CN103588863B - Rgd环肽合成制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了固相多肽合成领域的一种RGD环肽合成制备工艺。新的方法是选用2‑氯三苯甲基氯树脂为载体，先接好第一个侧链羧基带特殊保护基的D天冬氨酸氨基酸，然后把RGD序列肽的直线肽先接好在树脂上，最后一个氨基酸接好后先不用哌啶脱去氨基的保护基FMOC，加入特殊的催化剂把第一个D天冬氨酸的侧链羧基保护基直接在树脂上脱去掉，然后加哌啶把末端氨基酸的氨基保护基FMOC脱去掉，然后加缩合剂直接在树脂上把直线肽的首末端裸露的羧基和氨基脱水缩合以酰胺键的方式形成环肽。最后用切割液直接把环肽从树脂上切割下来。本发明具有工艺先进操作简单、产品收率高和提高合成效率等优点。

Description

RGD环肽合成制备工艺
技术领域
本发明涉及固相多肽合成领域的一种RGD环肽合成制备工艺。
背景技术
环肽是指以氨基酸肽键形成的化合物，根据成环与否分为环肽和直链肽。环肽类化合物具有多方面的生物活性，包括抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗疟、安眠、抑制血小板聚集、降压、抑制酪氨酸酶、抑制环氧化酶、抑制脂质过氧化酶、雌性激素样、免疫抑制等生物活性。以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，在树脂上合成带有R精氨酸、G甘氨酸、D天冬氨酸及其他氨基酸的小分子多肽，并以D天冬氨酸的侧链羧基和序列中最后一个氨基酸的末端氨基以酰胺键的形式首位结合，形成环肽。最后用含三氟乙酸的切割液将此序列环肽从树脂上切割下来，用乙醚沉析法拿到粗品，用HPLC纯化粗肽得到纯品。此方法缺点是只适用于短序列的肽链，多肽序列上必须要有D天冬氨酸或者E谷氨酸，这两个氨基酸带有2个羧基，而且接在2-氯三苯甲基氯树脂上的第一个氨基酸必须是D天冬氨酸或者E谷氨酸，长序列的肽链环化效果稍差。常用的RGD环肽的合成方法是先用固相法在2-氯三苯甲基氯树脂上合成RGD系列直线肽，把最后一个氨基酸末端的氨基保护基FMOC用哌啶脱去掉，然后用含三氟乙醇的切割液把直线肽从树脂上切割下来，此时的直线肽序列的侧链保护基都没被切割掉，然后用缩合剂在溶液里面把直线肽首末端裸露的羧基和氨基脱水缩合以酰胺键的方式形成环肽。然后再用含三氟乙酸的切割液将环肽侧链的保护基切割掉。这种方法相对复杂多了一步全保护切割和在液相里面缩合环化的步骤，而且环肽在溶液里面后期沉析步骤处理相对麻烦，粗品收率不高。
发明内容
本发明的目的是克服现有固相多肽合成工艺中的不足，提供一种操作简单方便，提高产品收率和合成效率的RGD环肽合成制备新工艺。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种RGD环肽合成制备工艺，其特征在于：制备工艺步骤如下：
1)侧链羧基带特殊保护基的D天冬氨酸氨基酸连接：称取2-氯三苯甲基氯树脂放入半自动多肽合成仪反应玻璃柱内，加DMF浸泡溶胀，称取保护氨基酸加入树脂中，加入反应溶液DMF溶剂；鼓氮气溶解氨基酸，加入DIEA催化剂，室温条件下反应1个小时，添加甲醇溶剂反应20分钟，封掉树脂上的反应活性位点；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸天冬氨酸连接在树脂上；
2)加入哌啶溶剂反应15分钟，去除天冬氨酸上的氨基保护基FMOC，用DMF和甲醇溶剂交叉清洗树脂6遍并抽掉；
3)用茚三酮显色法测定氨基酸的含量，取少量树脂，用5％茚三酮乙醇溶液、60％苯酚溶液和吡啶溶液混合液加热至100度，检测树脂显蓝色，说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基；
4)在已接好第一个D天冬氨基酸的树脂上依次连接好RGD序列肽的直线肽，最后一个氨基酸接好后先不用哌啶脱去氨基的保护基FMOC，加入催化剂把第一个D天冬氨酸的侧链羧基保护基直接在树脂上脱去掉，然后加哌啶把末端氨基酸的氨基保护基FMOC脱去掉，然后加缩合剂直接在树脂上把直线肽的首末端裸露的羧基和氨基脱水缩合以酰胺键的方式形成环肽，所述侧链羧基保护基为Oall，所述催化剂为三苯基膦和四(三苯基膦)钯；
将树脂倒出，并加入由95％TFA、2％TIS、2％EDT和1％水组成的切割液，反应4-5个小时，把环肽从树脂上切割下来，反应结束后过滤掉树脂，将收集下来的切割液加入10倍体积的冰乙醚沉析，环肽从切割液中沉析出来，将溶液用离心机离心收集沉淀下来的环肽，并用乙醚清洗3-4遍，沉淀下来的环肽，去除部分杂质和盐分，将乙醚挥干后即可得到环肽粗品，将粗品用HPLC纯化拿到目标环肽纯品，冻干即可得到粉末状的固体环肽纯品。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果效果：
1.工艺合理操作简单；
2.产品收率高；
3.提高合成效率。
附图说明
图1为RGDFK环肽合成步骤示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的说明：
实施例1
合成多肽序列cyclo(RGDfK)：
首尾以酰胺键形成环肽。选用本公司的半自动多肽合成仪，称取适量2-氯三苯甲基氯树脂放入反应玻璃柱内，加适量DMF浸泡溶胀，秤取适量FMOC-Asp(oall)-OH保护氨基酸加入树脂中，加入适量DMF溶剂作为反应溶液，鼓氮气溶解氨基酸，加入适量DIEA催化剂，室温条件下反应1个小时后添加少量甲醇溶剂反应20分钟封掉树脂上的反应活性位点。用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，这样第一个氨基酸天冬氨酸就连接在树脂上了。加入适量哌啶溶剂反应15分钟，去除天冬氨酸上的氨基保护基FMOC，并用DMF和甲醇溶剂交叉清洗树脂6遍并抽掉。取少量树脂用茚三酮法(5％茚三酮乙醇溶液，60％苯酚溶液，吡啶溶液混合液)加热至100度，检测试管内树脂和溶液均变成蓝色，这样第一个氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基。秤取适量第2个FMOC-Gly-OH甘氨酸，缩合剂HBTU加入树脂，加入适量DMF溶剂，鼓氮气溶解氨基酸和缩合剂，加入适量DIEA催化剂。室温反应45分钟后用DMF和甲醇溶剂交叉清洗3-4遍并抽掉溶剂。取少量树脂用茚三酮法检测为树脂本身的颜色不显蓝色即表示反应已通过，如树脂还显示有部分蓝色表示反应没有完全通过需要重新投料再次反应。反应通过加适量哌啶溶剂反应15分钟，去除甘氨酸上的FMOC保护基，并用DMF和甲醇溶剂交叉清洗6遍并抽掉。取少量树脂用茚三酮法检测显蓝色，这样甘氨酸上的氨基就裸露出来，同样的方法依次接上R(FMOC-Arg(pbf)-OH)、K(FMOC-Lys(Boc)-OH)、f(D型FMOC-Phe-OH)氨基酸，最后一个氨基酸f反应结束后，用DMF清洗干净，取少量树脂用茚三酮法检测通过后先不加哌啶去掉FMOC。分别加入适量的三苯基膦和四(三苯基膦)钯，加入适量DMF溶剂，鼓氮气溶解。全程鼓氮气，避光，在树脂上直接反应4个小时后，即可去掉D天冬氨酸侧链的羧基保护基团Oall，抽掉溶剂并用DMF和甲醇溶剂将树脂反复清洗干净，这样D天冬氨酸侧链的羧基保护基oall被去掉，羧基裸露出来。加入适量哌啶溶剂反应15分钟，去除f苯丙氨酸上的氨基保护基FMOC，并用DMF和甲醇溶剂交叉清洗6遍并抽掉。取少量树脂用茚三酮法检测显蓝色，这样D型苯丙氨酸上的氨基裸露出来。加入3倍量量缩合剂HBTU，HOBT和催化剂DIEA，加入适量DMF溶剂，鼓氮气溶解缩合剂。全程鼓氮气在树脂上反应1个小时后抽掉溶剂并用DMF溶剂清洗4-5遍，取少量树脂用茚三酮法检测。树脂不显蓝色为树脂本身的颜色，反应通过。即表示D天冬氨酸侧链的羧基和f苯丙氨酸的氨基已经反应生成稳固的酰胺键，肽链首尾成环。用甲醇把树脂清洗3-4遍并抽干，将树脂倒出并加入适量切割液(95％TFA，2％TIS，2％EDT，1％水)反应4-5个小时把环肽从树脂上切割下来，反应结束后过滤掉树脂，将收集下来的切割液加入10倍体积的冰乙醚沉析，环肽从切割液中沉析出来，将溶液用离心机离心收集沉淀下来的环肽并用乙醚清洗3-4遍沉淀下来的环肽，去除部分杂质和盐分，将乙醚挥干后即可得到环肽粗品。将粗品用HPLC纯化拿到目标环肽纯品，冻干即可得到粉末状的固体环肽纯品。

Claims (1)

1.一种RGD环肽合成制备工艺，其特征在于：制备工艺步骤如下：
1)侧链羧基带特殊保护基的D天冬氨酸氨基酸连接：称取2-氯三苯甲基氯树脂放入半自动多肽合成仪反应玻璃柱内，加DMF浸泡溶胀，称取保护氨基酸加入树脂中，加入反应溶液DMF溶剂；鼓氮气溶解氨基酸，加入DIEA催化剂，室温条件下反应1个小时，添加甲醇溶剂反应20分钟，封掉树脂上的反应活性位点；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸天冬氨酸连接在树脂上；
2)加入哌啶溶剂反应15分钟，去除天冬氨酸上的氨基保护基FMOC，用DMF和甲醇溶剂交叉清洗树脂6遍并抽掉；
3)用茚三酮显色法测定氨基酸的含量，取少量树脂，用5％茚三酮乙醇溶液、60％苯酚溶液和吡啶溶液混合液加热至100度，检测树脂显蓝色，说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基；
4)在已接好第一个D天冬氨酸的树脂上依次连接好RGD序列肽的直线肽，最后一个氨基酸接好后先不用哌啶脱去氨基的保护基FMOC，加入催化剂把第一个D天冬氨酸的侧链羧基保护基直接在树脂上脱去掉，然后加哌啶把末端氨基酸的氨基保护基FMOC脱去掉，然后加缩合剂直接在树脂上把直线肽的首末端裸露的羧基和氨基脱水缩合以酰胺键的方 式形成环肽，所述侧链羧基保护基为Oall，所述催化剂为三苯基膦和四(三苯基膦)钯；
5)将树脂倒出，并加入由95％TFA、2％TIS、2％EDT和1％水组成的切割液，反应4-5个小时，把环肽从树脂上切割下来，反应结束后过滤掉树脂，将收集下来的切割液加入10倍体积的冰乙醚沉析，环肽从切割液中沉析出来，将溶液用离心机离心收集沉淀下来的环肽，并用乙醚清洗3-4遍，沉淀下来的环肽，去除部分杂质和盐分，将乙醚挥干后即可得到环肽粗品，将粗品用HPLC纯化拿到目标环肽纯品，冻干即可得到粉末状的固体环肽纯品。
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