CN1953989A - 作为细胞抑制剂的在7位与环肽缀合的喜树碱 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了通式(I)的化合物，其中R1基团如本说明书中所定义，并且包括喜树碱分子在7位与含有RGD序列的环肽的缩合。所述的化合物被赋予了对整联蛋白受体αvβ3和αvβ5的高亲和性以及以微摩尔浓度对人肿瘤细胞系的选择性细胞毒活性。

Description

作为细胞抑制剂的在7位与环肽缀合的喜树碱
发明领域
本发明涉及具有细胞毒活性的由含有RGD序列的环肽类和喜树碱衍生物组成的化合物，其制备方法，其作为药物的应用和含有它们的组合物。
特别地，本发明中所述的化合物被赋予了对整联蛋白αvβ3和αvβ5的高亲和性以及以微摩尔浓度对人细胞系的选择性细胞毒活性。
发明背景
化疗抗癌药为治疗窗最受限的药物。实际上，由于其细胞毒活性为非选择性的，所以它们可以无差别地损害它们所接触的机体的所有细胞。
目前存在使细胞毒性剂选择性定向针对肿瘤细胞的问题，以使活性剂在不损害健康周围组织细胞的情况下发挥其活性，或至少尽可能地限制所述的损害。
据文献报导，通过使用选择性环肽类，其参考化合物被认为是环五肽c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(JACS 1997，119，1328-35；国际专利申请WO 97/06791)，或通过使用单克隆抗体(Cell，1994，79，1157-64)，封阻整联蛋白αvβ3和αvβ5，导致血管发生阻滞并且使肿瘤生长减少。此外，还观察到了抗转移作用(J.Clin.Invest.，1995，96，1815)。Brooks等(Science，1994，264，569-71)报导了与正常组织休眠细胞相比肿瘤脉管系统的内皮细胞和肿瘤细胞自身优先表达整联蛋白αvβ3。在处于晚期临床研发阶段的化合物中，我们可以提及c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-MeVal)或EMD121974或西仑吉肽。
Ruoslati和合作者(Current Opinion in Oncology，1998，10，560-5)显示结合肿瘤内皮的RGD类似物一旦与细胞毒性剂多柔比星缀合就形成比单独多柔比星更有效和毒性更低的化合物。这些作者还证实，无容置疑，这种作用可归因于与RGD缀合，因为结合被游离肽本身所拮抗(Arap，Pasqualini和Ruoslati，Science，1998，279，377-380)。后来，相同的作者还进行了使促编程性细胞死亡肽序列与RGD类似物化学结合的其它实验，证实新化合物对血管发生内皮细胞具有选择性毒性并且在小鼠中具有抗癌活性(Ruoslati，Nature Medicine，1999，5，1032-8)。
Marcus等在国际专利申请WO 01/17563中描述了通过由一个或多个氨基酸组成的间隔基与整联蛋白αvβ3和αvβ5的非肽抑制剂拮抗剂缀合的细胞毒性剂诸如喜树碱的特异性抗癌活性。
Aoki等在Cancer Gene Therapy，2001，8，783-787中描述了与RGD序列缀合的组氨酰化寡赖氨酸的特异性抗癌活性，揭示了在小鼠中对肿瘤的寻靶作用。
已经提出了由整联蛋白介导的在细胞表面上结合的构思用于基因转运(Hart等，J.Biol.Chem.，1994，269，12468-12474)。
现在已经发现在20位与含有RGD序列的环肽衍生物缀合(可能通过适当的间隔基)的7-亚氨基甲基或7-氧甲基喜树碱衍生物被赋予了高的选择性的抗癌活性，并可以有利地用于制备治疗肿瘤的药物。
本发明的化合物因其对肿瘤细胞的选择性细胞毒活性而产生了具有较少和严重程度较低的副作用的药物。
本发明的描述
本发明的目的在于与含有RGD序列的环肽衍生物缀合的喜树碱衍生物。所得分子保存了未改变的原始喜树碱的细胞毒性能和亲和性与对非辍合的环肽类所观察到的相当的整联蛋白结合特性。这种组合的结果有利于细胞毒性剂浓集在那些最多表达αvβ3和αvβ5型整联蛋白的细胞中(寻靶)。细胞毒性剂以缀合形式和/或通过酶或水解作用形成的游离形式发挥其胞内活性。
本发明的目的在于通式(I)的化合物：
其N1-氧化物、外消旋混合物、其单一对映体、其单一非对映异构体、其E和Z型、其混合物、其药物上可接受的盐；
其中：
i为0或1；
R1为基团-CH＝N-(O)m-R2-Z-X-Y；
其中m为0或1；
R2选自下列基团组成的组：直链或支链C1-C7亚烷基、直链或支链C2-C7亚烯基、C3-C10亚环烷基、C3-C10亚环烯基、C6-C14亚芳基、亚芳基(C6-C14)-亚烷基(C1-C6)、亚烷基(C1-C6)-亚芳基(C6-C14)、含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的芳族或非芳族杂环(C3-C14)、含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的亚杂环烷基(C3-C10)-亚烷基(C1-C6)、亚烷基(C1-C6)-含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的亚杂环烷基(C3-C10)；通式-(CH2)m1-NR8-(CH2)n1-NR9-(CH2-CH2-CH2-NR9)p1-H的多氨基烷基基团，其中m1和n1可以相同或不同，为0-6的整数；
R8和R9可以相同或不同，并且选自下列基团组成的组：H、直链或支链C1-C6烷基、Boc、Cbz；单糖类，诸如6-D-半乳糖基或6-D-葡糖基；上述基团中每一个可能被一个或多个选自以下的基团取代：CN、NO2、NH2、OH、SH、COOH、COO-(烷基)(C1-C5)、CONH-(烷基)(C1-C5)、SO3H、SO3-(烷基)(C1-C5)，其中烷基为直链或支链的；卤原子；
Z不存在或选自-NH-、-CO-、-O-；
X不存在或选自-COCHR3NH-、-COCHR6(CH2)n2R4-、-R4-CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4-、-R4(Q)R4-、-R5[Arg-NH(CH2)n1CO]n4R5-、-R5-[N-胍基丙基-Gly]n3R5-、-CON[CH2)n4NHR7]CH2-组成的组，其中n1为2-6的整数，n2为0-5的整数，n3为0-50的整数，n4为2-7的整数；
R3为H或可选地被-COOH、-CONH2、-NH2或-OH取代的直链或支链C1-C4烷基；C6-C14芳基；
R4选自-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-组成的组；
R5不存在或为-R4(Q)R4-；
R6为氢原子、-NH2；
R7为氢原子或直链或支链(C1-C4)烷基；
Q选自下列基团组成的组：直链或支链C1-C6亚烷基；直链或支链C3-C10亚环烷基；直链或支链C2-C6亚烯基；直链或支链C3-C10亚环烯基；C6-C14亚芳基；亚芳基(C6-C14)-亚烷基(C1-C6)；亚烷基(C1-C6)-亚芳基(C6-C14)；含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的芳族或非芳族杂环基(C3-C14)；
Y为通式c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2)，其中：
c指的是环；
AA1选自下列基团组成的组：(D)-Phe、(D)-Trp、(D)-Tyr、(D)-2-萘基Ala、(D)-4-叔丁基-Phe、(D)-4，4′-联苯基-Ala，(D)-4-CF3-Phe、(D)-4-乙酰氨基-Phe；
AA2选自下列基团组成的组：NW-CH[(CH2)n7-CO]-CO、NW-CH[(CH2)n5-NH]-CO、NW-[4-(CH2)n5-CO]-Phe、NW-[4-(CH2)n5-NH]-Phe、[NW]-Gly、NW-Val，其中W选自：H；直链或支链C1-C6烷基；-(CH2)n5-COOH，其中n7为0-5的整数；4-羧苄基、4-氨甲基苄基。
本发明还提供了制备上述通式(I)的化合物的方法。
本发明包括具有上述通式(I)的化合物作为药物的活性成分且特别是用作拓扑异构酶I抑制剂的药物的活性成分的应用。在源于拓扑I异构酶抑制的治疗应用中，我们提及肿瘤和寄生虫或病毒感染。
鉴于其特定的药理特征，所以通式(I)的化合物还可用于制备治疗肿瘤及其转移形式的药物。
本发明还包括含有作为活性成分的通式(I)的化合物与至少一种药物上可接受的载体和/或赋形剂的混合物的药物组合物。
本发明的化合物为在7位官能化的喜树碱分子与含有Arg-Gly-Asp序列的环肽缩合的结果。该结构组合具有有利于细胞毒性剂(喜树碱)浓集在最多表达αvβ3和αvβ5型整联蛋白的细胞中的优点。细胞毒性剂以缀合形式和/或通过酶或水解作用以游离形式发挥其活性。
在上述通式(I)中出现的各种官能团和残基的定义以及药物上可接受的盐的定义为任何化学领域技术人员的公知常识并且不必做特别的定义。不过，对这类基团的参照引用可以在技术和专利文献中找到，例如在以本申请人的名义提交的国际专利申请WO 00/53607(具有抗肿瘤活性的喜树碱衍生物)、WO 03/101995(带有修饰的内酯环的喜树碱；i＝1)和WO 03/101996(喜树碱20位的酯)中。
一组最初的优选化合物由通式(I)的化合物组成，其中m＝1。
在该第一组中，R2优选为亚烷基，并且更优选亚甲基或亚乙基，X不存在。
另一组优选化合物由通式(I)的化合物组成，其中X＝R4CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4]。
本发明最优选的化合物如下：
Figure A20058001523300111
下文称作ST2686；
Figure A20058001523300112
下文称作ST2724
Figure A20058001523300121
下文称作ST2742
可以使用本文下述和对本发明优选化合物例示的方法制备通式(I)的化合物。该方法构成了本发明的另一个目的。
基本上，作为本发明目的的通式(I)的化合物通过在7位适当官能化的喜树碱(其五环结构在这里简要地以缩写CP表示)与环肽衍生物Y1的缩合来制备。
该缩合反应可以如下图示：
7-CP-CH＝N-(O)m-R2-Z1-X1+Y1
其中7-CP表示7-取代的喜树碱的多环结构，且Z1、X1和Y1分别表示如通式I中所定义的基团Z、X和Y，它们可选地被适当官能化和/或被保护，以便获得通式I的缀合化合物。
已经使用公知手段，诸如在EP1044977或S.Dallavalle等在J.Med.Chem.2001，44，3264-3274中所述的方法，获得了7-CP衍生物，而可使用常规方法，例如S.S.Dharap等在Journal of ControlledRelease 2003，91，61-73；R.Bhatt在Journal of Medicinal Chem.2003，46，190-3中所述的方法，进行缩合反应。
如实施例1-6中所述，可以按照常规肽合成技术制备环肽Y1。
一旦获得了所需的环肽，就将其以被保护形式用于缩合反应，并且仅在获得最终化合物后除去保护基。使用公知方法例如通过使用纯三氟乙酸的酸性条件或在有氯化有机溶剂存在下进行脱保护。
使用本领域技术人员公知的方法获得喜树碱衍生物7-CP-CH＝N-(O)m-R2-Z1-X1。
关键的中间体在于氨基(烷氧基)-亚氨基甲基-喜树碱，其制备描述在WO 03/101995和WO 03/101996中，从7-甲酰基喜树碱开始，经过的反应与上述专利EP 1 044 977中所述的类似。
7-甲酰基喜树碱为已知化合物，其制备描述在专利申请WO00/53607及其中引述的参考文献中，其中还特别描述了N1-氧化物的制备等。
另外可参见Dallavalle S.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2001，11(3)：291-4；Dallavalle S.等，J.Med.Chem.，2000，43(21)：3963-9。
Y(-COOH)化合物是新的并且构成了本发明的另一个目的，特别是作为用于制备通式(I)的化合物的中间体。
本发明中所述的化合物为拓扑异构酶I抑制剂且由此可用作药物，特别是用于治疗得益于抑制所述的拓扑异构酶的疾病。特别地，本发明的化合物表现出抗增殖活性且由此用于其治疗特性，并且具有使其适合于药物组合物配制的理化特性。
药物组合物含有至少一种通式(I)的化合物作为活性成分，其用量以便产生显著的治疗作用。本发明涵盖的组合物是完全常规的并且使用制药工业中通常实施的方法获得。按照选择的给药途径，组合物为固体或液体形式并适合于口服、非肠道或静脉内给药。本发明的组合物含有至少一种药物上可接受的载体或赋形剂连同活性成分。特别可以使用制剂辅剂，例如增溶剂、分散剂、悬浮剂或乳化剂。
通式(I)的化合物还可以与其它活性成分联用，例如抗癌药或具有抗寄生虫或抗病毒活性的其它药物，既可以为单独分开的剂型，也可以在单一剂型中。
本发明的化合物可用作具有抗癌活性的药物，例如在非小细胞(non-microcytoma)和小细胞肺癌或在结肠直肠癌或前列腺癌、成胶质细胞瘤和神经母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、胃肠癌、肝癌、卡波西肉瘤、肾癌、肉瘤和骨肉瘤、睾丸癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、膀胱癌和头颈癌中具有抗癌活性的药物。本发明化合物提供的优点之一在于该分子的喜树碱部分固有的抗拓扑异构酶活性与该分子的环肽部分提供的整联蛋白抑制活性的组合。结果为本发明化合物将在肿瘤学领域中被从事该领域的技术人员有利接受的可能的联合作用。实际上，含有Arg-Gly-Asp序列的环肽部分不仅使所述分子定向针对表达整联蛋白的肿瘤，而且一旦达到靶物就能够发挥从该分子的细胞毒性部分的内化到整联蛋白抑制活性的多种功能，从而产生优点，特别是在抑制肿瘤血管发生方面。环肽部分一旦从喜树碱部分分离，还能够在距肿瘤部位一段距离处发挥其作用，且由此本发明的化合物还可用于预防或治疗转移形式。
作为本发明目的的药物还可以用于治疗寄生虫疾病。
下列实施例进一步解释了本发明。
使用缩写如下：
Aad(氨基己二酸)；
Amb(氨甲基苄基)；
Amp(氨甲基苯丙氨酸)；
Boc(叔丁氧羰基)；
CSA(樟脑磺酸)；
CTH(催化转移氢化)；
DCC(二环己基碳二亚胺)；
DCM(二氯甲烷)；
DIEA(二异丙基乙胺)；
DMF(二甲基甲酰胺)；
Dy(Otf3)三氟甲磺酸镝；
Fmoc(9-芴甲氧羰基)；
HOBT(羟基苯并三唑)；
NMP(N-甲基-吡咯烷酮)；
Pht(邻苯二甲酰基)；
Pmc(五甲基色满-6-磺酰基)；
ST1968(2-氨基乙氧基亚氨基甲基-喜树碱)；
TBTU(四氟硼酸-0-苯并三唑-1-基-四甲基脲鎓)；
TFA(三氟乙酸)。
                     实施例1
           c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)
                (被保护的ST2581)的合成
将1.587mmol Fmoc-Gly-Res(Res＝Sasrin Resin_，Bachem)在搅拌下悬浮于75ml DMF中30分钟，此后加入18ml哌啶，再继续搅拌30分钟。将过滤并且用DMF洗涤的树脂悬浮于50ml NMP(N-甲基-吡咯烷酮)中15分钟，此后加入Fmoc-Arg(Pmc)-OH、HOBT、TBTU和DIEA(各3.174mmol)；搅拌2小时后，过滤该混悬液并且用DMF洗涤。在使用哌啶脱保护后，依次使用其它氨基酸重复偶联，每次如上所述进行操作，即：Fmoc-Amp(Cbz)-OH、Fmoc-D-Phe-OH和Fmoc-Asp(OtBu)-OH。在Fmoc-N-末端最终脱保护后，使用45ml1％在DCM中的TFA使线性五肽从树脂上释放。将其溶于约11的CH3CN，并且加入4.761mmol HOBT和TBTU和10ml DIEA；将该溶液保持搅拌30分钟，蒸发溶剂至小体积并且使用水完成产物沉淀。将过滤的粗产物溶于27ml MeOH和DMF1∶1的混合物；加入5mmol甲酸铵(ammonium formiate)和0.55g 10％Pd/C并且在室温下搅拌30分钟。用C盐过滤该混悬液并且使其干燥。通过制备型RP-HPLC纯化残余物(柱：Alltima_C-18，Alltech；流动相50％CH3CN在水+0.1％TFA中；保留时间(Rt)＝9.13分钟)。得到483mg白色粉末。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.3，8.07，8.04，7.90，7.80，7.33，7.15，7.07，4.62，4.50，4.35，4.12，4.01，3.15，3.03，2.96-2.65，2.58，2.48，2.32，2.02，1.75，1.50，1.35，1.23。
分子量(Maldi-Tof)：973
                      实施例2
             c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Aad)
            (被保护的ST2650)的合成
正如实施例1中所述处理0.69mmol Fmoc-Gly-Res，差别在于在此情况中以二肽Fmoc-D-Phe-Aad(OBz1)-OH形式加入第三和第四个氨基酸。在通过CTH脱保护并且使用制备型RP-HPLC(流动相：66％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝17.29分钟)纯化粗产物后得到187mg纯肽。1H-NMR(DMSO-d6)δ7.23，4.58，4.20-3.90，3.28，3.05，2.99，2.85，2.74-2.35，2.15，2.05，1.85-1.25。
分子量(Maldi-Tof)：940
                            实施例3
              c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Me-Amp)
                         (被保护的ST2700)的合成
向达到回流的Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH2)-COOH在无水甲苯中的混悬液中加入2eq CSA和20eq低聚甲醛，分成4部分间隔15分钟加入。将该混合物冷却，使用120ml甲苯稀释并且用5％NaHCO3和水洗涤。在蒸发溶剂后，将残余物溶于15ml CHCl3+15ml TFA+700ulEt3SiH；将该混合物置于暗处搅拌42小时。在蒸发溶剂后，通过硅胶过滤纯化残余物。总产率：90％。
如实施例1中所述在固相中合成线性肽，插入如上所述制备的作为第三个氨基酸的Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH2)-COOH。在这种情况中，使用30％在DMF中的二异丙胺(300eq)溶液进行树脂上N-Fmoc-末端的脱保护(因为存在邻苯二甲酰亚胺)。环化后，将500mg肽趁热溶于10ml无水EtOH，向其中加入0.9ml NH2-NH2·H2O在乙醇中的1M溶液。在回流状态下加热2小时后，蒸发溶剂并且在剧烈振摇下将残余物吸收于10ml DCM+10ml Na2CO3溶液。在蒸发后从有机相中回收粗的终产物并且通过制备型RP-HPLC纯化(流动相：52％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝10分钟)。
1H-NMR(CDCl3)δ8.29-7.66，7.38-7.07，4.95-4.77，4.09，3.41，3.05-2.81，2.51，2.05，1.74，1.40，1.26。
分子量(Maldi-Tof)：987
                       实施例4
c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp(CO-(CH2)2-COOH)]
               (被保护的ST2649)的合成
将120mg环肽c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]·TFA(如实施例1中所述制备)与化学计算量的TEA和琥珀酸酐一起溶于3.6mlDCM-DMF2∶1的混合物。1小时后，用30ml DCM稀释该反应混合物并且用水洗涤。干燥和浓缩有机相得到残余物，为100mg纯产物。分析型RP-HPLC：柱：Purosphere STAR_，Merck；流动相：45％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝13.17分钟。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.20-7.75，7.19-7.02，4.58，4.45，4.36，4.30，4.20，4.05，3.00，2.97-2.57，1.83，1.62，1.32。
分子量(Maldi-Tof)：1073
                       实施例5
        c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amb-Gly)
                 (被保护的ST2701)的合成
向1.22mmol的Boc-一保护的对-苯二甲胺在6ml THF中的溶液中加入1.83mmol TEA并且滴加1.22mmol溴乙酸苄酯在2ml THF中的溶液。将该混合物在搅拌下保持过夜，此后蒸发溶剂并且在快速柱上纯化残余物(CHCl3-EtOAc，9∶1)。得到0.69mmol N-(4-Boc-NH-CH2-苄基)-甘氨酸苄酯。
将250mg Fmoc-D-Phe-OH溶于27ml DCM并且加入40μl双光气和230μl均-可力丁；15分钟后，加入190mg先前制备的酯(溶于3ml DCM)。3小时后，将80μl N-Me-哌嗪加入到该反应混合物中并且搅拌10分钟，此后用10ml DCM稀释该混合物并且用水、0.5NHCl、水、5％NaHCO3和水进行萃取。在蒸发溶剂后，通过硅胶快速色谱法纯化残余物(DCM-EtOAc，9∶1)。产率：80％。
向溶于6ml MeOH中的100mg由此获得的产物中加入76μl AcOH和42mg HCOONH4并且将该混合物冷却至0℃，且加入50mg 10％Pd/C。30分钟后，用C盐过滤该反应混合物。使滤液干燥并且在快速柱上纯化(CHCl3-MeOH 9∶1)。产率：90％。
将190mg由此获得的产物溶于1.2ml TFA并且使其干燥(Boc脱保护)；将残余物重新溶于9ml 10％Na2CO3+6ml二_烷，冷却至0℃并且滴加120μl苄氧羰基氯用3ml二_烷稀释的溶液。在室温下搅拌1小时后，在真空中进行蒸发至小体积，此后用水稀释该混合物，用HCl使pH降至1并且使用EtOAc进行萃取。在蒸发溶剂后，通过硅胶过滤纯化残余物，使用CHCl3-MeOH(8∶2)洗涤。纯二肽产率：82％。
如实施例1中所述处理0.69mmol Fmoc-Gly-Res。在Arg后，顺次加入先前制备的二肽Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH2-苄基)-G1。在通过CTH使Cbz脱保护后，通过制备型RP-HPLC纯化粗产物c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-N-Amp-Gly)(流动相：50％CH3CN在水+0.1％TFA中；Rt＝10.5分钟)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.29-7.66，7.44-6.90，5.15，4.72-4.18，4.20，4.05-3.32，3.15，3.06，2.70，2.51，2.49，2.01，1.8 0-1.35，1.49，1.35，1.23。
分子量(Maldi-Tof)：973
                         实施例6
c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2CH2)n-O-CH2
                       -COOH))的合成
向200mg c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)·TFA(如实施例1中所述获得)在4ml 3∶1 DCM-DMF混合物中的溶液中加入大大过量的乙二醇二酸。向同一溶液中加入DIEA(3eq)和DCC(2eq)。将该混合物搅拌过夜，此后用DCM稀释并且用水洗涤。
通过蒸发有机相回收粗产物并且通过快速色谱法纯化(流动相：CHCl3-MeOH 7∶3+1％ AcOH)；收集合并含有产物的级分，用水洗涤，脱水并且使其变干，且得到残余物，为157mg纯产物。
分析型RP-HPLC：(柱：Purosphere STAR_，Merck；流动相：50％在水中的CH3CN 50％+0.1％ TFA；Rt＝10.96)
1H-NMR(DMSO-d6)δ8.35-7.92，7.20-7.00，4.65，4.50，3.94，3.60-3.45，3.00-2.60，2.55，2.45，2.30，2.00，1.70，1.50，1.30，1.20。分子量(Maldi-Tof)：相应于使用的不同分子量的乙二醇。
缀合衍生物的合成
                  实施例7
ST2686的合成
Figure A20058001523300191
ST1968与被保护的ST2650的缩合
将15mg(0.016mmoli)被保护的ST2650溶于1ml无水DMF，并且使该溶液达到0℃；加入3.6mg(0.027mmol)HOBt和4mg(0.019mmol)EDC并且将该混合物置于0℃下反应30分钟。
然后加入6mg 2-氨基乙氧基亚氨基甲基喜树碱(0.0131mmoli)和8μl DIEA(0.046mmol)并且将该混合物在室温下反应约60小时。通过TLC(CH2Cl2∶CH3OH＝9∶1)监测反应。
用H2O(约10ml)稀释该反应混合物并且用CH2Cl2进行三次萃取；用盐水洗涤有机相，用Na2SO4脱水(anhydrified)，过滤并且使其干燥。得到40mg粗产物。
色谱：洗脱液CH2Cl2∶CH3OH＝94∶6→92∶8。得到11mg产物。
产率＝61％
保护基的释放
将9mg被保护的产物溶于4ml CH2Cl2∶CF3COOH 1∶1溶液并且在室温下反应24小时。
通过TLC(CH2Cl2∶CH3OH＝94∶6)监测该反应。
使该反应溶液干燥，用Et2O将获得的固体洗涤3次以消除释放反应中的副产物。
得到5mg三氟乙酸盐形式的产物。
产率＝66％。
分析数据：在CH3OH∶H2O＝7∶3中Rf＝0.24(TLC RP)。
HPLC分析：柱：Dynamax_RP C18，样品溶于甲醇；流速：1ml/分钟；洗
脱液混合物：乙腈∶水(0.1％ TFA)＝55∶45；梯度：10分钟至55％水(TFA 0.1％)∶45％乙腈，10分钟至10％水(TFA 0.1％)，10分钟处于10％水(TFA 0.1％)，5分钟至初始条件。λ＝360nm 8.323(25.8％)；
10.969(74.2％)。λ＝254nm 8.325(29.4％)；10.975(70.6％)。
                         实施例8
ST2724的合成
ST1968与被保护的ST2649的缩合
将25mg(0.023mmol)被保护的ST2649溶于2ml无水DMF，并且使该溶液达到0℃，此后加入5mg(0.039mmol)HOBt和5mg(0.027mmol)EDC并且使该混合物在0℃下反应30分钟。
加入8mg ST1968(0.019 mmol)和12μl DIEA(0.070mmol)并且使该混合物在室温下反应约39小时。通过TLC(CH2Cl2∶CH3OH＝9∶1以检查原料(start))监测反应。
蒸发DMF，用H2O(约10ml)稀释该反应混合物并且用CH2Cl2进行三次萃取；用盐水洗涤有机相，用Na2SO4脱水，过滤并且使其干燥。得到29mg粗产物。
色谱：洗脱液CH2Cl2∶CH3OH＝94∶6→9∶1。得到22mg产物(lom 184)其由在7位结合的CH＝NO基团的两种顺式和反式异构体组成。
产率＝78％
HPLC-MS分析：柱：Symmetry C18，(3.5μm，4.6×75mm)；流动相：乙腈(TFA 0.1％)∶水(TFA 0.1％)＝55∶45；梯度：10分钟55％水(TFA 0.1％)∶45％乙腈，10分钟至10％水(TFA 0.1％)，10分钟处于10％水(TFA 0.1％)，5分钟至初始条件。λ＝254nm：tr＝5.20(42％)；tr＝5.97(52％)。
MS：(ESI)m/z＝1492相当于[MH]+。
保护基的除去
将22mg被保护的ST2724溶于4ml CH2Cl2∶CF3COOH 1∶1溶液并且在室温下反应26小时。通过TLC(洗脱液：CH2Cl2∶CH3OH＝95∶5以检查原料；H2O∶CH3OH＝3∶7用于产物)监测反应。
另外通过HPLC监测被保护的ST2724的消失，注入在t＝0、t＝2小时、t＝26小时时取的样品，以下列梯度条件：10分钟55％水(TFA 0.1％)∶45％CH3CN，10分钟至10％水(TFA 0.1％)，10分钟处于10％水(TFA 0.1％)，5分钟至初始条件；Tr被保护的ST2724＝17.3；18.1。
柱：Alltima RP C18(150mm，DI4.6mm，5μ)。样品溶于洗脱液混合物中。
将该反应溶液干燥并且洗涤3次；用Et2O将获得的固体洗涤3次。
得到10mg三氟乙酸盐产物。
产率＝53％
在CH3OH∶H2O＝7∶3中Rf＝0.52(TLC RP)。
熔点：分解T＞160℃。
HPLC分析：柱：Alltima RP C18(150mm，DI 4.6mm，5μ)。样品溶于洗脱液混合物；流动相：乙腈(0.1％ TFA)∶水(TFA 0.1％)＝35∶65；流速＝1ml/分钟。恒溶剂分析。λ＝254nm 3.204(15.0％)；3.982(79.1％)。λ＝360nm 3.204(12.8％)；3.984(83.9％)。
实施例9
ST2742的合成
Figure A20058001523300221
ST1968与被保护的ST2661的缩合
将110mg(0.093mmoli)被保护的ST2661溶于4ml无水DMF，使该溶液达到0℃，此后加入21mg(0.158mmoli)HOBt和22mg(0.112mmol)EDC，并且使该混合物在0℃下反应30分钟。
加入33mg ST1578(0.077mmol)、47μl DIEA(0.270mmol)并且将该混合物在室温下反应约24小时。通过TLC(CH2Cl2∶CH3OH＝9∶1以检查原料)监测反应。
处理：蒸发DMF，用H2O(约15ml)稀释该反应混合物并且用CH2Cl2进行三次萃取；用盐水处理有机相，用Na2SO4脱水，过滤并且使其干燥。得到166mg粗产物。
色谱：洗脱液CH2Cl2∶CH3OH＝95∶5→8∶2。得到63mg产物(被保护的ST2742)。产率＝52％
HPLC分析：柱：Alltima RP C18(150mm，DI 4.6mm，5μ)；样品溶于洗脱液混合物；流动相：乙腈(TFA 0.1％)∶水(TFA 0.1％)＝35∶65；流速＝1ml/分钟；梯度：10分钟至55％水(TFA 0.1％)∶45％乙腈，10分钟至10％水(TFA 0.1％)，10分钟处于10％水(TFA 0.1％)，5分钟至初始条件。λ＝254nm：15.17(12.7％)；15.88(80.2％)。λ＝360nm 15.17(17.5％)；15.88(79.0％)。
保护基的除去
将30mg被保护的ST2724溶于4ml CH2Cl2∶CF3COOH 1∶1溶液并且在室温下保持反应25小时。通过HPLC监测被保护产物的消失，在上述分析条件中注入在t＝0、t＝1小时、t＝2小时和t＝24小时时取的样品。
得到19mg产物，为在7位结合的CH＝NO基团的两种顺式和反式异构体。
产率＝73％；m.p.160℃(分解)；MS(MALDI)m/z：1272.4。
在CH3OH∶H2O＝7∶3中Rf＝0.44(TLC RP-18)。
HPLC分析：柱：Alltima RP C18(150mm，DI 4.6mm，5μ)。样品溶于洗脱液混合物；流动相：乙腈(TFA 0.1％)∶水(TFA 0.1％)＝35∶65；
流速＝1ml/分钟；梯度：85％水(TFA 0.1％)∶15％乙腈，在20′内至10％水(TFA 0.1％)，10′处于10％水(TFA 0.1％)，在5′内至初始条件。λ＝254nm 9.65(28.4％)；10.24(62.4％)。
实施例10
生物学结果
与整联蛋白αvβ3受体的结合
在缓冲液(20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，1mM MnCl2)中将纯化的αvβ3受体(Chemicon，cat.CC1020)稀释至浓度为0.5μg/ml。将100μl等分部分加入到96-孔平板中并且在+4℃下保温过夜。用缓冲液(50mM Tris，pH7,4，100mM NaCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1％牛血清白蛋白)将平板洗涤一次且然后再在室温下保温2小时。用相同缓冲液将平板洗涤两次并且在室温下在有竞争配体存在下与放射性配体[125I]锯鳞血抑肽(echistatin)(Amersham Pharmacia Biotech)0.05nM一起保温3小时。在保温结束时，洗涤各孔并且使用γ计数器(Packard)测定放射性。在有过量冷锯鳞血抑肽(1μM)存在下测定配体的非特异性结合。
与整联蛋白αvβ5受体的结合
在缓冲液(20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，2mM CaCl2，1mMMgCl2，1mM MnCl2)中将纯化的αvβ5受体(Chemicon，cat.CC1020)稀释至浓度为1μg/ml。将100μl等分部分加入到96-孔平板中并且在+4℃下保温过夜。用缓冲液(50mM Tris，pH7,4，100mM NaCl，2mMCaCl2，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1％牛血清白蛋白)将平板洗涤一次且然后再在室温下保温2小时。用相同缓冲液将平板洗涤两次并且在室温下在有竞争配体存在下与放射性配体[125I]锯鳞血抑肽(AmershamPharmacia Biotech)0.15nM一起保温3小时。在保温结束时，洗涤各孔并且使用γ计数器(Packard)测定放射性。在有过量冷锯鳞血抑肽(1μM)存在下测定非特异性配体结合。
IC50参数的评价
将产物对玻连蛋白受体的亲和性表示为IC50值±SD，即表示为能够抑制50％特异性放射性配体-受体结合的浓度。使用″ALLFIT″软件研究IC50参数。
结果
与ST2724和ST2742相比，缀合物ST2686表现出对整联蛋白受体最有意义的亲和性，鉴于计算为IC50值的结合是低的(参见表1)。ST2686与放射性配体竞争整联蛋白αvβ3受体的能力大于游离RGD肽ST2650所表现出的并且与ST2650对αvβ5受体的相当(表2)。此外，ST2724与游离肽ST2649相比表现出对整联蛋白受体的较大亲和性(表2)，而ST2742与RGD游离肽ST2661相比表现出较小的亲和性，不过，对两种整联蛋白受体的亲和性均是有效力的。
此外，其它RGD肽类(ST2581、ST2700、ST2701)显示出与整联蛋白受体的有效相互作用(表2)。
                      表1
喜树碱-RGD缀合物对玻连蛋白αvβ3和αvβ5受体的亲和性
    化合物     αvβ3     αvβ5
    ST2686ST2724ST2742             IC50±SD(nM)
    0.59±0.017.27±0.0612.5±2.1     0.37±0.018.39±0.076.5±0.03
表2
RGD肽类对玻连蛋白αvβ3和αvβ5受体的亲和性
  化合物     αvβ3     αvβ5
    ST2650ST2649ST2661ST2581ST2700ST2701               IC50±SD(nM)
    28.6±0.737.6±0.94.0±0.11.7±0.17.2±0.0736.7±0.7     0.17±0.015.1±0.070.35±0.093.4±0.10.9±0.0052.9±0.1
缀合物对不同肿瘤细胞系的细胞毒性
为了评价化合物对细胞存活的作用，使用sulphorodamine B试验。使用PC3人前列腺癌、A498人肾癌、A2780人卵巢癌细胞。使A2780和PC3肿瘤细胞生长在含有10％胎牛血清(GIBCO)的RPMI 1640中，而使A498肿瘤细胞生长在含有10％胎牛血清(GIBCO)的EMEM中。
以约10％的融合率将肿瘤细胞接种在96-孔组织培养平板(Corning)中并且使其贴壁并恢复至少24小时。分析8个浓度的测试药物的作用以便计算其IC50值(抑制50％细胞存活的浓度)。将平板在37℃下保温72小时。在处理结束时，通过除去上清液并且添加PBS而洗涤平板3次。加入200μl PBS和50μl冷80％TCA。将平板在冰上保温至少1小时。除去TCA，将平板浸入蒸馏水洗涤3次并且在纸上和40℃下干燥5分钟。然后加入200μl 0.4％在1％乙酸中的sulphorodamine B。将平板在室温下再保温30分钟。除去Sulphorodamine B，将平板浸入1％乙酸洗涤3次，然后将它们在纸上和40℃下干燥5分钟。然后加入200μl Tris 10mM，将平板在搅拌下保持20分钟。在540nm下用Multiskan荧光分光光度计以光密度测定存活细胞。将杀死细胞的量计算为与对照培养物相比sulphorodamine B结合的降低百分比。使用″ALLFIT″程序计算IC50值。
正如报导的，所述缀合物对A2780卵巢肿瘤细胞表现出最有效力的细胞毒活性，IC50值为0.16-0.4μM。对A498肿瘤细胞，ST2742更具活性，IC50值为0.74μM，随后是ST2686和ST2724(IC50分别＝3.2和4.3μM)(表3)。
                            表3
缀合物对PC3前列腺癌、A498肾癌、A2780卵巢癌细胞的细胞毒性
  化合物     PC3     A498     A2780
  ST2686ST2724ST2742                     IC50±SD，μM
    15±1.54.7±0.427±3.9     3.2±0.44.3±0.10.7±0.1   0.4±0.030.16±0.0010.18±0.01

Claims (17)

1.通式(I)的化合物：
Figure A2005800152330002C1
其N1-氧化物、外消旋混合物、其单一对映体、其单一非对映异构体、其E和Z型、其混合物、其药物上可接受的盐；
其中：
i为0或1；
R1为基团-CH＝N-(O)m-R2-Z-X-Y；
其中m为0或1；
R2选自下列基团组成的组：直链或支链C1-C7亚烷基、直链或支链C2-C7亚烯基、C3-C10亚环烷基、C3-C10亚环烯基、C6-C14亚芳基、亚芳基(C6-C14)-亚烷基(C1-C6)、亚烷基(C1-C6)-亚芳基(C6-C14)、含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的芳族或非芳族杂环(C3-C14)、含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的亚杂环烷基(C3-C10)-亚烷基(C1-C6)、亚烷基(C1-C6)-含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的亚杂环烷基(C3-C10)；通式-(CH2)m1-NR8-(CH2)n1-NR9-(CH2-CH2-CH2-NR9)p1-H的多氨基烷基基团，其中m1和n1可以相同或不同，为2-6的整数且p1为0-3的整数；
R8和R9可以相同或不同，并且选自下列基团组成的组：H、直链或支链C1-C6烷基、Boc、Cbz；单糖类，诸如6-D-半乳糖基或6-D-葡糖基；上述基团中每一个可能被一个或多个选自以下的基团取代：CN、NO2、NH2、OH、SH、COOH、COO-(烷基)(C1-C5)、CONH-(烷基)(C1-C5)、SO3H、SO3-(烷基)(C1-C5)，其中烷基为直链或支链的；卤原子；
Z不存在或选自-NH-、-CO-、-O-；
X不存在或选自-COCHR3NH-、-COCHR6(CH2)n2R4-、-R4-CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4-、-R4(Q)R4-、-R5[Arg-NH(CH2)n1CO]n4R5-、-R5-[N-胍基丙基-Gly]n3R5-、-CON[CH2)n4NHR7]CH2-组成的组，其中n1为2-6的整数，n2为0-5的整数，n3为0-50的整数，n4为2-7的整数；
R3为H或可选地被-COOH、-CONH2、-NH2或-OH取代的直链或支链C1-C4烷基；C6-C14芳基；
R4选自-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-组成的组；
R5不存在或为-R4(Q)R4-；
R6为氢原子、-NH2；
R7为氢原子或直链或支链(C1-C4)烷基；
Q选自下列基团组成的组：直链或支链C1-C6亚烷基；直链或支链C3-C10亚环烷基；直链或支链C2-C6亚烯基；直链或支链C3-C10亚环烯基；C6-C14亚芳基；亚芳基(C6-C14)-亚烷基(C1-C6)；亚烷基(C1-C6)-亚芳基(C6-C14)；含有至少一个选自O、N、S组成的组的杂原子的芳族或非芳族杂环基(C3-C14)；
Y为通式c(Arg-Gly-Asp-AA1-AA2)，其中：
c指的是环；
AA1选自下列基团组成的组：(D)-Phe、(D)-Trp、(D)-Tyr、(D)-2-萘基Ala、(D)-4-叔丁基-Phe、(D)-4，4′-联苯基-Ala，(D)-4-CF3-Phe、(D)-4-乙酰胺-Phe；
AA2选自下列基团组成的组：NW-CH[(CH2)n7-CO]-CO、NW-CH[(CH2)n5-NH]-CO、NW-[4-(CH2)n5-CO]-Phe、NW-[4-(CH2)n5-NH]-Phe、[NW]-Gly、NW-Val，其中W选自：H；直链或支链C1-C6烷基；-(CH2)n5-COOH，其中n7为0-5的整数；4-羧苄基、4-氨甲基苄基。
2.权利要求1的化合物，其中m等于1。
3.权利要求2的化合物，其中R2为亚烷基且Z和X不存在。
4.权利要求2的化合物，其中X＝R4CH2(OCH2CH2)n3OCH2R4]。
5.权利要求3的化合物，具有如下通式：
其N1-氧化物、外消旋混合物、其单一对映体、其单一非对映异构体、其E和Z型、其混合物、其药物上可接受的盐。
6.权利要求3的化合物，具有如下通式：
Figure A2005800152330004C2
其N1-氧化物、外消旋混合物、其单一对映体、其单一非对映异构体、其E和Z型、其混合物、其药物上可接受的盐。
7.权利要求4的化合物，具有如下通式：
Figure A2005800152330005C1
其N1-氧化物、外消旋混合物、其单一对映体、其单一非对映异构体、其E和Z型、其混合物、其药物上可接受的盐。
8.制备权利要求1-7的化合物的方法，如下进行：
7-CP-CH＝N-(O)m-R2-Z1-X1+Y1
其中7-CP表示7-取代的喜树碱的多环结构，且Z1、X1和Y1分别表示如通式I中所定义的基团Z、X和Y，其可选地适当官能化和/或被保护。
9.药物组合物，含有作为活性成分的至少一种权利要求1-7的化合物与至少一种药物上可接受的赋形剂和/或载体的混合物。
10.权利要求1-7的化合物在制备药物中的应用。
11.权利要求1-7的化合物在制备被赋予拓扑异构酶1抑制活性的药物中的应用。
12.权利要求11的应用，用于制备具有抗癌活性的药物。
13.权利要求12的应用，其中所述的药物用于治疗非小细胞和小细胞肺癌、结肠直肠肿瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤和神经母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、胃肠癌、肝癌、卡波西肉瘤、肾癌、肉瘤和骨肉瘤、睾丸癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、膀胱癌和头颈癌。
14.权利要求1-7的化合物在制备用于预防或治疗转移形式的药物中的应用。
15.权利要求11的应用，用于制备具有抗寄生虫活性的药物。
16.权利要求11的应用，用于制备具有抗病毒活性的药物。
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