KR20070012524A

KR20070012524A - 인테그린 억제 활성을 갖는 사이클로펩티드 유도체

Info

Publication number: KR20070012524A
Application number: KR1020067025228A
Authority: KR
Inventors: 알마 달 포쪼; 세르지오 펜코; 지우세페 지아니니; 마리아 오르넬라 틴티; 클라우디오 피사노; 로레다나 베쉬; 밍 홍 니
Original assignee: 시그마타우 인두스트리에 파르마슈티케 리우니테 에스.피.에이.
Priority date: 2004-05-13
Filing date: 2005-05-04
Publication date: 2007-01-25
Also published as: MXPA06012887A; HRP20100301T1; BRPI0510985A; WO2005111064A8; PL1751176T3; ITRM20040239A1; CA2562576A1; TW200606178A; CN1953990A; PT1751176E; AR048957A1; DK1751176T3; AU2005243418A1; ATE460426T1; RS51300B; CY1110039T1; SI1751176T1; DE602005019876D1; EP1751176B1; US20070178045A1

Abstract

c(R₁-Arg-Gly-Asp-R₂)(이때 상기 다양한 그룹들의 의미는 명세서에 개시된 바와 같다)인 화학식 I의 화합물을 개시하며, 상기 화합물은 인테그린 억제제, 및 특히 α_vß₃ 및 α_vß₅ 계열의 인테그린의 억제제이고, 따라서 특히 비정상적인 혈관형성이 근원인 질병, 예를 들어 망막병증, 급성 신부전, 골다공증 및 전이의 치료를 위한 약제로서 유용하다. 본 발명에 개시된 화합물들은 적합하게 표지될 때 특히 작은 종양 덩어리 및 동맥 폐쇄 사건의 검출을 위한 진단제로서, 및 표적화된 약물 벡터로서 또한 유용하다.

인테그린 억제제, 망막병증, 급성 신부전, 골다공증 및 전이

Description

인테그린 억제 활성을 갖는 사이클로펩티드 유도체{CYCLOPEPTIDE DERIVATIVES WITH ANTI-INTEGRIN ACTIVITY}

본 발명의 목적은 약제로서 유용한 화합물, 그의 제조 방법, 상기를 함유하는 약학 조성물, 및 비정상적인 혈관형성으로 인한 질병의 치료에 유용한 약제의 제조를 위한 그의 용도이다.

종양 환자들에서, 화학요법은 많은 경우에, 전이된 암에 유일하게 선택되는 치료이다. 항암 요법의 효능을 개선시키고 그 독성을 감소시키기 위한 하나의 접근법은 종양 혈관형성에 관여하는 수용체들을 표적으로 하는 약물을 투여하는 것이다.

인테그린은 종양 혈관형성의 과정 및 전이 과정 모두에서 하나의 세포와 다른 세포 사이, 및 세포와 세포외 기질 사이의 결합에 관여한다. 특히, α_vß₃ 및 α_vß₅ 인테그린 수용체는 인간 종양 혈관의 내피 세포 및 종양 세포 자체에서 강하게 발현된다.

종양 혈관화는 현재 일반적으로 항암 요법에 유망한 표적인 것으로 간주되고 있다[H. Jin and J. Varner, Br. J. Cancer, 2004, 90(3):561-5].

최근 수년간, 다수의 연구들은 Arg-Gly-Asp 서열을 함유하는 사이클로펩티드 유도체가 인테그린 수용체에 대해 높은 친화성을 제공함을 입증하였다.

사이클릭 RGD-펩티드를 사용한 종양 진행 및 혈관신생의 억제가 연구중이며, 일부 연구는 이미 유망한 결과를 입증하였다.

예를 들어 최근에 래트에서 화학적으로 유발시킨 결장 암종에서, 최근의 인테그린-차단 펩티드에 의한 치료로, 적어도 부분적으로 혈관신생의 억제에 의해 매개되는 것으로 여겨지는 종양 성장의 억제 및 종양 부하의 감소가 발생함이 입증되었다(Haier J. et al, Clin Exp Metastasis. 2002;19(8):665-72). 따라서, α_vß₃-인테그린-수용체 억제는 암에 양호한 치료 전략인 것으로 보인다.

더욱이 상기 사이클릭 RGD 펩티드는 또한 표적 세포(예를 들어 HIV) 내로의 침투를 위해 세포 인테그린을 사용하는 심혈관 질병, 골다공증 및 바이러스 감염에 흥미로운 치료 용도를 가질 수 있다. 상기와 같은 화합물은 화학요법 약물, 특히 항암 약물을, 인테그린 수용체를 높은 수준으로 발현하는 세포로 향하게 하는데 유용하다. 이러한 식으로, 화학요법제에 의해 유발되는 부작용이 감소되면서 효능있는 치료 반응이 성취된다.

발명의 요약

본 발명은 인테그린 억제 활성이 부여된 사이클로펩티드 유도체, 및 특히 본 발명에 개시된 모든 화합물들에서 일정한 3 개의 아미노산 서열 이외에, 질소 또는 Cα상에서, 뜻밖에도 인테그린 α_vß₃ 및 α_vß₅ 에 대한 결합을 향상시키는 작용기를 갖는 말단 쇄 또는 작용 그룹인 잔기로 치환될 수 있는 천연 및 비 천연 아미노산인 다른 2 개의 잔기를 함유하는 사이클릭 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법, 질병, 예를 들어 망막병증, 급성 신부전, 골다공증 및 전이의 치료에 유용한 작용을 갖는 약제로서, 특히 인테그린 수용체 억제제로서 그의 용도, 및 상기를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 화합물은 또한 적합하게 표지되는 경우 작은 종양 덩어리 및 동맥 폐쇄 사건의 검출을 위한 진단제로서도 유용하다.

본 발명에 따른 사이클로펩티드에 의해 전달되는 약물은 세포독성제 부류, 예를 들어 알킬화제(사이클로포스파미드, 니트로소우레아), 대사길항물질(메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드), 천연 생성물(독소루비신 및 구조 동족체, 액티노마이신 D, 블레오마이신, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신 및 미토마이신 C)에 속한다.

α_vß₃ 및 α_vß₅ 인테그린 수용체 화합물 및 그의 용도에 관한 현 기술 수준의 총 망라된 설명에 대해서 독자는 본 출원인 이름의 WO 2004/011487을 참조하시오(과학적 배경과 관련하여서도 또한 명백히 참고가 된다).

놀랍게도, 본 발명의 생성 분자는 인테그린에 대한 친화성을 입증하며, 상기 친화성은 때때로 동일한 부류에 속하는 사이클로펩티드에 대해 관찰되고 문헌[H. Kessler, et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3033-40]에 개시된 것보다 상당히 더 크다.

따라서, 본 발명은 공지 화합물보다 훨씬 더 효능 있는 α_vß₃ 및 α_vß₅ 유형의 인테그린 억제제를 제공한다.

따라서, 본 발명의 주목적은 하기 화학식 I의 화합물, 그의 라세미 혼합물, 단일 에난티오머, 단일 부분입체이성질체, 및 약학적으로 허용 가능한 염이다:

c(R₁-Arg-Gly-Asp-R₂)

상기 식에서,

-c는 사이클릭을 의미하고;

-R₁은 화학식 -NX-CY(Z)-CO-를 갖는 아미노산이고; 이때

-X는 H, 선형 또는 분지된 C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₀ 아릴, 벤질, (CH₂)_n-COR, (CH₂)_n-NHR', 4-COR-벤질, 4-(CH₂-NHR')-벤질로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n은 1 내지 5의 정수이고;

-Y는 H, CH_mF_m'로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 여기에서 m + m' = 3이고, 이때 m 및 m'는 0 내지 3의 정수이고;

-Z는 H, 선형 또는 분지된 C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₀ 아릴, (CH₂)_n1-COR, (CH₂)_n1-NHR', 4-COR-벤질, 4-NHR'-(CH₂)_n1-벤질로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n₁은 0 내지 5의 정수이고;

-R은 W, OW, N[CH₂-CO-NH-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-COOW]₂, NH-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-COOW, NW-(CH₂-CH₂NH)_n2-CH₂-CH₂NHW로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n₂는 1 내지 22의 정수이고;

-W는 H, C₁-C₃ 알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

-R'는 H, CO-(CH₂)_n2-COOW, CO-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-NHW, CO-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-COOW로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n₂는 상기 보고된 의미를 갖고;

-R₂는 D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-2-나프틸-Ala, D-4-3급-부틸-Phe, D-4,4¹-비페닐-Ala, D-4-CF₃-Phe, D-4-아세틸아민-Phe로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

화학식 I 화합물의 바람직한 예는 하기와 같다:

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad);

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH₂)₂COOH];

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH₂-(O-CH₂CH₂)₂-O-CH₂-COOH];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH₂-(OCH₂CH₂)₈-O-CH₂-COOH];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(카복시펜틸렌)-Val];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(알릴옥시카보닐펜틸렌)-Val]; 및

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH₂-(OCH₂-CH₂)₃OCH₃)].

약학적으로 허용 가능한 염이 의미하는 것은 독성 또는 부작용을 발생시키지 않는 임의의 염이다.

상기와 같은 염들은 약리학자 및 제약 기술 전문가에게 널리 공지되어 있다.

화학식 I의 화합물을 본 발명에서 하기에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있으며 본 발명에 따른 바람직한 화합물들로 예시될 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 추가의 목적을 구성한다.

화학식 I의 화합물을 실험 부분의 실시예에 개시된 바와 같이, 통상적인 펩티드 합성 기법에 따라, 비-천연 아미노산 잔기의 합성 후에, 제조할 수 있다. 상기 펩티드 합성을 고체상 또는 용액으로 수행할 수 있다. 일단 적합하게 보호된 선형 펩티드가 제조되었으면, 상기를 환화시킨다.

본 발명에 개시된 화합물은 인테그린 억제제이며 따라서, 특히 예를 들어 방사선 요법의 결과로서 세포가 천연 및 유도된 방식 모두로 인테그린을 과발현하는 종양; 염증 질병(예를 들어 류마티스성 관절염), 비정상적인 혈관형성이 근원인 질병, 예를 들어 종양, 망막병증, 눈 질환, 급성 신부전, 골다공증 및 전이, 심혈관 질병(발작 및 심장 손상), 및 경피 경관 관상동맥 성형술 후의 재협착증의 치료를 위한 암 치료제, 진단 영상제, 및 표적화된 약물 벡터(G.C. Tucker 2003 Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 722-31)로서 유용하다(J.S. Kerr et al., Drug News Perspect 2001, 14, 143 50). 본 발명에 개시된 화합물은 또한 적합하게 표지될 때, 특히 작은 종양 덩어리 및 동맥 폐쇄 사건의 검출을 위한 진단제로서 유용하다. 인테그린은 새로운 혈관의 형성을 위한 내피 세포의 이동에 관여하므로(R.H. Haubner et al., 2003 Q. J. Nucl. Med. 47 189-99), 다양한 길항물질들을 (18)F, (111)In, (99)Tc, (90)Y 및 다수의 요오드 동위원소들로 표지하여 종양-유발된 혈관형성을 모니터하였다. α_vß₃ 인테그린 발현이 활성화된 내피 세포 및 혈관 손상 후 혈관 평활근 세포에서 증가되는 한, 고-친화성 방사성표지된 펩티드를 α_vß₃ 인테그린에 대한 표적으로서 및 혈관 손상 영역을 영상화하기 위해서 사용할 수 있다. 이러한 접근법은 자기 공명 및 전산화 단층 촬영 방법의 단점들, 예를 들어 생물학적으로 적합한 리간드 및 영상화를 위한 혈액 콘트라스트제의 결여를 극복한다(F.G. Blankenberg et al. 2002 Am. J. Cardiov. Drugs 2, 357-65).

약학 조성물은 유효 성분으로서 하나 이상의 화학식 I의 화합물을 예를 들어 중요한 치료 효과를 생성시키는 양으로 함유한다. 본 발명에 따른 조성물들은 전적으로 통상적이며 제약 산업에서 통상적으로 실행되는 방법을 사용하여 수득된다. 선택된 투여 경로에 따라, 상기 조성물은 고체 또는 액체 형일 것이며, 경구, 비 경구 또는 정맥 내 투여에 적합할 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 유효 성분과 함께 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 부형제를 함유한다. 제형화 보조제, 예를 들어 용해제, 분산제, 현탁제 및 유화제가 특히 유용할 수 있다.

화학식 I의 화합물을 또한 다른 항암 약물, 또는 기생충 또는 바이러스 억제 활성을 갖는 다른 약물들과 함께 별도의 형태 및 단일 투여형 모두로 사용할 수 있다.

본 발명의 목적인 약제를 또한 기생충 및 아데노바이러스 질병의 치료에 사용한다. 병원체의 세포 내로의 침입은 혈장 막의 직접적인 침투, 클라트린-매개된 세포 내 이입, 작은 함몰 세포 내 이입, 세포 흡수 작용 또는 대량 세포 흡수 작용에 의해 일어난다. 대량 세포 흡수 작용은 인테그린의 관여를 요한다(O. Meier et al., 2003, J. Gene Med. 5, 451-62). 기생충 억제 활성은 인테그린 매개된 결합의 억제, 및 예를 들어 트립파노소마 크루지에 의해 유발되는 염증의 억제에서 케모킨 수용체에 의해 유도되는 백혈구의 보충에 의해 발휘될 수 있다. 부수적으로, 샤가스 병의 급성기에서, 염증 과정의 유발은 숙주/기생충 평형의 표적 조직에서 트립파노소마 크루지의 억제에 중요하다(J. Lannes-Vieira, 2003, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 98, 299-304).

하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다.

사용되는 약어는 하기와 같다:

Aad(아미노아디프산);

Amb(아미노메틸벤질);

Amp(아미노메틸페닐알라닌);

Boc(3급-부톡시카보닐);

CSA(캄포설폰산);

CTH(촉매 전달 수소화);

DBU(1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔);

DCC(디사이클로헥실카보디이미드);

DCM(디클로로메탄);

DEAD(디에틸 아세틸렌디카복실레이트);

DIEA(디이소프로필에틸아민);

DMF(디메틸포름아미드);

EMEM(이글 염이 보충된 이글의 최소 필수 배지);

Fm(플루오레닐메틸);

Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐);

HOBT(하이드록시벤조트리아졸);

NMP(N-메틸-피롤리돈);

oNBS(2-니트로벤젠설포네이트);

PBS(포스페이트 완충 염수);

Pht(프탈로일);

Pmc(펜타메틸크로만-6-설포닐);

SDS(포스페이트 완충 염수);

TBTU(테트라플루오로보레이트-O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸유로늄);

TEA(트리에틸아민);

Teg(트리에틸렌글리콜 모노메틸에테르); 및

TFA(트리플루오로아세트산).

실시예 1

c( Arg - Gly - Asp -D- Phe - Amp )- ST2581 의 합성

1.587 몰의 Fmoc-Gly-Res(Res = Sasrin Resin(등록상표), Bachem)를 교반 하에서 DMF 75 ㎖에 30 분간 현탁시키고, 그 후에 피페리딘 18 ㎖을 가하고, 추가로 30 분간 계속 교반하였다. 여과 및 DMF로 세척한 수지를 NMP(N-메틸-피롤리돈) 50 ㎖에 15 분간 현탁하고, 그 후에 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, HOBT, TBTU 및 DIEA를 가하고(각각 3.174 밀리몰); 2 시간 교반 후에, 상기 현탁액을 여과하고 DMF로 세척하였다. 피페리딘으로 탈보호시킨 후에, 상기 커플링을 다른 아미노산, 즉: Fmoc-Amp(Cbz)-OH, Fmoc-D-Phe-OH 및 Fmoc-Asp(OtBu)-OH를 차례로 사용하여 매번 상술한 바와 같이 반복 수행하였다. 상기 Fmoc-N-말단의 최종 탈보호 후에, 선형 펜타펩티드를 DCM 중의 1% TFA 45 ㎖에 의해 상기 수지로부터 방출시켰다. 이를 대략 1 ℓ의 CH₃CN에 용해시키고, 4.761 밀리몰의 HOBT 및 TBTU, 및 10 ㎖의 DIEA를 가하고; 상기 용액을 30 분간 계속 교반하였으며, 용매를 작은 부피로 증발시키고 물을 사용하여 생성물의 침전을 완료시켰다.

여과된 조 생성물을 티오아니솔(50 당량) 및 TFA(270 당량)에 용해시키고 실온에서 밤새 교반하였다.

반응 혼합물을 건조시키고 잔사를 최소량의 TFA에 용해시키고 과잉의 에틸 에테르로 재침전시켰다. 최종적으로, 조 생성물을 RP-HPLC(컬럼: Alltima C-18, Alltech; 이동 상: 수 중 17% CH₃CN + 0.1% TFA)에 의해 정제시켰다.

분석 HPLC: 컬럼: Purosphere STAR, Merck; 이동 상: 수 중 15% CH₃CN + 0.1% TFA: Rt = 12.15 분.

분자 질량 = 652

실시예 2

c[ Arg - Gly - Asp -D- Phe - Aad ) - ST2650 의 합성

0.69 밀리몰의 Fmoc-Gly-Res를 실시예 1에 개시된 바와 똑같이 처리하였으나, 단 이 경우 세 번째 및 네 번째 아미노산을 디펩티드 Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH의 형태로 가하였다. CTH에 의해 탈보호하고 조 생성물을 예비 RP-HPLC(이동 상: 수 중 66% CH₃CN + 0.1% TFA; Rt = 17.29 분)에 의해 정제시킨 후에, 순수한 탈보호된 펩티드 187 ㎎을 수득하였다. 상기를 TFA에 용해시키고, 실온에서 1 시간 후에, 상기 용액을 건조시켰다. 잔사를 최소량의 TFA에 재용해시키고 과잉에 에틸 에테르로 침전시켰다. 상기 과정을 등명한 최종 생성물이 수득될 때까지 반복하였다.

분석 RP-HPLC(수 중 17% CH₃CN + 0.1% TFA), Rt = 12.52 분.

분자 질량 = 619

실시예 3

c( Arg - Gly - Asp -D- Phe -N- Me - Amp ) - ST2700 의 합성

환류시킨 무수 톨루엔 중의 Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH₂)-COOH의 현탁액에 2 당량의 CSA 및 20 당량의 파라포름알데히드를 가하고, 15 분 간격으로 4 회 분취량으로 나누었다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 톨루엔 120 ㎖로 희석하고 5% NaHCO₃ 및 물로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후에, 잔사를 CHCl₃ 15 ㎖ + TFA 15 ㎖ + Et₃SiH 700 ㎕에 용해시키고; 상기 혼합물을 암실에서 42 시간 동안 교반 방치하였다. 용매를 증발시킨 후에, 상기 잔사를 실리카겔 상에서 여과에 의해 정제시켰다. 전체 수율: 90%.

선형 펩티드를 상술한 바와 같이 제조된, 세 번째 아미노산으로서 Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH₂)-COOH를 삽입하여, 실시예 1에 개시된 바와 같이 고체상으로 합성하였다. 이 경우에, 수지상의 N-Fmoc-말단의 탈보호를 DMF 중의 용액 중의 30% 디이소프로필아민(300 당량)으로 수행하였다(프탈이미드의 존재로 인해). 환화 후에, 펩티드 500 ㎎을 절대 EtOH 10 ㎖에 고온 용해시키고, 여기에 에탄올 중의 1M NH₂-NH₂·H₂O 용액 0.9 ㎖을 가하였다. 2 시간 동안 환류 하에서 가열한 후에, 상기 용매를 증발시키고 잔사를 DCM 10 ㎖ + Na₂CO₃ 10 ㎖의 용액에 격렬히 진탕하면서 용해시켰다. 유기 상을 증발시킨 후에, 조 잔사를 예비 RP-HPLC(이동 상: 수 중 17% CH₃CN + 0.1% TFA)에 의해 정제시켰다.

분석 RP-HPLC(수 중 16% CH₃CN + 0.1% TFA), Rt = 11.7 분

분자 질량 = 665

실시예 4

c[ Arg - Gly - Asp -D- Phe - Amp -( CH ₂ ) ₂ COOH - ST2649 의 합성

사이클로펩티드 c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]·TFA(실시예 1에 개시된 바와 같이 제조됨) 120 ㎎을 DCM-DMF 2:1의 혼합물 3.6 ㎖에 화학량론적 양의 TEA 및 숙신산 무수물과 함께 용해시켰다. 1 시간 후에 반응 혼합물을 DCM 30 ㎖로 희석하고 물로 세척하였다. 유기 상을 건조 및 농축시켜 헤미숙시네이트 100 ㎎의 잔사를 수득하였다. 상기 생성물을 TFA로 완전히 탈보호시키고 이어서 상기 실시예에 이미 개시한 바와 같이, 첫 번째 정제시켰다. 이어서 상기를 예비 RP-HPLC(수 중 23% CH₃CN + 0.1% TFA)에 의해 추가로 정제시켰다.

분석학적 RP-HPLC: (수 중 20% CH₃CN + 0.1% TFA), Rt = 14.66 분

분자 질량 = 751

실시예 5

c( Arg - Gly - Asp -D- Phe -N- Amb - Gly ) - ST2701 의 합성

THF 6 ㎖ 중의 Boc-일보호된 p-자일릴렌디아민의 1 내지 22 밀리몰 용액에 TEA 1.83 밀리몰을 가하고, THF 2 ㎖ 중의 벤질 브로모아세테이트 1.22 밀리몰의 용액을 적가하였다. 상기 혼합물을 밤새 교반 하에 방치시키고, 그 후에 용매를 증발시키고 잔사를 플래시 컬럼(CHCl₃-EtOAc, 9:1) 상에서 정제시켰다. 0.69 밀리몰의 N-(4-Boc-NH-CH₂-벤질)-글리신 벤질에스테르를 수득하였다.

Fmoc-D-Phe-OH 250 ㎎을 DCM 27 ㎖에 용해시키고 디포스젠 40 ㎕ 및 sym-콜리딘 230 ㎕를 가하고; 15 분 후에 앞서 제조된 에스테르 190 ㎎을 가하고, DCM 3 ㎖에 용해시켰다. 3 시간 후에, 80 ㎕의 N-Me-피페라진을 반응 혼합물에 가하고 10 분간 교반하고, 그 후에 상기 혼합물을 DCM 10 ㎖로 희석하고, 물, 0.5N HCl, 물, 5% NaHCO₃ 및 물로 추출을 수행하였다. 용매를 증발시킨 후에, 잔사를 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피(DCM-EtOAc, 9:1)에 의해 정제시켰다. 수율: 80%.

MeOH 6 ㎖에 용해시킨, 상기와 같이 수득된 생성물 100 ㎎에 AcOH 76 ㎕ 및HCOONH₄ 42 ㎎을 가하고, 상기 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 10% Pd/C 50 ㎎을 가하였다. 30 분 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 상에서 여과하였다. 여액을 건조시키고 플래시 컬럼(CHCl₃-MeOH 9:1) 상에서 정제시켰다. 수율: 90%.

상기와 같이 수득된 생성물 190 ㎎을 TFA 1.2 ㎖에 용해시키고 건조시키고(Boc의 탈보호); 잔사를 0 ℃로 냉각시킨 10% Na₂CO₃ 9 ㎖ + 디옥산 6 ㎖에 재 용해시키고 디옥산 3 ㎖로 희석시킨 벤질옥시카보닐 클로라이드 120 ㎕의 용액을 적가하였다. 실온에서 1 시간 교반 후에, 증발을 진공 하에서 작은 부피로 수행하였으며, 그 후에 상기 혼합물을 물로 희석하고, pH를 HCl로 1로 감소시키고 EtOAc로 추출을 수행하였다. 상기 용매의 증발 후에, 잔사를 CHCl₃-MeOH(8:2)로 세척하면서 실리카겔 상에서 여과에 의해 정제시켰다. 순수한 디펩티드 수율: 82%.

Fmoc-Gly-Res 0.69 밀리몰을 실시예 1에 개시된 바와 같이 처리하였다. Arg 후에, 앞서 제조된 디펩티드 Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH₂-벤질)-Gly를 차례로 가하였다. 조 생성물을 티오아니솔 및 TFA에 용해시키고 실온에서 4.5 시간 동안 교반하였다. 첫 번째 정제를 다른 실시예들에 개시된 바와 같이 수행한 반면, 최종 정제는 예비 HPLC(이동 상: 수 중 16% CH₃CN + 0.1% TFA)에 의해 수행하였다.

분석 RP-HPLC(수 중 15% CH₃CN + 0.1% TFA), Rt = 7.67 분.

분자 질량 = 652

실시예 6

c[ Arg - Gly - Asp -D- Phe -N- Amp -( CO - CH ₂ -( OCH ₂ CH ₂ ) ₂ -O- CH ₂ - COOH ] - ST2661 의 합성

3:1 DCM-DMF 혼합물 4 ㎖ 중의 c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)·TFA(실시예 1에 개시된 바와 같이 수득됨) 200 ㎎ 용액에 실질적으로 과잉의 글리콜 이산을 가하였다. DIEA(3 당량) 및 DCC(2 당량)를 상기 동일 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 밤새 교반하고, 그 후에 상기를 DCM으로 희석하고 물로 세척하였다.

조 생성물을 유기상을 증발시킴으로써 회수하고 플래시 크로마토그래피(이동 상: CHCl₃-MeOH 7:3 + 1% AcOH)에 의해 정제시키고; 생성물을 함유하는 분획들을 모으고, 물로 세척하고, 탈수시키고 건조시켜, 순수한 생성물 157 ㎎의 잔사를 수득하였다. 이를 TFA로 1.5 시간 동안 처리하고 다른 실시예들에 개시된 바와 같이 세척하고, 그 후에 최종 정제를 예비 HPLC(이동 상: 수 중 22% CH₃CN + 0.1% TFA)에 의해 수행하였다.

분석학적 RP-HPLC: (수 중 23% CH₃CN + 0.1% TFA); Rt = 10 분

분자 질량 = 855

실시예 7

c[ Arg - Gly - Asp -D- Phe - Amp -( CO - CH ₂ -( OCH ₂ CH ₂ ) ₈ -O- CH ₂ - COOH ] - ST2874 의 합성

실시예 1에 개시된 펩티드 150 ㎎ 및 PEG 600-COOFm(1 당량) + HOAT(1.5 당량) + DIEA(2 당량) 110 ㎎을 DCM-DMF(2:1)의 혼합물 6 ㎖에 용해시키고, 상기 용액을 0 ℃로 냉각시키고; 1.5 당량의 DCC를 가하고 상기 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시킨 후에, 잔사를 플래시 크로마토그래피 컬럼(단계 I: CHCl₃-MeOH, 96:4; 단계 II: CHCl₃-MeOH, 90:10) 상에서 정제시켰다. 플루오레닐메틸에스테르의 탈보호를 위해서, 상기 에스테르 36 ㎎을 CHCl₃ 1.8 ㎖에 용해시키고, 피페리딘 41 ㎕(20 당량)를 가하고 실온에서 밤새 방치시켰다. 용매를 증발시킨 후에 조 잔사를 예비 HPLC(수 중 46% CH₃CN + 0.1% TFA)에 의해 정제시켰다. 상기와 같이 수득된 순수한 생성물을 TFA에 용해시키고 실온에서 2 시간 방치시켰다. 작은 부피로 감소시킨 후에, 완전히 탈보호된 생성물을 과잉의 에틸 에테르에 의해 침전시켰다.

분석학적 RP-HPLC: (수 중 26% CH₃CN + 0.1% TFA); Rt = 7.89-15.83 분.

분자 질량 = 1119.

실시예 8

c[ Arg - Gly - Asp -D- Phe -N( 카복시펜틸렌 )- Val )] ST2956 [및 알릴 유도체: ST2957 ]의 합성

Arg(Pmc)-Gly 서열을 상술한 방법에 따라 고상 합성에 의해 수득한 반면, 구성 블록 oNbs-N[CH₂)₅-COOAll]Val-OH는 하기의 방법에 의해 도입시켰다:

구성 블록(3 당량)(하기 개시된 합성) 및 1-브로모-N,N-2-트리메틸-1-프로페닐아민(4.5 당량)의 혼합물을 불활성 분위기(아르곤) 하에서 DMC에 용해시키고, 실온에서 10 분간 계속 교반하였다.

이어서 상기 혼합물을 불활성 분위기 하에서 콜리딘(12 당량)과 함께 DCM 중의 수지에 가하였다. 2 시간 후에(카이저 시험 음성), 상기 수지를 여과하고 DCM e DMF로 풍부히 세척하고, 감압 하에서 건조시켰다.

2-니트로벤젠 설포닐(oNbs) 잔기의 탈보호를 수행하기 위해서, DMF 중의 2-머캅토에탄올(10 당량) + DBU(5 당량)를 상기 수지에 가하였다. 30 분 후에 동일한 시약을 다시 가하고, 2 시간 후에, 절단을 완성하였다(HPLC를 통해 검사함). 상기 수지를 여과하고 DCM 및 DMF로 세척하였다.

다음 커플링의 합성 경로는 동일하였으나, 단 N3-D-Phe-Br을 사용하였다. 상응하는 α-아지드 산을 상응하는 아미노산으로부터 출발하여 "디아조전달" 반응에 의해 제조하였다[Alper et al., Tetrahedron Lett.(1996)37, 6029]. 상기 아 지드 잔기를 DMF 중의 SnCl₄(10 당량) + 티오페놀(40 당량) 및 TEA(10 당량)의 용액을 사용하여 환원시켰다. 상기와 같은 용액을 DMF 중의 수지에 가하고 교반 하에서 1 시간 동안 방치시켰다. 이어서 생성 현탁액을 2N NaOH로 5 분간 처리하고, 여과하고 물, DMF, MeOH, DMF e DCM으로 세척하였다.

후속적으로, Asp 축합, Fmoc 그룹의 후속 탈보호, 수지의 절단 및 펩티드의 환화 조건은 펩티드 화학 합성에 통상적으로 사용되는 것이었다.

원료 물질을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

수득된 펩티드를 먼저 Pd(Ph₃P)₄, 이어서 TFA로 단계적으로 탈보호시켰다.

최종 생성물을 TFA/디에틸에테르에 의한 침전에 의해 정제시켰다.

실시예 8a

oNbs -[N( CH ₂ ) ₅ - COOAll ] Val - OH 구성 블록 합성

하이드록시산 HO-(CH₂)₅COOH 및 절대 에탄올의 용액에 Cs₂CO₃(1 당량)를 가하였다. 상기 혼합물을 염이 완전히 용해될 때까지(약 40 분) 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고 잔사를 백색 고체 결정이 수득될 때까지 벤젠으로 건조시켰다. DMF에 용해시킨 상기 고체에 알릴 브로마이드(11 당량)를 가하고 2 시간 동안 교반하였다. 추가로 알릴 브로마이드를 가하고(11 당량) 실온에서 밤새 교반하였다. 원료 물질을 플래시 크로마토그래피(헥산/AcOEt, 1:1)에 의해 정제시켰다. 수율 70%.

10 ℃에서, THF 중의 oNbs-Val-OtBu 용액에 하이드록시에스테르(1.05 당량) 및 트리페닐포스핀(1.5 당량)을 가하였다. -20 ℃에서 4.08 ㎖의 DEAD(톨루엔 중의 40%)를 가하였다. 실온에서 48 시간 동안 교반한 후에, 용매를 증발시키고 원료 물질을 예비 RP-HPLC(CH₃CN/H₂O/TFA: 75 - 25 - 0.1)에 의해 정제시켰다. 수율 70%.

TFA로 3급-부틸 에스테르를 최종 탈보호시킨 후에, 목적하는 구성 블록을 수득하였다.

실시예 9

c[ Arg - Gly - Asp -D- Phe -N-Amp( CO - CH ₂ -( OCH ₂ CH ₂ ) ₃ - OCH ₃ )] - ST2597 의 합성

상기 펩티드를 실시예 1에 개시된 바와 같이 고상에 의해 합성하였으나, 단 세 번째 아미노산으로서 Fmoc-Amp(CO-CH₂-Teg)-OH를 삽입하였으며, 이를 하기와 같이 제조하였다:

CH₃O(CH₂CH₂O)₃-CH₂-COOH 570 ㎎, 2,3,4,5-펜타플루오로페놀(Pfp) 473 ㎎ 및 피리딘 207 ㎕를 DCM 11.4 ㎖로 용해시켰다. 0 ℃로 냉각시킨 상기 용액에 DCC 637 ㎎을 가하고 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 여과하고 여액을 물, 1N HCl, 물, 5% NaHCO₃ 및 물로 세척한 후에, 유기 용액을 건조시켜 원료 에스테르 984 ㎎을 제공하였다.

Fmoc-아미노메틸페닐알라닌 500 ㎎의 현탁액에 DCM 15 ㎖ 중의 TFA 염, TEA 260 ㎕를 가한 다음 활성화된 에스테르 800 ㎎을 가하고 혼합물을 3 시간 동안 교 반하였다. 조 생성물을 플래시 크로마토그래피에 의해 정제시켜 순수한 구성 블록을 제공하였다.

최종 환상 펩티드를 통상적으로 정제하고 예비 HPLC(수 중 27% CH₃CN + 1% TFA)에 의해 단리하였다, Rt = 12.7 분.

분자 질량 = 855

실시예 10

생물학적 결과

인테그린 α _v ß ₃ 수용체에의 결합

정제된 α_vß₃ 수용체(Chemicon, cat. CC1020)를 0.5 ㎍/㎖의 농도로 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂)에서 희석하였다. 100 ㎕의 분액을 96-웰 플레이트에 가하고 +4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 완충액(50 mM 트리스, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 1% 소 혈청 알부민)으로 1 회 세척하고 이어서 실온에서 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 동일 완충액으로 2 회 세척하고 실온에서 3 시간 동안 경쟁 리간드의 존재 하에서 0.05 nM의 방사성 리간드 [¹²⁵I]에키스타틴(Amersham Pharmacia Biotech)과 배양하였다. 배양의 끝에서, 웰들을 세척하고 감마 계수기(Packard)를 사용하여 방사능을 측정하였다. 상기 리간드의 비-특이적인 결합을 과잉의 저온 에키스타틴(1 μM)의 존재 하에서 측정하였다.

인테그린 α _v ß ₅ 수용체에의 결합

정제된 α_vß₅ 수용체(Chemicon, cat. CC1020)를 1 ㎍/㎖의 농도로 완충액(20 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂)에서 희석하였다. 100 ㎕의 분액을 96-웰 플레이트에 가하고 +4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 완충액(50 mM 트리스, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 1% 소 혈청 알부민)으로 1 회 세척하고 이어서 실온에서 추가로 2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 동일 완충액으로 2 회 세척하고 실온에서 3 시간 동안 경쟁 리간드의 존재 하에서 0.15 nM의 방사성 리간드 [¹²⁵I]에키스타틴(Amersham Pharmacia Biotech)과 배양하였다. 배양의 끝에서, 웰들을 세척하고 감마 계수기(Packard)를 사용하여 방사능을 측정하였다. 비-특이적인 리간드 결합을 과잉의 저온 에키스타틴(1 μM)의 존재 하에서 측정하였다.

IC ₅₀ 매개변수의 평가

비트로넥틴 수용체에 대한 상기 생성물의 친화성을 IC₅₀ 값 ± SD로서, 즉 특이적인 방사성리간드-수용체 결합의 50%를 억제할 수 있는 농도로서 나타내었다. 상기 IC₅₀ 매개변수를 "ALLFIT" 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

결과

조사된 모든 RGD 펩티드는 α_vß₃ 및 α_vß₅ 인테그린 수용체에 대해 나노몰 정도의 IC₅₀ 값으로 현저한 친화성을 나타내었다. 특히, α_vß₃ 인테그린에 대한 에키스타틴 결합의 억제에서 가장 활성인 것은 ST2581(IC₅₀ = 1.7 nM), 이어서 생성물 ST2661 및 ST2700(IC₅₀ = 4 및 7 nM)인 반면, α_vß₅ 인테그린 수용체에 가장 활성인 것은 생성물 ST2650(IC₅₀ = 0.17 nM), 이어서 분자 ST2661 및 ST2700(각각 IC₅₀ = 0.35 및 0.99 nM)이었다.

인테그린의 주요 작용은 세포 간 공간 및 기저 막에서 ECM 단백질에 대한 세포 결합을 매개하는 것이지만, 상기는 또한 세포 이동뿐만 아니라 생존을 촉진하는 세포내 신호를 변환시킨다. 인테그린은 본질적인 효소 활성을 갖는 것이 아니라, 다가 세포외 기질(ECM) 단백질과 회합 후 초점 결합 복합체 중의 연결기 단백질 및 키나제와의 공 군생에 의해 신호전달 경로를 활성화시킨다. 예를 들어 인테그린 연결은 세포자멸사의 억제인자를 활성화시키고 카스파제 활성화를 억제시킴으로써 세포자멸사를 억제한다. 인테그린은 또한 Rho 및 Rac GTPase(구아노신 트리포스파타제)를 활성화시키고 액틴 필라멘트를 상기 막에 고정시킴으로써 세포 이동을 자극한다. 이러한 결합 단백질은 사이클린의 억제를 자극함으로써 세포 주기 가입을 촉진시킨다. 따라서 인테그린 연결은 세포 증식, 생존 및 이동을 촉진하는 신호 변환 연속단계를 지원한다. 대조적으로, 세포 인테그린-리간드 상호작용의 억제는 세포 이동 및 증식을 억제하고 세포자멸사를 유발한다(Jin H. and Varner J. 2004 Br. J. Cancer 90, 561-565).

[표 1]

비트로넥틴 α_vß₃ 및 α_vß₅ 수용체에 대한 RGD 펩티드의 친화성

비트로넥틴에 대한 종양 세포의 결합 분석

A2780 인간 난소 암종 및 PC3 전립선 암종 세포를 10% 소 태아 혈청 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트를 함유하는 RPMI 1640에서 증식시켰다. A498 인간 신장 암종을 10% 소 태아 혈청 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트를 함유하는 EMEM에서 증식시켰다. 상기 세포를 모두 포화된 습도 및 95% 공기 및 5% CO₂의 분위기를 갖는 37 ℃ 배양기에서 유지시켰다.

A2780 세포 주는 높은 수준의 α_vß₅ 인테그린을 발현하고, A498은 높은 수준의 α_vß₃ 인테그린을 발현하며, PC3은 상기 두 인테그린을 모두 낮은 수준으로 발현한다.

세포 결합에 대한 약물의 효과를 시험하기 위해서, 각 종양 세포 주를 적합한 세포 밀도(40000 - 50000 세포/웰)로, 비트로넥틴(5 ㎍/㎖)으로 코팅시킨 96-웰 조직 배양 플레이트 중에서 상이한 농도의 화합물들과 배양하고 3 시간 동안 부착되게 하였다. 상기 시간 후에, 세포를 Ca² ⁺ e Mg² ⁺를 함유하는 PBS로 1 회 세척하였다. 종양 세포를 실온에서 10 분간 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 실온에서 10 분간 1% 톨루이딘으로 염색하였다. 종양 세포를 2차 증류수로 세척하고, 건조시키고 1% SDS로 용해시켰다. 결합 세포의 수를 마이크로플레이트 판독기(Victor2, EG&G Wallac)에서 600 ㎚에서 측정하였다.

비트로넥틴에의 종양 세포 결합에 대한 상기 분자들의 억제 효과를 측정하기 위한 매개변수로서 IC₅₀ 값을 "ALLFIT" 컴퓨터 프로그램을 사용하여 평가하였다. 본 발명에 따라 시험된 화합물들에 대해 수득된 결과를 표 2에 나타낸다.

[표 2]

결합 분석

Claims

하기 화학식 I을 갖는 사이클릭 펩티드, 그의 라세미 혼합물, 단일 에난티오머, 단일 부분입체이성질체, 및 약학적으로 허용 가능한 염:

화학식 I

c(R₁-Arg-Gly-Asp-R₂)

상기 식에서,

-c는 사이클릭을 의미하고;

-R₁은 화학식 -NX-CY(Z)-CO-를 갖는 아미노산이고; 이때

-X는 H, 선형 또는 분지된 C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₀ 아릴, 벤질, (CH₂)_n-COR, (CH₂)_n-NHR', 4-COR-벤질, 4-(CH₂-NHR')-벤질로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n은 1 내지 5의 정수이고;

-Y는 H, CH_mF_m'로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 여기에서 m + m' = 3이고, 이때 m 및 m'는 0 내지 3의 정수이고;

-Z는 H, 선형 또는 분지된 C₁-C₆ 알킬, C₆-C₁₀ 아릴, (CH₂)_n1-COR, (CH₂)_n1-NHR', 4-COR-벤질, 4-NHR'-(CH₂)_n1-벤질로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n₁은 0 내지 5의 정수이고;

-R은 W, OW, N[CH₂-CO-NH-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-COOW]₂, NH-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2- CH₂-COOW, NW-(CH₂-CH₂NH)_n2-CH₂-CH₂NHW로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n₂는 1 내지 22의 정수이고;

-W는 H, C₁-C₃ 알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;

-R'는 H, CO-(CH₂)_n2-COOW, CO-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-NHW, CO-CH₂-O-(CH₂CH₂O)_n2-CH₂-COOW로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 이때 n₂는 상기 보고된 의미를 갖고;

-R₂는 D-Phe, D-Tyr, D-Trp, D-2-나프틸-Ala, D-4-3급-부틸-Phe, D-4,4¹-비페닐-Ala, D-4-CF₃-Phe, D-4-아세틸아민-Phe로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
제 1 항에 있어서,

하기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물:

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad);

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH₂)₂COOH];

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH₂-(O-CH₂CH₂)₂-O-CH₂-COOH];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH₂-(OCH₂CH₂)₈-O-CH₂-COOH];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(카복시펜틸렌)-Val];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-N(알릴옥시카보닐펜틸렌)-Val]; 및

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH₂-(OCH₂-CH₂)₃OCH₃)].
선형 펩티드의 합성 및 그의 후속적인 환화를 포함하는, 제 1 항 또는 제 2 항의 화합물의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,

펩티드의 합성을 고상으로 또는 용액에서 수행하는 방법.
약제의 제조를 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 화합물을 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 비히클과의 혼합물로 함유하는 약학 조성물.
제 6 항에 있어서,

항암제, 기생충 억제제 및 바이러스 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 약물을 별도의 형태로 또는 단일 투여형으로 또한 함유하는 조성물.
인테그린 수용체 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 용도.
제 8 항에 있어서,

약제가 비정상적인 혈관형성으로부터 유래하는 질병의 치료에 유용한 용도.
제 9 항에 있어서,

질병이 천연 및 유도된 방식 모두로 인테그린을 과발현하는 종양, 염증 형태(예를 들어 류마티스성 관절염), 눈병, 망막병증, 급성 신부전, 골다공증 및 전이, 심혈관 질병(발작 및 심장 손상)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
인테그린 억제를 통해 기생충 억제 활성을 갖는 약제의 제조를 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 방사성 표지된 유도체를 함유하는 조성물.
진단제의 제조를 위한 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 방사성 표지된 유도체의 용도.
제 13 항에 있어서,

진단제가 작은 종양 덩어리 또는 동맥 폐쇄 사건의 검출을 위해 사용되는 용도.