JP3190758B2 - ペプチド誘導体及びその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は特定の構成を有するペプ
チドの誘導体またはその薬学上許容可能な塩及びそれら
の用途に関するものである。

【０００２】

【従来技術】フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネク
チン等は細胞と結合組織との結合に関与し、また動物細
胞の細胞機能に関連した種々の生物活性を有する蛋白質
であり、細胞接着性蛋白質と総称される。例えばフィブ
ロネクチンは肝臓で生合成され、ヒト血漿中に約0.3 mg
/mlの濃度で存在する糖蛋白質である。

【０００３】フィブロネクチンはその１次構造が分子ク
ローニングを用いて決定されており（Koarnblihtt, A.
R. et al., EMBO Journal, 4巻, 2519 (1985)）、分子
量約２５０ＫのポリペプチドであるＡ鎖と約２４０Ｋの
Ｂ鎖がＣ末端附近でジスルフィド結合した２量体蛋白質
であることが明らかにされている。またラミニンについ
ても佐々木ら（Sasaki, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 81巻, 935 (1987), Sasaki, M. et al.,
J. Biol. Chem., 262巻, 17111 (1987)）によりその１
次構造が決定されている。ラミニンはＡ、Ｂ１、Ｂ２と
よばれる３本のポリペプチド鎖から構成されており、十
字架状の構造をとっていることが知られている。

【０００４】そして細胞接着性に関与する結合部位の研
究も行われ、フィブロネクチンの細胞接着部のコア配列
はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）なるトリペプチド
であることが1984年に報告された（Pierschbacher, M.
D. et al., Nature 309巻, 30(1984)）。またラミニン
の細胞接着部位のコア配列はＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）で表されるペンタペプチ
ドであることも解明されている（Graf, J. et al., Cel
l 48巻, 989 (1987)）。

【０００５】これらフィブロネクチンやラミニンは、上
記コア配列を介して細胞のレセプターと結合することに
より各種の情報を細胞に伝達し、またヘパリン、コラー
ゲン、フィブリン等の生体高分子とも結合して細胞と結
合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与しているもの
と考えられている。

【０００６】このように細胞接着性蛋白質は多様な生物
活性を有するため、その活性部位配列ペプチドを用いた
研究が精力的になされている。例えばフィブロネクチン
の細胞結合部のコア配列の利用としては、ポリマーにＲ
ＧＤ配列を有するペプチドを共有結合させ、人工臓器用
基体や動物細胞培養用基体として用いる方法（特開平1-
309682号公報、特開平1-305960号公報、WO 90/05036 A
特許）、ＲＧＤ配列を有するペプチドに疎水性領域を連
結することにより目的とするペプチドを固体表面に付着
させ、歯科用埋め込み剤や組織培養基体に利用する方法
（WO 90/11297A特許）、ＲＧＤ配列を有する種々の環状
及び鎖状オリゴペプチドまたはその類縁体を用いて血小
板凝集を阻害する方法あるいは血栓症を予防、治療する
方法（高分子学会予稿集第38巻、3149 (1989)、特開平2
-174797号公報、特開平3-118330号公報、特開平3-11833
1号公報、特開平3-118398号公報、特開平3-118397号公
報、特開平3-118333号公報、WO 91/01331特許、WO 91/0
7429特許、WO 91/15515特許、WO 92/00995特許）、ＲＧ
Ｄペプチドとヒアルロン酸を共有結合した化合物を用い
て血小板凝集を調節する方法（特開平4-134096号公
報）、ＲＧＤ配列を有するペプチドを細胞移動制御剤と
して用いる方法（特開平2-4716号公報）、ＲＧＤ配列を
有するペプチドを固定化した膜を細胞接着膜として用い
る方法（高分子学会予稿集第37巻、705 (1988)）、ＲＧ
ＤＳ配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護
剤として用いる方法（特開昭64ー6217号公報）、ポリペ
プチド分子内に細胞接着活性を有するペプチドを付加す
ることにより人工機能性ポリペプチドとして利用する方
法（特開平3-34996号公報）等が開示されている。

【０００７】更に近年、細胞接着性蛋白質はガン転移に
関与する生体分子としても注目されてきている。癌転移
の一連の段階では、ガン細胞は種々の宿主細胞や生体高
分子と接触する。このときフィブロネクチンやラミニン
のような細胞接着性分子が存在すると該細胞は多細胞塊
を形成し、ガン細胞の増殖や生存がより容易になる。と
ころが、たとえばフィブロネクチンの接着部位コア配列
であるトリペプチドＲＧＤが共存すると、競争的に癌細
胞上のフィブロネクチンレセプターと結合するため細胞
接着がブロックされ、ガン転移阻害作用を示すことが報
告されている（Science 238巻, 467 (1986)）。

【０００８】しかしながらＲＧＤペプチドはそれ単独で
は細胞接着活性が充分でないため、効果の増強をはかる
目的で該配列を有するオリゴペプチド、環状オリゴペプ
チド、あるいはその繰返し配列を有するポリペプチドを
用いてガン転移を制御する方法（Int. J. Biol. Macrom
ol., 11巻, 23 (1989)、同誌, 11巻, 226 (1989)、Jpn.
J. Cancer Res., 60巻, 722, (1989)、特開平2-174798
号公報）、あるいは腫瘍再発を防止する方法（特開平2-
240020号公報）が試みられている。またフィブロネクチ
ン分子中の細胞接着ポリペプチドとヘパリン結合ポリペ
プチドを構成単位とするポリペプチドを用いてガン転移
を抑制する方法（特開平3-127742号公報）も報告されて
いる。しかし従来の研究では、ＲＧＤ（Arg-Gly-Asp）
なるコア配列はレセプターとリガンドの認識が関与する
各種の生物活性の発現に必須なものとされており、特に
Gly部分を他のアミノ酸残基で置換したアナログでは、
活性が消失することが報告されていた（高分子学会予稿
集，38巻，3149 (1989)、J. Biol. Chem., 262 巻, 172
94 (1987)）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、フィブ
ロネクチン等の細胞接着性蛋白質あるいはそのペプチド
断片を医薬品や関連医用材料として利用する研究は盛ん
に行われており、特にＲＧＤペプチドをガン転移抑制剤
として応用しようとする試みは活発である。しかしなが
ら該コア配列の細胞接着活性は未だ充分でないため、そ
れらのガン転移抑制作用は実際の医療に応用するために
は満足できるものではなかった。また一般に薬物が生体
に投与されたのち薬効を維持するためには、それ自体の
生物活性の強さのみならず薬物の生体内での安定性（例
えば血流中での滞留時間や排泄される時間など）が重要
であることが知られている。細胞接着性蛋白質の活性部
位コア配列ペプチドも例外ではなく、それ単独ではペプ
チド類に特有の速い代謝分解や排泄が起こり、結果的に
所望の効果が期待できない場合も生ずる。そこで生体内
での安定性を向上させるため従来技術の項で説明したよ
うな種々の方法が報告されているが、それらの化合物の
なかには未だ生物活性が不充分であったり、合成が困難
なものも多い。またポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
等の高分子と該コア配列を連結する方法や、該コア配列
を繰返すことにより高分子量化を行う方法も知られてい
るが、これらの方法では目的物の構造や分子量を特定し
て合成を行うことは極めて困難であり、この点で更に有
効な物質の開発が必要とされていた。

【００１０】従って本発明の目的は、細胞接着性蛋白質
様の活性を充分に保持しており、接着コア配列であるAr
g-Gly-Aspよりもガン転移抑制能が増強された新規なペ
プチド配列を必須構成単位として含み、さらに血液中で
の安定性が高く、簡便な手段で合成可能な新規なペプチ
ド誘導体を提供することにある。本発明はさらに上記ペ
プチド誘導体を含有してなる薬物組成物の提供も目的と
する。

【００１１】

【課題を解決する手段】本発明者らはこれまでにフィブ
ロネクチンの接着コア配列Arg-Gly-Asp-Serの特にGly部
とSer部、およびＮ末端側を種々のアミノ酸に変更した
アナログの系統的な検討を行った結果、ガン転移抑制活
性を充分に保持し、血液中での安定性の高い新規なペプ
チド配列を見出し、すでに特許出願済（特願平4-2279
9）である。本発明者らは、さらに合成も容易でかつガ
ン転移抑制能の高い新規な化合物を求めて鋭意検討を行
った結果、下記一般式（Ｉ）で表されるペプチド誘導体
またはその薬学上許容できる塩を見出したことにより上
記課題を達成、本発明を完成したものである。一般式
（Ｉ）

【００１２】

【化２】

【００１３】一般式（Ｉ）中、Ｒは下記一般式（II）で
表されるペプチド配列を表す。一般式（II） −［Ｚ］−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−［Ｙ］ （II） 一般式（II）中、ＡｒｇはＬ−またはＤ−アルギニンを
表し、ＡｓｐはＬ−またはＤ−アスパラギン酸を表す。
ＸはＬ−またはＤ−ロイシンもしくはＤ−イソロイシン
を表す。［ ］は、［ ］内の残基が存在しても存在し
なくてもよいことを表し、存在する場合ＺはＬ−または
Ｄ−アスパラギン酸を、ＹはＬ−セリンまたはＬ−スレ
オニンを表す。

【００１４】本発明のペプチド誘導体は、一般式（II）
で表されるペプチドのＮ末端アミノ基がトリメシン酸と
アミド結合してなる化合物であり、１分子中に３個の一
般式（II）で表されるペプチド配列を含んでいることを
特徴とする。従っていわゆるポリマー類とは異なり、分
子構造は明確である。本発明において、一般式（II）で
表されるペプチド配列をトリメシン酸と共有結合せしめ
るのは、有効なペプチドの周辺を修飾することにより生
体内酵素等による分解から保護したり、また高分子量に
して徐放効果を付与することを意図したものである。

【００１５】本発明のペプチド誘導体中に存在するイオ
ン性基は、適当な対イオンと塩を形成していてもよい。
塩の状態でも本発明の化合物はその生物学的活性を充分
に維持する。ただしその塩は生理学的、薬理学的に許容
されるものであることが必要である。具体的には塩酸
塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩の様な無機酸との塩、酢
酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩、さらにナト
リウム塩、カリウム塩などが挙げられるが、なかでも塩
酸塩、ナトリウム塩が特に好ましい。そのような塩への
変換は慣用手段により行うことができる。

【００１６】以下に本発明のペプチド誘導体の具体例を
列挙するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。なお該ペプチド誘導体のＣ末端が−ＯＨの場合は、
該分野の慣例によりその記載を省略する。またアミノ酸
残基がＤ−体の場合はD- と表記するが、天然型のＬ−
体の場合は特に表記していない。

【００１７】

【化３】

【００１８】次に本発明の化合物の合成法について説明
する。本発明のペプチド誘導体は種々の方法でこれを合
成することができるが、まず保護ペプチド部を合成のの
ちアミノ末端側の保護基を除去し、これをトリメシン酸
と縮合せしめ、しかるのちに保護基を除去することによ
り合成する方法が実用的かつ有利である。ペプチド部の
合成方法としては特に限定しないが、固相法及び固相法
を利用したペプチド自動合成装置による合成法がまず挙
げられる。固相法及び固相法を利用したペプチド自動合
成装置による合成法に関しては、生化学実験講座・タン
パク質の化学IV p.207（日本生化学会編、東京化学同
人）、続生化学実験講座・タンパク質の化学（下） p.6
41（日本生化学会編、東京化学同人）等に記載されてい
る。

【００１９】本発明の化合物のペプチド部は液相法によ
って合成する場合は、Ｃ末端成分となる保護アミノ酸か
ら出発し、Ｃ末端を保護あるいは修飾ののちアミノ末端
保護基を除去、以下保護アミノ酸残基を逐次縮合あるい
はフラグメント縮合を行い、まず全保護ペプチドを合成
する。保護アミノ酸あるいは保護ペプチドを縮合する方
法としては、公知の方法、例えば泉屋信夫ら編「ペプチ
ド合成の基礎と実験」（丸善）に記載の方法のなかから
適宜選択することができるが、1-ヒドロキシベンゾトリ
アゾールとＤＣＣを用いるDCC-Additive法、あるいはカ
ルボニルジイミダゾールを用いる縮合法が最も良い結果
を与えた。

【００２０】以上の方法により合成した全保護ペプチド
のアミノ末端保護基を除去し、これをトリメシン酸と縮
合する。縮合反応を行う方法としては、ＤＣＣあるいは
カルボニルジイミダゾールといった縮合剤を用いること
も可能であるが、ピリジンあるいは３級アミン等の脱ハ
ロゲン化水素剤の存在下、酸ハロゲン化物具体的にはト
リメシン酸クロライドと反応させる方法が実用的かつ有
利である。トリメシン酸クロライドは市販品を用いるこ
とも勿論可能である。

【００２１】保護基の除去の条件は用いている保護基の
種類に依存する。通常用いられる方法は、加水素分解、
ＨＦ処理、トリフルオロメタンスルホン酸／チオアニソ
ール／m-クレゾール／トリフルオロ酢酸混合系処理等で
あるが、保護基の種類によってはさらにさまざまな方法
も可能であることは言うまでもない。目的とするペプチ
ド誘導体は脱保護ののち公知の方法、例えばイオン交換
クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなど
で精製することができる。

【００２２】つぎに本発明のペプチド誘導体の作用及び
用途について説明する。本発明のペプチド誘導体のin v
ivo系での強力なガン転移抑制作用の機構は未だ完全に
明らかではないが、フィブロネクチンの接着コア配列ペ
プチドであるArg-Gly-Aspと類似の機構で悪性細胞上の
フィブロネクチン受容体に作用し、フィブロネクチンへ
の結合を阻害することにより悪性細胞の接着、コロニー
化、破壊的浸食を阻止するものと考えられる。さらに本
発明のペプチド誘導体は１分子中に一般式（II）で表さ
れる配列を３個有するため悪性細胞上のフィブロネクチ
ン受容体に多点で作用し、またある程度の大きい分子量
を有するため酵素分解や代謝によって排泄されにくく、
そのため顕著なガン転移阻害活性を示すと考えられる。
本発明のペプチド誘導体は乳癌、表皮癌、筋線メラノー
マ（muscle line melanoma）、表皮線神経芽細胞腫xグ
リオマ（epidermal line neuroblastoma x glioma）、
軟骨細胞、フィブロザルコーマを含め種々の細胞の接着
及び転移を阻止するのに有効である。

【００２３】さらに本発明のペプチド誘導体は創傷治癒
作用等の広範な生物活性が認められた。また本発明のペ
プチド誘導体はマウスを用いて毒性試験を行ったとこ
ろ、毒性は全く認められなかった。

【００２４】本発明のペプチド誘導体またはその薬学上
許容可能な塩は、ペプチド系医薬に一般に使用されてい
る投与方法によって使用することができ、通常賦形剤を
含む薬物組成物として投与される。この薬物組成物はレ
ミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Scien
ces, Merck, 16, (1980)）に開示されているように、知
られているどのような方法で製造してもよい。賦形剤と
しては蒸留水、生理食塩水、リン酸塩あるいは酢酸塩の
様な緩衝塩類を含有する緩衝液、浸透圧調節剤としての
塩化ナトリウムやショ糖、若しくはアスコルビン酸のよ
うな酸化防止剤、または許容し得るこれらの組合せがあ
る。

【００２５】このような薬物組成物は溶液、錠剤の様な
種々の形態とすることができる。投与形態としては経
口、経鼻、非経口（静脈注射、皮下注射、腹腔内投与な
ど）等のなかから適宜選択することができる。例えば生
理食塩水に溶解して注射用製剤としても良く、あるいは
0.1規定程度の酢酸緩衝液に溶解したのち凍結乾燥剤と
しても良い。またリポソーム中に内包したマイクロカプ
セル剤あるいはミクロスフェアー等の形態で利用するこ
とも可能である。

【００２６】本発明のペプチド誘導体の投与量は、患者
の体重に対して通常一日0.2 μg/kgから200 mg/kgの範
囲であるが、患者の年齢、体重、症状、投与方法によっ
て決定されるものである。

【００２７】

【実施例】以下実施例によって本発明を更に詳細に説明
する。なお通常用いられる溶媒や試薬、保護基の表記に
は以下の略号を使用した。

【００２８】Ｂｏｃ ：t-ブトキシカルボニル Ｂｎ ：ベンジル ＡｃＯＥｔ ：酢酸エチル Ｍｔｓ ：メシチレンスルホニル ＨＯＢｔ ：1ーヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ｉＰｒ₂ＮＥｔ ：ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド ＣＤＩ ：カルボニルジイミダゾール ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＴＦＭＳＡ ：トリフルオロメタンスルホン酸

【００２９】実施例１ 化合物１の合成 化合物１の液相法による合成法について詳細に説明す
る。化合物１の合成経路を以下に示す。

【００３０】

【化４】

【００３１】

【化５】

【００３２】１） 中間体１の合成 Boc-Ser(Bn)-OH (20.4 g, 69 mmol)、ベンジルブロミド
(13 g, 76 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (9.8
g, 76 mmol)を酢酸エチル (100 ml)に溶解し、反応混合
物を５時間加熱還流した。室温まで放冷した後生成した
塩を濾過して除き、濾液を水、1 M クエン酸溶液、飽和
重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥
ののち減圧濃縮して中間体１を無色油状物として得た。
このものは精製することなく次の反応に用いた。

【００３３】２）中間体２の合成 前項記載の方法により得た中間体１の塩化メチレン (80
ml) 溶液にトリフルオロ酢酸 (80 ml) を加え、反応混
合物を室温で４０分間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し
て大部分の溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルで希釈し、
飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで
乾燥ののち減圧濃縮してアミン体を無色油状物として得
た。得られたアミン体と、Boc-Asp(Bn)-OH (22.6 g, 70
mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (1
0.7 g, 70 mmol)をDMF (80 ml) 及び塩化メチレン (80
ml)の混合溶媒に溶解し、氷冷しながらDCC (14.4 g, 70
mmol) を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室
温まで昇温しながら終夜撹拌した後、セライト濾過して
生成した沈殿を除去した。濾液を適当量の酢酸エチルで
希釈し、水、5% 炭酸ナトリウム溶液、1 M クエン酸溶
液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥のの
ち減圧濃縮して油状物を得た。シリカゲルカラムクロマ
トグフラフィーで精製（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル
＝４／１）し、目的とする中間体２を無色結晶として35
.8 g（３段階で収率87 %）得た。

【００３４】３） 中間体３の合成 中間体２ (35.7 g, 60.5 mmol) の塩化メチレン (100 m
l) 溶液にトリフルオロ酢酸 (100 ml) を加え、反応混
合物を室温で４０分間撹拌した。反応終了後溶媒を留去
し、残渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸
塩32.5 gを得た。得られたトリフルオロ酢酸塩 (22.7
g, 37.6 mmol) と、Boc-Leu-OH・１水和物 (9.34 g, 3
7.6 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物
(5.76 g,37.6 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (5.
2 g, 40 mmol) をDMF (40 ml) 及び塩化メチレン (40 m
l)の混合溶媒に溶解し、氷冷しながらDCC (7.76 g, 37.
6mmol) を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室
温まで昇温しながら終夜撹拌した後、セライト濾過して
生成した沈殿を除去した。濾液を適当量の酢酸エチルで
希釈し、水、5 % 炭酸ナトリウム溶液、1 M クエン酸溶
液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥のの
ち減圧濃縮して無色固形物を得た。このものをヘキサン
／酢酸エチル（２／１）から再結晶して中間体３を22.1
g（84 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 704.

【００３５】４） 中間体４の合成 中間体３ (21.0 g, 30 mmol) の塩化メチレン (60 ml)
溶液にトリフルオロ酢酸 (60 ml) を加え、反応混合物
を室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残
渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩20.8
gを得た。一方Boc-Arg(Mts)-OH (6.7 g, 15 mmol)をDM
F (20 ml) に溶解し、このものに氷冷しながらCDI（2.4
g, 15 mmol) のDMF (15 ml) 溶液を加えた。反応混合
物を氷冷しながら１時間撹拌したのち、上記操作により
得られたトリフルオロ酢酸塩 (10.6 g, 15 mmol) とジ
イソプロピルエチルアミン (2.0 g, 15.5 mmol) のDMF
(30 ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、
更に室温まで昇温しながら終夜撹拌した後、減圧下大部
分の溶媒を留去した。残渣を氷水にあけて粗結晶を析出
させた。得られた粗結晶を濾過して集め、水洗ののち風
乾して目的とする中間体４を無色結晶として14.4 g (92
%) 得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1042.

【００３６】５） 中間体５の合成 中間体４ (10 g, 9.6 mmol) のジオキサン (70 ml) 溶
液に塩化水素／ジオキサン溶液 (4 M, 60 ml) を加え、
反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応終了後溶媒を
留去し、残渣をエーテルから結晶化させて塩酸塩9.3 g
を得た。得られた塩酸塩（2.09 g, 2.2 mmol）をピリジ
ン（2 ml）及びクロロホルム（15 ml）からなる混合溶
媒に溶解し、このものにトリメシン酸クロライド (190
mg, 0.72 mmol)のクロロホルム（2 ml）溶液を加えた。
反応混合物を室温に終夜放置したのち減圧下溶媒を留去
した。残渣を適当量のクロロホルムで希釈し、水、5 %
炭酸ナトリウム溶液、1 M クエン酸溶液、飽和食塩水で
洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮した。
残渣をエーテルから結晶化させて、目的とする中間体５
を2.1 g（定量的）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 2980.

【００３７】６） 化合物１の合成 中間体５ (1.9 g, 0.68 mmol) のトリフルオロ酢酸 (15
ml) 溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸 (6 g)、
チオアニソール (4 ml)、m-クレゾール (3.5 ml) 、ト
リフルオロ酢酸 (18 ml) からなる混合溶液を氷冷しな
がら加え、反応混合物を氷冷下２時間撹拌した。反応液
をエーテル (700 ml) に滴下して３０分間ゆっくり撹拌
した。沈殿した粗生成物を少量の水にとかし、イオン交
換クロマトグラフィー（アンバーライトIRA-400、対イ
オンCl^-）にかけて精製、凍結乾燥して目的とする化合
物１を無色粉末として870 mg（88 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1624.

【００３８】実施例２ 化合物２の合成 実施例１に記載した中間体４のＮ末端側に、Boc-Asp(B
n)-OHをCDI法により縮合し、BocAsp(Bn)-Arg(Mts)-Leu-
Asp(Bn)-Ser(Bn)-OBnを合成した。以下実施例１に記載
の方法に従い、Ｎ末端のBoc基を除去したのちトリメシ
ン酸クロライドと反応した。すべての保護基をトリフル
オロメタンスルホン酸、チオアニソール、m-クレゾール
／トリフルオロ酢酸混合系処理により除去し、イオン交
換クロマトグラフィーにより精製、凍結乾燥して目的と
する化合物２を無色粉末として得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1969.

【００３９】実施例３ 化合物３の合成 実施例１に記載の中間体３の合成において、Boc-Leu-OH
・１水和物の代りにBoc-D-Leu-OH・１水和物を用いて同
様に縮合反応を行い、Boc-D-Leu-Asp(Bn)-Ser(Bn)-OBn
を合成した。以下実施例１及び２に記載の方法と同様に
合成を行い、目的とする化合物３を無色粉末として得
た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1969.

【００４０】実施例４ メラノーマ細胞を用いた実験的
肺転移モデル系によるガン転移阻害作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体のガン転移抑制作用について、
実験的肺転移モデル系によって検討した。実施例に記載
した本発明の化合物１〜３、比較例としてテトラペプチ
ドであるArg-Leu-Asp-Ser、及びフィブロネクチンの接
着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serを用いた。
これらのペプチド各々1000 μgと非常に転移性の強いガ
ン細胞であるB16-BL6メラノーマ細胞（対数増殖期のも
の5 x 10⁴個）を各々PBS中で混合し、これを１群５匹の
C57BL/6の雌マウスに尾静脈注射により投与した。投与
後14日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移したガンの
コロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較した。そ
の結果を以下の表１に示す。

【００４１】

【表１】 表１ ──────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 154±35 (116-206) Arg-Gly-Asp-Ser 160±48 (94-239) Arg-Leu-Asp-Ser 116±39 (66-184) 化合物１ 44±23 (21-75)^* 化合物２ 1±1 (0-1)^* 化合物３ 1±1 (0-1)^* ──────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.001

【００４２】この結果によれば、従来から知られている
フィブロネクチンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gl
y-Asp-Serは、マウス１匹あたり1000 μgの投与量では
転移抑制効果を示さず、またArg-Leu-Asp-Serペプチド
に関しては転移数の減少は見られたものの、未処理区と
比較して有意差は認められなかった（危険率 5 %）。こ
れに対し本発明の化合物１から３を投与した場合には、
肺へのガン転移は顕著に抑制された。これは本発明の重
要な目的の１つである、修飾による活性の増強が目論見
通り達成されていることを示している。

【００４３】実施例５ メラノーマ細胞を用いた自然肺
転移モデル系によるガン転移阻害作用の検討 本発明の化合物のガン転移抑制作用について、より現実
的な病態治療モデルである自然肺転移抑制試験により検
討した。本発明の化合物１〜３と、比較化合物としてテ
トラペプチドであるArg-Leu-Asp-Ser、及びフィブロネ
クチンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Ser
を用いた。１群７匹のC57BL/6の雌マウスを用い、これ
らの右足かかと部分にB16-BL6メラノーマ細胞（対数増
殖期のもの5 x 10⁴/50 μl)を移植した。移植後14、1
6、18、20、22、24、26日目に被試験化合物を尾静脈注
射により投与した（１回あたり100 μg/200 μl PB
S）。移植ガンは21日目に外科的に切除した。メラノー
マ移植後35日めにマウスを屠殺、解剖し、肺に転移した
ガンのコロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較し
た。その結果を以下の表２に示す。

【００４４】

【表２】 表２ ──────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 61±22 (25-103) Arg-Gly-Asp-Ser 67±13 (53-88) Arg-Leu-Asp-Ser 55±18 (35-94) 化合物１ 26±13 (11-52)^* 化合物２ 24±15 (0-51)^* 化合物３ 23±19 (0-61)^* ──────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.01

【００４５】この結果によれば、本発明の化合物１〜３
の投与によって、現実的な病態治療モデルである自然肺
転移抑制試験においてもガンの転移数は有意に抑制され
た。これに対してArg-Gly-Asp-SerやArg-Leu-Asp-Serに
は、自然肺転移モデル系におけるガン転移の抑制効果は
なかった。従って本発明のペプチド誘導体のガン転移抑
制効果、およびその有用性、優位性は明白である。

【００４６】実施例６ リンパ腫細胞を用いた実験的転
移モデル系によるガン転移阻害作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体のガン転移抑制作用について、
悪性リンパ腫細胞であるL5178Y ML25 T-lymphomaを用い
て実験的転移モデル系により検討した。実施例に記載し
た本発明の化合物１〜３と、比較化合物としてテトラペ
プチドであるArg-Leu-Asp-Ser、及びフィブロネクチン
の接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Ser を用い
た。これらのペプチド各々1000 μgとL5178Y ML25 T-ly
mphoma細胞（対数増殖期のもの4 x 10⁴個）を各々PBS中
で混合し、これを１群５匹のCDF1 (BALB/C ×DBA/2)の
雌マウスに尾静脈注射により投与した。投与後14日目に
マウスを屠殺、解剖してマウスの肝臓及び脾臓の重量を
測定し、対照のPBS投与群と比較した。その結果を以下
の表３に示す。

【００４７】

【表３】 表３ ────────────────────────────────── 投与化合物 肝臓の重量 脾臓の重量 平均±SD 平均±SD ────────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 3.12±0.82 0.19±0.04 Arg-Gly-Asp-Ser 3.13±1.16 0.21±0.05 Arg-Leu-Asp-Ser 1.57±0.73^** 0.11±0.05^* 化合物１ 1.19±0.11^*** 0.10±0.01^*** 化合物２ 1.16±0.10^*** 0.11±0.02^*** 化合物３ 1.07±0.08^*** 0.10±0.01^*** リンパ腫細胞未投与 1.11±0.15 0.09±0.01 ────────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.02 ** P<0.01 *** P<0.001

【００４８】この結果によれば、本発明の化合物１から
３の投与によって、肝臓及び脾臓の重量はリンパ腫細胞
未投与区のそれとほぼ同程度となった。すなわち本発明
の化合物は、悪性リンパ腫細胞であるL5178Y ML25 T-ly
mphomaの肝臓や脾臓への転移に対しても抑制効果を示す
ことが明らかとなった。これに対し既存のフィブロネク
チンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Ser
は、L5178Y ML25 T-lymphomaに対して転移抑制効果を示
さなかった。

【００４９】以上実施例により本発明を特定の例に関し
て説明したが、限定して解釈されるべきではない。本発
明の本質及び範囲から逸脱しない種々の変更や修正が可
能であることは明らかである。そしてそのような発明は
本発明に含まれると考える。

【００５０】

【発明の効果】以上説明したように本発明のペプチド誘
導体は細胞接着性蛋白質であるフィブロネクチンのコア
配列と比較して細胞接着性が大きく、ガン転移抑制作用
等の種々の生物活性を充分に保持し、毒性の問題もほと
んど無い。またメラノーマ細胞のみならずリンパ腫細胞
に対してもガン転移抑制効果を示し、さらにより現実的
な病態治療モデルである自然肺転移抑制試験においても
ガン転移抑制作用を示す。またその構造は単純であるた
め合成も容易であり、医薬として価値の高いものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 済木 育夫 北海道札幌市厚別区厚別北３条西５丁目 12−６ (72)発明者 東 市郎 北海道札幌市南区真駒内上町５丁目３− ２ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/00 - 7/66

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（I）で表されるペプチド誘
   導体またはその薬理学的に許容できる塩。 一般式（I） 【化１】 一般式（I）中、Ｒは下記一般式（II）で表されるペプ
   チド配列を表す。 一般式（II） −［Ｚ］−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｙ （II） 一般式（II）中、ＡｒｇはＬ−アルギニンを表し、Ａｓ
   ｐはＬ−アスパラギン酸を表し、ＸはＬ−またはＤ−ロ
   イシンを表し、ＹはＬ−セリンを表す。［ ］は、［
   ］内の残基が存在しても存在しなくてもよいことを表
   し、存在する場合ＺはＬ−アスパラギン酸を表す。
2. 【請求項２】 薬学上許容できる賦形剤及び請求項１に
   記載のペプチド誘導体またはその薬学上許容できる塩を
   有効成分として含有してなる、ガン転移抑制剤。