ES2340862T3

ES2340862T3 - Derivados ciclopeptidicos con actividad anti-integrina.

Info

Publication number: ES2340862T3
Application number: ES05742999T
Authority: ES
Inventors: Alma Dal Pozzo; Sergio Penco; Giuseppe Giannini; Maria Ornella Tinti; Claudio Pisano; Loredana Vesci; Ming Hong Ni
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2004-05-13
Filing date: 2005-05-04
Publication date: 2010-06-10
Anticipated expiration: 2025-05-04
Also published as: RS51300B; SI1751176T1; KR20070012524A; ITRM20040239A1; EP1751176A1; DE602005019876D1; DK1751176T3; WO2005111064A1; JP2008500971A; EP1751176B1; MXPA06012887A; PT1751176E; CY1110039T1; AR048957A1; CA2562576A1; BRPI0510985A; CN1953990A; WO2005111064A8; TW200606178A; AU2005243418A1

Abstract

Péptidos cíclicos que tienen la siguiente Fórmula I: (Fórmula I)c(R1-Arg-Gly-Asp-R2) en la que: c significa cíclico; R1 un aminoácido con fórmula general: -NX-CY(Z)-CO-; en la que X se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, alquilo C1-C6 lineal o ramificado, arilo C6-C10, bencilo, (CH2)n-COR, (CH2)n-NHR'', 4-COR-bencilo, 4-(CH2-NHR'')-bencilo; en la que n es un número entero de 1 a 5; Y se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, CHmFm''; en la que m + m'' = 3, en que m y m'' son números enteros de 0 a 3; Z se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, (CH2)n1-NHR'', 4-NHR''-(CH2)n1-bencilo, 4-COR-bencilo, en la que n1 es un número entero de 0 a 5; R se selecciona entre el grupo que está constituido por: W, OW, N[CH2-CO-NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW]2, NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW, NW-(CH2-CH2NH)n2-CH2-CH2NHW; en las que n2 es un número entero de 1 a 22; y W se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, alquilo C1-C3; R'' se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, CO-(CH2)n2-COOW, CO-CH2-O-(CH2CH2 O)n2-CH2-NHW, CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW: en las que n2 tiene el significado que se ha reseñado anteriormente; y R2 se selecciona entre el grupo que está constituido por: D-Phe, D-4-terc-butil-Phe, D-4-CF3-Phe, D-4-acetilamina-Phe; sus mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Derivados ciclopeptídicos con actividad anti-integrina.

Campo de la invención

Los objetos de la presente invención son compuestos útiles como medicamentos, procedimientos para la preparación de los mismos, composiciones farmacéuticas que los contienen y usos de los mismos para la preparación de medicamentos útiles para la terapia de enfermedades debidas a angiogénesis anormal.

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Antecedentes de la invención

En pacientes oncológicos, la quimioterapia es, en muchos casos, la única opción de tratamiento contra un cáncer diseminado. Una aproximación para mejorar la eficacia y reducir la toxicidad de la terapia anticáncer es administrar fármacos que tengan como diana los receptores implicados en la angiogénesis tumoral.

En la adhesión entre una célula y otra y entre células y la matriz extracelular están implicadas integrinas tanto en el proceso de angiogénesis tumoral como en el proceso metastático. En particular, los receptores de integrinas \alpha_{\nu}\beta_{3} y \alpha_{\nu}\beta_{5} se expresan fuertemente en las células endoteliales de los microvasos de tumores humanos y en las propias células tumorales.

En la actualidad se reconoce generalmente que la vascularización de tumores es una diana prometedora para terapia anticáncer [H. Jin y J. Varner, Br. J. Cancer, 2004, 90(3): 561-5].

En los últimos años, numerosos estudios han demostrado que derivados ciclopeptídicos que contienen la secuencia Arg-Gly-Asp presentan alta afinidad para receptores de integrina.

Se está estudiando la inhibición de la progresión y la neoangiogénesis tumorales usando péptidos RGD cíclicos y algunos estudios ya han mostrado resultados prometedores.

Por ejemplo, se ha demostrado recientemente en un carcinoma de colon inducido químicamente en ratas que el comienzo tardío de tratamiento con péptidos bloqueadores de integrina dio como resultado la inhibición de crecimiento tumoral y la reducción de carga tumoral que parece que está mediada, al menos en parte, por inhibición de neoangiogénesis (Haier J. y col., Clin Exp Matastasis, 2002; 19 (8); 665-72). Por lo tanto, la inhibición de receptor de integrina \alpha_{\nu}\beta_{3} parece que es una buena estrategia terapéutica contra el cáncer.

Además, estos péptidos RGD cíclicos también pueden tener aplicaciones terapéuticas interesantes en enfermedades cardiovasculares, osteoporosis e infecciones virales que utilizan integrinas celulares en su penetración en las células diana (por ejemplo VIH). Compuestos de este tipo son útiles para dirigir fármacos de quimioterapia, particularmente fármacos anticáncer, contra aquellas células que expresan niveles altos de receptores de integrina. De esta manera, se consigue una respuesta terapéutica eficaz con bajos efectos laterales inducidos por el agente de quimioterapia.

Hauber R., y col., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7461 estudiaron la influencia de los cambios conformacionales de pentapéptidos cíclicos que contienen RGD de fórmula RGD-XX sobre el perfil de inhibición de estos últimos sobre diversos tipos de receptores de integrina. Al variar la naturaleza de los dos últimos restos aminoácido (es decir, XX) los autores concluyeron que la naturaleza del último resto no tenía influencia alguna sobre el perfil inhibidor del ciclo completo. Sin embargo, no se reseñaron datos respecto a \alpha_{\nu}\beta_{5}.

El documento DE19725368 describió derivados de fórmula RGD-XX, aunque, como no se describieron en esta patente datos biológicos respecto a derivados de este tipo, este documento no da retrospectiva alguna sobre la influencia de diversos restos en la posición 4 y/o la 5 de la estructura cíclica.

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Resumen de la invención

La presente invención se refiere a derivados ciclopeptídicos dotados de actividad anti-integrina, y particularmente a péptidos cíclicos que contienen, además de una secuencia de tres aminoácidos que es constante en todos los compuestos que se describen en este documento, otros dos restos que están constituidos por aminoácidos naturales o no naturales, que pueden estar sustituidos sobre el nitrógeno o sobre el C\alpha con un resto que está constituido por un grupo funcional o una cadena terminal con un grupo funcional que, inesperadamente, potencia su unión a integrinas \alpha_{\nu}\beta_{3} y \alpha_{\nu}\beta_{5}. La presente invención también se refiere a procedimientos para la preparación de dichos compuestos, el uso de los mismos como medicamentos, particularmente como inhibidores de receptor de integrina, con acción útil en el tratamiento de enfermedades tales como retinopatía, insuficiencia renal aguda, osteoporosis y metástasis y a composiciones farmacéuticas que los contienen. Estos compuestos, cuando se marcan adecuadamente, también son útiles como agentes de diagnóstico para la detección de masas tumorales pequeñas y episodios de oclusión
arterial.

Los fármacos vehiculados por los ciclopéptidos según la presente invención pertenecen a clases de agentes citotóxicos tales como agentes alquilantes (ciclofosfamidas, nitrosoureas), antimetabolitos (metotrexato, 5-fluoruracilo, arabinósido de citosina), productos naturales (doxorubicina y análogos estructurales, actinomicina D, bleomicina, alcaloides vinca, epipodofilotoxinas, y mitomicina C).

Para una descripción exhaustiva del estado de la técnica respecto a los compuestos receptores de integrinas \alpha_{\nu}\beta_{3} y \alpha_{\nu}\beta_{5} y sus aplicaciones, se remite al lector al documento WO 2004/011487, a nombre del solicitante, al que también se hace referencia explícita en conexión con los antecedentes científicos.

Sorprendentemente, las moléculas resultantes de la presente invención demuestran afinidad para integrinas, que a veces es considerablemente mayor que la que se observa para los ciclopéptidos que pertenecen a la misma clase y que se describen en la bibliografía [H. Kessler, y col., J. Med. Chem., 1999, 42, 3033-40].

Por lo tanto, esta invención proporciona inhibidores de integrina del tipo \alpha_{\nu}\beta_{3} y \alpha_{\nu}\beta_{5}, que son mucho más potentes que los compuestos conocidos.

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Por lo tanto, el principal objeto de la presente invención son compuestos de Fórmula I, como sigue:

(Fórmula I)c(R_{1}-Arg-Gly-Asp-R_{2})

en la que:

-: c significa cíclico;

-: R_{1} un aminoácido con fórmula general: -NX-CY(Z)-CO-; en la que

-: X se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, arilo C_{6}-C_{10}, bencilo, (CH_{2})_{n}-COR, (CH_{2})_{n}-NHR', 4-COR-bencilo, 4-(CH_{2}-NHR')-bencilo; en la que n es un número entero de 1 a 5;

-: Y se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, CH_{m}F_{m'}; en la que m + m' = 3, en que m y m' son números enteros de 0 a 3;

-: Z se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, (CH_{2})_{n1}-NHR', 4-NHR'-(CH_{2})_{n1}-bencilo, 4-COR-bencilo, en la que n_{1} es un número entero de 0 a 5;

-: R se selecciona entre el grupo que está constituido por: W, OW, N[CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n2}-CH_{2}-COOW]_{2}, NH-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n2}-CH_{2}-COOW, NW-(CH_{2}-CH_{2}NH)_{n2}-CH_{2}-CH_{2}NHW; en que n_{2} es un número entero de 1 a 22; y

-: W se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, alquilo C_{1}-C_{3};

-: R' se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, CO-(CH_{2})_{n2}-COOW, CO-CH_{2}-O- (CH_{2}CH_{2}O)_{n2}- CH_{2}-NHW, CO-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n2}-CH_{2}-COOW: en las que n_{2} tiene el significado que se ha reseñado anteriormente; y

-: R_{2} se selecciona entre el grupo que está constituido por: D-Phe, D-4-terc-butil-Phe, D-4-CF_{3}-Phe, D-4-acetilamina-Phe;

sus mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales y sus sales farmacéuticamente aceptables.

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Ejemplos preferidos de compuestos de Fórmula (I) son:

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp);

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad);

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp);

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH_{2})_{2}COOH];

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly);

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{2}-O-CH_{2}-COOH)];

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{8}-OCH_{2}-COOH)]; y

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH_{2}-(OCH_{2}-CH_{2})_{3}OCH_{3})];

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Lo que se quiere dar a entender por sal farmacéuticamente aceptable es cualquier sal que no dé origen a efectos tóxicos o laterales.

Sales de este tipo son bien conocidas para los farmacólogos y expertos en tecnología farmacéutica.

Los compuestos de Fórmula I se pueden preparar según el procedimiento que se describe a continuación en este documento y se ejemplifica para los compuestos preferidos según la invención. Este procedimiento constituye un objeto adicional de la invención.

Los compuestos de Fórmula I se pueden preparar, después de sintetizar los restos aminoácido no naturales, según técnicas convencionales de síntesis de péptidos, según se describe en los ejemplos de la parte experimental. La síntesis de péptidos se puede realizar tanto en fase sólida como en disolución. Una vez que se ha preparado el péptido lineal adecuadamente protegido, se somete a ciclación.

Los compuestos que se describen en la presente invención son inhibidores de integrina y por lo tanto son útiles como medicamentos en el tratamiento del cáncer, como agentes de diagnóstico por imagen y como vectores de fármacos que se dirigen a dianas (G.C. Tucker 2003 Curr. Opin. Investig Drugs 4, 722-31), particularmente para el tratamiento de tumores cuyas células sobreexpresan integrinas tanto de manera natural como inducida, por ejemplo, como resultado de radioterapia; en enfermedades inflamatorias, (por ejemplo, artritis reumatoide), en las enfermedades que comportan angiogénesis anormal, tales como tumores, retinopatía, enfermedades oculares, insuficiencia renal aguda, osteoporosis y metástasis, enfermedades cardiovasculares (infarto y ataque cardíaco), y restenosis después de angioplastia transluminal percutánea coronaria (J. S. Kerr y col., Drug News Perspect 2001, 14, 143 50). Los compuestos que se describen en este documento también son útiles, cuando se marcan adecuadamente, como agentes de diagnóstico, especialmente para la detección de masas tumorales pequeñas y episodios de oclusión arterial. Diversos antagonistas han sido marcados con (18)F, (111)In, (99)Tc, (90)Y y muchos isótopos de yodo para vigilar la angiogénesis inducida por tumores, puesto que en la migración de células endoteliales para la formación de nuevos vasos hay integrinas implicadas (R. H. Haubner y col., 2003 Q. J. Nucl. Med. 47 189-99). Se pueden usar péptidos radiomarcados de alta afinidad como dianas para integrinas \alpha_{\nu}\beta_{3} y con el fin de formar imágenes de las áreas de daño vascular, puesto que la expresión de integrina \alpha_{\nu}\beta_{3} aumenta en las células endoteliales activadas y en las células vasculares de músculo de fibra lisa después del daño vascular. Esta aproximación resuelve los inconvenientes de los métodos de formación de imágenes mediante resonancia magnética y tomografía axial computarizada tales como la falta de ligandos relevantes biológicamente y agentes de contraste sanguíneo para la formación de imágenes (F.G. Blankenberg y col., 2002 Am. J. Cardiov. Drugs 2, 357-65).

Las composiciones farmacéuticas contienen al menos un compuesto de Fórmula I como ingrediente activo en una cantidad tal que produzca un efecto terapéutico significativo. Las composiciones según la presente invención son enteramente convencionales y se obtienen usando métodos que son práctica común en la industria farmacéutica. Según la ruta de administración seleccionada, las composiciones estarán en forma sólida o líquida, adecuada para administración oral, parenteral, o intravenosa. Las composiciones según la presente invención contienen, junto con el ingrediente activo, al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Pueden ser particularmente útiles los adyuvantes de formulación, tales como, por ejemplo, agentes de solubilización, agentes de dispersión, agentes de suspensión y agentes de emulsión.

Los compuestos de Fórmula I también se pueden usar en combinación con otros fármacos anticáncer o con otros fármacos con actividad antiparasitaria o antiviral, tanto en formas farmacéuticas por separado o en formas farmacéuticas únicas.

Los medicamentos que son objeto de la presente invención también se usan en el tratamiento de enfermedades de parásitos y de adenovirus. La entrada de agentes patógenos en las células ocurre por medio de penetración directa de la membrana plasmática, endocitosis mediada por clatrina, endocitosis caveolar, pinocitosis o macropinocitosis. La macropinocitosis requiere la implicación de integrinas (O. Meier y col., 2003, J. Gene Med. 5, 451-62). La actividad antiparasitaria se puede ejercer entonces mediante inhibición de la adhesión mediada por integrina y mediante abastecimiento de leucocitos guiados por los receptores de quimioquina, por ejemplo, en el control de inflamación inducida por Trypanosoma cruzi. Incidentalmente, en la fase aguda de la enfermedad de Chagas, la inducción del proceso inflamatorio es crucial para el control de Trypanosoma cruzi en el tejido diana del equilibrio hospedador/parásito (J. Lannes-Vieira, 2003, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 98, 299-304).

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

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Las abreviaturas que se usan son:

Aad: (ácido aminoadípico);

Amb: (aminometilbencilo);

Amp: (aminometilfenilalanina);

Boc: (terc-butoxicarbonilo);

CSA: (ácido canfosulfónico);

CTH: (hidrogenación por transferencia catalítica);

DBU: (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno);

DCC: (diciclohexilcarbodiimida);

DCM: (diclorometano);

DEAD: (acetilenodicarboxilato de dietilo);

DIEA: (diisopropiletilamina);

DMF: (dimetilformamida);

EMEM: (medio esencial mínimo de Eagle con sal de Earle);

Fm: (fluorenilmetilo);

Fmoc: (9-fluorenilmetil-oxicarbonilo);

HOBT: (hidroxibenzotriazol);

NMP: (N-metil-pirrolidona);

oNBS: (2-nitrobencenosulfonato)

PBS: (solución salina tamponada de fosfato)

Pht: (ftaloilo);

Pmc: (pentametilcroman-6-sulfonilo);

SDS: (dodecilsulfato de sodio);

TBTU: (tetrafluorborato-O-benzotriazol-1-il-tetrametiluronio);

TEA: (trietilamina);

Teg: (trietilenglicol monometil éter); y

TFA: (ácido trifluoracético);

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Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis de c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp) - ST2581

Se suspendieron 1,587 mmol de Fmoc-Gly-Res (Res = Sasrin Resin®, Bachem) con agitación en 75 ml de DMF durante 30 minutos, al cabo de los cuales se añadieron 18 ml de piperidina, continuando la agitación durante 30 minutos más. La resina, filtrada y lavada con DMF, se suspendió en 50 ml de NMP (N-metil-pirrolidona) durante 15 minutos, al cabo de los cuales se añadieron Fmoc-Arg(Pmc)-OH, HOBT, TBTU y DIEA (3,174 mmol de cada uno); después de 2 horas de agitación, se filtró la suspensión y se lavó con DMF. Después de la desprotección con piperidina, se repitió la condensación con los otros aminoácidos en sucesión, operando cada vez como se describe anteriormente, es decir: Fmoc-Amp(Cbz)-OH, Fmoc-D-Phe-OH, y Fmoc-Asp(OtBu)-OH. Después de la última desprotección del Fmoc N-terminal, se libera el pentapéptido lineal de la resina con 45 ml de TFA al 1% en DCM. Se disuelve en aproximadamente 1 l de CH_{3}CN, y se añaden 4,761 mmol de HOBT y TBTU, y 10 ml de DIEA; la disolución se deja con agitación durante 30 minutos, se evapora el disolvente hasta que quede un volumen pequeño y se completa la precipitación del producto con agua.

El producto bruto filtrado se disolvió en tioanisol (50 eq) y TFA (270 eq) y se dejó con agitación toda la noche a temperatura ambiente.

La mezcla de reacción se llevó a sequedad y se recogió el residuo con la mínima cantidad de TFA y se reprecipitó con exceso de éter etílico. Finalmente, se purificó el producto bruto mediante RP-HPLC [Columna: Alltima C-18, Alltech; fase móvil: CH_{3}CN al 17% en agua + 0,1% de TFA].

HPLC analítica: columna: Purosphere STAR, Merck; fase móvil: CH_{3}CN al 15% en agua + 0,1% de TFA); Rt = 12,15 min.

Masa molecular = 652.

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Ejemplo 2

Síntesis de c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad) - ST2650

Se trataron 0,69 mmol de Fmoc-Gly-Res exactamente como se describe en el ejemplo 1, con la diferencia de que en este caso, los aminoácidos tercero y cuarto se añadieron en forma de dipéptido Fmoc-D-Phe-Aad(OBzI)-OH. Después de la desprotección del benciléster por medio de CTH, y purificación de producto bruto con RP-HPLC preparatoria (fase móvil: CH_{3}CN al 55% en agua + TFA al 1%; Rt = 17,29 minutos), se obtuvieron 187 mg de péptido desprotegido puro. Se disolvió en TFA y, después de 1 hora a temperatura ambiente, la disolución se llevó a sequedad. El residuo se redisolvió en la cantidad mínima de TFA y se precipitó con exceso de éter etílico. Se repitió la operación hasta que se obtuvo el producto final limpio.

RP-HPLC analítica (CH_{3}CN al 17% en agua + 0,1% de TFA); Rt = 12,52 min.

Masa molecular = 619.

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Ejemplo 3

Síntesis de c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp) - ST2700

A una suspensión de Fmoc-Phe(4Pht-N-CH_{2})-COOH en tolueno anhidro, que se había llevado a reflujo, se añadieron 2 eq de CSA y 20 eq de paraformaldehído divididos en 4 porciones a intervalos de 15 minutos. La mezcla se dejó enfriar, se diluyó con 120 ml de tolueno y se lavó con NaHCO_{3} al 5% y agua. Después de evaporación del disolvente, el residuo se disolvió en 15 ml de CHCl_{3} + 15 ml de TFA + 700 \mul de Et_{3}SiH; se dejó la mezcla con agitación en la oscuridad durante 42 horas. Después de evaporación del disolvente, se purificó el residuo mediante filtración sobre gel de sílice. Rendimiento global: 90%.

El péptido lineal se sintetizó en fase sólida según se describe en el ejemplo 1, insertando Fmoc-N-Me-Phe-(4Pht-N-CH_{2})-COOH como el tercer aminoácido, preparado como se ha descrito anteriormente. En este caso las desprotecciones del terminal N-Fmoc sobre la resina se llevaron a cabo con disolución de diisopropilamina (300 eq) al 30% en DMF (debido a la presencia de ftalimida). Después de la ciclación, se disolvieron 500 mg de péptido calentando en 10 ml de EtOH absoluto, a los que se añadieron 0,9 ml de una disolución de NH_{2}-NH_{2}\cdotH_{2}O 1M en etanol. Después de calentar a reflujo durante 2 horas, se evaporó el disolvente y se recogió el residuo con 10 ml de DCM + 10 ml de disolución de Na_{2}CO_{3} con un batido vigoroso. Después de evaporación de la fase orgánica, se purificó el residuo bruto mediante RP-HPLC preparatoria (fase móvil: CH_{3}CN al 17% en agua + TFA al 0,1%.

RP-HPLC analítica (CH_{3}CN al 16% en agua + TFA al 0,1%); Rt = 11,7 min.

Masa molecular = 665.

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Ejemplo 4

Síntesis de c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CH_{2})_{2}COOH] - ST2649

Se disolvieron 120 mg de ciclopéptido c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]\cdotTFA (preparado según se describe en el ejemplo 1) en 3,6 ml de una mezcla de DCM-DMF 2:1, junto con una cantidad estequiométrica de TEA y anhídrido succínico. Después de 1 hora se diluyó la mezcla de reacción con 30 ml de DCM y se lavó con agua. La fase orgánica, seca y concentrada, produjo un residuo de 100 mg de hemisuccinato. Este producto se desprotegió completamente con TFA y se sometió entonces a una primera purificación, según ya se ha descrito en los ejemplos anteriores. Se purificó adicionalmente entonces mediante RP-HPLC preparatoria (CH_{3}CN al 20% en agua + TFA al 0,1%).

RP-HPLC analítica (CH_{3}CN al 20% en agua + TFA al 0,1%), Rt = 14,66 min.

Masa molecular = 751.

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Ejemplo 5

Síntesis de c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly) - ST2701

A una disolución de 1,22 mmol de p-xilenodiamina monoprotegida con Boc en 6 ml de THF se añadieron 1,83 mmol de TEA y, gota a gota, una disolución de 1,22 mmol de bromoacetato de bencilo en 2 ml de THF. La mezcla se dejó con agitación toda la noche, después de lo cual se evaporó el disolvente y se purificó el residuo en una columna de cromatografía rápida (CHCl_{3}-EtOAc, 9:1). Se obtuvieron 0,69 mmol de éster bencílico de N-(4-Boc-NH-CH_{2}-bencil)-glicina.

Se disolvieron 250 mg de Fmoc-D-Phe-OH en 27 ml de DCM y se añadieron 40 \mul de difosgeno y 230 \mul de sim-colidina; después de 15 minutos, se añadieron 190 mg de éster previamente preparado, disueltos en 3 ml de DCM. Después de 3 horas, se añadieron a la mezcla de reacción 80 \mul de N-Me-piperazina y se agitó durante 10 minutos, al cabo de los cuales se diluyó la mezcla con 10 ml de DCM y se hizo extracción con agua, HCl 0,5N, agua, NaHCO_{3} al 5% y agua. Después de evaporación del disolvente, se purificó el residuo mediante cromatografía rápida en gel de sílice (DCM-EtOAc, 9:1). Rendimiento: 80%.

A 100 mg del producto así obtenido, disueltos en 6 ml de MeOH, se añadieron 76 \mul de AcOH y 42 mg de HCOONH_{4}, y se enfrió la mezcla a 0ºC, y se añadieron 50 mg de Pd/C al 10%. Después de 30 minutos, se filtró la mezcla de reacción sobre celita. El filtrado se llevó a sequedad y se purificó en una columna de cromatografía rápida (CHCl_{3}-MeOH, 9:1). Rendimiento 90%.

Se disolvieron 190 mg del producto así obtenido en 1,2 ml de TFA y se llevaron a sequedad (desprotección de Boc); el residuo se redisolvió en 9 ml de Na_{2}CO_{3} al 10% + 6 ml de dioxano, se enfrió a 0ºC y se añadió gota a gota una disolución de 120 \mul de cloruro de benciloxicarbonilo diluido con 3 ml de dioxano. Después de 1 hora de agitación a temperatura ambiente, se llevó a cabo evaporación al vacío hasta tener un volumen pequeño, después de lo cual se diluyó la mezcla con agua, se redujo el pH a 1 con HCl y se hizo extracción con EtOAc. Después de evaporación del disolvente, se purificó el residuo mediante filtración sobre gel de sílice, y lavado con CHCl_{3}-MeOH (8:2). Rendimiento de dipéptido puro: 82%.

Se trataron 0,69 mmol de Fmoc-Gly-Res según se describe en el ejemplo 1. Después de Arg, se añadió en secuencia el dipéptido previamente preparado Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH_{2}-bencil)-Gly. El producto bruto se disolvió en tioanisol y TFA y se dejó con agitación a temperatura ambiente durante 4,5 horas. La primera purificación se hizo según se describe en los otros ejemplo, mientras que la purificación final se hizo con HPLC preparatoria (fase móvil: CH_{3}CN al 16% en agua + TFA al 0,1%).

RP-HPLC analítica (CH_{3}CN al 15% en agua + TFA al 0,1%), Rt = 7,67 min.

Masa molecular = 652.

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Ejemplo 6

Síntesis de c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{2}-O-CH_{2}-COOH)] - ST2661

A una disolución de 200 mg de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]\cdotTFA (obtenida según se describe en el ejemplo 1) en 4 ml de una mezcla de DCM-DMF 3:1 se añadió un exceso sustancial de diácido glicólico. Se añadieron a la misma disolución DIEA (3 eq) y DCC (2 eq). La mezcla se dejó con agitación toda la noche, después de lo cual se diluyó con DCM y se lavó con agua. El producto bruto se recuperó evaporando la fase orgánica y se purificó mediante cromatografía rápida (fase móvil: CHCl_{3}-MeOH 7:3 + AcOH al 1%); se agruparon las fracciones que contenían el producto, se lavaron con agua, se deshidrataron y se llevaron a sequedad, y produjeron un residuo de 157 mg de producto puro. Éste se trató con TFA durante 1,5 horas y se limpió según se describe en los otros ejemplos, después de lo cual se hizo la purificación final mediante HPLC preparatoria (fase móvil: CH_{3}CN al 22% en agua + TFA al 0,1%).

RP-HPLC analítica (CH_{3}CN al 23% en agua + TFA al 0,1%); Rt = 10 min.

Masa molecular = 855.

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Ejemplo 7

Síntesis de c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(OCH_{2}-CH_{2})_{8}-OCH_{2}-COOH)] - ST2874

Se disolvieron 150 mg del péptido que se describe en el ejemplo 1 y 110 mg de PEG 600-COOFm (1 eq) + HOAT (1,5 eq) + DIEA (2 eq) en 6 ml de una mezcla de DCM-DMF (2:1) y se enfrió la disolución a 0ºC; se añadieron 1,5 eq de DCC y la mezcla se dejó con agitación toda la noche. Después de evaporación del disolvente, se purificó el residuo en una columna de cromatografía rápida (etapa I: CHCl_{3}-MeOH, 96:4; etapa II: CHCl_{3}-MeOH, 90:10. Para la desprotección del éster de fluorenilmetilo, se disolvieron 36 mg del éster en 1,8 ml de CHCl_{3}, se añadieron 43 \mul (20 eq) de piperidina y se dejó durante 1 noche a temperatura ambiente. Después de evaporación del disolvente, se purificó el residuo bruto mediante HPLC preparatoria (CH_{3}CN al 46% en agua + TFA al 0,1%). El producto puro así obtenido se disolvió en TFA y se dejó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de reducción a un volumen pequeño, el producto totalmente desprotegido se precipitó con éter etílico en exceso.

RP-HPLC analítica (CH_{3}CN al 26% en agua + TFA al 0,1%); Rt = 7,89-15,83 min.

Masa molecular = 1119.

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Ejemplo 8

Síntesis de c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(OCH_{2}-CH_{2})_{3}-O-CH_{3})] - ST2597

Se sintetizó este péptido en fase sólida según se describe en el ejemplo 1, insertando Fmoc-Amp(CO-CH_{2}-Teg)-OH como tercer aminoácido, que se preparó como sigue:

: Se disolvieron 570 mg de CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{3}-CH_{2}-COOH, 473 mg de 2,3,4,5-pentafluorfenol (Pfp) y 207 \mul de piridina con 11,4 ml de DCM. A la disolución, enfriada hasta 0ºC, se añadieron 637 mg de DCC y se dejó la mezcla de reacción con agitación durante 1,5 h. Después de filtración y lavado del filtrado con agua, HCl 1N, agua, NaHCO_{3} al 5% y agua, la disolución orgánica se llevó a sequedad, dando 984 mg del éster bruto.

A una suspensión de 500 mg de sal de TFA y Fmoc-aminometilfenilalanina en 15 ml de DCM, se añadieron 260 \mul de TEA seguidos de 800 mg de éster activado y se dejó la mezcla con agitación durante 3 horas. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía rápida, produciendo el bloque de síntesis puro.

El péptido cíclico final se purificó como habitualmente y se aisló mediante HPLC preparatoria (CH_{3}CN al 27% en agua + TFA al 1%), Rt = 12,7 min.

Masa molecular = 855.

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Ejemplo 9

Resultados biológicos Unión a receptores de integrina \alpha_{\nu}\beta_{3}

Se diluyó el receptor de \alpha_{\nu}\beta_{3} purificado (Chemicon, cat CC1020) en tampón (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM) a una concentración de 0,5 \mug/ml. Se añadieron partes alícuotas de 100 \mul a placas de 96 pocillos y se incubaron toda la noche a +4ºC. Se lavaron las placas una vez con tampón (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl2 1 mM, albúmina de suero bovino al 1%) y se incubaron entonces durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas dos veces con el mismo tampón y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente con el ligando radiactivo [^{125}I] equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0,05 nM en presencia de ligandos de competencia. Al final de incubación, se lavaron los pocillos, y se determinó la radiactividad usando un contador de radiación gamma (Packard). Se determinó la unión no específica del ligando en presencia de exceso de equistatina fría (1 \muM).

Unión a receptores de integrina \alpha_{\nu}\beta_{5}

Se diluyó el receptor de \alpha_{\nu}\beta_{5} purificado (Chemicon, cat DCC1020) en tampón (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM) a una concentración de 1 \mug/ml. Se añadieron partes alícuotas de 100 \mul a placas de 96 pocillos y se incubaron toda la noche a +4ºC. Se lavaron las placas una vez con tampón (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM, albúmina de suero bovino al 1%) y se incubaron entonces durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas dos veces con el mismo tampón y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente con el ligando radiactivo [^{125}I] equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0,15 nM en presencia de ligandos de competencia. Al final de incubación, se lavaron los pocillos, y se determinó la radiactividad usando un contador de radiación gamma (Packard). Se determinó la unión no específica del ligando en presencia de exceso de equistatina fría (1 \muM).

Evaluación de parámetros IC_{50}

La afinidad de los productos para receptores de vitronectina se expresó como índice IC_{50} \pmSD, es decir, como la concentración capaz de inhibir 50% de la unión específica receptor- radioligando. El parámetro IC_{50} se elaboró usando el programa de ordenador "ALLFIT"

Resultados

Todos los péptidos RGD examinados mostraron afinidad significativa para receptores de integrina \alpha_{\nu}\beta_{3} y \alpha_{\nu}\beta_{5} con un índice IC_{50} del orden de nanomoles. En particular, el más activo en la inhibición de la unión de equistatina a integrinas \alpha_{\nu}\beta_{3} fue ST2581 (IC_{50} = 1,7 nM) seguido por los productos ST 2661 y ST2700 (IC_{50} = 4 y 7 nM) mientras que el más activo para receptores de integrina \alpha_{\nu}\beta_{5} fue el producto ST2650 (IC_{50} = 0,17 nM) seguido por las moléculas ST2661 y ST2700 (IC_{50} = 0,35 y 0,99 nM, respectivamente).

Aunque la función principal de las integrinas es mediar la adhesión celular a proteínas ECM en espacios celulares y membranas basales también transducen señales intracelulares que fomentan la migración, así como la supervivencia, celular. Las integrinas no tienen actividad enzimática intrínseca pero activan los sistemas de transducción de señales mediante co-agrupación con quinasas y proteínas adaptadoras en complejos de adición focal después de su asociación con proteínas polivalentes de la matriz extracelular (ECM). Por ejemplo, la ligación de integrina suprime apoptosis activando los supresores de apoptosis e inhibiendo la activación de caspasa. La integrina también estimula la migración celular activando las GTPasas Rho y Rac (guanosina trifosfatasas) y anclando filamentos de actina a la membrana. Estas proteínas de adhesión fomentan la entrada en el ciclo celular estimulando la expresión de ciclinas. Por lo tanto, la ligación de integrina soporta cascadas de transducción de señales que fomentan proliferación, supervivencia y migración de células. En contraposición, la inhibición de la interacción del ligando con la integrina celular, inhibe la migración y la proliferación de las células e induce apoptosis (Jin H. y Varner J. 2004 Br. J. Cancer 90, 561-565).

TABLA 1

1

Ensayo de adhesión de células tumorales sobre vitronectina

Se hicieron crecer células de carcinoma ovárico humano A2780 y de carcinoma de próstata PC3 en RPMI 1640 que contenía 10% de suero bovino fetal y 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Se hizo crecer carcinoma renal humano A498 en ENEM que contenía 10% de suero bovino fetal y 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Todas las células se mantuvieron en una incubadora a 37ºC saturada de humedad y con una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO_{2}.

La línea celular A2780 expresa niveles altos de integrinas \alpha_{\nu}\beta_{5}, A498 niveles altos de integrinas \alpha_{\nu}\beta_{3}, y PC3 niveles bajos de ambas integrinas.

Para comprobar el efecto del fármaco sobre la adhesión celular, se incubó la densidad celular apropiada (40000-50000 células por pocillo) para cada línea de célula tumoral con diferentes concentraciones de los compuestos en placas de cultivo tisular de 96 pocillos revestidas con vitronectina (5 \mu/ml) y se dejó que se unieran durante 3 horas. Al cabo de este tiempo, se lavaron las células una vez con PBS que contenía Ca^{2+} y Mg^{2+}. Las células tumorales se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con azul de toluidina al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células tumorales con agua bidestilada, se secaron y se solubilizaron con SDS al 1%. Se determinó el número de células adheridas con un lector de microplacas (Victor2, EG&G Wallac) a 600 nm.

Se evaluó el índice IC_{50} como parámetro para medir el efecto de inhibición de las moléculas sobre la adhesión de células tumorales a vitronectina usando el programa de ordenador "ALLFIT". Los resultados obtenidos con los compuestos probados según la invención se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2

2

Claims

1. Péptidos cíclicos que tienen la siguiente Fórmula I:

(Fórmula I)c(R_{1}-Arg-Gly-Asp-R_{2})

en la que:

: c significa cíclico;

: R_{1} un aminoácido con fórmula general: -NX-CY(Z)-CO-; en la que

: X se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, arilo C_{6}-C_{10}, bencilo, (CH_{2})_{n}-COR, (CH_{2})_{n}-NHR', 4-COR-bencilo, 4-(CH_{2}-NHR')-bencilo; en la que n es un número entero de 1 a 5;

: Y se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, CH_{m}F_{m'}; en la que m + m' = 3, en que m y m' son números enteros de 0 a 3;

: Z se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, (CH_{2})_{n1}-NHR', 4-NHR'-(CH_{2})_{n1}-bencilo, 4-COR-bencilo, en la que n_{1} es un número entero de 0 a 5;

: R se selecciona entre el grupo que está constituido por: W, OW, N[CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n2}-CH_{2}-COOW]_{2}, NH-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n2}-CH_{2}-COOW, NW-(CH_{2}-CH_{2}NH)_{n2}-CH_{2}-CH_{2}NHW; en las que n_{2} es un número entero de 1 a 22; y

: W se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, alquilo C_{1}-C_{3};

: R' se selecciona entre el grupo que está constituido por: H, CO-(CH_{2})_{n2}-COOW, CO-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2} O)_{n2}-CH_{2}-NHW, CO-CH_{2}-O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n2}-CH_{2}-COOW: en las que n_{2} tiene el significado que se ha reseñado anteriormente; y

: R_{2} se selecciona entre el grupo que está constituido por: D-Phe, D-4-terc-butil-Phe, D-4-CF_{3}-Phe, D-4-acetilamina-Phe;

: sus mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereoisómeros individuales y sus sales farmacéuticamente aceptables.

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2. Un compuesto según la reivindicación 1 seleccionado entre el grupo que está constituido por:

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp);

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp);

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH_{2})_{2}COOH];

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly);

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{2}-O-CH_{2}-COOH)];

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{8}-OCH_{2}-COOH)].

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3. Un compuesto de fórmula:

: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH_{2}-(OCH_{2}-CH_{2})_{3}OCH_{3})];

: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad).

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4. Procedimiento para la preparación de los compuestos según las reivindicaciones 1-3 que comprende la síntesis del péptido lineal y su posterior ciclación.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la síntesis del péptido se realiza en fase sólida o en disolución.

6. Uso del compuesto según las reivindicaciones 1-3 para la preparación de medicamentos.

7. Composiciones farmacéuticas que contienen al menos un compuesto según la reivindicación 1 ó 2 ó 3 en mezclas con al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Composiciones según la reivindicación 7, que contienen adicionalmente un fármaco que está selecciono entre el grupo que está constituido por agentes anticáncer, antiparasitarios o antivirales, bien en formas de dosificación separada o única.

9. Uso de compuestos según las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento con actividad inhibidora de receptor de integrina.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de enfermedades que se derivan de angiogénesis anormal.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad se selecciona entre el grupo que está constituido por tumores que sobreexpresan integrinas, tanto natural como inducida, formas inflamatorias (por ejemplo artritis reumatoide), enfermedades oculares, retinopatía, insuficiencia renal aguda, osteoporosis y metástasis, enfermedades cardiovasculares (infarto y lesión cardíaca).

12. Uso de compuestos según las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un medicamento con actividad antiparasitaria por medio de inhibición de integrina.

13. Composición que contiene un derivado radiomarcado de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 ó 2, ó 3.

14. Uso de un derivado radiomarcado de un compuesto según una de las reivindicaciones 1 ó 2, ó 3 para la preparación de un agente de diagnóstico.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que se usa dicho agente de diagnóstico para la detección de masas tumorales pequeñas o episodios de oclusión arterial.