JPH06306096A - ペプチド誘導体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 細胞接着性蛋白質様の活性を保持しており、
簡便な手段で合成可能であり、血液中での安定性の高い
新規なペプチド誘導体を提供する。 【構成】 下記式（Ｉ）で表される配列を構成単位とし
て有するペプチドと適当な有機分子が共有結合してなる
化合物であって、１分子内に定まった複数個の式（Ｉ）
で表される配列を含んでいることを特徴とするペプチド
誘導体またはその薬学上許容できる塩有効成分として含
有してなる、ガン転移抑制剤。 Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ 式（Ｉ）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は特定の構成を有するペプ
チドの誘導体に関するものであり、より詳しくは細胞接
着性蛋白質であるフィブロネクチンの接着コア配列ペプ
チドの誘導体またはその薬学上許容可能な塩、及びその
用途に関するものである。

【０００２】

【従来技術】フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネク
チン等は細胞と結合組織との結合に関与し、また動物細
胞の細胞機能に関連した種々の生物活性を有する蛋白質
であり、細胞接着性蛋白質と総称される。例えばフィブ
ロネクチンは肝臓で生合成され、ヒト血漿中に約0.3 mg
/mlの濃度で存在する糖蛋白質である。

【０００３】フィブロネクチンはその１次構造が分子ク
ローニングを用いて決定されており（Koarnblihtt, A.
R. et al., EMBO Journal, 4巻, 2519 (1985)）、分子
量約２５０ＫのポリペプチドであるＡ鎖と約２４０Ｋの
Ｂ鎖がＣ末端附近でジスルフィド結合した２量体蛋白質
であることが明らかにされている。またラミニンについ
ても佐々木ら（Sasaki, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 81巻, 935 (1987), Sasaki, M. et al.,
J. Biol. Chem., 262巻, 17111 (1987)）によりその１
次構造が決定されている。ラミニンはＡ、Ｂ１、Ｂ２と
よばれる３本のポリペプチド鎖から構成されており、十
字架状の構造をとっていることが知られている。

【０００４】そして細胞接着性に関与する結合部位の研
究も行われ、フィブロネクチンの細胞接着部のコア配列
はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）なるトリペプチド
であることが1984年に報告された（Pierschbacher, M.
D. et al., Nature 309巻, 30(1984)）。またラミニン
の細胞接着部位のコア配列はＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）で表されるペンタペプチ
ドであることも解明されている（Graf, J. et al., Cel
l 48巻, 989 (1987)）。

【０００５】これらフィブロネクチンやラミニンは、上
記コア配列を介して細胞のレセプターと結合することに
より各種の情報を細胞に伝達し、またヘパリン、コラー
ゲン、フィブリン等の生体高分子とも結合して細胞と結
合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与しているもの
と考えられている。

【０００６】このように細胞接着性蛋白質は多様な生物
活性を有するため、その活性部位配列ペプチドを用いた
研究が精力的になされている。例えばフィブロネクチン
の細胞結合部のコア配列の利用としては、ポリマーにＲ
ＧＤ配列を有するペプチドを共有結合させ、人工臓器用
基体や動物細胞培養用基体として用いる方法（特開平1-
309682号公報、特開平1-305960号公報、WO 90/05036 A
特許）、ＲＧＤ配列を有するペプチドに疎水性領域を連
結することにより目的とするペプチドを固体表面に付着
させ、歯科用埋め込み剤や組織培養基体に利用する方法
（WO 90/11297A特許）、ＲＧＤ配列を有する種々の環状
及び鎖状オリゴペプチドまたはその類縁体を用いて血小
板凝集を阻害する方法あるいは血栓症を予防、治療する
方法（高分子学会予稿集第38巻、3149 (1989)、特開平2
-174797号公報、特開平3-11830号公報、特開平3-118331
号公報、特開平3-118398号公報、特開平3-118397号公
報、特開平3-118333号公報、WO 91/01331特許、WO 91/0
7429特許、WO 91/15515特許、WO 92/00995特許）、ＲＧ
Ｄペプチドとヒアルロン酸を共有結合した化合物を用い
て血小板凝集を調節する方法（特開平4-134096号公
報）、ＲＧＤ配列を有するペプチドを細胞移動制御剤と
して用いる方法（特開平2-4716号公報）、ＲＧＤ配列を
有するペプチドを固定化した膜を細胞接着膜として用い
る方法（高分子学会予稿集第37巻、705 (1988)）、ＲＧ
ＤＳ配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護
剤として用いる方法（特開昭64ー6217号公報）、ポリペ
プチド分子内に細胞接着活性を有するペプチドを付加す
ることにより人工機能性ポリペプチドとして利用する方
法（特開平3-34996号公報）等が開示されている。

【０００７】更に近年、細胞接着性蛋白質はガン転移に
関与する生体分子としても注目されてきている。ガン転
移の一連の段階では、ガン細胞は種々の宿主細胞や生体
高分子と接触する。このときフィブロネクチンやラミニ
ンのような細胞接着性分子が存在すると該細胞は多細胞
塊を形成し、ガン細胞の増殖や生存がより容易になる。
ところが、たとえばフィブロネクチンの接着部位コア配
列であるトリペプチドＲＧＤが共存すると、競争的にガ
ン細胞上のフィブロネクチンレセプターと結合するため
細胞接着がブロックされ、ガン転移阻害作用を示すこと
が報告されている（Science 238巻, 467 (1986)）。

【０００８】しかしながらＲＧＤペプチドはそれ単独で
は細胞接着活性が充分でないため、効果の増強をはかる
目的で該配列を有するオリゴペプチド、環状オリゴペプ
チド、あるいはその繰返し配列を有するポリペプチドを
用いてガン転移を制御する方法（Int. J. Biol. Macrom
ol., 11巻, 23 (1989)、同誌, 11巻, 226 (1989)、Jpn.
J. Cancer Res., 60巻, 722, (1989)、特開平2-174798
号公報）、あるいは腫瘍再発を防止する方法（特開平2-
240020号公報）が試みられている。またフィブロネクチ
ン分子中の細胞接着ポリペプチドとヘパリン結合ポリペ
プチドを構成単位とするポリペプチドを用いてガン転移
を抑制する方法（特開平3-127742号公報）も報告されて
いる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述のようにフィブロ
ネクチン等の細胞接着性蛋白質の活性部位コア配列は様
々な生物活性を保持しているため、その応用価値は高い
ものと考えられる。しかしながら該コア配列の細胞接着
活性が充分でないため、それらのガン転移抑制作用は実
際の医療に応用するためには満足できるものではなかっ
た。また一般に薬物が生体に投与されたのち薬効を維持
するためには、それ自体の生物活性の強さのみならず薬
物の生体内での安定性（例えば血流中での滞留時間や排
泄される時間など）が重要であることが知られている。
細胞接着性蛋白質の活性部位コア配列ペプチドも例外で
はなく、それ単独ではペプチド類に特有の速い代謝分解
や排泄が起こり、結果的に所望の効果が期待できない場
合も生ずる。そこで生体内での安定性を向上させるため
従来技術の項で説明したような種々の方法が報告されて
いるが、それらの化合物のなかには未だ生物活性が不充
分であったり、合成が困難なものも多い。またポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）等の高分子と該コア配列を連
結する方法や、該コア配列を繰返すことにより高分子量
化を行う方法も知られているが、これらの方法では目的
物の構造や分子量を特定して合成を行うことは極めて困
難であり、この点で更に有効な物質の開発が必要とされ
ていた。そこで本発明者らは細胞接着性蛋白質であるフ
ィブロネクチンの持つ種々の生物活性を充分に保持し、
合成も容易でかつ血液中での安定性の高い新規な化合物
を求めて鋭意検討を行った結果、公知のフィブロネクチ
ンコア配列ペプチド誘導体に比べてガン転移抑制能が大
きく、さらに簡便な手段で合成可能な新規なペプチド誘
導体を見出し、本発明を完成するに至った。従って本発
明の目的は、細胞接着性蛋白質様の活性を充分に保持し
ており、簡便な手段で合成可能であり、血液中での安定
性の高い新規なペプチド誘導体を提供することにある。
本発明はさらにガン転移阻害活性の高い新規なペプチド
誘導体を提供することを目的とする。本発明はさらに上
記ペプチド誘導体を含有してなる薬物組成物の提供も目
的とする。

【００１０】

【課題を解決する手段】上記課題は、下記式（Ｉ）で表
される配列を構成単位として有するペプチドと適当な有
機分子が共有結合してなる化合物であって、１分子内に
定まった複数個の式（Ｉ）で表される配列を含んでいる
ことを特徴とするペプチド誘導体またはその薬学上許容
できる塩を見出したことにより達成された。 Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ 式（Ｉ） ここでＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｐは、アルギニン、グリシ
ン、アスパラギン酸残基をそれぞれ表す。これらのアミ
ノ酸（グリシン残基は除く）はＤ-体、Ｌ-体、ラセミ体
のいずれでもよいが、好ましくはＬ-体である。

【００１１】本発明において使用されるペプチド配列
は、ペプチド鎖中あるいはその末端にＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ配列を構成単位として有するオリゴペプチドであ
って、その残基数は７残基以下であるものが望ましい。
またペプチド鎖のカルボキシ末端側は任意にアミド化さ
れていてもよい。具体的なペプチドとしては、以下に示
すオリゴペプチドを挙げることができる。 Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ

【００１２】本発明において、式（Ｉ）で表される配列
を構成単位として有するペプチドを有機分子と共有結合
するのは、有効なペプチドの周辺を修飾することによ
り、生体内酵素による分解から保護したり、また高分子
量にして徐放効果を付与するためである。式（Ｉ）で表
される配列を構成単位として有するペプチドと有機分子
の結合様式としては、アミド結合、イミド結合、ウレタ
ン結合、尿素結合のなかの少なくとも１種を挙げること
ができる。なおここでアミド結合とはカルボアミド、ス
ルホンアミド、ホスホンアミドのいずれをも意味する。
本発明のため使用することの可能な有機分子としては、
薬学的に許容されるものであり、有用な生物活性を減ず
ることなく、分子全体の水溶性を妨げず、さらに式
（Ｉ）で表される配列を構成単位として有するペプチド
中のアミノ基と反応して上記共有結合を形成しうるよう
な官能基を、１分子中に２個以上の定数個、好ましくは
２個以上６個以下有するものであれば、目的に応じて使
い分けることができる。つまり本発明のペプチド誘導体
は、１分子中に定まった複数個の式（Ｉ）で表される配
列を有することになる。従っていわゆるポリマー類とは
異なり、分子構造は明確であることが特徴である。

【００１３】本発明において用いられる具体的な有機分
子としては、まず価数が２〜６価の有機酸、より具体的
には多価カルボン酸を挙げることができる。多価カルボ
ン酸の価数としては上述の通り２〜６価であることが好
ましく、また芳香族系、脂肪族系多価カルボン酸いずれ
をも用いることが可能である。具体的な多価カルボン酸
としては、トリメシン酸（1,3,5-ベンゼントリカルボン
酸）、テレフタル酸、テトラヒドロフランテトラカルボ
ン酸、ピロメリット酸（1,2,4,5-ベンゼンテトラカルボ
ン酸）、1,4,5,8-ナフタレンテトラカルボン酸、アジピ
ン酸（ヘキサン２酸）、クエン酸、リンゴ酸、1,2,3-プ
ロパントリカルボン酸等が挙げられる。多価カルボン酸
とペプチド中のアミノ基を反応させる方法としては、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法
も挙げられるが、多価カルボン酸を活性アシル誘導体に
変換ののち縮合する方法が実用的かつ有利である。活性
アシル誘導体としては酸ハロゲン化物、より好ましくは
酸塩化物が挙げられる。多価カルボン酸の相当する酸塩
化物への変換は公知の方法により行うことができるが、
市販品を購入することも可能である。

【００１４】本発明において用いられる他の有機分子と
しては、多価スルホン酸を挙げることができる。多価ス
ルホン酸の価数としては２〜６価であることが好まし
い。また芳香族系、脂肪族系多価スルホン酸いずれをも
用いることが可能であるが、２価または３価の芳香族ス
ルホン酸を用いることが特に好ましい。具体的な多価ス
ルホン酸としては、1,3-ベンゼンジスルホン酸、1,5-ナ
フタレンジスルホン酸等が挙げられる。これらの多価ス
ルホン酸とペプチド中のアミノ基を反応させてスルホン
アミド結合を形成する方法としては、活性誘導体である
スルホニルクロライド等に変換ののち縮合する方法が実
用的かつ有利である。多価スルホン酸の相当するスルホ
ニルクロライドへの変換は公知の方法により行うことが
できるが、市販品を購入して利用することも勿論可能で
ある。

【００１５】また本発明において用いられる他の有機分
子としては、多価イソシアナート、イソチオシアナート
類を挙げることができる。イソシアナート、イソチオシ
アナート類は、イソシアン酸及びイソチオシアン酸の活
性誘導体ともみなすことができる分子である。多価イソ
シアナート、イソチオシアナートの価数としては２〜６
価であることが好ましい。また芳香族系、脂肪族系多価
スルホン酸いずれをも用いることが可能であるが、２価
の脂肪族イソシアナート、イソチオシアナートを用いる
ことが特に好ましくまた現実的である。具体的にこのよ
うな条件を満たすイソシアナート、イソチオシアナート
としては、ヘキサメチレンジイソシアナート等を挙げる
ことができる。多価イソシアナート、イソチオシアナー
ト類の合成法としては、相当する多価アミンとホスゲン
（条件によってはホスゲンダイマー）あるいは二硫化炭
素を反応させる方法等により合成することができる。イ
ソシアナート、イソチオシアナート類の合成法として
は、新実験化学講座１４、有機化合物の合成と反応（II
I) P.1490 〜1509に詳述されている。

【００１６】さらに本発明において好ましく用いること
の可能な他の有機分子として、式（Ｉ）で表される配列
を構成単位として有するペプチド中のアミノ基と反応し
て共有結合を形成しうるような異なった種類の官能基
を、一分子中に２個以上の定数個有するようなものも挙
げることができる。このような担体としては、以下に示
すような多官能性化合物が挙げられる。

【００１７】

【化１】

【００１８】Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−（ＣＨ₂ ）_n −ＣＯＣl 上記式中、ｎは例えば２〜５の整数である。

【００１９】以上説明してきた中でも、トリメシン酸
（1,3,5-ベンゼントリカルボン酸）及びテトラヒドロフ
ランテトラカルボン酸が、式（Ｉ）で表される配列を構
成単位として有するペプチドと共有結合を形成する有機
分子として最も好ましい。

【００２０】本発明のペプチド誘導体中に存在するイオ
ン性基は適当な対イオンと塩を形成していてもよい。塩
の状態でも本発明の化合物はその生物学的活性を充分に
維持する。ただしその塩は生理学的、薬理学的に許容さ
れるものであることが必要である。具体的には塩酸塩、
硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩のような無機酸との塩、酢酸
塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩、さらにナトリ
ウム塩、カリウム塩などが挙げられるが、なかでも塩酸
塩、酢酸塩、ナトリウム塩が特に好ましい。そのような
塩への変換は慣用手段により行うことができる。

【００２１】以下に好ましい本発明の化合物の具体例を
示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２２】

【化２】

【００２３】次に本発明の化合物の合成法について説明
する。本発明のペプチド誘導体は種々の方法でこれを合
成することができるが、まず保護ペプチド部を合成のの
ちアミノ末端側の保護基を除去し、これをアミノ基と反
応して請求項２に記載の共有結合を形成しうるような官
能基を１分子中に２個以上の定数個、好ましくは２個以
上６個以下有する有機分子と反応せしめ、しかるのちに
保護基を除去することにより合成する方法が実用的かつ
有利である。ペプチド部の合成方法としては特に限定し
ないが、固相法及び固相法を利用したペプチド自動合成
装置による合成法がまず挙げられる。固相法及び固相法
を利用したペプチド自動合成装置による合成法に関して
は、生化学実験講座・タンパク質の化学IV p.207（日本
生化学会編、東京化学同人）、続生化学実験講座・タン
パク質の化学（下） p.641（日本生化学会編、東京化学
同人）等に記載されている。

【００２４】また本発明の化合物のペプチド部は液相法
によって合成することも可能である。すなわちＣ末端成
分となる保護アミノ酸から出発し、Ｃ末端を保護あるい
は修飾ののちアミノ末端保護基を除去し、以下保護アミ
ノ酸を逐次縮合する方法である。またフラグメント縮合
を行う方法も有効である。保護アミノ酸あるいは保護ペ
プチドを縮合する方法としては、公知の方法、例えば泉
屋信夫ら編「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善）に記
載の方法のなかから適宜選択することができる。縮合反
応には種々の方法が知られているが、1-ヒドロキシベン
ゾトリアゾールとＤＣＣを用いるDCC-Additive法、ある
いはカルボニルジイミダゾールを用いる縮合法が最も良
い結果を与えた。

【００２５】以上の方法により合成した保護ペプチドの
アミノ末端保護基を除去し、これを先に説明した有機分
子と反応せしめ、しかるのちに保護基の除去を行う。保
護基の除去の条件は用いている保護基の種類に依存す
る。通常用いられる方法は、加水素分解、ＨＦ処理、ト
リフルオロメタンスルホン酸／チオアニソール／m-クレ
ゾール／トリフルオロ酢酸混合系処理等であるが、保護
基の種類によってはさらにさまざまな方法も可能である
ことは言うまでもない。目的とするペプチド誘導体は脱
保護ののち公知の方法、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどで精製するこ
とができる。

【００２６】つぎに本発明のペプチド誘導体の作用及び
用途について説明する。本発明のペプチド誘導体は１分
子中にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を複数個
有し、さらにある程度の大きい分子量を有するため酵素
分解や代謝によって排泄されにくく、そのため顕著なガ
ン転移阻害活性を示す。本発明のペプチド誘導体は悪性
細胞上のフィブロネクチン受容体に多点で作用し、フィ
ブロネクチンへの結合を阻害することにより悪性細胞の
接着、コロニー化、破壊的浸食を阻止する。本発明のペ
プチド誘導体は乳癌、表皮癌、筋線メラノーマ（muscle
line melanoma）、表皮線神経芽細胞腫xグリオマ（epi
dermal line neuroblastoma x glioma）、軟骨細胞、フ
ィブロザルコーマを含め種々の細胞の接着及び転移を阻
止するのに有効である。

【００２７】さらに本発明のペプチド誘導体は創傷治癒
作用等の広範な生物活性が認められた。また本発明のペ
プチド誘導体はマウスを用いて毒性試験を行ったとこ
ろ、毒性は全く認められなかった。

【００２８】本発明のペプチド誘導体またはその薬学上
許容可能な塩は、ペプチド系医薬に一般に使用されてい
る投与方法によって使用することができ、通常賦形剤を
含む薬物組成物として投与される。この薬物組成物はレ
ミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Scien
ces, Merck, 16, (1980)）に開示されているように、知
られているどのような方法で製造してもよい。賦形剤と
しては蒸留水、生理食塩水、リン酸塩あるいは酢酸塩の
ような緩衝塩類を含有する緩衝液、浸透圧調節剤として
の塩化ナトリウムやショ糖、もしくはアスコルビン酸の
ような酸化防止剤、または許容し得るこれらの組合せが
ある。

【００２９】このような薬物組成物は溶液、錠剤のよう
な種々の形態とすることができる。投与形態としては経
口、経鼻、非経口（静脈注射、皮下注射、腹腔内投与な
ど）等のなかから適宜選択することができる。例えば生
理食塩水に溶解して注射用製剤としてもよく、あるいは
0.1規定程度の酢酸緩衝液に溶解したのち凍結乾燥剤と
してもよい。またリポソーム中に内包したマイクロカプ
セル剤あるいはミクロスフェアー等の形態で利用するこ
とも可能である。

【００３０】また本発明のペプチド誘導体は他の薬理作
用を有する化合物、より具体的には抗ガン性化合物と併
用して使用することも可能であり、これらは本発明の範
囲に属するものである。本発明のペプチド誘導体と併用
して使用することの可能な抗ガン性化合物としては、ガ
ン化学療法において通常用いられる公知の制ガン剤のな
かから適宜選択することが可能であるが、具体的にはア
ドリアマイシンやシスプラチン、マイトマイシン等が挙
げられる。一般に従来の化学療法においては、制ガン剤
の副作用による危険性は避けられない問題であることが
知られている。それゆえ本発明のペプチド誘導体との併
用投与により制ガン剤の投与量を減らし、制ガン剤によ
る副作用を軽減することは非常に有用であると思われ
る。またこれはガン転移抑制効果をより向上させること
をも意味する。

【００３１】本発明のペプチド誘導体の投与量は、患者
の体重に対し通常１日当たり0.2 μg/kgから200 mg/kg
の範囲であるが、患者の年齢、体重、症状、投与方法に
よって決定されるものである。

【００３２】

【実施例】以下実施例によって本発明を更に詳細に説明
する。なお通常用いられる溶媒や試薬、保護基の表記に
は以下の略号を使用した。

【００３３】Ｂｏｃ ：t-ブトキシカルボニル Ｂｎ ：ベンジル ＡｃＯＥｔ ：酢酸エチル Ｍｔｓ ：メシチレンスルホニル ＨＯＢｔ ：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ｉＰｒ₂ＮＥｔ ：ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド ＣＤＩ ：カルボニルジイミダゾール ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＴＦＭＳＡ ：トリフルオロメタンスルホン酸

【００３４】実施例１ 化合物１の合成 化合物１の液相法による合成法について詳細に説明す
る。化合物１の合成経路を以下に示す。

【００３５】

【化３】

【００３６】

【化４】

【００３７】１） 中間体１の合成 Boc-Ser(Bn)-OH (20.4 g, 69 mmol)、ベンジルブロミド
(13 g, 76 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (9.8
g, 76 mmol)を酢酸エチル (100 ml)に溶解し、反応混合
物を５時間加熱還流した。室温まで放冷した後生成した
塩を濾過して除き、濾液を水、1 M クエン酸溶液、飽和
重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥
ののち減圧濃縮して中間体１を無色油状物として得た。
このものは精製することなく次の反応に用いた。

【００３８】２）中間体２の合成 前項記載の方法により得た中間体１の塩化メチレン (80
ml) 溶液にトリフルオロ酢酸 (80 ml) を加え、反応混
合物を室温で４０分間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し
て大部分の溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルで希釈し、
飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで
乾燥ののち減圧濃縮してアミン体を無色油状物として得
た。得られたアミン体とBoc-Asp(Bn)-OH (22.6 g, 70 m
mol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (10.7 g, 70 m
mol)をDMF (80 ml) 及び塩化メチレン (80 ml)の混合溶
媒に溶解し、氷冷しながらDCC (14.4 g, 70 mmol) を加
えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温し
ながら終夜撹拌した後、セライト濾過して生成した沈殿
を除去した。濾液を適当量の酢酸エチルで希釈し、水、
5 % 炭酸ナトリウム溶液、1 M クエン酸溶液、飽和食塩
水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮し
て油状物を得た。シリカゲルカラムクロマトグフラフィ
ーで精製（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）
し、目的とする中間体２を無色結晶として35 .8 g（３
段階で収率87 %）得た。

【００３９】３） 中間体３の合成 中間体２ (35.7 g, 60.5 mmol) の塩化メチレン (100 m
l) 溶液にトリフルオロ酢酸 (100 ml) を加え、反応混
合物を室温で４０分間撹拌した。反応終了後溶媒を留去
し、残渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸
塩32.5 gを得た。得られたトリフルオロ酢酸塩 (18.9
g, 31.3 mmol) とBoc-Gly-OH (5.75 g, 3mmol)、1-ヒド
ロキシベンゾトリアゾール (5.04 g, 33 mmol)、ジイソ
プロピルエチルアミン (4.45 g, 34.4 mmol) をDMF (20
ml) 及び塩化メチレン (50 m)の混合溶媒に溶解し、氷
冷しながらDCC (6.8 g, 33 mmol)を加えた。反応混合物
を氷冷下２時間、更に室温まで昇温しながら終夜撹拌し
た後、セライト濾過して生成した沈殿を除去した。濾液
を適当量の酢酸エチルで希釈し、水、5 % 炭酸ナトリウ
ム溶液、1 M クエン酸溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫
酸ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮して無色固形物を得
た。このものをヘキサン／酢酸エチル（２／１）から再
結晶して中間体３を17.9 g（87 %）得た。

【００４０】４） 中間体４の合成 中間体３ (17.9 g, 27 mmol) の塩化メチレン (60 ml)
溶液にトリフルオロ酢酸 (60 ml)を加え、反応混合物を
室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残渣
をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩15.9 g
を得た。一方Boc-Arg(Mts)-OH (4.56 g, 10 mmol)をDMF
(20 ml) に溶解し、このものに氷冷しながらCDI（1.63
g, 10 mmol) のDMF (10 ml) 溶液を加えた。反応混合
物を氷冷しながら１時間撹拌したのち、上記操作により
得られたトリフルオロ酢酸塩 (6.61 g, 10 mmol) とジ
イソプロピルエチルアミン (1.42 g, 11 mmol)のDMF (2
0 ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に
室温まで昇温しながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒を留
去した。残渣を適当量のクロロホルムで希釈し、水、5
% 炭酸ナトリウム溶液、1 M クエン酸溶液、飽和食塩水
で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮し
た。残渣をエーテルから結晶化させて目的とする中間体
４を無色結晶として9.8 g （定量的）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 986.

【００４１】５） 中間体５の合成 中間体４ (5.5 g, 5.6 mmol) の塩化メチレン (20 ml)
溶液にトリフルオロ酢酸 (20 ml) を加え、反応混合物
を室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残
渣をエーテルから結晶化させて中間体５を5.3 g（94.7
%）得た。

【００４２】６） 中間体６の合成 中間体５（2.26 g, 2.3 mmol）をピリジン（3 ml）及び
クロロホルム（20 ml）からなる混合溶媒に溶解し、こ
のものにトリメシン酸クロライド (200 mg, 0.75 mmol)
のクロロホルム（2 ml）溶液を加えた。反応混合物を室
温に終夜放置したのち減圧下溶媒を留去した。残渣を適
当量のクロロホルムで希釈し、水、5 %炭酸ナトリウム
溶液、1 M クエン酸溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸
ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮した。残渣をエーテル
から結晶化させて中間体６を1.97g（93 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 2812.

【００４３】７） 化合物１の合成 中間体６ (1.9 g, 0.68 mmol) のトリフルオロ酢酸 (15
ml) 溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸 (6 g)、
チオアニソール (4 ml)、m-クレゾール (3.5 l) 、トリ
フルオロ酢酸 (18 ml) からなる混合溶液を氷冷しなが
ら加え、反応合物を氷冷下２時間撹拌した。反応液をエ
ーテル (700 ml) に滴下して３０分間ゆっくり撹拌し
た。沈殿した粗生成物を少量の水にとかし、イオン交換
クロマトグラフィー（アンバーライトIRA-400、対イオ
ンCl^-）にかけて精製、凍結乾燥して目的とする化合物
１を無色粉末として870 mg（88 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1456.

【００４４】実施例２ 化合物２の合成 化合物２の合成経路の概略を以下に示す。

【００４５】

【化５】

【００４６】１） 中間体７の合成 Boc-Asp(Bn)-OH (970 mg, 3.0 mmol)のDMF (10 ml) 溶
液に、氷冷しながらCD(490 mg, 3.0 mmol)のDMF (10 m
l) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷しながら１時間撹
拌したのち、実施例１の中間体５ (3.0 g, 3.0 mmol)
とジイソプロピルエチルアミン (450 mg, 3.5 mmol) の
DMF (20 ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷下２時
間、更に室温まで昇温しながら終夜撹拌した後、減圧下
溶媒を留去した。残渣を適当量のクロロホルムで希釈
し、水、5 % 炭酸ナトリウム溶液、1 Mクエン酸溶液、
飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち減
圧濃縮した。残渣をエーテルから結晶化させて目的とす
る中間体７を無色粉末として3.33g（93 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1191.

【００４７】２） 化合物２の合成 以下実施例１に記載の方法に従い、中間体７のＮ末端Bo
c基を除去したのちトリメシン酸クロライドと反応させ
た。すべての保護基をトリフルオロメタンスルホン酸／
チオアニソール／m-クレゾール／トリフルオロ酢酸混合
系処理により除去、イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製し、目的とする化合物２を無色粉末として得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1801. (M+Na)⁺ 1823.

【００４８】実施例３ 化合物３の合成 化合物３の合成経路の概略を以下に示す。

【００４９】

【化６】

【００５０】１） 中間体８の合成 テトラヒドロフランテトラカルボン酸 (250 mg, 1.0 mm
ol)のDMF (10 ml) 溶液に、氷冷しながらCDI（650 mg,
4.0 mmol) のDMF (10 ml) 溶液を加えた。反応混合物を
氷冷しながら１時間撹拌したのち、実施例１の中間体５
(3.0 g, 3.0mmol) とジイソプロピルエチルアミン (45
0 g, 3.5 mmol) のDMF (20 ml) 溶液を加えた。反応混
合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温しながら終夜撹
拌した後、減圧下溶媒を留去した。残渣を適当量のクロ
ロホルムで希釈し、水、5 %炭酸ナトリウム溶液、1 M
クエン酸溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウム
で乾燥ののち減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製（溶出液：酢酸エチル／メタノ
ール＝１０／１）し、目的とする中間体８を無色粉末と
して1.21 g（43 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 2832.

【００５１】２） 化合物３の合成 以下実施例１に記載の方法に従い、すべての保護基をト
リフルオロメタンスルホン酸／チオアニソール／m-クレ
ゾール／トリフルオロ酢酸混合系処理により除去した。
イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、目的とす
る化合物３を無色粉末として得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1476. (M+Na)⁺ 1498.

【００５２】実施例４ メラノーマ細胞を用いた実験的
肺転移モデル系によるガン転移阻害作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体のガン転移抑制作用について、
実験的肺転移モデル系によって検討した。実施例に記載
した本発明の化合物１〜３、比較例としてフィブロネク
チンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serを
用いた。これらのペプチド各々1000 μgと非常に転移性
の強いガン細胞であるB16-BL6メラノーマ細胞（対数増
殖期のもの5 x 10⁴個）を各々PBS中で混合し、これを１
群５匹のC57BL/6の雌マウスに尾静脈注射により投与し
た。投与後14日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移し
たガンのコロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較
した。その結果を以下の表１に示す。

【００５３】

【表1】 表1 ──────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 24±9 (11-36) 化合物１ 8±6 (0-14)* 化合物２ 3±2 (1-6)** 化合物３ 7±2 (5-10)* Arg-Gly-Asp-Ser 25±2 (23-29) ──────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.01 ** P<0.001

【００５４】この結果によれば、本発明の化合物１から
３の投与によって肺へのガン転移は有意に抑制された。
これに対し従来から知られているフィブロネクチンの接
着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serは、マウス
１匹あたり1000 μgの投与量では転移抑制効果を示さな
かった。

【００５５】実施例５ メラノーマ細胞を用いた自然肺
転移モデル系によるガン転移阻害作用の検討 本発明の化合物のガン転移抑制作用について、より現実
的な病態治療モデルである自然肺転移抑制試験により検
討した。本発明の化合物１〜３と、比較化合物としてフ
ィブロネクチンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-
Asp-Serを用いた。１群７匹のC57BL/6の雌マウスを用
い、これらの右足かかと部分にB16-BL6メラノーマ細胞
（対数増殖期のもの5 x 10⁴/50 μl)を移植した。移植
後14、16、18、20、22、24、26日目に被試験化合物を尾
静脈注射により投与した（１回あたり100 μg/200 μl
PBS）。移植ガンは21日目に外科的に切除した。メラノ
ーマ移植後35日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移し
たガンのコロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較
した。その結果を以下の表２に示す。

【００５６】

【表２】 表２ ──────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 61±22 (25-103) Arg-Gly-Asp-Ser 67±13 (53-88) 化合物１ 24±13 (5-43)* 化合物２ 27±7 (16-37)* 化合物３ 21±16 (6-53)** ──────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.01 ** P<0.001

【００５７】この結果によれば、本発明の化合物１〜３
の投与によって、現実的な病態治療モデルである自然肺
転移抑制試験においてもガンの転移数は有意に抑制され
た。これに対し従来から知られているフィブロネクチン
の接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serには、
ガン転移の抑制効果は全くなかった。これは本発明の重
要な目的の１つである、修飾による活性の増強が目論見
通り達成されていることを示している。従って本発明の
ペプチド誘導体のガン転移抑制効果、及びその有用性、
優位性は明白である。

【００５８】実施例６ リンパ腫細胞を用いた実験的転
移モデル系による癌転移阻害作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体の癌転移抑制作用について、悪
性リンパ腫細胞であるL5178Y ML25 T-lymphomaを用いて
実験的転移モデル系により検討した。実施例に記載した
本発明の化合物１〜３と、比較化合物としてフィブロネ
クチンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Ser
を用いた。これらのペプチド各々1000μgとL5178Y ML25
T-lymphoma細胞（対数増殖期のもの4 x 10⁴個）を各々
PBS中で混合し、これを１群５匹のCDF1 (BALB/C×DBA/
2)の雌マウスに尾静脈注射により投与した。投与後14日
目にマウスを屠殺、解剖してマウスの肝臓及び脾臓の重
量を測定し、対照のPBS投与群と比較した。その結果を
以下に示す。

【００５９】

【表３】 表３ ──────────────────────────────── 投与化合物 肝臓の重量 脾臓の重量 平均±SD 平均±SD ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 4.67±0.50 0.23±0.03 Arg-Gly-Asp-Ser 4.11±0.72 0.25±0.03 化合物１ 1.98±0.98^*** 0.15±0.06^*** 化合物２ 1.37±0.37^*** 0.11±0.03^*** 化合物３ 1.40±0.31^*** 0.11±0.02^*** リンパ腫細胞未投与 1.11±0.15 0.09±0.01 ──────────────────────────────── *** t-検定で未処理区と比較して P<0.001

【００６０】この結果によれば、本発明の化合物１から
３の投与によって、肝臓及び脾臓の重量はリンパ腫細胞
未投与区のそれとほぼ同程度となった。すなわち本発明
の化合物は、悪性リンパ腫細胞であるL5178Y ML25 T-ly
mphomaの肝臓や脾臓への転移に対しても抑制効果を示す
ことが明らかとなった。これに対し既存のフィブロネク
チンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Ser
は、L5178Y ML25 T-lympomaに対して転移抑制効果を示
さなかった。

【００６１】実施例７ 結腸ガン細胞を用いた実験的肺
転移モデル系によるガン転移阻害作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体のガン転移抑制作用について、
結腸ガン細胞であるcolon26を用いて実験的肺転移モデ
ル系により検討した。実施例に記載した本発明の化合物
２と、比較例としてフィブロネクチンの接着コア配列ペ
プチドであるArg-Gly-Asp-Serを用いた。これらのペプ
チド各々1000 μgとcolon26/3.1細胞（対数増殖期のも
の4 x 10⁴個）を各々PBS中で混合し、これを１群５匹の
BALB/cの雌マウスに尾静脈注射により投与した。投与後
14日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移したガンのコ
ロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較した。その
結果を以下の表３に示す。

【００６２】

【表４】 表４ ──────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 219±28 (180-250) Arg-Gly-Asp-Ser 241±54 (141-285) 化合物２ 41±25 (14-74)** ──────────────────────────────── ** t-検定で未処理区と比較して P<0.001

【００６３】この結果によれば、本発明の化合物２は結
腸ガン細胞であるcolon26の肺への転移に対しても抑制
効果を示すことが明かとなった。これに対し既存のフィ
ブロネクチンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-As
p-Serは、colon26に対して転移抑制効果を示さなかっ
た。

【００６４】実施例８ メラノーマ細胞を用いた実験的
肺転移モデル系における延命作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体の延命作用について、制ガン剤
との併用で実験的肺転移モデル系によって検討した。実
施例に記載した本発明の化合物３と、制ガン剤として市
販のアドリアマイシン（協和発酵工業社製アドリアシン
注）を用いた。1000μgの本発明の化合物３と非常に転
移性の強いガン細胞であるB16-BL6メラノーマ細胞（対
数増殖期のもの5 x 10⁴個）を各々PBS中で混合し、これ
を１群１０匹のC57BL/6の雌マウスに尾静脈注射により
投与した。投与後５、６日目にアドリアマイシンを各々
１回ずつ計２回（１回あたり100 μg/200μl PBS）尾静
脈注射により投与した。この実験を行った群をＡ区とす
る。一方、本発明の化合物３のみを最初に投与しアドリ
アマイシン投与を行わなかった群をＢ区、本発明の化合
物３を投与せずアドリアマイシン投与のみを行った群を
Ｃ区、未処理区としてＰＢＳのみを投与した群をＤ区と
する。そのまま飼育を続け、マウスの生存数の経時変化
を記録した。延命効果の検定はマン-ウィットニーのｕ
−テストにより行った。結果を添付の図１に示す。

【００６５】図１において、グラフの横軸はメラノーマ
移植後の日数、縦軸はマウスの生存数を示す。なお死亡
したマウスを解剖して調べたところ、肺に転移したガン
のコロニーが認められた。この結果によれば、本発明の
化合物３を投与したＢ区は、ＰＢＳのみを投与したＤ区
と比較して有意な延命効果を示した。さらに本発明の化
合物３とアドリアマイシンを併用したＡ区には、本発明
の化合物３のみを投与したＢ区、アドリアマイシンのみ
を投与したＣ区、ＰＢＳのみを投与したＤ区いずれと比
較しても顕著な延命効果が認められた。

【００６６】以上実施例により本発明を特定の例に関し
て説明したが、限定して解釈されるべきではない。本発
明の本質及び範囲から逸脱しない種々の変更や修正が可
能であることは明らかである。そしてそのような発明は
本発明に含まれると考える。

【００６７】

【発明の効果】以上説明したように本発明のペプチド誘
導体は細胞接着性蛋白質であるフィブロネクチンのコア
配列と比較して細胞接着性が大きく、ガン転移抑制作用
等の種々の生物活性を充分に保持し、毒性の問題もほと
んど無い。またメラノーマ細胞のみならず結腸ガン細
胞、悪性リンパ腫細胞に対してもガン転移抑制効果を示
し、さらにより現実的な病態治療モデルである自然肺転
移抑制試験においてもガン転移抑制作用を示す。またそ
の構造は単純であるため合成も容易であり、医薬として
価値の高いものである。

【図面の簡単な説明】

【００６８】

【図１】 図１は本発明の化合物とアドリアマイシンを
用いて行ったガン接種マウスの延命効果の検定の結果を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 済木 育夫 北海道札幌市厚別区厚別北３条西５丁目12 −６ (72)発明者 東 市郎 北海道札幌市南区真駒内上町５丁目３−２

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（Ｉ）で表される配列を構成単位
   として有するペプチドと適当な有機分子が共有結合して
   なる化合物であって、１分子内に定まった複数個の式
   （Ｉ）で表される配列を含んでいることを特徴とするペ
   プチド誘導体またはその薬学上許容できる塩。 Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ 式（Ｉ）
2. 【請求項２】 式（Ｉ）で表される配列を構成単位とし
   て有するペプチドと有機分子の結合様式が、アミド結
   合、イミド結合、ウレタン結合、尿素結合のなかの少な
   くとも１種である請求項１に記載のペプチド誘導体また
   はその薬学上許容できる塩。
3. 【請求項３】 式（Ｉ）で表される配列を構成単位とし
   て有するペプチドと共有結合を形成する有機分子が、ア
   ミノ基と反応して請求項２に記載の共有結合を形成しう
   るような官能基を１分子中に２個以上６個以下有する分
   子である、請求項１及び２に記載のペプチド誘導体また
   はその薬学上許容できる塩。
4. 【請求項４】 式（Ｉ）で表される配列を構成単位とし
   て有するペプチドと共有結合を形成する有機分子が、２
   価以上６価以下の有機酸またはその活性誘導体である請
   求項３に記載のペプチド誘導体またはその薬学上許容で
   きる塩。
5. 【請求項５】 式（Ｉ）で表される配列を構成単位とし
   て有するペプチドと共有結合を形成する有機分子が、テ
   トラヒドロフランテトラカルボン酸またはその活性誘導
   体である請求項４に記載のペプチド誘導体またはその薬
   学上許容できる塩。
6. 【請求項６】 式（Ｉ）で表される配列を構成単位とし
   て有するペプチドと共有結合を形成する有機分子が、ト
   リメシン酸またはその活性誘導体である請求項４に記載
   のペプチド誘導体またはその薬学上許容できる塩。
7. 【請求項７】 薬学上許容できる賦形剤及び請求項１〜
   ６のいずれかに記載のペプチド誘導体またはその薬学上
   許容できる塩を有効成分として含有してなる、ガン転移
   抑制剤。