DERIVADOS CICLOPEPTIDOS CON ACTIVIDAD DE ANTIINTEGRINA
Campo de la Invención Los objetivos de la presente invención son compuestos útiles como medicamentos, procesos para la preparación de estos, composiciones farmacéuticas que los contienen y sus usos para la preparación de medicamentos útiles para la terapia contra enfermedades debido a angiogénesis anormal. Antecedentes de la Invención En pacientes oncológicos, la quimioterapia es en muchos casos, la única opción de tratamiento para cáncer diseminado. Un método para mejorar la eficacia y reducir la toxicidad de quimioterapia anticancerígena es administrar fármacos que tienen como objetivo a los receptores involucrados en la angiogénesis tumoral . Las integrinas están involucradas en la adhesión entre una célula y la otra y entre células y la matriz extracelular tanto en procesos de angiogénesis tumoral como en procesos metastásicos. En particular, los receptores de integrina ?vß3 y OCvßs se expresan fuertemente en las células endoteliales de los microvasos tumorales de humano y en células tumorales en sí mismas . Ahora se reconoce generalmente la vascularización tumoral como un objetivo prometedor para la terapia anticancerígena [H. Jin y J. Varner, Br. J. Cáncer, 2004 , 90 (3) : 561 -5] .
REF:176352 Recientemente, numerosos estudios han demostrado que los derivados de ciclopéptido que contienen la secuencia Arg-Gly-Asp presentan una elevada afinidad para receptores de integrina. La inhibición de la producción y neoangiogénesis tumoral utilizando péptidos RGD cíclicos está siendo investigada y algunos estudios ya han mostrado resultados prometedores. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado en ratas con carcinoma de colon químicamente inducido que la manifestación tardía de tratamiento con péptidos bloqueadores de integrina dio como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y una carga tumoral reducida que parece estar regulada, al menos parcialmente, por la inhibición de la neoangiogénesis (Haier J. et al., Clin Exp Met stasis. 2002; 19(8): 665-72). Por lo tanto, la inhibición del receptor de integrina avß3 parece ser una buena estrategia terapéutica contra el cáncer. Más aún, estos péptidos RGD cíclicos también pueden tener aplicaciones terapéuticas interesantes contra enfermedades cardiovasculares, osteoporosis e infecciones virales utilizando integrinas celulares para su penetración en las células objetivo (por ejemplo, VIH) . Estos compuestos son útiles para dirigir los fármacos quimioterapéuticos, particularmente fármacos anticancerígenos contra aquellas células que expresan para elevados niveles de receptores de integrina. De esta forma, se logra una respuesta terapéutica eficaz con efectos secundarios reducidos inducida por el agente quimioterapéutico. Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona con derivados de ciclopéptido con actividad antiintegrina y particularmente con péptidos cíclicos que contienen, además de la secuencia de tres aminoácidos que es constante en todos los compuestos descritos aquí, otros dos residuos que comprenden aminoácidos naturales y no naturales y que pueden sustituirse en el nitrógeno o en el Ca con un residuo que comprende un grupo funcional o en una cadena terminal con un grupo funcional que potencializa inesperadamente su enlace a integrinas oß3 y ?vß5. La presente invención también se relaciona con procesos para la preparación de estos compuestos, con el uso de éstos como medicamentos, particularmente como inhibidores para receptor de integrina, con una acción útil en el tratamiento contra enfermedades como retinopatía, insuficiencia renal aguda, osteoporosis y metástasis y con composiciones farmacéuticas que los contienen. Estos compuestos, cuando se marcan adecuadamente, también son útiles como agentes de diagnóstico para la detección de pequeñas masas tumorales y eventos de oclusión arterial. Los fármacos transportados por vehículos de ciclopéptidos según la presente invención pertenecen a las clases de agentes citotóxicos como agentes alquilantes (ciclofosfamidas, nitrosoureas) , antimetabolitos (metotrexato, 5-fluorouracilo, citosina arabinósida) , productos naturales (doxorubicina y análogos estructurales, actinomicina D, bleomicina, alcaloides vinca, epipodofilotoxinas y mitomicina C) . Para una descripción exhaustiva del estado de la técnica concerniente a los compuestos de receptores de integrina ?vß3 y avßs y sus aplicaciones, el lector debe referirse al documento WO 2004/011487, con el nombre del Solicitante, al cual se hace referencia explícita en conexión con antecedentes científicos. Sorprendentemente, las moléculas resultantes de la presente invención demuestran afinidad para integrinas, que a veces es considerablemente mayor que la observada para ciclopéptidos que pertenecen a la misma clase y descritos en la literatura [H. Kessler, et al . , J. Med. Chem . , 1999, 42, 3033-40] . Por lo tanto, esta invención proporciona inhibidores de integrina de tipo ovß3 y avßs, que son mucho más potentes que los compuestos conocidos . Por lo tanto, el principal objetivo de la presente invención son compuestos de la Fórmula I, como sigue: C (R?-Arg-Gly-Asp-R2) (Fórmula I) donde : -c significa cíclico; -Ri es un aminoácido con la fórmula general: -NX-CY (Z) -CO;
donde -X se selecciona del grupo que comprende: H, alquilo Ci-Cd lineal o ramificado, arilo C6-C10, bencilo, (CH2)n-COR, (CH2)n- NHR' , 4-COR-bencilo, 4- (CH2-NHR' ) -bencilo; donde n es un número entero con un valor de 1 a 5; -Y se selecciona del grupo que comprende: H, CHmFm- ; donde m + m' = 3, donde m y m' son números enteros con un valor de 0 a
3; -Z se selecciona del grupo que comprende: H, alquilo C?-C6 lineal o ramificado, arilo C6-C?0, (CH2)n?-COR, (CH2) nl-NHR' , 4- NHR' - (CH2)nl-bencilo, 4-COR-bencilo, donde ni es un número entero con un valor de 0 a 5 ; -R se selecciona del grupo que comprende: W, OW, N[CH2-CO-NH- CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-COOW]2, NH-CH2-0- (CH2CH20) n2-CH2-COOW, NW-(CH2CH2 H)n2-CH2-CH2 HW; donde n2 es un número entero con un valor de 1 a 22; y -W se selecciona del grupo que comprende: H, alquilo C1-C3; -R' se selecciona del grupo que comprende: H, CO- (CH2)n2-COOW,
CO-CH2-0- (CH2CH20)n2-CH2-NHW, CO-CH2-0- (CH2CH20) n2-CH2-COOW; donde n2 tiene el significado mencionado anteriormente; y -R2 se selecciona del grupo que comprende: D-Phe, D-Tyr, D- Trp, D-2-naf il-Ala, D-4-ter-butil-Phe, D-4 , 41-bifenil-Ala, D- 4-CF3-Phe, D-4-acetilamina-Phe; sus mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales y sus sales farmacéuticamente aceptables . Los ejemplos preferidos de los compuestos de la Fórmula (I) son: c (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp) ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad] ; c (Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp) ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO (CH2) 2COOH] ; c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly) ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (0-CH2-CH2) 2-0-CH2-COOH] ; c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (OCH2-CH2) 8-OCH2-COOH] ; c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(carboxipentileno) -Val] ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(aliloxicarbonilpentileno) -Val] ; y c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (OCH2-CH2) 3OCH3) ] . Lo que se quiere dar a entender con una sal farmacéuticamente aceptable es cualquier sal que no produzca efectos tóxicos o secundarios . Estas sales se conocen bien por los farmacólogos y por los expertos en la tecnología farmacéutica. Los compuestos de la Fórmula I pueden prepararse según los procesos descritos a continuación y se ejemplifican para los compuestos preferidos según la invención. Este proceso constituye otro objetivo de la invención. Los compuestos de la Fórmula I pueden prepararse, después de sintetizar los residuos de aminoácidos no naturales, según tecnología convencional de síntesis de péptidos como se describe en los ejemplos en la parte experimental. La síntesis de péptidos puede lograrse ya sea como fase sólida o en solución. Una vez que se ha preparado el péptido lineal protegido adecuadamente, este se cicliza. Los compuestos descritos en la presente invención son inhibidores de integrina y por lo tanto son útiles como medicamentos en el tratamiento contra cáncer, como agentes de formación de imágenes para diagnóstico y como vectores para fármacos con especificidad de objetivo (G. C. Tucker 2003 Curr. Opin . Inveetig. Drugs 4 , 722-31 ) , particularmente para el tratamiento contra tumores cuyas células sobreexpresan integrinas tanto naturalmente como de forma inducida, por ejemplo, como resultado de radioterapia; en enfermedades inflamatorias (por ejemplo, artritis reumatoide) , en las enfermedades subyacentes a la angiogénesis anormal como tumores, retinopatías, enfermedades oculares, insuficiencia renal aguda, osteoporosis y metástasis, enfermedades cardiovasculares (apoplejía y daño cardiaco) y restenosis después de una angioplastía coronaria transluminal percutánea ( J. S. Kerr et al . Drug News Perspect 2001 , 14, 143 50) . Los compuestos descritos aquí también son útiles, cuando se marcan adecuadamente, como agente de diagnóstico especialmente para la detección de pequeñas masas tumorales y eventos de presión arterial. Se han marcado diversos antagonistas con (18)F, (111) In, (99)Tc, (90) Y y varios isótopos de yodo para monitorizar la angiogénesis inducida por tumor, ya que las integrinas están involucradas en la migración de células endoteliales para la formación de nuevos vasos (R . H. Haubner et al . 2003 Q. J. Nucí . Med. 47 189-99) . La elevada afinidad de péptidos radiomarcados pueden utilizarse como objetivos para integrinas ?vß3 y a fin de crear imágenes de áreas en daño vascular, tanto que la expresión de integrinas ?vß3 aumenta en las células endoteliales activadas y en las células del músculo liso vascular después de daño vascular. Este enfoque se sobrepone a los inconvenientes de los métodos de formación de imágenes mediante resonancia magnética y tomografía axial computarizada como falta de ligandos biológicamente relevantes y agentes de contraste sanguíneo para la formación de imágenes
(F. G. Blankenberg et al . 2002 Am . J. Cardiov. Drugs 2, 357-65) . Las composiciones farmacéuticas contienen al menos un compuesto de la Fórmula I como el ingrediente activo en una cantidad tal para producir un efecto terapéutico significativo. Las composiciones según la presente invención son completamente convencionales y se obtienen utilizando métodos que son de práctica común en la industria farmacéutica. Según la ruta de administración seleccionada, las composiciones tendrán forma sólida o líquida, serán adecuadas para su administración oral, parenteral o intravenosa. Las composiciones según la presente invención contienen, junto con el ingrediente activo, al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptables . Particularmente útil son los adyuvantes de formulación como por ejemplo, agentes solubilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión y agentes emulsionantes. Los compuestos de la Fórmula I también pueden utilizarse combinados con otros fármacos anticancerígenos o con otros fármacos con actividad antiparasitaria o antiviral, tanto en forma separada como en forma de dosis individual . Los medicamentos que son el objetivo de la presente invención también se utilizan en el tratamiento contra enfermedades parasitarias y de adenovirus. La entrada de patógenos en células ocurre por medio de la penetración directa de la membrana plasmática, endocitosis mediada por clatrina, endocitosis caveolar, pinocitosis o macropinocitosis . La macropinocitosis requiere del involucramiento de integrinas ( O . Meier et al . , 2003 , J. Gene Med. 5, 451 -62) . La actividad antiparasitaria puede ejercerse mediante la inhibición de la adhesión mediada por integrina y mediante el reclutamiento de leucocitos guiados por los quimiorreceptores, por ejemplo, en el control de la inflamación inducida por Trypanosoma cruzi . Incidentalmente, la fase aguda de la enfermedad de Chagas, inducción de procesos inflamatorios es crucial para el control de Trypanosoma cruzi en el tejido objetivo para el equilibrio hospedero/parásito (J. Lannes-Vieira, 2003 , Mem . Inst . Oswaldo
Cruz, 98, 299-304 ) . Los siguientes ejemplos ilustran aún más la invención. Las abreviaturas utilizadas son: Aad (ácido aminoadípico) ; Amb (aminometilbencilo) ; Amp (aminometilfenillalanina) ; Boc (ter-butoxicarbonilo) ; CSA (ácido alcanforsulfónico) ; CTH (hidrogenación de transferencia catalítica) ; DBU (1, 8-Diazabiciclo[5.4.0] undec-7-eno) ; DCC (diciciohexilcarbodiimida) ; DCM (diclorometano) ; DEAD (dietilacetilendicarboxilato) DIEA (diisopropiletilamina) ; DMF (dimetilformamida) ; EMEM (medio mínimo esencial de Eagle con sal de Eagle) ; Fm (fluorenilmetilo) ; Fmoc (9-fluorenilmetil-oxicarbonilo) ; HOBT (hidroxibenzotriazol) ; NMP ( (N-metil-pirrolidona) ; oNBS (2-nitrobencensulfonato) ; PBS (amortiguador salino de fosfato) ; Pht (ftaloilo) ; Pmc (pentametilcroman-6-sulfonilo) ;
SDS (dodecilsulfato de sodio) ; TBTU (tetrafluoroborato-O-benzotriazol-l-il-tetrametiluronio) ; TEA (trietilamina); Teg (monometiléter de trietilenglicol) ; y TFA (ácido trifluoroacético) . Descripción Detallada de la invención Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp) -ST2581 Se suspenden 1.587 mmol de Fmoc-Gly-Res (Res = Sasrin Resin®, Bachem) con agitación en 75 ml de DMF durante 30 minutos, después de lo cual se agregan 18 ml de piperidina, continuándose agitando durante 30 minutos adicionales. La resina, que se filtra y se lava con DMF, se suspende en 50 ml de NMP (N-metil-pirrolidona) durante 15 minutos, después de lo cual se agrega Fmoc-Arg(Pmc) -OH, HOBT, TBTU y DIEA (3.174 mmol de cada una) ,- después de dos horas de agitación, la suspensión se filtra y se lava con DMF. Después de desprotegersecon piperidina, se repite la condensación con otros aminoácidos en sucesión, operando cada vez como se describe anteriormente, a decir: Fmoc-Amp (Cbz) -OH, Fmoc-D-Phe-OH y F oc-Asp(OtBu) -OH. Luego de la última desprotección del Fmoc-N-terminal, el pentapéptido lineal se libera de la resina con 45 ml de 1% TFA en DCM. Esto se disuelve en aproximadamente un litro de CH3CN y se agregan 4.761 mmol de HOBT y TBTU y 10 ml de DIEA; la solución se mantiene agitándose durante 30 minutos, el solvente se evapora hasta obtener un pequeño volumen y se completa con agua la precipitación del producto. El producto crudo filtrado se disuelve en tionasol (50 eq) y TFA (270 eq) agitándose durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se seca y el residuo se absorbe con una cantidad mínima de TFA y se vuelve a precipitar con una cantidad excesiva de éter etílico. Finalmente, el producto crudo se purifica mediante Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC por sus siglas en inglés) [Columna: Al1 ima C-18, Alltech; fase móvil: 17% CH3CN en agua + 1.1% TFA] . HPLC analítico: columna: Purosphere STAR, Merck,; fase móvil: 15% CH3CN en agua + 1.1% TFA): Rt = 12.15 minutos. Masa molecular = 652. Ejemplo 2 Síntesis de c (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad) - ST2650 Se somete a tratamiento 0.69 mmol de Fmoc-Gly-Res exactamente como se describe en el ejemplo 1, con la diferencia de que en este caso, el tercer y cuarto aminoácidos se agregan en forma de dipéptido Fmoc-D-Phe-Aad (OBzl)-OH. Después de desprotegerse mediante CTH y purificar el producto crudo con RP-HPLC preparativa (fase móvil: 66% CH3CN en agua + 0.1% TFA; Rt = 17.29 minutos), se obtienen 187 mg de péptido puro. Esto se disuelve en TFA y después de una hora a temperatura ambiente, la solución se seca. El residuo se vuelve a disolver con una cantidad mínima de TFA y se precipita con una cantidad excesiva de éter etílico. La operación se repite hasta que se obtiene el producto final purificado. RP-HPLC analítico (17% CH3CN en agua + 0.1% TFA), Rt = 12.52 minutos Masa molecular = 619. Ejemplo 3 Síntesis de c (Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp) - ST2700 A una suspensión de Fmoc-Phe (4-Pht-N-CH2) -COOH en tolueno anhidro en reflujo, se le agregan 2 equivalentes de CSA y 20 equivalentes de paraformaldehí o, dividido en 4 porciones a intervalos de 15 minutos. Se enfría la muestra, se diluye con 120 ml de tolueno y se lava con 5% NaHC03 y agua. Después de la evaporación del solvente, el residuo se disuelve en 15 ml de CHC13 + 15 ml de TFA + 700 µl de Et3SiH; la mezcla se mantiene en la oscuridad agitándose durante 42 horas . Después de evaporarse el solvente, el residuo se purifica mediante filtración sobre gel de sílice. Producción general: 90%. El péptido lineal se sintetiza en fase sólida como se describe en el ejemplo 1, insertando Fmoc-N-Me-Phe- (4-Pht-N-CH2)-COOH como el tercer aminoácido, que se prepara como se describe anteriormente, en este caso, las desprotecciones en N-Fmoc-terminal sobre resina se llevaron a cabo con 30% de diisopropilamina (300 equivalentes en solución con DMF (debido a la presencia de ftalamida) . Luego de la ciclación, se disuelven 500 mg de péptido en 10 ml de EtOH absoluto, a lo cual se agregan 0.9 ml de una solución de NH2-NH2»H20 1 M en etanol. Luego de calentarse en reflujo durante dos horas, el solvente se evapora y el residuo se absorbe con 10 ml de DCM + 10 ml de solución Na2C03 con agitación vigorosa. El producto final crudo se recupera a partir de la fase orgánica después de evaporarse y purificarse mediante RP-HPLC preparativa (fase móvil: 17% CH3CN en agua + 0.1% TFA) . RP-HPLC analítico (16% CH3CN en agua + 0.1% TFA), Rt = 11.7 minutos. Masa molecular = 665. Ejemplo 4 Síntesis de c [Arg(Pmc) -Gly-Asp(OtBu) -D-Phe-Amp(CO- (CH2)2-COOH] ST2649 protegido) Se disuelven 120 mg de ciclopéptido c [Arg(Pmc) -Gly-Asp(OtBu) -D-Phe-Amp]»TFA (que se prepara como se describe en el ejemplo 1) en 3.6 ml de una mezcla de DCM-DMF 2:1, junto con una cantidad estequiómetrica de TEA y anhídrido succínico. Después de una hora, la mezcla de reacción se diluye con 30 ml de DCM y se lava con agua. La fase orgánica, seca y concentrada, proporcionó un residuo de 100 mg de hemisuccinato. Este producto se desprotege completamente con TFA y luego se somete a una primera purificación como ya se describió en los ejemplos anteriores. Luego se purifica aún más mediante RP-HPLC preparativa (23% CH3CN en agua + 0.1% TFA) . RP-HPLC analítica: (20% CH3CN en agua + 0.1% TFA), Rt = 14.66 minutos . Masa molecular = 751. Ejemplo 5 Síntesis de c (Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly) - ST2701 A una solución de 1-22 mmol de p-xililendiamina Boc-monoprotegida en 6 ml de THF se agrega 1.83 mmol de TEA y gota a gota, se agrega una solución de 1.22 mmol de bromoacetato de bencilo en 2 ml de THF. La mezcla se deja agitando durante la noche después de lo cual el solvente de evapora y el residuo se purifica en una columna rápida (CHCl3-EtOAc, 9:1). Se obtienen 0.69 mmol de benciléster de N- (4-Boc-NH-CH2-bencil) -glicina. Se disuelven 250 mg de Fmoc-D-Phe-OH en 27 ml de DCM y se agregan 40 µl de difosfeno y 230 µl de sim-colidina; luego de 15 minutos, se agregan 190 ml del éster previamente preparado, se disuelve en 3 ml de DCM. Luego de un período de tres horas, se agregan 80 µl de N-Me-piperazina a la mezcla de reacción y se agita durante 10 minutos, después de lo cual la mezcla se diluye con 10 ml de DCM y se lleva a cabo la extracción con agua, HCl 0.5N, agua, 5% NaHC03 y agua. Luego de la evaporación del solvente, el residuo se purifica mediante cromatografía rápida sobre gel de sílice (DCM-EtOAc, 9:1).
Producción: 80%. A 100 mg del producto así obtenido, disuelto en 6 ml de
MeOH, se agregan 76 µl de AcOH y 42 mg de HCOONH y la mezcla se enfría a 0°C y se agregan 50 mg de 10% Pd/C. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se mezcla sobre celite. El producto filtrado se deshidrata y purifica en columna rápida
(CHCl3-MeOH 9:1). Producción: 90%. Se disuelven 190 mg del producto obtenido así en 1.2 ml de TFA y se deshidrata (desprotección de Boc) ; el residuo se vuelve a disolver en 9 ml de 10% Na2C03 + 6 ml de dioxano, se enfría a 0°C y se agrega gota a gota una solución de 120 µl de cloruro de benciloxicarbonilo diluido con 3 ml de dioxano. Luego de una hora de agitarse a temperatura ambiente, se lleva a cabo la evaporación en vacío hasta un pequeño volumen, después de lo cual la mezcla se diluye con agua, el pH se reduce a 1 con HCL y la extracción se lleva a cabo con EtOAc. Luego de la evaporación del solvente, el residuo se purifica mediante filtración sobre gel de sílice, se lava con CHC13-MeOH (8:2). Producción de dipéptido puro: 82%. Se somete a tratamiento 0.69 mmol de Fmoc-Gly-Res como se describe en el ejemplo 1. Después de Arg, el dipéptido previamente preparado Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH2-bencil) -Gly se agrega secuencialmente. El producto crudo se disuelve en tioanisol y TFA y se agita a temperatura ambiente durante 4.5 horas. La primera purificación se lleva a cabo como se describe en los demás ejemplos, mientras que la purificación final se lleva a cabo mediante HPLC preparativa (fase móvil: 16% CH3CN en agua + 0.1% TFA) . RP-HPLC analítica (15% CH3CN en agua + 0.1% TFA), Rt = 7.67 minutos . Masa molecular = 652. Ejemplo 6 Síntesis de c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2- (OCH2CH2)2-0-CH2-COOH] - ST2661 A una solución de 200 mg de c (Arg(Pmc) -Gly-Asp(OtBu) -D-Phe-Amp)»TFA (obtenida como se describe en el ejemplo 1) en 4 ml de una mezcla 3:1 DCM-DMF, se agrega una cantidad sustancial de glicol diácido. Se agrega DIEA (3 eq) y DCC (2 eq) a la misma solución. La mezcla se deja agitando durante la noche y después de esto se diluye con DCM y se lava con agua.
El producto crudo se recupera mediante la evaporación de la fase orgánica y se purifica en cromatografía rápida (fase móvil: CHCl3-MeOH 7:3 + 1% AcOH); las fracciones que contienen el producto se agrupan, se lavan con agua, se deshidratan y se secan, lo que produce un residuo de 157 mg de producto puro. Esto se somete a tratamiento con TFA durante 1.5 hrs . y se depura como se describe en los otros ejemplos, después de esto la purificación final se lleva a cabo mediante HPLC preparativa (fase móvil: 22% CH3CN en agua + 0.1% TFA). RP-HPLC analítica (23% CH3CN en agua + 0.1% TFA);
Rt = 10 minutos. Masa molecular = 855. Ejemplo 7 Síntesis de c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2- (OCH2CH2)8-OCH2-COOH] -ST2874 150 mg del péptido descrito en el ejemplo 1 y 110 mg de PEG 600-COOFm (1 eq) + HOAT (1.5 eq) + DIEA (2 eq) se disuelven en 6 ml de una mezcla de DCM-DMF (2:1) y luego la solución se enfría a una temperatura de 0°C; 1.5 equivalentes de DCC se agregan y la mezcla se agita durante la noche. Después de evaporarse el solvente, el residuo se purifica mediante cromatografía rápida (paso I: CHCl3-MeOH, 96:4, paso II: CHCl3-MeOH, 90:10). Para la desprotección de fluorenilmetiléster, 36 mg de éster se disuelven en 1.8 ml de CHC13, se agregan 41µl (20 eq) de piperidina y se deja durante una noche a temperatura ambiente. Después de evaporarse el solvente, el residuo crudo se purifica mediante HPLC preparativa (46% CH3CN en agua + 0.1% TFA). El producto puro obtenido así se disuelve en TFA y se deja durante dos horas a temperatura ambiente. Después de reducirse a un pequeño volumen, el producto totalmente desprotegido se precipita con una cantidad excesiva de éter etílico. RP-HPLC analítica (26% CH3CN en agua + 0.1% TFA); Rt = 7.89-15.83 minutos. Masa molecular: 1119.
Ejemplo 8 Síntesis de c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(carboxipentilen) -Val]ST2956 [y los derivados alilo: ST2957] Se obtiene la secuencia Arg(Pmc)-Gly mediante síntesis de fase sólida según el proceso descrito anteriormente, mientras que se , introduce el bloque estructural oNbs-N[ (CH2) 5-C00A11]Val-OH mediante el siguiente proceso: La mezcla del bloque estructural (3 eq. ) (síntesis descrita a continuación) y l-bromo-N,N-2-trimetil-l-propenilamina (4.5 eq) se disuelve en DCM en atmósfera inerte
(Argón) , la agitación continua durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego la mezcla se agrega a resina a DCM con colidina (12 eq) , con atmósfera inerte. Luego de dos horas (prueba Kaiser negativa) , la resina se filtra y se lava abundantemente con DCM y DMF y se seca a presión reducida. Para llevar a cabo la desprotección de la entidad 2-nitrobencensulfonilo (oNbs) , se agrega 2-mercaptoetanol (10 eq) + 10 DBU (5 eq) en DMF, a la resina. Luego de un período de 30 minutos, se agregan los reactivos nuevamente y después de dos horas, la escisión es completada (verificar por medio de HPLC) . La resina se filtra y se lava con DCM y DMF. La ruta sintética del siguiente acoplamiento fue igual, utilizando N3-D-Phe-Br. El ácido a-azida correspondiente se prepara mediante "diazotransferencia" como reacción iniciando a partir del aminoácido correspondiente [Alper et al . , Tetrahedron Lett. (1996)37, 6029]. La entidad azida se reduce utilizando una solución de SnCl4 (10 eq) + tiofenol (40 eq) y TEA (10 eq) en DMF. Esta solución se agrega a la resina en DMF y se deja agitando durante una hora. Luego la suspensión resultante se somete a tratamiento con 2N NaOH durante 5 minutos, se filtra y se lava con agua, DMF, MeOH, DMF y DCM. Subsiguientemente, las condiciones para la condensación de Asp, la siguiente desprotección del grupo Fmoc, la escisión de la resina y la ciclación del péptido fueron las que se utilizan comúnmente en la síntesis química de péptidos. La materia prima se purificó mediante cromatografía rápida. El péptido obtenido se desprotege paso a paso, primero utilizando Pd(Ph3P) y luego con TFA. El producto final se purifica mediante precipitación con TFA/dietiléter . Ejemplo 8a Síntesis de bloques estructurales oNbs- [N(CH2)5-COOAll] -Val-OH A una solución de hidroxiácido HO- (CH2) 5COOH y etanol absoluto, se agrega Cs2C03 (1 eq) . La mezcla se deja agitando hasta a total disolución de la sal (aproximadamente 40 minutos) . El solvente se evapora al vacío y el residuo se seca con benceno hasta obtener un cristal sólido color blanco. A este sólido, disuelto en DMF, se agrega bromuro de alilo (11 eq) y se deja agitando durante dos horas. Se agrega otra cantidad de bromuro de alilo (11 eq) y se deja agitando a temperatura ambiente durante la noche. La materia prima se purifica mediante cromatografía rápida (hexano/AcOEt, 1:1). Producción 70%. A una solución de oNbs-Val-OtBu en THF a una temperatura de 10°C, que se le había agregado hidroxiéster (1.05 eq) y trifenilfosfina (1.5 eq) . A una temperatura de -20°C, se agregan 4.08 ml de DEAD (40% en tolueno). Después de agitarse a temperatura ambiente durante 48 horas, el solvente se evapora y la materia prima se purifica mediante RP-HPLC preparativa (CH3CN/H20/TFA: 75-25-0.1). Producción 70%. Después de la desprotección final del éster ter-butílico con TFA, se obtiene el bloque estructural deseado. Ejemplo 9 Síntesis de c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2- (OCH2CH2)3-OCH3) ] -ST2597 Este péptido se sintetizó mediante fase sólida como se describe en el ejemplo 1, insertando Fmoc-Amp(CO-CH2-Teg) -OH como el tercer aminoácido, que se prepara de la siguiente forma: 570 mg de CH30 (CH2CH20) 3-CH2-COOH, 473 mg de 2,3,4,5-pentafluorofenol (Pfp) y 207 µl de piridina se disuelven con 11.4 ml de DCM. A la solución, enfriada a 0°C, se agregan 637 mg de DCC y la mezcla de reacción se deja agitando durante 1.5 horas. Después de la filtración y lavar el producto filtrado con agua, 1 N HCl, agua, 5% NaHC03 y agua, la solución orgánica se seca, proporcionando 984 mg de éster crudo. A una suspensión de 500 mg, de Fmoc-aminometilfenilalanina, se agrega sal TFA en 15 ml de DCM, 260 µl de TEA seguido de 800 mg de éster activado y la mezcla se deja agitando durante tres horas. El producto crudo se purifica mediante cromatografía rápida, proporcionando el bloque estructural puro. El péptido cíclico final se purifica como es usual y se aisla a partir de HPLC preparativa (27% CH3CN en agua + 1% TFA), Rt = 12.7 minutos. Masa molecular = 855. Ejemplo 10 Resultados Biológicos Enlace a receptores o]^ de integrina El receptor ?vß3 purificado (Chemicon catálogo CC1020) se diluye en amortiguador (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2) a una concentración de 0.5 µg/ml. Se agrega una parte alícuota de 100 µl a placas de 96 pocilios y se incuban durante la noche a una temperatura de +4°C. Las placas se lavan una vez con amortiguador (50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1% albúmina de suero de bovino) y luego se incuba durante dos horas adicionales a temperatura ambiente. Las placas se layan dos veces con el mismo amortiguador y se incuban durante tres horas a temperatura ambiente con el ligando radioactivo [125I] equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0.05 nM en presencia de ligandos competitivos. Al final de la incubación, los pocilios se lavan y se determina la radioactividad utilizando un contador de rayos gamma (Packard) . Se pudo determinar la unión inespecífica del ligando en presencia de una cantidad excesiva de equistatina fría (1 µM) . Enlace a receptores Oyßs de integrina El receptor Ovßs purificado (Chemicon, catálogo CC1020) se diluye en amortiguador (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl ) a una concentración de 1 µg/ml. Se agrega una parte alícuota de 100 µl a placas de 96 pocilios y se enjuaga durante la noche a una temperatura de + 4°C. Las placas se lavan una vez con amortiguador (1% albúmina sérica de bovino) y luego se incuban durante otras dos horas adicionales a temperatura ambiente. Las placas se lavan dos veces con el mismo amortiguador y se incuban durante tres horas a temperatura ambiente con el ligando radioactivo [125I] equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0.15 nM en presencia de ligandos competitivos. Al final de la incubación, los pocilios se lavan y la radioactividad se determina utilizando un contador de rayos gamma (Packard) . Se determina la unión inespecífica del ligando en presencia de una cantidad excesiva de equistatina fría (lµM) .
Evaluación de parámetros CI50 Se expresó la afinidad de los productos para receptores de vitronectina como un valor CI50 - SD, es decir, como la concentración capaz de inhibir 50% de la unión específica de radioligando-receptor . Se elabora el parámetro CI50 utilizando el sof ware "ALLFIT" . Resultados Todos los péptidos RGD que se examinaron mostraron una significativa afinidad para los receptores de integrina ?vß3 y avßs con un valor CI50 en el orden de nanomoles. En particular, el más activo para inhibir la unión de equistatina a integrinas ?vß3 fue ST2581 (CI50 = 1.7 nM) seguido de los productos ST2661 y ST2700 (CI50 = 4 y 7 nM) , mientras que el más activo para los receptores de integrina c ßs fue el producto ST2650 (CI50 = 0.17 nM) seguido de las moléculas ST2661 y ST2700 (CI50 = 0.35 y 0.99 nM, respectivamente). Aunque la función principal de integrinas es regular la adhesión celular a proteínas ECM en espacios intercelulares y en membranas básales, también transducen señales intracelulares que promueven la migración celular así como la supervivencia. Las integrinas no tienen actividad enzimática intrínseca pero activan las vías de señalización agrupándose con cinasas y proteínas adaptadoras en complejos de adhesión focalizados después de su asociación con las proteínas de matriz extracelular polivalente (ECM) . Por ejemplo, el enlace de integrinas suprime la apoptosis activando los supresores de apoptosis e inhibiendo la activación de caspasa. La integrina también estimula la migración celular activando Rho y Rae GTPasas (guanosina trifosfatasa) y anclando los filamentos de actina en la membrana. Estas proteínas de adhesión promueven la entrada del ciclo celular al estimular la expresión de ciclinas/ Por lo tanto, en el enlace de integrinas, se apoyan las cascadas de transducción de señales que promueven la proliferación celular, su supervivencia y migración. A diferencia, la inhibición de la interacción de ligandos-integrina celular, inhibe la migración celular y su proliferación e induce la apoptosis (Jin H. y Varner J. 2004 Br. J. Cáncer 90, 561 -565) . Tabla 1
vitronectina
Prueba de adhesión en vitronectina para células tumorales Se cultivan células A2780 de carcinoma ovárico humano y PC3 de carcinoma prostático humano en RPMI 1640 que contiene 10% suero fetal de bovino y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina. Se cultivaron células A498 de carcinoma renal de humano en EMEM que contiene 10% suero fetal de bovino y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina. Todas las células se mantuvieron en una incubadora a 37°C con humedad saturada y una atmósfera de 95% aire y 5% C02. La línea celular A2780 expresa para elevados niveles de integrinas Ovßs, A498 elevados niveles de integrinas ?vß3 y PC3 bajos niveles de ambas integrinas. Para probar el efecto de los fármacos sobre la adhesión celular, se incubó la densidad celular apropiada (40000-50000 células/pocilio) para cada línea de célula tumoral con diferentes concentraciones de compuestos en placas para cultivo tisular de 96 pocilios recubiertas con vitronectina (5 µg/ml) y se les permitió adherirse durante tres horas. Después de esto las células se lavaron una vez con PBS que contenía Ca2+ y Mg2+. Las células tumorales se fijaron con 4% paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con 1% azul de toluidina durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células tumorales se lavaron con agua doblemente destilada, se secaron y solubilizaron con 1% SDS. El número de células adherentes se determino en un lector de microplacas (Victor2, EG&G Wallac) a 600 nm. Un valor CI50 como parámetro para medir el efecto inhibidor de las moléculas sobre la adhesión de células tumorales en vitronectina utilizando el programa de computadora "ALLFIT" . Los resultados obtenidos con los compuestos analizados de conformidad con la invención se mencionan en la Tabla 2. Tabla 2 Valoración de Adhesión
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.