CN105037496B - 一种依替巴肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种依替巴肽的制备方法，包括以Fmoc‑Cys(Trt)树脂为偶联树脂载体，依次偶联接入Fmoc保护的氨基酸、保护氨基酸三肽片段；将依替巴肽树脂使用裂解剂裂解；将还原型依替巴肽在乙腈水溶液中使用氧化剂氧化，氧化后浓缩；将依替巴肽粗品浓缩液纯化、转盐、冷冻干燥后得到依替巴肽精品。本发明的制备方法，可以有效的降低生产成本，提高收率，减少成品中杂质含量。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，具体涉及到一种依替巴肽的制备方法。
背景技术
依替巴肽，别名依非巴特、埃替非巴肽、依非巴肽，英文名为Eptifibatide。
依替巴肽的结构式如式Ⅰ：
分子式为：C35H49N11O9S2
依替巴肽(Eptifibatide)是一种人工合成的含一个巯基丙酸和六个氨基酸残基的环肽。它是一种具有特异针对性的血小板糖蛋白GP II b/IIIa受体拮抗剂，选择性、可逆性抑制血小板聚集的最终共同通路(血浆凝血因凝血因子Ⅰ与GPⅡb/Ⅲa结合)，可逆转因血栓形成而导致的缺血状态。依菲巴特(Eptifibatide)临床上主要用于治疗不稳定性心绞痛，急性心肌梗死，其主要的不良反应是出血，大多数出血为轻中度出血，最主要的出血部位为PCI时血管刺穿部位，脑出血少见。依菲巴特(Eptifibatide)最早由美国CORTherapeuties公司研发，1998年7月以Integrelin为商品名在美国首次上市。
中国专利CN102040652A报道了依替巴肽的一种固液合成法，采按照Fmoc法合成五肽树脂H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-RinkAM，将Trt-Mpa-Har(Boc)2-OH和五肽树脂键合得七肽树脂Trt-Mpa-Har(Boc)2-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-RinkAM，裂解后经碘氧化得依替巴肽粗品，再经离子交换树脂纯化后得依替巴肽。该反应周期长，产品纯度低，不利于大规模生产。
在中国专利CN102584944B中公开了一种依非巴特的制备方法，其过程是在氨基树脂上通过固相偶联合成法依次接入下列序列中相对应的保护氨基酸或片段，得到依非巴特树脂：X-Y-Trp(R1)-Pro-Cys(R2)-氨基树脂；其中X为Mpr(Trt)-Harg；Y为Gly-Asp(OtBu)。在该专利中，将四个保护氨基酸按照顺序位置关系形成两个二肽片段。
现有技术中，偶联时需添加缩合试剂和活化试剂，缩合试剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)。
活化试剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)，优选的为1-羟基苯并三唑(HOBt)。
在上述两篇现有技术的专利文献中，其粗品在纯化前需要进行浓缩，进而减少纯化时间和降低生成成本，现有技术中将粗品置于水相中进行环化和氧化，由于水相浓缩的效率低，且不能够在高温下进行浓缩，现有技术的方法会大大延长生成时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种依替巴肽的制备方法，可以提高产品纯度，缩短生成周期。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种依替巴肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)以Fmoc-Cys(Trt)树脂为偶联树脂载体，使用脱保护试剂处理后，依次偶联接入Fmoc保护的氨基酸和保护氨基酸三肽片段；得到依替巴肽树脂；其中氨基酸包括脯氨酸、色氨酸和天冬氨酸；
其中所述三肽片段为含有-Mpr-Har-Gly-基团的肽片；
所述的保护氨基酸和三肽片段的用量均为所投料树脂总摩尔数的2～4倍；优选为3倍；
依次偶联反应结束和脱去Fmoc保护后经过KaiserTest检测。脱去Fmoc保护的脱保护试剂为PIP/DMF(哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)混合溶液，混合溶液中含哌啶为20％～25％(V/V)。每克氨基树脂使用脱保护试剂10ml～15mL。脱保护次数为两次，第一次脱10～15分钟，第二次脱保护30～35分钟。
作为本发明优选的方案，偶联试剂是DIC/HOBT、PyBOP/HOBT或者DIC/HOAT中的一种；或者是DIC、三乙胺和N-乙基对甲苯胺混合溶液；该混合溶液中摩尔比DIC：三乙胺：N-乙基对甲苯胺为100:2～5:2～5；接单个保护氨基酸优选的偶联试剂为DIC/HOBT；接三肽片段优选的偶联试剂是DIC/HOAT；偶联试剂的用量为Fmoc-Cys(Trt)载体树脂摩尔数的2～4倍；优选的为3倍；所述偶联反应的溶剂是DMF、DCM中的一种；优选为DMF；
(2)将依替巴肽树脂使用裂解剂裂解，得到还原型依替巴肽；
(3)将还原型依替巴肽在乙腈水溶液中使用氧化剂氧化，得到依替巴肽粗品，并将依替巴肽粗品减压浓缩，得到依替巴肽粗品浓缩液；
(4)将所述依替巴肽粗品浓缩液纯化、转盐、冷冻干燥后得到依替巴肽精品。
本发明的优化实施例中，偶联树脂载体为Fmoc-Cys(Trt)载体树脂。
本发明的优化实施例中，三肽片段为Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly；或Mpr(trt)-Har-Gly或Mpr-Har-Gly或Mpr-Har(pbf)-Gly中的一种。
本发明的优化实施例中，裂解剂为三氟醋酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的混合溶剂；混合溶剂中含有TFA90％～95％、EDT1％～4％和TIS1％～4％。每克依替巴肽树脂消耗的裂解剂用量为10～15ml；优选的，每克依替巴肽树脂需要10mL裂解剂。裂解时间为室温条件下2～6小时，优选3小时。
本发明的优化实施例中，在氧化步骤中，氧化剂为饱和碘/甲醇溶液。乙腈水溶液的浓度为40％～80％；还原型依替巴肽的溶液浓度为0.5～5mg/ml；氧化反应时间为2～5小时；用HPLC监控至反应终点。
本发明的优化实施例中，依替巴肽粗品浓缩液采用高效液相色谱法进行纯化，所述纯化的色谱柱为十八烷基键合硅胶；流动相分别为醋酸铵溶液和乙腈溶液。转盐步骤采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈溶液。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明方法直接使用含保护氨基酸片段制备依非巴特，直接避免了[+1Gly]-依非巴特、[-1Gly]-依非巴特等杂质的产生，使纯化难度大幅度减低，保证了产品纯度，所得大于产品纯度99.5％，单一杂质较小，与已有技术相比，本发明工艺具有反应操作简单、反应条件温等特点，具有广泛的实用价值和应用前景。
2、本发明采用已工业化生产的Fmoc-Cys(Trt)载体树脂为起始原料来生产，无需自己通过树脂脱Fmoc基团与Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联来制备载体树脂，缩短了生产依替巴肽的生产工艺步骤，降低了生产成本。
3、本发明采用已工业化生产的三肽片段作为偶联反应的原料，避免了现有技术中在合成前需要单独将三肽片段偶联后进行二次反应，缩短了生产依替巴肽的生产工艺步骤，降低了生产成本。
4、由于氧化反应需要在较低的还原型依替巴肽溶液浓度中进行，成环反应完成以后，反应产物需要浓缩才能进行纯化。、本发明在乙腈水溶液中对还原型依替巴肽进行碘/甲醇溶液氧化成环反应。乙腈可以在40℃下通过减压快速的浓缩除去，而避免了产品降解，缩短了生产周期。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
本发明所使用的缩写的含义列于下表中。
| 缩写 | 中文名称 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| PIP | 哌啶 |
| HOBT | 1-羟基苯并三唑 |
| HOAT | 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 |
| DIC | 二异丙基碳化二亚胺 |
| Py(BOP) | 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷 |
| Cys | 半胱氨酸 |
| Pro | 脯氨酸 |
| Trp | 色氨酸 |
| Asp | 天冬氨酸 |
| Gly | 甘氨酸 |
| Har | 高精氨酸 |
| Mpr | 3-巯基丙酸 |
| Fmoc | 芴甲氧羰基 |
| TFA | 三氟醋酸 |
| pbf | 2，2，4，6，7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺酰基 |
| Trt | 三苯基 |
| OtBu | 氧叔丁基 |
| boc | 叔丁氧羰基 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| EDT | 乙二硫醇 |
本发明使用的氨基酸相对应的保护氨基酸对照表
| 缩写 | 保护氨基酸形式 |
| Cys | Fmoc-Cys(Trt)-OH |
| Pro | Fmoc-Pro-OH |
| Trp | Fmoc-Trp(boc)-OH |
| Asp | Fmoc-Asp(OtBu)-OH |
| 三肽片段1 | Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly |
| 三肽片段2 | Mpr(trt)-Har-Gly |
| 三肽片段3 | Mpr-Har(pbf)-Gly |
依替巴肽的具体合成路线为：
连接第一个氨基酸Pro的反应：
连接第二个氨基酸Trp(boc)的反应：
连接第三个氨基酸Asp(OtBu)的反应：
连接三肽片段的反应：
将肽从树脂上裂解下来，同时去氨基酸侧链保护：
环化：
实施例1
步骤1 Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
将Fmoc-Cys(Trt)载体树脂(0.45mmol/g，50mmol)加入反应器中，用DMF洗涤一次，用DCM溶胀30分钟后。溶胀结束，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将50.6gFmoc-Pro-OH、(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤2 Fomc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤1的Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将78.9g Fmoc-Trp(boc)-OH(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤3 Fomc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤2的Fmoc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将61.7gFmoc-Asp(OtBu)-OH、(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤4 Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤3的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将124.15g Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly-OH、(150mmol)，20.4gHOAt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到依替巴肽树脂167.5g(树脂增重率99.1％)。
步骤5 还原型依替巴肽的制备
将167.5g依替巴肽树脂(50mmol)加入到3000ml圆底烧瓶中，配制裂解试剂1800ml(TFA为1710ml、EDT为27ml，TIS为36ml，H2O为27ml)，将裂解试剂倒入树脂中，室温反应3小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液，将滤液减压浓缩，并且用冰冻乙醚沉淀，再用冰冻乙醚洗涤3次，过滤，抽干，得到还原型依替巴肽粗肽43.2g(HPLC纯度87.2％，收率90.3％)。
步骤6 依替巴肽粗品的制备
将43.2g步骤5制得的还原型依替巴肽粗品用50％乙腈水溶液溶解并制成约2mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/甲醇饱和溶液至HPLC监控至反应终点，搅拌反应30分钟后滴加Vc溶液至棕红色消失，40℃减压浓缩，得依替巴肽粗品浓缩溶液。
步骤7 依替巴肽的纯化、转盐、浓缩和冻干
依替巴肽粗品溶液浓缩后用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，所述纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流动相分别为醋酸铵和乙腈溶液，流速为120ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为220nm。
取依替巴肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈溶液，流速为20mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到依替巴肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得依替巴肽精品27.09g，总收率为64.97％，纯度为99.0％。
实施例2
步骤1 Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
将Fmoc-Cys(Trt)载体树脂(0.45mmol/g，50mmol)加入反应器中，用DMF洗涤一次，用DCM溶胀30分钟后。溶胀结束，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将50.6gFmoc-Pro-OH、(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤2 Fomc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤1的Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将78.9g Fmoc-Trp(boc)-OH(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤3 Fomc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤2的Fmoc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将61.7gFmoc-Asp(OtBu)-OH、(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤4 Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤3的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将Mpr(trt)-Har-Gly(150mmol)，20.4gHOAt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到依替巴肽树脂167.5g(树脂增重率99.1％)。
步骤5 还原型依替巴肽的制备
将167.5g依替巴肽树脂(50mmol)加入到3000ml圆底烧瓶中，配制裂解试剂1800ml(TFA为1710ml、EDT为27ml，TIS为36ml，H2O为35ml)，将裂解试剂倒入树脂中，室温反应2小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂3次，合并滤液，将滤液减压浓缩，并且用冰冻乙醚沉淀，再用冰冻乙醚洗涤3次，过滤，抽干，得到还原型依替巴肽粗肽43.2g(HPLC纯度89.1％，收率91.0％)。
步骤6 依替巴肽粗品的制备
将43.2g步骤5制得的还原型依替巴肽粗品用52％乙腈水溶液溶解并制成约2mg/ml的溶液，搅拌下滴加碘/甲醇饱和溶液至HPLC监控至反应终点，搅拌反应30分钟后滴加Vc溶液至棕红色消失，38℃减压浓缩，得依替巴肽粗品浓缩溶液。
步骤7 依替巴肽的纯化、转盐、浓缩和冻干
依替巴肽粗品溶液浓缩后用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；
采用高效液相色谱法进行纯化，所述纯化的色谱柱为直径10cm、填料为粒径10um的十八烷基键合硅胶、孔径的C18柱，流动相分别为醋酸铵和乙腈溶液，流速为120ml/min，上样量为5～10g，色谱仪的检测波长为220nm。
取依替巴肽纯化中间体浓缩液，用0.45μm滤膜滤过备用；
采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈溶液，流速为20mL/min；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到依替巴肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得依替巴肽精品27.86g，总收率为65.2％，纯度为99.3％。
实施例3
步骤1 Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
将Fmoc-Cys(Trt)载体树脂(0.45mmol/g，50mmol)加入反应器中，用DMF洗涤一次，用DCM溶胀30分钟后。溶胀结束，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将50.6gFmoc-Pro-OH、(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC、0.5g三乙胺和0.45gN-乙基对甲苯胺溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤2 Fomc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤1的Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将78.9g Fmoc-Trp(boc)-OH(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤3 Fomc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤2的Fmoc-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将61.7gFmoc-Asp(OtBu)-OH、(150mmol)，20.3gHOBt(150mmol)，19gDIC、.5g三乙胺和0.45gN-乙基对甲苯胺溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次。
步骤4 Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备
在步骤3的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂树脂中，用20％PIP/DMF溶液脱Fmoc保护2次，经检测脱完保护后，DMF洗涤3次，DCM洗3次。将124.15g Mpr(trt)-Har(pbf)-Gly-OH、(150mmol)，20.4gHOAt(150mmol)，19gDIC、.5g三乙胺和0.45gN-乙基对甲苯胺溶于DMF中，加入固相反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准)，反应结束，用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用甲醇收缩，放置在真空干燥器中干燥过夜。第二天，称重得到依替巴肽树脂167.5g(树脂增重率99.1％)。
实施例3与实施例1相比，优化了缩合剂的组成，从具体实施效果来看，实施例3的缩合时间比实施例1的缩合反应时间减少了25.6％左右，大大降低了反应时间；同时，通过单独实验，即将三乙胺和N-乙基对甲苯胺作为缩合剂使用时，其基本不具备缩合效果，说明增加的三乙胺和N-乙基对甲苯胺可以显著提高DIC的缩合反应效率，进而减少反应时间，降低企业生产成本。
实施例4
一种制备依替巴肽的方法，包括以下步骤：
A、.Fmoc-Rink Amide AM树脂在20％哌啶，DMF，室温20分钟下，脱Fmoc-保护后得到H2N-Rink Amide AM树脂；
B、.按照固相合成的方法在H2N-Rink Amide AM树脂上依次进行缩合反应连接如下保护氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Gly-OH；(图中未显示)得到Fmoc-Cys(Trt)-NH-Rink Amide AM树脂以及连接后续保护氨基酸的树脂，选择缩合剂为HBTU，HOBt，DMF，反应时间为室温下2小时。
C、其间利用哌啶脱去Fmoc-保护基团，得到NH2-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH-Rink AM树脂，用Kaiser test检测反应进程；
D、制备S-三苯基巯基丙酰-N，N-二叔丁氧羰基-高精氨酸，其步序是：
①H-Lys-OH侧端氨基加Z基团(苯甲氧羰基)保护：赖氨酸溶于碱式碳酸铜的水溶液中，回流30分钟后加入Z-Cl，并用2当量NaOH调PH值；反应1小时后得产物H-Lys(Z)-OH。
②H-Lys(Z)-OH甲酯化：将H-Lys(Z)-OH加入CH3OH，滴加SOCl2，并回流4小时，分离纯化后得到H-Lys(Z)-OMe。
③连接S-三苯基巯基丙酰：将H-Lys(Z)-OMe及加入Mpr(Trt)溶于DMF中，加入DCC及HOBt后，室温搅拌4小时，分离纯化得Mpr(Trt)-Lys(Z)-OMe。以钯碳为催化剂在室温下氢化12小时得Mpr(Trt)-Lys-OMe。
④将赖氨酸侧链上氨基转变为呱基，即将赖氨酸转变为高精氨酸：在Mpr(Trt)-Lys-OMe的DMF溶液中加入DCC，室温搅拌12小时，分离纯化得Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OMe。
⑤去甲酯：加入2当量NaOH/CH3OH，经室温，2小时，得到Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH。
E、将Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH在HBTU，HOBt，DMF，室温，2小时条件下连接到NH2-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH-Rink AM树脂上得到Mpr(Trt)-Har(Boc)2-Gly-Asp(otBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH Rink Amide AM树脂。
F、用Reagent K脱去e中树脂，得还原态粗品Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2；
G、粗品加入碘进行氧化、环化反应，得到并用高压液相色谱分析(HPLC)跟踪环化反应至完全，然后经HPLC制备即得纯品环七肽Eptifibatide。
步骤f中：Reagent K配比(体积比)TFA∶phenol∶H2O∶thioanisole∶1，2-ethanethiol＝82.5∶5∶5∶5∶2.5。
经过实验数据的分析，本发明实施例1和实施例2的收率比实施例4高，实施例1和实施例2的产品纯度与实施例4相比也具有显著性差异，具有明显的优势。此外，从原料到制成产品的过程中，本发明实施例1和实施例2在裂解、氧化、纯化上的操作时间低于实施例4，说明本发明可以显著降低生产时间。
Claims (8)
1.一种依替巴肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）以Fmoc-Cys(Trt)树脂为偶联树脂载体，使用脱保护试剂处理后，依次偶联接入Fmoc保护的氨基酸和保护氨基酸三肽片段；得到依替巴肽树脂；
其中所述保护氨基酸三肽片段为含有-Mpr-Har-Gly-基团的肽片；
（2）将所述依替巴肽树脂使用裂解剂裂解，得到还原型依替巴肽；
（3）将所述还原型依替巴肽在乙腈水溶液中使用氧化剂氧化，得到依替巴肽粗品，并将依替巴肽粗品减压浓缩，得到依替巴肽粗品浓缩液；
（4）将所述依替巴肽粗品浓缩液纯化、转盐、冷冻干燥后得到依替巴肽精品；
所述三肽片段为Mpr（trt）-Har（pbf）-Gly；或Mpr（trt）-Har-Gly或Mpr-Har-Gly或Mpr-Har（pbf）-Gly中的一种；
其中Fmoc-Pro-Cys(Trt)树脂的制备、Fomc-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro- Cys(Trt)树脂的制备以及Mpr（trt）-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(boc)-Pro-Cys(Trt)树脂的制备过程中，所采用的缩合剂为：DIC19重量份、三乙胺0.5重量份以及N-乙基对甲苯胺0.45重量份。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述偶联树脂载体为Fmoc-Cys(Trt)载体树脂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱保护试剂为哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液，混合溶液中哌啶含量为20%~25%V/V。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述裂解剂为三氟醋酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的混合溶剂；混合溶剂中含有TFA90％~95％、EDT1％~4％和TIS1％~4％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙腈水溶液的浓度为40%~80%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氧化剂为饱和碘/甲醇溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述依替巴肽粗品浓缩液采用高效液相色谱法进行纯化，所述纯化的色谱柱为十八烷基键合硅胶；流动相分别为醋酸铵溶液和乙腈溶液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转盐步骤采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1%醋酸/水溶液-乙腈溶液。
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