ES2321114T3 - Camptotecinas conjugadas en posicion 7 con peptidos ciclicos como agentes citostacios. - Google Patents

Camptotecinas conjugadas en posicion 7 con peptidos ciclicos como agentes citostacios. Download PDF

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Giuseppe Giannini
Maria Ornella Tinti
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Domenico Alloatti
Loredana Vesci
Sabrina Dallavalle
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Abstract

Compuestos de fórmula (I) ** ver fórmula** en la que i es 0 ó 1; R1 es el grupo -CH=N-(O)m-R2-Z-X-Y; en el que m es 0 ó 1; R2 se selecciona del grupo constituido por un alquileno C1-C7 lineal o ramificado, alquenileno C2-C7 lineal o ramificado, cicloalquileno C3-C10, cicloalquenileno C3-C10, arileno C6-C14, arilen (C6-C14)-alquileno (C1-C6), alquilen (C 1-C 6)-arileno (C 6-C 14), heterociclo (C 3-C 14) aromático o no aromático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; heterocicloalquilen (C 3-C 10)-alquileno (C 1-C 6) que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; alquilen (C1-C6)-heterocicloalquileno (C3-C10) que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; un grupo poliaminoalquilo de fórmula -(CH2)m1-NR8-(CH2)n1-NR9-(CH2-CH2-CH2-NR9)p1-H, en la que m1 y n1, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 2 a 6 y p 1 es un número entero de 0 a 3; R8 y R9, que pueden ser iguales o diferentes, se seleccionan del grupo constituido por H, un alquilo C1-C6 lineal o ramificado, Boc, Cbz, monosacáridos tales como 6-D-galactosilo, o 6-D-glucosilo; cada uno de los grupos anteriormente mencionados puede estar posiblemente sustituido con uno o más grupos seleccionados del grupo constituido por CN, NO 2, NH 2, OH, SH, COOH, COO-(alquilo) (C 1-C 5), CONH-(alquilo)(C 1-C 5), SO 3H, SO 3-(alquilo)(C 1-C 5), en los que el grupo alquilo es lineal o ramificado; un átomo de halógeno; Z está ausente o se selecciona de -NH-, -CO-, -O-; X está ausente o se selecciona del grupo constituido por -COCHR 3NH-, -COCHR 6(CH 2) n2R 4-, -R 4-CH 2(OCH 2 CH2)n3OCH2R4, -R4(Q)R4-, -R5[Arg-NH(CH2)n1CO]n4R5-, -R5-[N-guanidinopropil-Gly]n3R5-, -CON[(CH2)n4NHR7] CH2-, en los que n1 es un número entero de 2 a 6, n2 es un número entero de 0 a 5, n3 es un número entero de 0 a 50, n4 es un número entero de 2 a 7; R 3 es H o alquilo C 1-C 4 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con -COOH, -CONH 2, -NH 2 u -OH; arilo C6-C14; R 4 se selecciona del grupo constituido por: -NH-, -CO-, -CONH-, -NHCO-; R5 está ausente o es -R4(Q)R4-; R6 es un átomo de hidrógeno, -NH2; R 7 es un átomo de hidrógeno o alquilo (C 1-C 4) lineal o ramificado; Q se selecciona del grupo constituido por: alquileno C1-C6 lineal o ramificado; cicloalquileno C3-C10 lineal o ramificado; alquenileno C 2-C 6 lineal o ramificado; cicloalquenileno C 3-C 10 lineal o ramificado; arileno C 6-C 14; arilen (C 6-C 14)-alquileno (C 1-C 6), alquilen (C 1-C 6)-arileno (C 6-C 14); heterociclilo (C 3-C 14) aromático o no aromático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; Y es la fórmula c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2), en la que: c significa cíclico; AA1 se selecciona del grupo constituido por: (D)-Phe, (D)-Trp, (D)-Tyr, (D)-2-naftil-Ala, (D)-4-terc-butil-Phe, (D)-4,4''-bifenil-Ala, (D)-4-CF3-Phe, (D)-4-acetilamino-Phe; AA 2 se selecciona del grupo constituido por NW - CH[(CH 2) n7 - CO] - CO, NW-CH[(CH2)n5-NH]-CO, NW-[4-(CH2)n5-CO]-Phe, NW-[4-(CH2)n5-NH]-Phe, [NW]-Gly, NW-Val, en los que W se selecciona de H, alquilo C1-C6 lineal o ramificado, -(CH2)n5-COOH, domde n7 es un número entero de 0 a 5, 4carboxibencilo, 4-aminometilbencilo; los N 1-óxidos, mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereómeros individuales, las formas E y Z, mezclas de las mismas, las sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Camptotecinas conjugadas en posición 7 con péptidos cíclicos como agentes citostáticos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos con actividad citotóxica constituidos por ciclopéptidos que contienen la secuencia RGD y derivados de camptotecina, a procedimientos para la preparación de los mismos, a su uso como medicamentos y a composiciones que los contienen.
En particular, los compuestos descritos en la presente invención están dotados tanto con alta afinidad por las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} como con actividad citotóxica selectiva sobre líneas celulares humanas a concentraciones micromolares.
Antecedentes de la invención
Los agentes anticancerosos quimioterapéuticos son los medicamentos con la ventana terapéutica más restringida. De hecho, puesto que su actividad citotóxica es no selectiva, pueden dañar indiscriminadamente todas las células del cuerpo con las que se ponen en contacto.
Existe actualmente el problema de dirigir el agente citotóxico selectivamente contra las células tumorales, permitiendo al agente ejercer su actividad sin dañar las células de los tejidos circundantes sanos, o al menos limitando el daño lo más posible.
Se ha reseñado en la bibliografía que bloquear las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} mediante el uso de ciclopéptidos selectivos, para los que se considera el compuesto de referencia el ciclopentapéptido c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (JACS 1997, 119, 1328-35; solicitud de patente internacional WO 97/06791), o mediante el uso de anticuerpos monoclonales (Cell, 1994, 79, 1157-64), conduce a la detención de la angiogénesis y a una reducción del crecimiento tumoral. Además, se han observado también efectos antimetastásicos (J. Clin. Invest., 1995, 96, 1815). Brooks y col. (Science, 1994, 264, 569-71) reseñaron que las células endoteliales de los vasos tumorales y las células tumorales mismas expresan preferiblemente la integrina \alpha_{v}\beta_{3} en comparación con las células quiescentes de tejido normal. Entre los compuestos en una
etapa avanzada de desarrollo clínico, pueden mencionarse c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-MeVal) o EMD121974 o cilengitida.
Ruoslati y colaboradores (Current Opinion in Oncology, 1998, 10, 560-5) mostraron que los análogos de RGD que se unen al endotelio tumoral, una vez conjugados con el agente citotóxico doxorubicina, forman compuestos que son más eficaces y menos tóxicos que la doxorubicina sola. Estos autores demostraron también, más allá de cualquier duda razonable, que el efecto es atribuible a la conjugación con RGD, en la medida en que la unión se antagoniza por el péptido libre mismo (Arap, Pasqualini y Ruoslati, Science, 1998, 279, 377-380). Posteriormente, los mismos autores llevaron a cabo otros experimentos consistentes en unir químicamente una secuencia peptídica proapoptótica a un análogo de RGD, demostrando que los nuevos compuestos eran selectivamente tóxicos para células endoteliales angiogénicas y que tenían actividad anticancerosa en ratones (Ruoslati, Nature Medicine, 1999, 5, 1032-8).
Marcus y col., en la solicitud de patente internacional WO 01/17563, describen actividad anticancerosa específica para agentes citotóxicos, tales como camptotecina, conjugados mediante un espaciador, constituido por uno o más aminoácidos, con un antagonista inhibidor no peptídico de las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}.
Aoki y col., Cancer Gene Therapy, 2001, 8, 783-787 describen la actividad anticancerosa específica de una oligolisina histidilada conjugada con una secuencia RGD, revelando un efecto de guiado a tumores en ratones.
El concepto de unión a la superficie celular mediado por integrinas se ha propuesto para el transporte génico (Hart, y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 12468-12474).
Se ha encontrado ahora que los derivados de 7-iminometil- o 7-oximetilcamptotecina conjugados, posiblemente mediante espaciadores adecuados, con derivados ciclopeptídicos que contienen la secuencia RGD, están dotados con una alta actividad anticancerosa selectiva y pueden usarse ventajosamente para la preparación de medicamentos para el tratamiento de tumores.
En virtud de su actividad citotóxica selectiva sobre células tumorales, los compuestos según la presente invención proporcionan medicamentos con menos efectos secundarios y menos graves.
Descripción de la invención
Son objeto de la presente invención derivados de camptotecina conjugados con derivados ciclopeptídicos que contienen la secuencia RGD. Las moléculas resultantes conservan inalteradas tanto las propiedades citotóxicas de las camptotecinas originales como las propiedades de unión a integrina, con afinidad comparable con la observada con los ciclopéptidos no conjugados. El resultado de esta combinación es favorecer la concentración del agente citotóxico en aquellas células que expresan mayoritariamente integrinas de tipo \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} (guiado). El agente citotóxico ejerce su actividad intracelular en la forma conjugada y/o libre mediante acción enzimática o hidrolítica.
Son objeto de la presente invención compuestos de fórmula (I)
1
en la que
i es 0 ó 1;
R_{1} es el grupo -CH=N-(O)_{m}-R_{2}-Z-X-Y;
en el que m es 0 ó 1;
R_{2} se selecciona del grupo constituido por un alquileno C_{1}-C_{7} lineal o ramificado, alquenileno C_{2}-C_{7} lineal o ramificado, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{3}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{14}, arilen (C_{6}-C_{14})-alquileno (C_{1}-C_{6}), alquilen (C_{1}-C_{6})-arileno (C_{6}-C_{14}), heterociclo (C_{3}-C_{14}) aromático o no aromático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S, heterocicloalquilen (C_{3}-C_{10} que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S)-alquileno (C_{1}-C_{6}), alquilen (C_{1}-C_{6})-heterocicloalquileno (C_{3}-C_{10} que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S); un grupo poliaminoalquilo de fórmula
-(CH_{2})_{m1}-NR_{8}-(CH_{2})_{n1}-NR_{9}-(CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NR_{9})_{p1}-H, en la que m_{1} y n_{1}, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 0 a 6;
R_{8} y R_{9}, que pueden ser iguales o diferentes, se seleccionan del grupo constituido por H, un alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, Boc, Cbz, monosacáridos tales como 6-D-galactosilo o 6-D-glucosilo; cada uno de los grupos anteriormente mencionados puede estar posiblemente sustituido con uno o más grupos seleccionados del grupo constituido por CN, NO_{2}, NH_{2}, OH, SH, COOH, COO-(alquilo) (C_{1}-C_{5}), CONH-(alquilo)(C_{1}-C_{5}), SO_{3}H, SO_{3}-(alquilo)(C_{1}-C_{5}), en los que el grupo alquilo es lineal o ramificado; un átomo de halógeno;
Z está ausente o se selecciona de -NH-, -CO-, -O-;
X está ausente o se selecciona del grupo constituido por -COCHR_{3}NH-, COCHR_{6}(CH_{2})_{n2}R_{4}-, -R_{4}-CH_{2}(OCH_{2}
CH_{2})_{n3}OCH_{2}R_{4-}, -R_{4}(Q)R_{4}-, -R_{5}[Arg-NH(CH_{2})_{n1}CO]_{n4}R_{5}-, -R_{5}-[N-guanidinopropil-Gly]_{n3}R_{5}-, -CON[(CH_{2})_{n4}NHR_{7}]CH_{2}-, en los que n_{1} es un número entero de 2 a 6, n_{2} es un número entero de 0 a 5, n_{3} es un número entero de 0 a 50, n_{4} es un número entero de 2 a 7;
R_{3} es H o alquilo C_{1}-C_{4} lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con -COOH, -CONH_{2}, -NH_{2} u -OH; arilo C_{6}-C_{14};
R_{4} se selecciona del grupo constituido por: -NH-, -CO-, -CONH-, -NHCO-;
R_{5} está ausente o es -R_{4}(Q)R_{4}-;
R_{6} es un átomo de hidrógeno, -NH_{2};
R_{7} es un átomo de hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado;
Q se selecciona del grupo constituido por: alquileno C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, cicloalquileno C_{3}-C_{10} lineal o ramificado; alquenileno C_{2}-C_{6} lineal o ramificado; cicloalquenileno C_{3}-C_{10} lineal o ramificado; arileno C_{6}-C_{14}; arilen (C_{6}-C_{14})-alquileno (C_{1}-C_{6}); alquilen (C_{1}-C_{6})-arileno (C_{6}-C_{14}); heterociclilo (C_{3}-C_{14}) aromático o no aromático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S;
Y es la fórmula c(Arg-Gly-Asp-AA_{1}-AA_{2}), en la que:
c significa cíclico;
AA_{1} se selecciona del grupo constituido por: (D)-Phe, (D)-Trp, (D)-Tyr, (D)-2-naftil-Ala, (D)-4-terc-butil-Phe, (D)-4,4'-bifenil-Ala, (D)-4-CF_{3}-Phe, (D)-4-acetilamino-Phe;
AA_{2} se selecciona del grupo constituido por NW-CH[(CH_{2})_{n7}-CO]-CO, NW-CH[(CH_{2})_{n5}-NH]-CO,
NW-[4-(CH_{2})_{n5}-CO]-Phe, NW-[4-(CH_{2})_{n5}-NH]-Phe, [NW]-Gly, NW-Val, en los que W se selecciona de H, alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, -(CH_{2})_{n5}-COOH, en la que n_{7} es un número entero de 0 a 5, 4-carboxibencilo, 4-aminometilbencilo;
los N_{1}-óxidos, mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereómeros individuales, las formas E y Z, mezclas de las mismas, las sales farmacéuticamente aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona también procedimientos para la preparación de los compuestos anteriormente mencionados de fórmula (I).
La presente invención comprende el uso de compuestos de la fórmula general (I) anteriormente mencionada como ingredientes activos para medicamentos, y particularmente para medicamentos útiles como inhibidores de topoisomerasa I. Entre las aplicaciones terapéuticas que derivan de la inhibición de topoisomerasa I, se mencionan tumores e infecciones parasitarias o víricas.
Dadas sus particulares características farmacológicas, los compuestos de fórmula (I) son también útiles para la preparación de medicamentos para el tratamiento de tumores y las formas metastásticas de los mismos.
La presente invención comprende también composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula (I) como ingredientes activos, en mezclas con al menos un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos según la presente invención son el resultado de la condensación de una molécula de camptotecina, funcionalizada en posición 7, con un ciclopéptido que contiene la secuencia Arg-Gly-Asp. Esta combinación estructural tiene la ventaja de favorecer la concentración del agente citotóxico (camptotecina) en las células que más expresan las integrinas de tipo \alpha_{v}\beta_{3} y a_{v}\beta_{5}. El agente citotóxico ejerce su actividad en la forma conjugada y/o libre mediante acción enzimática o hidrolítica.
Las definiciones de los diversos grupos funcionales y residuos, así como las definiciones de las sales farmacéuticamente aceptables que figuran en la fórmula (I) anteriormente mencionada, son de conocimiento común para cualquier químico experto y no son necesarias definiciones particulares. Sin embargo, pueden encontrarse referencias a dichos grupos en la bibliografía técnica y de patentes, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional WO 00/53607 (derivados de camptotecina que tienen actividad antitumoral), WO 03/101995 (camptotecina con un anillo de lactona modificado, i= 1) y WO 03/101996 (éster en posición 20 de camptotecina), presentadas a nombre del presente solicitante.
Un grupo inicial de compuestos preferidos consiste en los compuestos de fórmula (I) en la que m= 1.
En este primer grupo, R_{2} es preferiblemente alquileno, y más preferiblemente metileno o etileno, X está ausente.
Otro grupo de compuestos preferidos consiste en compuestos de fórmula (I) en la que X= R_{4}CH_{2}
(OCH_{2}CH_{2})_{n3}OCH_{2}R_{4}].
Los compuestos más preferidos según la presente invención son los siguientes:
2
designado de aquí en adelante como ST2686;
3
\vskip1.000000\baselineskip
designado de aquí en adelante como ST2724
4
designado de aquí en adelante como ST2742.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse con el procedimiento descrito aquí a continuación y ejemplificado para los compuestos preferidos según la invención. Este procedimiento constituye un objeto adicional de la invención.
Fundamentalmente, los compuestos de fórmula (I) que son objeto de la presente invención se preparan mediante la condensación de camptotecina, cuya estructura pentacíclica está indicada aquí brevemente por la abreviatura CP, adecuadamente funcionalizada en posición 7 con un derivado ciclopeptídico Y_{1}.
La reacción de condensación puede representarse esquemáticamente del modo siguiente:
7-CP-CH=N-(O)_{m}-R_{2}-Z_{1}-X_{1} + Y_{1}
en la que 7-CP representa la estructura policíclica de una camptotecina 7-sustituida y Z_{1}, X_{1} e Y_{1} representan respectivamente los grupos Z, X e Y como se definen en la fórmula I, eventualmente apropiadamente funcionalizados y/o protegidos de modo que se obtengan los compuestos conjugados de fórmula I.
Se han obtenido derivados de 7-CP usando aproximaciones conocidas, tales como los descritos en el documento EP 1044977, o en J. Med. Chem. 2001, 44, 3264-3274, S. Dallavalle y col., mientras que la reacción de condensación puede realizarse usando procedimientos convencionales tales como, por ejemplo, Journal of Controlled Release 2003, 91, 61-73; S.S. Dharap y col.; Journal of Medicinal Chem. 2003, 46, 190-3, R. Bhatt.
El ciclopéptido Y_{1} puede prepararse según técnicas convencionales de síntesis de péptidos como se describen en los ejemplos 1 a 6.
Una vez se ha obtenido el ciclopéptido deseado, se usará en la reacción de condensación en su forma protegida, y los grupos protectores se retirarán sólo después de obtener el compuesto final. Se realiza la desprotección usando procedimientos conocidos, por ejemplo, condiciones ácidas mediante el uso de ácido trifluoroacético puro o en presencia de disolventes orgánicos clorados.
El derivado de camptotecina 7-CP-CH=N-(O)_{m}-R_{2}-Z_{1}-X_{1} se obtiene usando procedimientos que son de conocimiento común para los expertos en el campo.
El intermedio clave consiste en amino(alcoxi)iminometilcamptotecina, cuya preparación se describe en los documentos WO 03/101995 y WO 03/101996, partiendo de 7-formilcamptotecina mediante una reacción análoga a la descrita en la patente EP 1.044.977 anteriormente mencionada.
La 7-formilcamptotecina es un compuesto conocido cuya preparación se describe en la solicitud de patente WO 00/53607 y en las referencias citadas en la misma en las que, entre otras cosas, se describe también la preparación de los N_{1}-óxidos.
Véanse también Dallavalle S., y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11(3): 291-4; Dallavalle S., y col., J. Med. Chem. 2000, 43(21): 3963-9.
Los compuestos Y(-COOH) son nuevos y constituyen un objeto adicional de la presente invención, particularmente como intermedios para la preparación de los compuestos de fórmula (I).
Los compuestos descritos en la presente invención son inhibidores de topoisomerasa I y son por lo tanto útiles como medicamentos, particularmente para el tratamiento de enfermedades que se benefician de la inhibición de dicha topoisomerasa. En particular, los compuestos según la presente invención exhiben actividad antiproliferativa, y por lo tanto se usan por sus propiedades terapéuticas, y poseen propiedades fisicoquímicas que los hacen adecuados para formulación en composiciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas contienen al menos un compuesto de fórmula (I) como ingrediente activo, en una cantidad tal que produzca un efecto terapéutico significativo. Las composiciones cubiertas por la presente invención son enteramente convencionales y se obtienen usando procedimientos que son práctica común en la industria farmacéutica. Según la vía de administración seleccionada, las composiciones estarán en forma sólida o líquida y adecuada para administración oral, parenteral o intravenosa. Las composiciones según la presente invención contienen, junto con el ingrediente activo, al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los coadyuvantes de formulación, tales como por ejemplo agentes solubilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión o agentes emulsionantes, pueden ser particularmente útiles.
Los compuestos de fórmula (I) pueden usarse también en combinación con otros ingredientes activos tales como, por ejemplo, agentes anticancerosos u otros medicamentos con actividad antiparasitaria o antivírica, tanto en formas separadas como en una sola forma de dosificación.
Los compuestos según la presente invención son útiles como medicamentos con actividad anticancerosa, por ejemplo, en cáncer de pulmón no microcítico y de células pequeñas, o en cáncer colorrectal o de próstata, glioblastoma y neuroblastoma, cáncer de cuello del útero, cáncer de ovario, carcinoma gastrointestinal, carcinoma hepático, sarcoma de Kaposi, carcinoma renal, sarcoma y osteosarcoma, carcinoma testicular, carcinoma de mama, carcinoma de páncreas, melanoma, carcinoma de la vejiga urinaria y de cabeza y cuello. Una de las ventajas proporcionadas por los compuestos según la presente invención es la combinación de actividad antitopoisomerasa, propia de la porción de camptotecina de la molécula, y actividad inhibidora de integrina, proporcionada por la porción ciclopeptídica de la molécula. El resultado es la posible acción combinada de los compuestos según la presente invención, que se recibirá favorablemente en el campo oncológico por los expertos que trabajan en ese campo. De hecho, la porción ciclopeptídica que contiene la secuencia Arg-Gly-Asp no sólo dirige a la molécula contra tumores que expresan integrinas, sino que una vez se ha alcanzado la diana, es capaz de ejercer múltiples funciones, en el intervalo de internalización de la porción citotóxica de la molécula a actividad inhibidora de integrina, con las ventajas resultantes, particularmente en términos de inhibición de la angiogénesis tumoral. La porción ciclopeptídica, una vez separada de la porción de camptotecina, es también capaz de ejercer su función a una distancia desde el sitio del tumor, y por lo tanto los compuestos según la presente invención se demuestran también útiles en la prevención o el tratamiento de formas metastásicas.
Los medicamentos que son objeto de la presente invención pueden usarse también en el tratamiento de enfermedades parasitarias.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.
Las abreviaturas usadas son las siguientes:
Aad (ácido aminoadípico);
Amb (aminometilbencilo);
Amp (aminometilfenilalanina);
Boc (terc-butoxicarbonilo);
CSA (ácido canfosulfónico);
CTH (hidrogenación por transferencia catalítica);
DCC (diciclohexilcarbodiimida);
DCM (diclorometano);
DIEA (diisopropiletilamina);
DMF (dimetilformamida);
Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo);
HOBT (hidroxibenzotriazol);
NMP (N-metilpirrolidona);
Pht (ftaloílo);
Pmc (pentametilcroman-6-sulfonilo);
ST1968 (2-aminoetoxiiminometilcamptotecina);
TBTU (tetrafluoroborato de O-benzotriazol-1-iltetrametiluronio);
TFA (ácido trifluoroacético).
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Ejemplo 1 Síntesis de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-Amp) (ST2581 protegido)
Se suspendieron 1,587 mmol de Fmoc-Gly-Res (Res= Sasrin Resin®, Bachem) con agitación en 75 ml de DMF durante 30 minutos, después de lo cual se añadieron 18 ml de piperidina, continuando la agitación durante 30 minutos adicionales. Se suspendió la resina, filtrada y lavada con DMF, en 50 ml de NMP (N-metilpirrolidona) durante 15 minutos, después de lo cual se añadieron Fmoc-Arg(Pmc)-OH, HOBT, TBTU y DIEA (3,174 mmol de cada uno); después de 2 horas de agitación, se filtró la suspensión y se lavó con DMF. Después de la desprotección con piperidina, se repitió el acoplamiento con los otros aminoácidos sucesivamente, operando cada vez como se describe anteriormente, a saber: Fmoc-Amp(Cbz)-OH, Fmoc-D-Phe-OH y Fmoc-Asp(Oterc-Bu)-OH. Después de la última desprotección de Fmoc-N-terminal, se liberó el pentapéptido lineal de la resina con 45 ml de TFA al 1% en DCM. Se disolvió éste en aproximadamente 1 l de CH_{3}CN y se añadieron 4,761 mmol de HOBT y TBTU y 10 ml de DIEA; se mantuvo la disolución con agitación durante 30 minutos, se evaporó el disolvente hasta un volumen pequeño y se completó la precipitación del producto con agua. Se disolvió el producto bruto filtrado en 27 ml de una mezcla de MeOH y DMF 1:1, se añadieron 5 mmol de formiato de amonio y 0,55 g de Pd/C al 10% y se dejó con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se filtró la suspensión sobre Celite y se llevó a sequedad. Se purificó el residuo mediante HPLC-FI preparativa (columna: Alltima® C-18, Alltech; fase móvil 50% de CH_{3}CN en agua + 0,1% de TFA; tiempo de retención (T_{R})= 9,13 minutos). Se obtuvieron 483 mg de un polvo blanco.
RMN-^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 8,3, 8,07, 8,04, 7,90, 7,80, 7,33, 7,15, 7,07, 4,62, 4,50, 4,35, 4,12, 4,01, 3,15, 3,03, 2,96-2,65, 2,58, 2,48, 2,32, 2,02, 1,75, 1,50, 1,35, 1,23. Masa molecular (Maldi-Tof): 973.
Ejemplo 2 Síntesis de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-Aad) (ST2650 protegido)
Se trataron 0,69 mmol de Fmoc-Gly-Res exactamente como se describe en el ejemplo 1, con la diferencia de que en este caso los tercero y cuarto aminoácidos se añadieron en forma del dipéptido Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH. Después de la desprotección mediante CTH y la purificación del producto bruto con HPLC-FI preparativa (fase móvil: 66% de CH_{3}CN en agua + 0,1% de TFA; T_{R} = 17,29 minutos), se obtuvieron 187 mg de péptido puro.
RMN-^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 7,23, 4,58, 4,20-3,90, 3,28, 3,05, 2,99, 2,85, 2,74-2,35, 2,15, 2,05, 1,85-1,25. Masa molecular (Maldi-Tof): 940.
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Ejemplo 3 Síntesis de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-N-Me-Amp) (ST2700 protegido)
Se añadieron 2 eq de CSA y 20 eq de paraformaldehído a una suspensión de Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH_{2})-COOH en tolueno anhidro llevado a reflujo, divididos en 4 porciones a intervalos de 15 minutos. Se dejó enfriar la mezcla, se diluyó con 120 ml de tolueno y se lavó con NaHCO_{3} al 5% y agua. Después de la evaporación del disolvente, se disolvió el residuo en 15 ml de CHCl_{3} + 15 ml de TFA + 700 \mul de Et_{3}SiH; se dejó agitar la mezcla en la oscuridad durante 42 horas. Después de la evaporación del disolvente, se purificó el residuo mediante filtración en gel de sílice. Rendimiento global: 90%.
Se sintetizó el péptido lineal en fase sólida como se describe en el ejemplo 1, insertando Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH_{2})-COOH como tercer aminoácido, preparado como se describe anteriormente. En este caso, las desprotecciones de N-Fmoc-terminal en la resina se llevaron a cabo con diisopropilamina al 30% (300 eq) en disolución de DMF (debido a la presencia de ftalimida). Después de la ciclación, se disolvieron en caliente 500 mg del péptido en 10 ml de EtOH absoluto, a los que se añadieron 0,9 ml de una disolución de NH_{2}-NH_{2}\cdotH_{2}O 1 M en etanol. Después de calentar a reflujo durante 2 horas, se evaporó el disolvente y se recogió el residuo con 10 ml de DCM + 10 ml de disolución de Na_{2}CO_{3} con agitación vigorosa. Se recuperó el producto final bruto de la fase orgánica después de la evaporación y
se purificó mediante HPLC-FI preparativa (fase móvil: 52% de CH_{3}CN en agua + 0,1% de TFA; T_{R} = 10 minutos).
RMN-^{1}H (CDCl_{3}) \delta 8,29-7,66, 7,38-7,07, 4,95-4,77, 4,09, 3,41, 3,05-2,81, 2,51, 2,05, 1,74, 1,40, 1,26. Masa molecular (Maldi-Tof): 987.
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Ejemplo 4 Síntesis de c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-Amp(CO-(CH_{2})_{2}-COOH)] (ST2649 protegido)
Se disolvieron 120 mg de ciclopéptido c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-Amp]\cdotTFA (preparado como se describe en el ejemplo 1) en 3,6 ml de una mezcla de DCM-DMF 2:1, junto con una cantidad estequiométrica de TEA y anhídrido succínico. Después de 1 hora, se diluyó la mezcla de reacción con 30 ml de DCM y se lavó con agua. La fase orgánica, secada y concentrada, proporcionó un residuo de 100 mg de producto puro.
HPLC-FI analítica: columna: Purosphere STAR®, Merck; fase móvil: 45% de CH_{3}CN en agua + 0,1% de TFA; T_{R} = 13,17 minutos.
RMN-^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 8,20-7,75, 7,19-7,02, 4,58, 4,45, 4,36, 4,30, 4,20, 4,05, 3,00, 2,97-2,57, 1,83, 1,62, 1,32. Masa molecular (Maldi-Tof): 1073.
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Ejemplo 5 Síntesis de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-N-Amb-Gly) (ST2701 protegido)
Se añadieron 1,83 mmol de TEA a una disolución de 1-22 mmol de p-xililendiamina monoprotegida con Boc en 6 ml de THF y, gota a gota, una disolución de 1,22 mmol de bromoacetato de bencilo en 2 ml de THF. Se dejó la mezcla con agitación durante una noche, después de lo cual se evaporó el disolvente y se purificó el residuo en una columna ultrarrápida (CHCl_{3}-AcOEt, 9:1). Se obtuvieron 0,69 mmol de éster bencílico de N-(4-Boc-NH-CH_{2}-bencil)glicina.
Se disolvieron 250 mg de Fmoc-D-Phe-OH en 27 ml de DCM y se añadieron 40 \mul de difosgeno y 230 \mul de sim-colidina; después de 15 minutos, se añadieron 190 mg del éster anteriormente preparado, disueltos en 3 ml de DCM. Después de 3 horas, se añadieron 80 \mul de N-Me-piperazina a la mezcla de reacción y se agitó durante 10 minutos, después de dicho tiempo se diluyó la mezcla con 10 ml de DCM y se realizó la extracción con agua, HCl 0,5 N, agua, NaHCO_{3} al 5% y agua. Después de la evaporación del disolvente, se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (DCM-AcOEt, 9:1). Rendimiento: 80%.
Se añadieron 76 \mul de AcOH y 42 mg de HCOONH_{4} a 100 mg del producto así obtenido, disuelto en 6 ml de MeOH, se enfrió la mezcla a 0ºC y se añadieron 50 mg de Pd/C al 10%. Después de 30 minutos, se filtró la mezcla de reacción por Celite. Se llevó a sequedad el filtrado y se purificó en una columna ultrarrápida (CHCl_{3}-MeOH 9:1). Rendimiento: 90%.
Se disolvieron 190 mg del producto así obtenido en 1,2 ml de TFA y se llevaron hasta sequedad (desprotección de Boc); se redisolvió el residuo en 9 ml de Na_{2}CO_{3} al 10% + 6 ml de dioxano, se enfrió a 0ºC y se añadió gota a gota una disolución de 120 \mul de cloruro de benciloxicarbonilo diluida con 3 ml de dioxano. Después de 1 hora de agitación a temperatura ambiente, se llevó a cabo la evaporación a vacío hasta un volumen pequeño, después de lo cual se diluyó la mezcla con agua, se redujo el pH a 1 con HCl y se realizó la extracción con AcOEt. Después de la evaporación del disolvente, se purificó el residuo mediante filtración en gel de sílice, lavando con CHCl_{3}-MeOH (8:2). Rendimiento de dipéptido puro: 82%.
Se trataron 0,69 mmol de Fmoc-Gly-Res como se describe en el ejemplo 1. Después de Arg, se añadió el dipéptido anteriormente preparado Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH_{2}-bencil)-Gly secuencialmente. Después de la desprotección de Cbz mediante CTH, se purificó el producto bruto c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-N-Amp-Gly) mediante HPLC-FI preparativa (fase móvil: 50% de CH_{3}CN en agua + 0,1% de TFA; T_{R} = 10,5 minutos).
RMN-^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 8,29-7,66, 7,44-6,90, 5,15, 4,72-4,18, 4,20, 4,05-3,32, 3,15, 3,06, 2,70, 2,51, 2,49, 2,01, 1,80-1,35, 1,49, 1,35, 1,23. Masa molecular (Maldi-Tof): 973.
Ejemplo 6 Síntesis de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-Amp(CO-CH_{2}-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-O-CH_{2}-COOH))
Se añadió un exceso sustancial de diácido glicólico a una disolución de 200 mg de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(Oterc-Bu)-D-Phe-Amp)\cdotTFA (obtenida como se describe en el ejemplo 1) en 4 ml de mezcla de DCM-DMF 3:1. Se añadieron DIEA (3 eq) y DCC (2 eq) a la misma disolución. Se dejó la mezcla con agitación durante una noche, después de lo cual se diluyó con DCM y se lavó con agua.
Se recuperó el producto bruto mediante evaporación de la fase orgánica y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (fase móvil: CHCl_{3}-MeOH 7:3 + 1% de AcOH); se combinaron las fracciones que contenían el producto, se lavaron con agua, se deshidrataron, se llevaron hasta sequedad y proporcionaron un residuo de 157 mg de producto puro.
HPLC-FI analítica (columna: Purosphere STAR®, Merck; fase móvil: 50% de CH_{3}CN en agua + 0,1% de TFA; T_{R}= 10,96).
RMN-^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 8,35-7,92, 7,20-7,00, 4,65, 4,50, 3,94, 3,60-3,45, 3,00-2,60, 2,55, 2,45, 2,30, 2,00, 1,70, 1,50, 1,30, 1,20.
Masa molecular (Maldi-Tof): correspondiente a los diferentes glicoles usados de diversos pesos moleculares.
Síntesis de derivados conjugados Ejemplo 7 Síntesis de ST2686
5
Condensación de ST1968 con ST2650 protegido
Se disolvieron 15 mg (0,016 mmol) de ST2650 protegido en 1 ml de DMF anhidra, y se llevó la disolución a 0ºC; se añadieron 3,6 mg (0,027 mmol) de HOBt y 4 mg (0,019 mmol) de EDC y se dejó reaccionar la mezcla durante 30 minutos a 0ºC.
Se añadieron entonces 6 mg de 2-aminoetoxiiminometilcamptotecina (0,0131 mmol) y 8 \mul de DIEA (0,046 mmol) y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 horas. Se controló la reacción mediante TLC (CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 9:1).
Se diluyó la mezcla de reacción con H_{2}O (aproximadamente 10 ml) y se realizaron tres extracciones con CH_{2}Cl_{2}; se lavaron las fases orgánicas con salmuera, se deshidrataron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se llevaron hasta sequedad. Se obtuvieron 40 mg de producto bruto.
Cromatografía: eluyente CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 94:6 \rightarrow 92:8. Se obtienen 11 mg de producto.
Rendimiento= 61%.
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Liberación de grupos protectores
Se disolvieron 9 mg de producto protegido en 4 ml de una disolución de CH_{2}Cl_{2}:CF_{3}COOH 1:1 y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 24 horas.
Se controló la reacción mediante TLC (CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 94:6).
Se llevó la disolución de reacción hasta sequedad, obteniendo un sólido que se lavó 3 veces con Et_{2}O para eliminar los subproductos de la reacción de liberación.
Se obtuvieron 5 mg de producto en forma de trifluoroacetato.
Rendimiento= 66%.
Datos analíticos:
F_{R}= 0,24 en CH_{3}OH:H_{2}O= 7:3 (TLC FI)
Análisis de HPLC: columna: Dynamax® RP C_{18}, muestra disuelta en metanol; caudal: 1 ml/minuto; mezcla eluyente: acetonitrilo:agua (0,1% de TFA)= 55:45; gradiente: 10 minutos a 55% de agua (0,1% de TFA):45% de acetonitrilo, 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 5 min a condiciones iniciales. \lambda= 360 nm 8,323 (25,8%), 10,969 (74,2%). \lambda= 254 nm. 8,325 (29,4%), 10,975 (70,6%).
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Ejemplo 8 Síntesis de ST2724
6
Condensación de ST1968 con ST2649 protegido
Se disolvieron 25 mg (0,023 mmol) de ST2649 protegido en 2 ml de DMF anhidra y se llevó la disolución a 0ºC, después de lo cual se añadieron 5 mg (0,039 mmol) de HOBt y 5 mg (0,027 mmol) de EDC y se dejó reaccionar la mezcla durante 30 minutos a 0ºC.
Se añadieron 8 mg de ST1968 (0,019 mmol) y 12 \mul de DIEA (0,070 mmol) y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente 39 horas. Se controló la reacción mediante TLC (CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 9:1 para comprobar el inicio).
Se evaporó la DMF, se diluyó la mezcla con H_{2}O (aproximadamente 10 ml) y se realizó la extracción 3 veces con CH_{2}Cl_{2}. Se lavaron las fases orgánicas con salmuera, se deshidrataron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se llevaron hasta sequedad. Se obtuvieron 29 mg de producto bruto.
Cromatografía: eluyente CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 94:6 \rightarrow 9:1. Se obtuvieron 22 mg de producto (lom184) constituido por los dos isómeros sin y anti del grupo CH=NO unido en posición 7.
Rendimiento= 78%.
Análisis de HPLC-EM: columna: Symmetry C_{18} (3,5 \mum, 4,6 x 75 mm); fase móvil: acetonitrilo (0,1% de TFA):
agua (0,1% de TFA)= 55:45; gradiente: 10 minutos a 55% de agua (0,1% de TFA):45% de acetonitrilo, 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 5 min a condiciones iniciales. \lambda= 254 nm; t_{R}= 5,20 (42%); t_{R}= 5,97 (52%).
EM (ESI) m/z= 1492 correspondiente a [MH]^{+}.
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Retirada de grupos protectores
Se disolvieron 22 mg de ST2724 protegido en 4 ml de una disolución de CH_{2}Cl_{2}:CF_{3}COOH 1:1 y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 26 horas. Se controló la reacción mediante TLC (eluyente: CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 95:5 para comprobar el inicio; H_{2}O:CH_{3}OH= 3:7 para el producto).
Se controló también la desaparición de ST2724 protegido mediante HPLC, inyectando muestras tomadas a t= 0, t= 2 horas, t= 26 horas en las siguientes condiciones de gradiente: 10 minutos a 55% de agua (0,1% de TFA):45% de CH_{3}CN, 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 5 min a condiciones iniciales; t_{R} de ST2724 protegido: 17,3, 18,1.
Columna: Alltima RP C_{18} (150 mm, DI 4,6 mm, 5 \mum). Muestra disuelta en mezcla eluyente.
Se llevó la disolución de reacción hasta sequedad y se lavó 3 veces; se lavó el sólido obtenido 3 veces con Et_{2}O.
Se obtuvieron 10 mg de producto trifluoroacetato.
Rendimiento= 53%.
F_{R}= 0,52 en CH_{3}OH:H_{2}O= 7:3 (TLC FI).
Punto de fusión: desc. a T > 160ºC.
Análisis de HPLC: columna: Alltima RP C_{18} (150 mm, DI 4,6 mm, 5 \mum). Muestra disuelta en mezcla de eluyentes; fase móvil: acetonitrilo (0,1% de TFA):agua (0,1% de TFA)= 35:65; caudal= 1 ml/minuto. Análisis isocrático, \lambda= 254 nm, 3,204 (15,0%), 3,982 (79,1%). \lambda = 360 nm, 3,204 (12,8%), 3,984 (83,9%).
Ejemplo 9 Síntesis de ST2742
7
Condensación de ST1968 con ST2661 protegido
Se disolvieron 110 mg (0,093 mmol) de ST2661 protegido en 4 ml de DMF anhidra, se llevó la disolución a 0ºC, después de lo cual se añadieron 21 mg (0,158 mmol) de HOBt y 22 mg (0,112 mmol) de EDC, y se dejó la mezcla reaccionar durante 30 minutos a 0ºC.
Se añadieron 33 mg de ST1578 (0,077 mmol), 47 \mul de DIEA (0,270 mmol) y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas. Se controló la reacción mediante TLC (CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 9:1 para comprobar el inicio).
Procesamiento: se evaporó la DMF, se diluyó la mezcla con H_{2}O (aproximadamente 15 ml) y se realizaron tres extracciones con CH_{2}Cl_{2}. Se procesaron las fases orgánicas con salmuera, se deshidrataron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se llevaron hasta sequedad. Se obtuvieron 166 mg de producto bruto.
Cromatografía: eluyente CH_{2}Cl_{2}:CH_{3}OH= 95:5 \rightarrow 8:2. Se obtuvieron 63 mg de producto (ST2742 protegido). Rendimiento= 52%.
Análisis de HPLC: columna: Alltima RP C_{18} (150 mm, DI 4,6 mm, 5 \mum), muestra disuelta en la mezcla de eluyentes; fase móvil: acetonitrilo (0,1% de TFA):agua (0,1% de TFA)= 35:65; caudal: 1 ml/minuto; gradiente: 10 minutos a 55% de agua (0,1% de TFA):45% de acetonitrilo, 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 5 min a condiciones iniciales. \lambda= 254 nm 15,17 (12,7%), 15,88 (80,2%). \lambda= 360 nm 15,17 (17,5%), 15,88 (79,0%).
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Retirada de grupos protectores
Se disolvieron 30 mg de ST2742 protegido en 4 ml de disolución de CH_{2}Cl_{2}:CF_{3}COOH 1:1 y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 25 horas. La desaparición del producto protegido se controló mediante HPLC, inyectando muestras tomadas a t= 0, t= 1 hora, t= 2 horas y t= 24 horas en las condiciones de análisis descritas anteriormente.
Se obtuvieron 19 mg de producto constituido por los dos isómeros sin y anti del grupo CH=NO unido en la posición 7.
Rendimiento= 73%, p.f.= 160ºC (desc.); EM (MALDI) m/z: 1272,4.
F_{R}= 0,44 en CH_{3}OH:H_{2}O= 7:3 (TLC RP-18).
Análisis de HPLC: columna: Alltima RP C_{18} (150 mm, DI 4,6 mm, 5 \mum), muestra disuelta en la mezcla de eluyentes; fase móvil: acetonitrilo (0,1% de TFA):agua (0,1% de TFA)= 35:65; caudal= 1 ml/minuto; gradiente: 85% de agua (0,1% de TFA):15% de acetonitrilo, en 20 min a 10% de agua (0,1% de TFA), 10 min a 10% de agua (0,1% de TFA), en 5 min a condiciones iniciales. \lambda= 254 nm 9,65 (28,4%), 10,24 (62,4%).
Ejemplo 10 Resultados biológicos Unión a receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{3}
Se diluyó el receptor \alpha_{v}\beta_{3} purificado (Chemicon, cat. CC1020) en tampón (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM) a una concentración de 0,5 \mug/ml. Se añadió una alícuota de 100 \mul a placas de 96 pocillos y se incubó durante una noche a +4ºC. Se lavaron las placas una vez con tampón (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM, seroalbúmina bovina al 1%) y se incubaron entonces durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas dos veces con el mismo tampón y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente con el ligando radiactivo [^{125}I]equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0,05 nM en presencia de ligandos competitivos. Al final de la incubación, se lavaron los pocillos y se determinó la radiactividad usando un contador gamma (Packard). Se determinó la unión no específica de ligando en presencia de equistatina no radiactiva en exceso (1 \muM).
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Unión a receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{5}
Se diluyó el receptor \alpha_{v}\beta_{5} purificado (Chemicon, cat. CC1020) en tampón (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM) a una concentración de 1 \mug/ml. Se añadió una alícuota de 100 \mul a placas de 96 pocillos y se incubó durante una noche a +4ºC. Se lavaron las placas una vez con tampón (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM, seroalbúmina bovina al 1%) y se incubaron entonces durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas dos veces con el mismo tampón y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente con el ligando radiactivo [^{125}I]equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0,15 nM en presencia de ligandos competitivos. Al final de la incubación, se lavaron los pocillos y se determinó la radiactividad usando un contador gamma (Packard). Se determinó la unión no específica de ligando en presencia de equistatina no radiactiva en exceso (1 \muM).
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Evaluación de los parámetros de CI_{50}
Se expresó la afinidad de los productos para receptores de vitronectina como el valor de CI_{50} \pm DE, concretamente, como la concentración capaz de inhibir el 50% de la unión de radioligando-receptor específica. El parámetro CI_{50} se elaboró usando el software "ALLFIT".
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Resultados
El conjugado ST2686 mostró la afinidad más interesante por receptores de integrina en comparación con ST2724 y ST2742, dado que la unión calculada como el valor de CI_{50} era baja (véase la Tabla 1). La capacidad de ST2686 de competir con el radioligando por los receptores de integrina \alpha_{v}\beta_{3} era mayor que la mostrada por el péptido ST2650 con RGD libre y comparable con la de ST2650 por los receptores de \alpha_{v}\beta_{5} (Tabla 2). También ST2724 reveló una importante afinidad por receptores de integrina en comparación con el péptido libre ST2649 (Tabla 2), mientras que ST2742 mostraba una menor afinidad en comparación con el péptido ST2661 con RGD libre, aunque tenía una potente afinidad por ambos receptores de integrina.
También los otros péptidos con RGD (ST2581, ST2700, ST2701) demostraron una potente interacción con los receptores de integrina (Tabla 2).
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TABLA 1 Afinidad de conjugados de camptotecina-RGD por receptores de vitronecina \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}
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TABLA 2 Afinidad de péptidos RGD por receptores de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}
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Citotoxicidad de los conjugados sobre diferentes líneas de células tumorales
Para evaluar el efecto del compuesto sobre la supervivencia celular, se usó el ensayo de sulforodamina B. Se usaron células de carcinoma de próstata humana PC3, carcinoma renal humano A498 y carcinoma de ovario humano A2780. Se cultivaron las células tumorales A2780 y PC3 en RPMI 1640 que contenía 10% de suero fetal bovino (GIBCO), mientras que las células tumorales A498 se cultivaron en EMEM que contenía 10% de suero fetal bovino (GIBCO).
Se sembraron las células tumorales en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Corning) a aproximadamente 10% de confluencia y se dejaron unirse y recuperarse durante al menos 24 h. Se analizó el efecto de 8 concentraciones de los medicamentos ensayados para calcular su valor de CI_{50} (la concentración que inhibe el 50% de la supervivencia celular). Se incubaron las placas durante 72 h a 37ºC. Al final del tratamiento, se lavaron las placas mediante la retirada del sobrenadante y la adición de PBS 3 veces. Se añadieron 200 \mul de PBS y 50 \mul de TCA al 80% frío. Se incubaron las placas en hielo durante al menos 1 h. Se retiró el TCA, se lavaron las placas 3 veces por inmersión en agua destilada y se secaron en papel y a 40ºC durante 5 min. Se añadieron entonces 200 \mul de sulforodamina B al 0,4% en 1% de ácido acético. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante otros 30 min. Se retiró la sulforodamina B, se lavaron las placas por inmersión en ácido acético al 1% 3 veces, se secaron entonces en papel y a 40ºC durante 5 min. Se añadieron entonces 200 \mul de Tris 10 mM, y se mantuvieron las placas con agitación durante 20 min. Se determinó la supervivencia celular como la densidad óptica mediante un espectrofluorímetro Multiskan a 540 nm. Se calculó la cantidad de células muertas como la reducción porcentual de unión a sulforodamina B en comparación con los cultivos de control. Se calcularon los valores de CI_{50} con el programa "ALLFIT".
Como se ha reseñado, los conjugados mostraron la actividad citotóxica más potente sobre células de tumor de ovario A2780, con valores de CI_{50} entre 0,16 y 0,4 \muM. Sobre células tumorales A498, ST2742 era más activo, con un valor de CI_{50} de 0,74 \muM, seguido de ST2686 y ST2724 (CI_{50}= 3,2 y 4,3 \muM, respectivamente) (Tabla 3).
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TABLA 3 Citotoxicidad de los conjugados sobre células de carcinoma de próstata PC3, carcinoma renal A498 y carcinoma de ovario A2780
10

Claims (16)

1. Compuestos de fórmula (I)
11
en la que
i es 0 ó 1;
R_{1} es el grupo -CH=N-(O)_{m}-R_{2}-Z-X-Y;
en el que m es 0 ó 1;
R_{2} se selecciona del grupo constituido por un alquileno C_{1}-C_{7} lineal o ramificado, alquenileno C_{2}-C_{7} lineal o ramificado, cicloalquileno C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno C_{3}-C_{10}, arileno C_{6}-C_{14}, arilen (C_{6}-C_{14})-alquileno (C_{1}-C_{6}), alquilen (C_{1}-C_{6})-arileno (C_{6}-C_{14}), heterociclo (C_{3}-C_{14}) aromático o no aromático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; heterocicloalquilen (C_{3}-C_{10})-alquileno (C_{1}-C_{6}) que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; alquilen (C_{1}-C_{6})-heterocicloalquileno (C_{3}-C_{10}) que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S; un grupo poliaminoalquilo de fórmula -(CH_{2})_{m1}-NR_{8}-(CH_{2})_{n1}-NR_{9}-(CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-NR_{9})_{p1}-H, en la que m_{1} y n_{1}, que pueden ser iguales o diferentes, son números enteros de 2 a 6 y p_{1} es un número entero de 0 a 3;
R_{8} y R_{9}, que pueden ser iguales o diferentes, se seleccionan del grupo constituido por H, un alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, Boc, Cbz, monosacáridos tales como 6-D-galactosilo, o 6-D-glucosilo; cada uno de los grupos anteriormente mencionados puede estar posiblemente sustituido con uno o más grupos seleccionados del grupo constituido por CN, NO_{2}, NH_{2}, OH, SH, COOH, COO-(alquilo) (C_{1}-C_{5}), CONH-(alquilo)(C_{1}-C_{5}), SO_{3}H, SO_{3}-(alquilo)(C_{1}-C_{5}), en los que el grupo alquilo es lineal o ramificado; un átomo de halógeno;
Z está ausente o se selecciona de -NH-, -CO-, -O-;
X está ausente o se selecciona del grupo constituido por -COCHR_{3}NH-, -COCHR_{6}(CH_{2})_{n2}R_{4}-, -R_{4}-CH_{2}(OCH_{2}
CH_{2})_{n3}OCH_{2}R_{4-}, -R_{4}(Q)R_{4}-, -R_{5}[Arg-NH(CH_{2})_{n1}CO]_{n4}R_{5}-, -R_{5}-[N-guanidinopropil-Gly]_{n3}R_{5}-, -CON[(CH_{2})_{n4}NHR_{7}]CH_{2}-, en los que n_{1} es un número entero de 2 a 6, n_{2} es un número entero de 0 a 5, n_{3} es un número entero de 0 a 50, n_{4} es un número entero de 2 a 7;
R_{3} es H o alquilo C_{1}-C_{4} lineal o ramificado, opcionalmente sustituido con -COOH, -CONH_{2}, -NH_{2} u -OH; arilo C_{6}-C_{14};
R_{4} se selecciona del grupo constituido por: -NH-, -CO-, -CONH-, -NHCO-;
R_{5} está ausente o es -R_{4}(Q)R_{4}-;
R_{6} es un átomo de hidrógeno, -NH_{2};
R_{7} es un átomo de hidrógeno o alquilo (C_{1}-C_{4}) lineal o ramificado;
Q se selecciona del grupo constituido por: alquileno C_{1}-C_{6} lineal o ramificado; cicloalquileno C_{3}-C_{10} lineal o ramificado; alquenileno C_{2}-C_{6} lineal o ramificado; cicloalquenileno C_{3}-C_{10} lineal o ramificado; arileno C_{6}-C_{14}; arilen (C_{6}-C_{14})-alquileno (C_{1}-C_{6}), alquilen (C_{1}-C_{6})-arileno (C_{6}-C_{14}); heterociclilo (C_{3}-C_{14}) aromático o no aromático que contiene al menos un heteroátomo seleccionado del grupo constituido por O, N, S;
Y es la fórmula c(Arg-Gly-Asp-AA_{1}-AA_{2}), en la que:
c significa cíclico;
AA_{1} se selecciona del grupo constituido por: (D)-Phe, (D)-Trp, (D)-Tyr, (D)-2-naftil-Ala, (D)-4-terc-butil-Phe, (D)-4,4'-bifenil-Ala, (D)-4-CF_{3}-Phe, (D)-4-acetilamino-Phe;
AA_{2} se selecciona del grupo constituido por NW-CH[(CH_{2})_{n7}-CO]-CO,
NW-CH[(CH_{2})_{n5}-NH]-CO, NW-[4-(CH_{2})_{n5}-CO]-Phe, NW-[4-(CH_{2})_{n5}-NH]-Phe, [NW]-Gly, NW-Val, en los que W se selecciona de H, alquilo C_{1}-C_{6} lineal o ramificado, -(CH_{2})_{n5}-COOH, domde n_{7} es un número entero de 0 a 5, 4-carboxibencilo, 4-aminometilbencilo;
los N_{1}-óxidos, mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereómeros individuales, las formas E y Z, mezclas de las mismas, las sales farmacéuticamente aceptables.
2. Compuestos según la reivindicación 1, en los que m es igual a 1.
3. Compuestos según la reivindicación 2, en los que R_{2} es alquileno y Z y X están ausentes.
4. Compuestos según la reivindicación 2, en los que X= R_{4}CH_{2}(OCH_{2}CH_{2})_{n3}OCH_{2}R_{4}].
5. Compuesto según la reivindicación 3 de fórmula
12
los N_{1}-óxidos, mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereómeros individuales, las formas E y Z, mezclas de las mismas y las sales farmacéuticamente aceptables.
6. Compuesto según la reivindicación 3 de fórmula
13
los N_{1}-óxidos, mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereómeros individuales, las formas E y Z, mezclas de las mismas y las sales farmacéuticamente aceptables.
7. Compuesto según la reivindicación 4 de fórmula
14
los N_{1}-óxidos, mezclas racémicas, sus enantiómeros individuales, sus diastereómeros individuales, las formas E y Z, mezclas de las mismas y las sales farmacéuticamente aceptables.
8. Procedimiento para la preparación de compuestos según las reivindicaciones 1-7, llevado a cabo del siguiente modo:
7-CP-CH=N-(O)_{m}-R_{2}-Z_{1}-X_{1} + Y_{1}
en la que 7-CP representa la estructura policíclica de una camptotecina 7-sustituida y Z_{1}, X_{1} e Y_{1} representan respectivamente los grupos Z, X e Y como se definen en la fórmula I, eventualmente apropiadamente funcionalizados y/o protegidos.
9. Composición farmacéutica que contiene al menos un compuesto según las reivindicaciones 1-7 como ingrediente activo en una mezcla con al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Uso de los compuestos según las reivindicaciones 1-7 para la preparación de medicamentos.
11. Uso de los compuestos según las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un medicamento dotado de actividad inhibidora de topoisomerasa 1.
12. Uso según la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento con actividad anticancerosa.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que dicho medicamento es útil para el tratamiento de cáncer de pulmón no microcítico y de células pequeñas, tumores colorrectales, cáncer de próstata, glioblastoma y neuroblastoma, cáncer de cuello del útero, carcinoma de ovario, carcinoma gastrointestinal, carcinoma hepático, sarcoma de Kaposi, carcinoma renal, sarcoma y osteosarcoma, carcinoma testicular, carcinoma de mama, carcinoma de páncreas, melanoma, carcinoma de la vejiga urinaria y de cabeza y cuello.
14. Uso de los compuestos según las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un medicamento útil para la prevención o el tratamiento de formas metastásicas.
15. Uso según la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento con actividad antiparasitaria.
16. Uso según la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento con actividad antivírica.
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