解し、ＤＣＣ8.０ｇ（３９
mmol）、 HOBt 6.８ｇ（４５mmol）を氷冷下加え３時間
撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。DCureaをろ
別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。NaHCO3水
溶液、１Ｍクエン酸水溶液、NaCl水溶液の順に洗浄し、
Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を１9.５ｇ
（収率５０％）得た。
mmol）をＤＭＦ４００mlに溶解し、ＤＣＣ8.０ｇ（３９
mmol）、 HOBt 6.８ｇ（４５mmol）を氷冷下加え３時間
撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。DCureaをろ
別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。NaHCO3水
溶液、１Ｍクエン酸水溶液、NaCl水溶液の順に洗浄し、
Na2SO4で乾燥してから減圧乾固して白色粉末を１9.５ｇ
（収率５０％）得た。
【００６６】 (5) 合成物１５の合成 BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl１5.０ｇ（１５m
mol）にＴＦＡ：CH2Cl2＝１：１を１００ml加えて室温
で１時間撹拌した後、ＴＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。
これを酢酸エチルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後、
NaCl水溶液で洗浄した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチ
ルを減圧留去した。
mol）にＴＦＡ：CH2Cl2＝１：１を１００ml加えて室温
で１時間撹拌した後、ＴＦＡとCH2Cl2を減圧濃縮した。
これを酢酸エチルに溶解しNaHCO3水溶液で中和した後、
NaCl水溶液で洗浄した。Na2SO4で乾燥してから酢酸エチ
ルを減圧留去した。
【００６７】この化合物とカルボキシエチルメタクリル
アミド2.４ｇ（１５mmol）をCH2Cl2２００mlに溶解しＤ
ＣＣ3.１ｇ（１５mmol）を氷冷下加え３時間撹拌してか
ら、さらに室温で終夜撹拌した。減圧濃縮してからアセ
トンを加え、生じたDCureaをろ別した。減圧濃縮後、酢
酸エチルに続いてエーテルで洗浄し、減圧乾燥して白色
粉末を１0.０ｇ（収率６５％）得た。
アミド2.４ｇ（１５mmol）をCH2Cl2２００mlに溶解しＤ
ＣＣ3.１ｇ（１５mmol）を氷冷下加え３時間撹拌してか
ら、さらに室温で終夜撹拌した。減圧濃縮してからアセ
トンを加え、生じたDCureaをろ別した。減圧濃縮後、酢
酸エチルに続いてエーテルで洗浄し、減圧乾燥して白色
粉末を１0.０ｇ（収率６５％）得た。
【００６８】この化合物１０ｇ（9.８mmol）のＴＦＡ溶
液に、１Ｍ−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニ
ソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液を氷冷下加えて１
時間反応させ、ペプチド側鎖および末端の保護基の脱保
護を行なった。反応液をエーテル中に投入しオイル状の
沈澱物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで洗浄した後、陰イ
オン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；
Ｃｌ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固体4.
８ｇ（収率８０％）が得られた。
液に、１Ｍ−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニ
ソール−ｍ−クレゾールのＴＦＡ溶液を氷冷下加えて１
時間反応させ、ペプチド側鎖および末端の保護基の脱保
護を行なった。反応液をエーテル中に投入しオイル状の
沈澱物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで洗浄した後、陰イ
オン交換樹脂カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００；
Ｃｌ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥した。白色固体4.
８ｇ（収率８０％）が得られた。
【００６９】 合成例１６ 合成物１６ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−CO−RGDSGNH2 （配列番号１６）
【００７０】合成例１５と同様な方法でペプチド鎖を延
長した。以下にその概略を示す。
長した。以下にその概略を示す。
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】 ＨＯＢｔ ：0.７２ｇ（5.３mmol） １Ｍ−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−ｍ−クレゾールのＴ ＦＡ溶液 ：２５０ml アンバーライトＩＲＡ−４００；Ｃｌ型処理 合成物１６ 2.２９ｇ（収率６５％） アミノ酸分析（nmol／５０μｌ） Ｒ：0.９５１７ Ｇ：2.１００４ Ｄ：0.９７５３ Ｓ：0.８９２６ β−アラニン：1.０１４３ マススペクトル Ｍ+ ： ６２９
【００７５】 合成例１７ 合成物１７ RGDG−NH−C2H4−NH−CO−CCH3＝CH2 （配列番号１７）
【００７６】 合成物１７を逐次延長法により液相法にて合成した。 (1) BocGlyONb の合成 BocGly３５ｇ（0.２mol)、トリエチルアミン２８ml（0.
２mol)、臭化ｐ−ニトロベンジル４3.２ｇ（0.２mol)を
酢酸エチル４００mlに加えて５時間還流した後、室温で
１晩放置した。沈澱物をろ別しろ液をNaHCO3水溶液で洗
浄した後、水洗し、Na2SO4で乾燥、ろ液を減圧濃縮し酢
酸エチル−ヘキサンより再結晶させた。５2.７ｇ（収率
８５％）。
２mol)、臭化ｐ−ニトロベンジル４3.２ｇ（0.２mol)を
酢酸エチル４００mlに加えて５時間還流した後、室温で
１晩放置した。沈澱物をろ別しろ液をNaHCO3水溶液で洗
浄した後、水洗し、Na2SO4で乾燥、ろ液を減圧濃縮し酢
酸エチル−ヘキサンより再結晶させた。５2.７ｇ（収率
８５％）。
【００７７】以下合成例１５と同様な方法でペプチド鎖
を延長した。以下に、その概略を示す。 (2) BocAsp(OBzl)GlyONbの合成 (1) の生成物 ：４6.５ｇ（0.１５mol) TFA/CH2Cl2 ：２００ml／２００ml BocAsp(OBzl) ：４8.５ｇ（0.１５mol) CH2Cl2 ：７５０ml ＤＣＣ ：３0.９ｇ（0.１５mol) (2) の収量 ６4.０ｇ（収率８０％）
を延長した。以下に、その概略を示す。 (2) BocAsp(OBzl)GlyONbの合成 (1) の生成物 ：４6.５ｇ（0.１５mol) TFA/CH2Cl2 ：２００ml／２００ml BocAsp(OBzl) ：４8.５ｇ（0.１５mol) CH2Cl2 ：７５０ml ＤＣＣ ：３0.９ｇ（0.１５mol) (2) の収量 ６4.０ｇ（収率８０％）
【００７８】 (3) BocGlyAsp(OBzl)GlyONb の合成 (2) の生成物 ：６4.０ｇ（0.１２mol) TFA/CH2Cl2 ：２００ml／２００ml BocGly ：２１ｇ（0.１２mol) CH2Cl2 ：７５０ml ＤＣＣ ：２4.７ｇ（0.１２mol) (3) の収量 ５8.８ｇ（収率８３％）
【００７９】 (4) BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)GlyONb の合成 (3) の生成物 ：５3.７ｇ（９１mmol） TFA/CH2Cl2 ：２００ml／２００ml BocArg(Mts) ：４1.５ｇ（９１mmol） ＤＭＦ ：８００ml ＤＣＣ ：１8.７ｇ（９１mmol） ＨＯＢｔ ：１3.５ｇ（0.１mol) (4) の収量 ４6.５ｇ（収率５５％）
【００８０】 (5) BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Glyの合成 (4) の生成物9.２９ｇ（１０mmol）を９０％酢酸３００
mlに溶かし、Ｚn 末３2.７ｇ（0.５mol)を加え、０℃で
３時間撹拌した。Ｚn 末をろ別し、ろ液を減圧濃縮、こ
れにクエン酸を加えて酸性にし酢酸エチルで抽出した。
Na2SO4で乾燥し減圧濃縮してからエーテルを加えて白色
粉末6.２６ｇ（収率７９％）を得た。
mlに溶かし、Ｚn 末３2.７ｇ（0.５mol)を加え、０℃で
３時間撹拌した。Ｚn 末をろ別し、ろ液を減圧濃縮、こ
れにクエン酸を加えて酸性にし酢酸エチルで抽出した。
Na2SO4で乾燥し減圧濃縮してからエーテルを加えて白色
粉末6.２６ｇ（収率７９％）を得た。
【００８１】 (6) 合成物１７の合成 (5) の生成物 ：5.３１ｇ（6.７mmol） アミノエチルメタクリルアミド：0.８６ｇ（6.７mmol） ＤＭＦ ：６０ml ＤＣＣ ：1.４ｇ（6.７mmol） ＨＯＢｔ ：0.９５ｇ（７mmol） １Ｍ−トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール
−ｍ−クレゾールのＴ ＦＡ溶液 ：２５０ml
−ｍ−クレゾールのＴ ＦＡ溶液 ：２５０ml
【００８２】 合成例１８ 合成物１８ CH2＝CCH3−CO−NH−C2H4−CO−RGDG−NH−C2H4−NH−C
O−CCH3＝CH2 （配列番号１０）
O−CCH3＝CH2 （配列番号１０）
【００８３】合成例１７の（１）〜（５）と同様の合成
を行なった後、以下の合成により合成物１８を得た。 (1) BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Gly-NH-C2H4-NH-CO-CCH3=
CH2 BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Gly ：5.１９ｇ（6.７mmol） アミノエチルメタクリルアミド：0.８６ｇ（6.７mmol） ＤＭＦ ：６０ml ＤＣＣ ：1.４ｇ（6.７mmol） ＨＯＢｔ ：0.９５ｇ（７mmol） (1) の収量4.７ｇ（収率８０％） マススペクトル Ｍ+ ： ８８５
を行なった後、以下の合成により合成物１８を得た。 (1) BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Gly-NH-C2H4-NH-CO-CCH3=
CH2 BocArg(Mts)GlyAsp(OBzl)Gly ：5.１９ｇ（6.７mmol） アミノエチルメタクリルアミド：0.８６ｇ（6.７mmol） ＤＭＦ ：６０ml ＤＣＣ ：1.４ｇ（6.７mmol） ＨＯＢｔ ：0.９５ｇ（７mmol） (1) の収量4.７ｇ（収率８０％） マススペクトル Ｍ+ ： ８８５
【００８４】 (2) 合成物１８の合成 (1) の生成物 ：4.４ｇ（５mmol） ＴＦＡ／CH2Cl2 ：５０ml／５０ml カルボキシエチルメタクリルアミド：0.７９ｇ（５mmo
l） ＤＭＦ ：５０ml ＤＣＣ ：1.０３ｇ（５mmo
l） ＨＯＢｔ ：0.６８ｇ（５mmo
l） １Ｍトリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−
ｍ−クレゾールのＴＦ Ａ溶液 ：２５０ml アンバーライトＩＲＡ−４００ ：ＣＩ型処理 合成物１８ 2.４１ｇ（収率７０％） アミノ酸分析（nmol／５０μｌ）
l） ＤＭＦ ：５０ml ＤＣＣ ：1.０３ｇ（５mmo
l） ＨＯＢｔ ：0.６８ｇ（５mmo
l） １Ｍトリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール−
ｍ−クレゾールのＴＦ Ａ溶液 ：２５０ml アンバーライトＩＲＡ−４００ ：ＣＩ型処理 合成物１８ 2.４１ｇ（収率７０％） アミノ酸分析（nmol／５０μｌ）
【００８５】 合成例１９ 合成物１５と製造物１０とのラジカル共重合物を合成し
た。 合成物１５ ５００mg（0.８２mmol）と製造例１０の単
量体６７７mg（3.３mmol）を水１０mlに溶解し１Ｎ NaO
H でpH7.４に調整した後開始剤として、過硫酸カリウム
6.０mgと亜硫酸水素ナトリウム2.４mgを加え窒素気流下
２０℃で２０時間重合した。
た。 合成物１５ ５００mg（0.８２mmol）と製造例１０の単
量体６７７mg（3.３mmol）を水１０mlに溶解し１Ｎ NaO
H でpH7.４に調整した後開始剤として、過硫酸カリウム
6.０mgと亜硫酸水素ナトリウム2.４mgを加え窒素気流下
２０℃で２０時間重合した。
【００８６】スペクトラポア７（分子分画量３０００）
を用いて純水に対して透析し低分子量分を除いた後凍結
乾燥させた。収量２４３mg（合成物１９）
を用いて純水に対して透析し低分子量分を除いた後凍結
乾燥させた。収量２４３mg（合成物１９）
【００８７】元素分析のＮの値から共重合物の組成を求
めたところ合成物１５が１８％導入されていることがわ
かった。 元素分析Ｎ値： １5.４６％
めたところ合成物１５が１８％導入されていることがわ
かった。 元素分析Ｎ値： １5.４６％
【００８８】合成物１９をゲルクロマトグラフィーによ
り分子量分画を行なった。分子量は、製造例１２と同様
の方法で測定した。 画分１ 分子量約５００００ （合成物１９−１） 画分２ 分子量約２３０００ （合成物１９−２） 画分３ 分子量約１１０００ （合成物１９−３）
り分子量分画を行なった。分子量は、製造例１２と同様
の方法で測定した。 画分１ 分子量約５００００ （合成物１９−１） 画分２ 分子量約２３０００ （合成物１９−２） 画分３ 分子量約１１０００ （合成物１９−３）
【００８９】 合成例２０ 合成物１５と製造例１０の単量体の共重合を合成例１９
と同様の方法で開始剤量を変えて行なった。
と同様の方法で開始剤量を変えて行なった。
【００９０】 合成例２１、２２ 合成例１９と同じ方法で単量体組成を変えて共重合を行
なった。
なった。
【００９１】
【００９２】
【００９３】 合成例２３〜３８ 合成例１９と同じ方法で合成物１〜１４、１６および１
７と各種カチオン性単量体との共重合を行なった。
７と各種カチオン性単量体との共重合を行なった。
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】 合成例２６ 単量体 合成物 ４ ５００ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ） ジメチルアミノエチルアクリレート（アルドリッチ製） １４４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ） 開始剤 過硫酸カリウム ３．２ｍｇ 亜硫酸水素ナトリウム １．３ｍｇ 収量 １８６ｍｇ（合成物２６） 分子量 １００００ 合成物４の組成 ２３％ 元素分析Ｎ値 １９．５６％
【００９８】 合成例２７ 単量体 合成物 ５ ５００ｍｇ（０．８２ｍｍｏｌ） 製造物１１ １．１７ｇ（３．２８ｍｍｏｌ） 開始剤 過硫酸カリウム ８．４ｍｇ 亜硫酸水素ナトリウム ３．４ｍｇ 収量 ４１５ｇ（合成物２７） 分子量 ８０００ 合成物５の組成 ２０％（アミノ酸分析ＡｒｇとＧｌｙの値より算出） アミノ酸分析値（ｎｍｏｌ／５０μｌ） Ｒ：１６．８７２９ Ｇ： ３．４２５２ Ｄ： ３．３８１２ Ｓ： ３．０２１６ β−アラニン： ３．３８４６
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】 合成例３９ 合成物１５・合成物１８と製造物１０のハイドロゲルを
ラジカル重合法により合成した。シラン処理したガラス
板（５cm×６cm×１cm）２枚とガスケットを用意した。
合成物１５ 0.２３ｇ（0.４mmol）と合成物１８ 0.２
８ｇ（0.４mmol）と製造物１０ 1.４９ｇ（7.２mmol）
を蒸留水に溶解し、１０wt％のモノマー溶液とした。１
Ｎ NaOH でpH7.４に合わせてから、過硫酸アンモニウム
１１mgを加え充分窒素置換をした後、ガラス板の間に注
入した。万力でガラス板を押え、６０℃で４０時間重合
させた。生成したハイドロゲルを蒸留水で洗浄し未反応
モノマーを除いた。合成物３９中の合成物１５・合成物
１８の単量体比は約１２％であった。（元素分析Ｎ値
１5.６８％）生成したゲルは紫外線ランプにより滅菌処
理した後、細胞培養実験に供した。
ラジカル重合法により合成した。シラン処理したガラス
板（５cm×６cm×１cm）２枚とガスケットを用意した。
合成物１５ 0.２３ｇ（0.４mmol）と合成物１８ 0.２
８ｇ（0.４mmol）と製造物１０ 1.４９ｇ（7.２mmol）
を蒸留水に溶解し、１０wt％のモノマー溶液とした。１
Ｎ NaOH でpH7.４に合わせてから、過硫酸アンモニウム
１１mgを加え充分窒素置換をした後、ガラス板の間に注
入した。万力でガラス板を押え、６０℃で４０時間重合
させた。生成したハイドロゲルを蒸留水で洗浄し未反応
モノマーを除いた。合成物３９中の合成物１５・合成物
１８の単量体比は約１２％であった。（元素分析Ｎ値
１5.６８％）生成したゲルは紫外線ランプにより滅菌処
理した後、細胞培養実験に供した。
【０１１１】 試験例１ 細胞接着性阻害活性の測定 本発明のプロペンアミド誘導体の共重合物の塩は、細胞
のフィブロンネクチンやビトロネクチンに対する接着を
阻害する。その活性の測定方法を以下に示す。本実験例
で用いられた競争法は基本的に生化学分野では広く用い
られているものであり、例えば“Methods in Enzymolog
y"、８２、８０３−８３１（１９８１）、特開平１−３
０９６８２号、同２−１７４７９７号に開示されてい
る。
のフィブロンネクチンやビトロネクチンに対する接着を
阻害する。その活性の測定方法を以下に示す。本実験例
で用いられた競争法は基本的に生化学分野では広く用い
られているものであり、例えば“Methods in Enzymolog
y"、８２、８０３−８３１（１９８１）、特開平１−３
０９６８２号、同２−１７４７９７号に開示されてい
る。
【０１１２】 実験方法 1. フィブロネクチンおよびビトロネクチン吸着プレー
トの作製市販のフィブロネクチン（ヒト由来：生化学工
業（株）より購入）あるいはビトロネクチン（ヒト由来
フナコシ薬品（株）より購入）をＰＢＳで各々1.０μ
ｌ／ml、2.０μｌ／mlに希釈しその希釈液0.５mlを２４
穴のプラスチックプレートに入れ３７℃で一晩保温しコ
ーティングした。次に非特異的吸着を防ぐ目的で牛血清
アルブミン（ＢＳＡ１％）を加え３７℃で１時間保温
し、その後通常の洗浄操作（ＰＢＳ）を加え充分に水切
りしてフィブロネクチン吸着プレートを作製した。同様
の操作によりビトロネクチン吸着プレートを作製した。
トの作製市販のフィブロネクチン（ヒト由来：生化学工
業（株）より購入）あるいはビトロネクチン（ヒト由来
フナコシ薬品（株）より購入）をＰＢＳで各々1.０μ
ｌ／ml、2.０μｌ／mlに希釈しその希釈液0.５mlを２４
穴のプラスチックプレートに入れ３７℃で一晩保温しコ
ーティングした。次に非特異的吸着を防ぐ目的で牛血清
アルブミン（ＢＳＡ１％）を加え３７℃で１時間保温
し、その後通常の洗浄操作（ＰＢＳ）を加え充分に水切
りしてフィブロネクチン吸着プレートを作製した。同様
の操作によりビトロネクチン吸着プレートを作製した。
【０１１３】 2. 接着阻害実験 凍結乾燥により得たプロペンアミド誘導体の共重合物の
塩をDulbecco's Modified Eagles Medium(以下ＤＭＥＭ
と略記する）に溶解し、０、0.２５、0.５、1.０、1.５
mg／mlの各濃縮の溶液とした。この溶液0.２５mlを上記
方法で作製したプレートに入れ、そこへ血管内皮細胞
（４×１０6 cells ／ml）の懸濁液を0.２５ml加え、３
７℃で１時間保温し細胞を接着させた。ＤＭＥＭ培地で
３回洗浄し、未接着の細胞を剥離し、２％トリパンブル
ーで染色して細胞数を計測した。結果を表１及び表２に
示す。
塩をDulbecco's Modified Eagles Medium(以下ＤＭＥＭ
と略記する）に溶解し、０、0.２５、0.５、1.０、1.５
mg／mlの各濃縮の溶液とした。この溶液0.２５mlを上記
方法で作製したプレートに入れ、そこへ血管内皮細胞
（４×１０6 cells ／ml）の懸濁液を0.２５ml加え、３
７℃で１時間保温し細胞を接着させた。ＤＭＥＭ培地で
３回洗浄し、未接着の細胞を剥離し、２％トリパンブル
ーで染色して細胞数を計測した。結果を表１及び表２に
示す。
【０１１４】 表１ フィブロネクチンに対する細胞接着阻害(cells／well) 濃度（mg／ml） ０ 0.25 0.5 1.0 1.5 添加化合物 合成物１９−１ × △ ○ ○ ○ 合成物１９−２ × △ ○ ○ ○ 合成物１９−３ × △ ○ ○ ○ 合成物２０ × △ ○ ○ ○ 合成物２１ × △ ○ ○ ○ 合成物２２ × × △ △ ○ 合成物２３ × × △ △ ○ 合成物２４ × △ ○ ○ ○ 合成物２５ × △ ○ ○ ○ 合成物２６ × △ ○ ○ ○ 合成物２７ × △ ○ ○ ○ 合成物２８ × △ △ ○ ○ 合成物２９ × △ ○ ○ ○ 合成物３０ × △ ○ ○ ○ 合成物３１ × △ △ ○ ○ 合成物３２ × △ ○ ○ ○ 合成物３３ × △ ○ ○ ○ 合成物３４ × △ ○ ○ ○ 合成物３５ × △ ○ ○ ○ 合成物３６ × △ ○ ○ ○ 合成物３７ × △ ○ ○ ○ 合成物３８ × △ ○ ○ ○ 製造物１２ × × × × × ＲＧＤ × × × × △ ＲＧＤＳ × × × △ △ (cells／well) ； ○：５０以下、△：５１〜９９、×：１００以上
【０１１５】 表２ ビトロネクチンに対する細胞接着阻害(cells／well) 濃度（mg／ml） ０ 10 50 100 300 添加化合物 合成物１９−１ × ○ ○ ○ ○ 合成物１９−２ × ○ ○ ○ ○ 合成物１９−３ × ○ ○ ○ ○ 合成物２０ × ○ ○ ○ ○ 合成物２１ × ○ ○ ○ ○ 合成物２２ × × △ ○ ○ 合成物２３ × × △ ○ ○ 合成物２４ × ○ ○ ○ ○ 合成物２５ × ○ ○ ○ ○ 合成物２６ × ○ ○ ○ ○ 合成物２７ × ○ ○ ○ ○ 合成物２８ × △ △ ○ ○ 合成物２９ × ○ ○ ○ ○ 合成物３０ × ○ ○ ○ ○ 合成物３１ × △ △ ○ ○ 合成物３２ × ○ ○ ○ ○ 合成物３３ × ○ ○ ○ ○ 合成物３４ × ○ ○ ○ ○ 合成物３５ × ○ ○ ○ ○ 合成物３６ × ○ ○ ○ ○ 合成物３７ × ○ ○ ○ ○ 合成物３８ × ○ ○ ○ ○ 製造物１２ × × × × × ＲＧＤ × × × △ △ ＲＧＤＳ × × △ △ ○ (cells／well) ；○：１００以下、△：１０１〜１９９、×：２００以上
【０１１６】 試験例２ 血小板凝集阻害活性の測定 本発明において合成したプロペンアミド誘導体の共重合
物の塩のin vitro系での血小板凝集阻害作用をヒト多血
小板血漿を用いて検討した。以下にその実験方法を示
す。
物の塩のin vitro系での血小板凝集阻害作用をヒト多血
小板血漿を用いて検討した。以下にその実験方法を示
す。
【０１１７】 実験方法 新鮮なヒト血液に１／９量の3.８％クエン酸ナトリウム
を加え遠心分離（１０００rpm 、１０分）し、上層を多
血小板血漿として分取した。凍結乾燥より得たプロペン
アミド誘導体の共重合物の塩を０−1.５mg／mlの種々の
濃度となる様に生理食塩水に溶解した。この塩溶液２５
μｌを血漿２００μｌに加え、３７℃で３分間インキュ
ベートしたのち、５０μＭアデノンシ二リン酸（ＡＤ
Ｐ）溶液あるいは２００μｇ／mlのコラーゲン溶液を２
５μｌ加え凝集の様子をアグリゴメーターを用いて透過
度を測定することにより検定した。結果を表３に示す。
を加え遠心分離（１０００rpm 、１０分）し、上層を多
血小板血漿として分取した。凍結乾燥より得たプロペン
アミド誘導体の共重合物の塩を０−1.５mg／mlの種々の
濃度となる様に生理食塩水に溶解した。この塩溶液２５
μｌを血漿２００μｌに加え、３７℃で３分間インキュ
ベートしたのち、５０μＭアデノンシ二リン酸（ＡＤ
Ｐ）溶液あるいは２００μｇ／mlのコラーゲン溶液を２
５μｌ加え凝集の様子をアグリゴメーターを用いて透過
度を測定することにより検定した。結果を表３に示す。
【０１１８】 凝集阻害率（１−Ｔ／Ｔ0 ）×１００％ Ｔ0 ＝プロペンアミド誘導体の共重合物の塩、非添加時
の透過度 Ｔ ＝プロペンアミド誘導体の共重合物の塩、添加時の
透過度
の透過度 Ｔ ＝プロペンアミド誘導体の共重合物の塩、添加時の
透過度
【０１１９】 表３ 血小板凝集阻害 添加化合物 阻害活性 ＡＤＰ刺激 コラーゲン刺激 合成物１９−１ ○ ○ 合成物１９−２ ○ ○ 合成物１９−３ ○ ○ 合成物２０ ○ ○ 合成物２１ ○ ○ 合成物２２ △ ○ 合成物２３ △ ○ 合成物２４ ○ ○ 合成物２５ ○ ○ 合成物２６ ○ ○ 合成物２７ ○ ○ 合成物２８ ○ ○ 合成物２９ ○ ○ 合成物３０ ○ ○ 合成物３１ ○ ○ 合成物３２ ○ ○ 合成物３３ ○ ○ 合成物３４ ○ ○ 合成物３５ ○ ○ 合成物３６ ○ ○ 合成物３７ ○ ○ 合成物３８ ○ ○ 製造物１０ × × ＲＧＤ △〜○ △〜○ ＲＧＤＳ △〜○ △〜○ ＩＣ50（μｇ／ml）；○：４０以下、△：４０〜８０、×：８０以上
【０１２０】 試験例３ 動物細胞の増殖性の評価 実施例および比較例にて作成した動物細胞培養基体を用
いて細胞培養を行なった。細胞は血管内皮細胞を用い、
培養液はＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含むＤＭＥＭを用いた。この培養液に細胞を１×１０
4 個／mlの割合となるように浮遊させ、予め架橋共重合
物を入れておいたプラスチックシャーレの中に、１×１
０4 個／cm2 となる割合で加えた。これを３７℃、５％
の炭酸ガス雰囲気下にて培養した。培養後、位相差顕微
鏡にて接着性および増殖性の観察を行った。結果を表４
に示した。
いて細胞培養を行なった。細胞は血管内皮細胞を用い、
培養液はＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含むＤＭＥＭを用いた。この培養液に細胞を１×１０
4 個／mlの割合となるように浮遊させ、予め架橋共重合
物を入れておいたプラスチックシャーレの中に、１×１
０4 個／cm2 となる割合で加えた。これを３７℃、５％
の炭酸ガス雰囲気下にて培養した。培養後、位相差顕微
鏡にて接着性および増殖性の観察を行った。結果を表４
に示した。
【０１２１】 表４ 動物細胞の増殖性の評価 ＤＭＥＭ培地 ＤＭＥＭ／ＦＣＳ培地 接着性 増殖性 接着性 増殖性 実施例（合成物３９） ○ ○ ○ ○ 比較例（製造物１３） ×〜△ ×〜△ △〜○ △〜○ ○：良好、 △：やや不良、 ×：不良
【０１２２】比較に用いた製造物１３はＦＣＳを含まな
いＤＭＥＭ培地において細胞接着性および増殖性は、実
施例の合成物３９の基体に比べ劣っていた。
いＤＭＥＭ培地において細胞接着性および増殖性は、実
施例の合成物３９の基体に比べ劣っていた。
【０１２３】
【０１２４】 配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa は4Abuで置換されている 配列 Xaa Arg Gly Asp 1
【０１２５】 配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ala はbAlaで置換されている 配列 Ala Arg Gly Asp Arg Gly Asp 1 5
【０１２６】 配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ala はbAlaで置換されている 配列 Ala Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg GlyAsp 1 5 10
【０１２７】 配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ala はbAlaで置換されている 配列 Ala Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Asp 1 5 10 15
【０１２８】 配列番号：５ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa は4Abuで置換されている 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1
【０１２９】 配列番号：６ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa はNva で置換されている 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３０】 配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa はAcp で置換されている 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３１】 配列番号：８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa は１２−アミノラウリン酸で置換されて
いる 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1 5
いる 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３２】 配列番号：９ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Leu Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３３】 配列番号：１０ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Gln Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３４】 配列番号：１１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa はｐ−アミノ安息香酸で置換されている 配列 Xaa Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３５】 配列番号：１２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Xaa はNva で置換されている 配列 Xaa Gly Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３６】 配列番号：１３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5
【０１３７】 配列番号：１４ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３８】 配列番号：１５ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ala はbAlaで置換されている 配列 Ala Arg Gly Asp Ser 1 5
【０１３９】 配列番号：１６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ala はbAlaで置換されている 配列 Ala Arg Gly Asp Ser Gly 1 5
【０１４０】 配列番号：１７ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Arg Gly Asp Gly 1
【０１４１】 配列番号：１８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列の特徴： 特徴を表す記号：modified site 存在位置：１ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：Ala はbAlaで置換されている 配列 Ala Arg Gly Asp Gly 1 5
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/78 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ Ｃ１２Ｍ 3/00 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
Claims (8)
- 【請求項１】 下記一般式〔Ｉ〕の側鎖に、下記一般式
〔ＩＩ〕又は〔ＩＩＩ〕で表される接着性ペプチドを必
須単位として有するプロペンアミド誘導体と、下記一般
式〔ＩＶ〕で表されるカチオン性単量体との共重合物又
はその塩。 一般式〔Ｉ〕 Ｒ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３−ＣＯ−［ＮＨ］− 式中、Ｒ１、Ｒ２は水素原子又はカルボキシル基を表
し、Ｒ３は水素原子、メチル基、エチル基、ハロゲン原
子又はカルボキシメチル基を表す。 一般式〔ＩＩ〕 −（Ｒ ４ ）−［ＣＯ］−（［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−［Ｙ］）ｎ− ［Ｚ］−Ｈ 一般式〔ＩＩＩ〕 Ｈ−［ＣＯ］−（［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−［Ｙ］）ｎ−［Ｚ］− （Ｒ ５ ）− 一般式〔ＩＩ］、〔ＩＩＩ〕において 、Ｘ、ＹはＳｅ
ｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓｎ，Ｐｒｏから選択されるア
ミノ酸残基又はペプチド残基を表し、Ｚは−Ｏ−又は−
ＮＨ−を示す。Ｒ４、Ｒ５は炭素数が１〜１１の直鎖又
は分岐のアルキレン基、又は炭素数が６〜１１のアリー
レン基を表し、置換基を有していてもよい。ｎは１〜５
の整数を表す。 一般式〔ＩＶ〕 Ｈ２Ｃ＝ＣＲ６−［ＣＯ］−［Ｗ］−Ｒ７ 一般式〔ＩＶ〕において 、Ｒ６は水素原子又は炭素数１
〜３のアルキル基で置換基を有していてもよい。Ｗは−
Ｏ−又は−ＮＨ−を示す。Ｒ７は水素原子又は炭素数が
１〜１２の直鎖又は分岐のアルキル基、又は炭素数が６
〜１１のアリール基であり、置換基として少なくともア
ミノ基、イミノ基、ニトリロ基、アミジノ基、アンモニ
ウム、４級アンモニウムのいずれか一つを含み、さらに
置換基を有していてもよい。一般式〔Ｉ〕、〔ＩＩ〕、
〔ＩＩＩ〕、〔ＩＶ〕において［］は［］内の基が存在
するかあるいは存在しなくてもよいことを示す。 - 【請求項２】 分子量が約3,000 〜200,000 の範囲であ
る、請求項１記載のプロペンアミド誘導体共重合物又は
その塩。 - 【請求項３】 プロペンアミド誘導体由来の構成単位の
含有量が0.1 〜90モル％である、請求項１記載のプロペ
ンアミド誘導体共重合物又はその塩。 - 【請求項４】 請求項１記載のプロペンアミド誘導体と
カチオン性単量体との架橋共重合物又はその塩。 - 【請求項５】 プロペンアミド誘導体由来の構成単位及
び多官能性単量体由来の構成単位の含有量が、それぞれ
0.1 〜90モル％及び0.1 〜30モル％である請求項４記載
の架橋共重合物又はその塩。 - 【請求項６】 請求項１、２又は３記載のプロペンアミ
ド誘導体共重合物又はその塩を有効成分とする動物細胞
の接着阻害剤。 - 【請求項７】 請求項１、２又は３記載のプロペンアミ
ド誘導体共重合物又はその塩を有効成分とする血小板凝
集・粘着抑制剤。 - 【請求項８】 請求項４又は５記載のプロペンアミド誘
導体とカチオン性単量体との架橋共重合物又はその塩を
有効成分とする動物細胞培養基体。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3066160A JP2745343B2 (ja) | 1990-11-30 | 1991-03-29 | プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途 |
| EP91120332A EP0488258B1 (en) | 1990-11-27 | 1991-11-27 | Propenamide derivatives, polymers, copolymers and use thereof |
| DE69118826T DE69118826T2 (de) | 1990-11-27 | 1991-11-27 | Propenamidderivate, deren Polymere, Copolymere und deren Verwendung |
| US08/278,251 US6046289A (en) | 1990-11-27 | 1994-07-20 | Propenamide derivatives containing Arg-Gly-Asp polymers obtained therefrom |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-334793 | 1990-11-30 | ||
| JP33479390 | 1990-11-30 | ||
| JP3066160A JP2745343B2 (ja) | 1990-11-30 | 1991-03-29 | プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04213312A JPH04213312A (ja) | 1992-08-04 |
| JP2745343B2 true JP2745343B2 (ja) | 1998-04-28 |
Family
ID=26407331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3066160A Expired - Fee Related JP2745343B2 (ja) | 1990-11-27 | 1991-03-29 | プロペンアミド誘導体とカチオン性単量体との共重合物およびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2745343B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5000439B2 (ja) * | 2007-09-19 | 2012-08-15 | 三洋化成工業株式会社 | 細胞培養用担体 |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3066160A patent/JP2745343B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 第１１回日本バイオマテリアル学会大会予稿集１９８９第８２頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04213312A (ja) | 1992-08-04 |
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