CN102702320B - 一种制备爱啡肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种固液相结合制备多肽药物爱啡肽的方法,属于多肽的合成技术领域。所述的技术方案包括以下步骤:1)固相制备片段A:4肽2-CTC树脂;2)固相制备肽片段B:3肽-Sieber树脂;3)裂解肽树脂;4)将片段A与B采用液相片段缩合方法得到全保护线性肽;5)液相中采用I2氧化6)裂解得到爱啡肽粗肽;7)采用HPLC方法纯化粗肽,最终得到爱啡肽精肽。本发明可大大降低了Cys、Asp的消旋产物,提高了产品的收率和纯度。
Description
技术领域
本发明涉及了一种多肽药物的制备方法,尤其涉及固液相结合制备多肽药物爱啡肽的方法。
背景技术
爱啡肽,又名依非巴特、埃替非巴肽,英文名:Eptifibatide,分子式:C35H49N11O9S2,CAS登录号148031-34-9,其结构为
Eptifibatide为抗血小板聚集剂,由美国CORTherapeuties公司与美国Schering-Plough公司共同研制开发。1998年7月由Schering-Plough公司以商品名Intrifiban在美国首次上市,1999年以商品名Intrifiban在欧洲上市。
埃替非巴肽为环形肽,是血小板糖蛋白GPIIb/IIIa受体拮抗剂,可阻断由各种激活剂引起的血小板聚集反应,主要用于防止心肌供氧动脉闭塞,心脏病发作,不稳定性心绞痛、无Q波心肌梗塞、冠脉介入治疗引起的猝死。
关于爱啡肽的制备方法,国内外已有报道:
中国专利200910153416公开了一种依替巴肽(Eptifibatide)的固液相结合合成方法。技术方案是:1.按照Fmoc固相合成策略合成五肽树酯H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-RinkAM,其中P1为Trt-及Acm-保护基;2.将Trt-Mpa-HArg(Boc)2-OH和五肽树酯H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-RinkAM缩合得到七肽树酯Trt-Mpa-HArg(Boc)2-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-RinkAM;3.七肽从树酯上裂解下来,脱去各侧链保护基团后,碘氧化成环得到依替巴肽(Eptifibatide)粗品;4.依替巴肽(Eptifibatide)粗品经离子交换树酯纯化后制得纯品依替巴肽(Eptifibatide)。
中国专利200910101674公开了一种新的依替巴肽(Eptifibatide)的全液相结合合成方法。技术方案是:1.采用Trt-Mpa-OH和H-Lys(Fmoc)-OMe为原料合成二肽,脱去Fmoc保护基后运用金属有机催化方法与Boc-保护的硫脲进行胍基化反应后水解得到的二肽偶联物Trt-MpaHarg(Boc)2-OH;2.按照Fmoc氮端保护策略液相多肽合成H-Gly-A sp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-NH2片段,其中P1为Trt-及Acm-保护基;3.将Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH和H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-NH2片段缩合得到全保护肽Trt-Mpa-Har(Boc)2-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-NH2;4.全保护七肽脱去各侧链保护基团后氧化成环得到依替巴肽(Eptifibatide)粗品;6.依替巴肽(Eptifibatide)粗品经纯化后冻干制得纯品依替巴肽(Eptifibatide)。
中国专利200910104994公开了一种依替巴肽(Eptifibatide)的固相合成方法。合成工艺为:1)选择Sieber树脂进行去Fmoc反应,得到H2N-Sieber树脂;2)采用Fmoc/tBu固相法逐一偶联合成侧链全保护线性肽Eptifibatide-Sieber树脂;3)进行树脂固相氧化,得到侧链全保护氧化肽Eptifibatide-Sieber树脂;4)进行树脂的切割和侧链保护的脱除,得到Eptifibatide粗品;5)分离纯化、冻干机冻干得到Eptifibatide精肽。
美国专利US20060036071公开了一种全液相合成的依替巴肽(Eptifibatide)合成方法。先液相制备三肽片段Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH,再在液相中依次偶联Gly、Harg得到五肽片段Fmoc-Harg-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH,后C端连接Cys(Npys)-NH2得到六肽片段:Fmoc-Harg-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NPys)-NH2,六肽片段与Mpa形成分子间二硫键得到中间体:Fmoc-Harg-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH.sub.2)-Mpa,再脱除Harg氨基的保护得到H-Harg-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH.sub.2)-Mpa,再分子内酰胺键成环得到目的产物依替巴肽[Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys]
美国专利US20060276626公开了一种固液相结合的依替巴肽(Eptifibatide)合成方法。合成工艺为:2-Cl-Trt-resin为起始原料,用TBTU/HOBt-DIEA或Collidine作为偶联激活剂逐个偶联氨基酸,TFA裂解得到线性粗肽,用I2氧化得到爱啡肽产品。
但上述现有技术都难以解决爱啡肽合成过程中固有的、难以去除的杂质因为爱啡肽结构中含有一个Gly-Asp结构单元,以及C-端第一个氨基酸Cys,而Gly-Asp在固相合成中极易异构化,而且Asp、Cys也在固相合成中很容易产生消旋产物杂质。
在已发表的文献和专利中,未有大规模生产、并且纯化工艺的收率比较低。
发明内容
本发明针对现有工艺缺陷,旨在提供一种合成路线优化简单、成本低廉、工艺过程简单、样品杂质可控的爱啡肽的合成纯化方法。
本发明提供一种爱啡肽的制备方法,包括以下步骤:
1)固相制备肽树脂片段A:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂;
2)固相制备肽树脂片段B:NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-Sieber树脂;
3)裂解肽树脂片段A得到全保护肽片段A1:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OH;
4)裂解肽树脂片段B得到全保护肽片段B1:NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2;
5)将全保护肽片段A1与B1采用液相片段缩合得到爱啡肽全保护线性肽Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2;
6)将爱啡肽全保护线性肽在液相中采用I2氧化形成分子内的二硫键全保护环肽:Mpa-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys-CONH2;所述的二硫键在Mpa与Cys之间;
7)加入含有TFA切割试剂,裂解得到爱啡肽粗肽;
8)纯化粗肽,得到爱啡肽精肽;
所述步骤1)中固相制备片段A的固相载体为2-CTC树脂;采用2-CTC树脂可以提高线性肽的偶联效率,同时,申请人意外的发现,2-CTC树脂可以减少Asp消旋产物的形成。
所述步骤1)固相制备肽树脂片段A的第一步是制备Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂,制备Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂采用Fmoc-Asp(OtBu)-OH与2-CTC树脂在-5℃~10℃反应获得。其中,温度是控制的关键点;当温度高于10℃的反应条件下,消旋反应会变得活跃,将会生成消旋杂质;当温度低于-5℃时,Asp的偶联会变得非常缓慢,树脂替代度很难得到稳定保证,同时反应时间过长会导致其它不可预知杂质产生。
所述步骤1)中Fmoc-Asp(OtBu)-OH与2-CTC树脂偶联,得到的Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂替代度范围小于1.0mmol/g即可实现本发明的技术方案。优选替代度范围为0.6~1.0mmol/g,更优选值为0.8mmol/g;当替代度低于0.6mmol/g,虽然可以实现本发明,但会导致相同规模下树脂利用率低,规模化生产成本增加;当替代度高于1.0mmol/g时,会导致线性肽树脂偶联难度增加,会有缺省肽片段产生。优选0.8mmol/g,此时既能使偶联效果得到保证又能使2-CTC树脂有较高的利用率。其中,2-CTC树脂的起始替代度控制在1.0~1.2mmol/g之间,Fmoc-Asp(OtBu)-OH的投料倍数控制在0.7~1.0倍之间,控制偶联反应时间3小时以内能够准确的控制替代度范围,当偶联反应时间为2小时能够准确得到替代度0.6-1.0mmol/g范围之内的Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂。
所述步骤2)中固相制备片段B的固相载体为Sieber树脂;Sieber树脂相对Rink、Rink AM为酸敏感树脂,能够通过低酸裂解得到全保护肽,同时避免树脂连接臂的脱落产生其他杂质,尤其是Rink、Rink AM上苯氧甲基的断裂产生相应杂质。
所述步骤2)固相制备片段B的第一步是制备Fmoc-Cys(Acm)Sieber-树脂,制备Fmoc-Cys(Acm)-Sieber-树脂采用Fmoc-Cys(Acm)-OH与Seiber树脂在低温-5℃~10℃反应获得。其中,温度是控制的关键点;当温度高于10℃反应条件下消旋反应会变得活跃,将会生成消旋杂质;当温度低于-5℃时,虽然可以实现本发明,Cys的偶联会变得非常缓慢,树脂替代度很难得到稳定保证,同时反应时间过长会导致其它不可预知杂质产生。
所述步骤2)中固相制备片段B中制备Fmoc-Cys(Acm)-Sieber-树脂采用Fmoc-Cys(Acm)-OH与Seiber树脂偶联,得到的Fmoc-Cys(Acm)Sieber-树脂替代度范围小于0.6mmol/g即可实现本发明的技术方案。优选替代度范围在0.4~0.6mmol/g之间,更优选替代度为0.5mmol/g。当替代度低于0.4mmol/g,会导致相同规模下树脂利用率低,规模化生产成本增加;当替代度高于0.6mmol/g时,会导致线性肽树脂偶联难度增加,会有缺省肽片段产生。优选0.5mmol/g,此时既能使偶联效果得到保证又能使Sieber-树脂有较高的利用率。其中,Sieber-树脂的起始替代度控制在0.4-1.2mmol/g,Fmoc-Cys(Acm)-OH的投料倍数控制在0.8~1.0倍之间,控制偶联反应时间3小时以内能够准确的控制替代度范围,偶联反应时间为2小时能够准确得到替代度在0.4~0.6mmol/g范围之内的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber-树脂。
所述步骤3)中将肽从CTC树脂上切割下来,但又能避免侧链脱落产生其它杂质,这对选择切割试剂造成一个挑战。申请人发现20%TFE/DCM切割试剂恰好能够将肽从树脂上切割下来,又能避免侧链脱落产生其它杂质。所述步骤3)中裂解肽树脂片段A的试剂为20%TFE/DCM;TFE是比较弱的一种切割试剂。
所述步骤4)中将肽从Sieber-树脂上切割下来,但又能避免侧链脱落产生其它杂质,这对选择切割试剂造成一个挑战。申请人发现2%TFA/DCM切割试剂恰好能够将肽从树脂上切割下来,又能避免侧链脱落产生其它杂质。所述步骤4)中裂解肽树脂片段B的试剂为2%TFA/DCM;
所述步骤5)全保护肽片段A1与B1采用液相片段缩合,其中缩合采用偶联剂,偶联剂为PyAOP、HOAt、DIPEA的其中一种或任意两种或两种以上的组合。全保护肽片段的缩合一般比较难,当PyAOP和HOAT组合时,PyAOP和HOAT对于片段缩合有很好的保障,避免偶联不完全的情况,同时HOAT对消旋有很好的抑制作用。更加优选PyAOP、HOAt和DIPEA。
所述步骤6)中二硫键的氧化方法是全保护肽液相氧化方法,氧化试剂为I2。
作为本发明的进一步改进,所述步骤7)中含有TFA的切割试剂为三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚(Thioanisole)、三异丙基硅烷(TIS)、二巯基乙醇(EDT)和水的混合试剂,混合溶剂的配比为:TFA体积比例为82%-87%(V/V),TIS体积比例为2%-3%(V/V),苯甲硫醚体积比例为3%-7%(V/V)、EDT体积比例为3%-7%(V/V)、余量为水。其中最优的体积配比为TFA∶苯甲硫醚∶EDT∶苯酚∶水∶TIS=85∶5∶5∶2.5∶2.5(V/V)。本发明肽结构中侧链保护基包含有Pbf、Trt、Boc、Otbu,苯甲硫醚对Pbf有良好的清除作用,EDT对Trt、TIS对Boc有良好的清除作用,水对Otbu有良好的清除作用。
本发明采用(3肽片段+4肽片段)的方式,在Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂制备得到全保护N端4肽片段,Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂制备得到C-端为酰胺的3肽片段。树脂制备过程中采用低温反应,大大降低了Cys、Asp的消旋产物,而这两个氨基酸在以前专利和文献中消旋化产物是很难避免的;同时通过Asp位点的选择,降低了Asp暴露于碱中的几率,有效的降低了Asp变构的产生。现有技术对EP-D-Asp,EP-D-Cys两个杂质在精肽中的纯度只是在0.5%左右,而本专利的发明,杂质含量为EP-D-Asp小于0.1%,EP-D-Cys小于0.2%。
所述步骤8)纯化方法包括:
第一步纯化:将合成所得粗肽经过滤后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,以三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相,进行梯度洗脱纯化。
流动相A相:体积比为0.1%TFA水溶液,B相:纯乙腈。梯度洗脱的流程如图2所示。
第二步纯化:将第一步纯化所得目的肽溶液浓缩后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相,进行梯度洗脱纯化。
流动相A相:85mmol/L磷酸二氢钾溶液B相:纯乙腈。梯度洗脱的流程如图3所示。
转盐:采用反向高效液相色谱法将磷酸盐转成醋酸盐。
纯化规模包括以下规格色谱柱:5cm*25cm(柱子直径*长度)、15cm*25cm、30cm*25cm
本发明采用反相HPLC纯化,该方法可有效去除粗肽中的杂质,提高目的产物的收率。
本发明的纯化收率在60%-80%,而现有技术的收率范围在40%-60%。
本发明的有益的技术效果:
1.采用上述技术方案的优势在于,本发明通过片段缩合方法用两个片段液相对接方法保证了线性肽合成总收率,通过液相全保护肽氧化形成分子内二硫键,避免其它氧化杂质的产生。
2.在Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂制备,Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂制备过程中采用低温反应,大大降低了Cys、Asp的消旋产物;
3.通过在合适的偶联位点的确定,降低了Asp暴露于碱中的几率,有效的降低了Gly-Asp结构单元变构的产生。从而提高了产品的收率和纯度,有利于实现规模化的合成制备。
4.通过HPLC方法大规模制备爱啡肽。该方法合成收率高、杂质可控,具有广泛的实用价值和应用前景。
附图说明
图1是本发明总的工艺流程图
图2是粗肽纯化的第一步纯化的梯度洗脱流程示意图
图3是粗肽纯化的第二步纯化的梯度洗脱流程示意图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
Sieber树脂和2-CTC树脂购自天津南开和成有限公司,各种保护氨基酸购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中:
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中:
Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
2-CTC树脂 | 2-三苯甲基氯树脂 |
Sieber树脂 | Sieber酰胺树脂 |
Boc | 叔丁氧羰基 |
OtBu | 叔丁氧基 |
Pbf | 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
Trt | 三苯甲基 |
Acm | 乙酰胺甲基 |
DCM | 二氯甲烷 |
DBLK | 20%六氢吡啶/DMF溶液 |
DIPEA | N,N-二异丙基乙胺 |
TFE | 三氟乙醇 |
TIS | 三异丙基硅烷 |
TFA | 三氟乙酸 |
EDT | 二巯基乙醇 |
DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
下面以具体的实施例,对本发明的技术方案做进一步的技术说明;但本发明并不限于这些实施例。
实施例一:替代度为0.6mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂300g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取86.31g Fmoc-Asp(OtBu)-OH用DMF溶解,冰水浴下加入89.38mL DIPEA活化后,加入上述装有树脂的反应柱中,控制反应温度-5℃反应2h。加入260mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次,DCM洗3次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂,检测替代度为0.615mmol/g。
实施例二:替代度为1.0mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的制备
称取替代度为1.2mmol/g的2-CTC树脂300g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取147.96g Fmoc-Asp(OtBu)-OH用DMF溶解,冰水浴下加入153.23mL DIPEA活化后,加入上述装有树脂的反应柱中,控制反应温度-5℃反应2h。加入260mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次,DCM洗3次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂,检测替代度为0.975mmol/g。
实施例三:替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂300g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取111.09g Fmoc-Asp(OtBu)-OH用DMF溶解,冰水浴下加入114.93mL DIPEA活化后,加入上述装有树脂的反应柱中,控制反应温度-5℃反应2h。加入260mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次,DCM洗3次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂,检测替代度为0.775mmol/g。
实施例四:替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂300g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取111.09g Fmoc-Asp(OtBu)-OH用DMF溶解,冰水浴下加入114.93mL DIPEA活化后,加入上述装有树脂的反应柱中,控制反应温度0℃反应2h。加入260mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次,DCM洗3次,甲醇收缩抽干,得 到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂,检测替代度为0.787mmol/g。
实施例五:替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂300g,加入到固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取111.09g Fmoc-Asp(OtBu)-OH用DMF溶解,冰水浴下加入114.93mL DIPEA活化后,加入上述装有树脂的反应柱中,控制反应温度10℃反应2h。加入260mL无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次,DCM洗3次,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂,检测替代度为0.783mmol/g。
实施例六:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-CTC Resin的制备
称取替代度为0.775mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂387.09g(300mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂30分钟后,用DBLK脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。将267.57g Fmoc-Gly-OH(900mmol),145.9g HOBt(1080mmol),136.1gDIC(1080mmol)溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混合溶液,加入固相反应柱中,室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准,如果树脂无色透明,则反应完全,树脂显色,表示反应不完全,需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照片段A的顺序,依次完成Fmoc-HArg(Pbf)-OH、Mpa(Acm)偶联,反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,得到Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-2CTC Resin 637g。
实施例七:替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Sieber树脂300g(300mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取87.1g Fmoc-Cys(Acm)-OH、34.04g HOBt、42.68g DIC溶于600mlDCM和600mlDMF混合溶液,加入固相反应柱中,控制反应温度-5℃反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。然后加入168ml吡啶和196ml乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次,DCM洗涤2次后,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂,检测替代度为0.388mmol/g。
实施例八:替代度为0.6mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Sieber树脂300g(300mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取136.72g Fmoc-Cys(Acm)-OH、53.50gHOBt、67.06g DIC溶于600mlDCM和600mlDMF混合溶液,加入固相反应柱中,控制反应温度-5℃反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。然后加入168ml吡啶和196ml乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次,DCM洗涤2次后, 甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂,检测替代度为0.595mmol/g。
实施例九:替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Sieber树脂300g(300mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取111.90g Fmoc-Cys(Acm)-OH、43.90gHOBt、54.88g DIC溶于600mlDCM和600mlDMF混合溶液,加入固相反应柱中,控制反应温度-5℃反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。然后加入168ml吡啶和296ml乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次,DCM洗涤2次后,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂,检测替代度为0.488mmol/g。
实施例十:替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Sieber树脂300g(300mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取111.90g Fmoc-Cys(Acm)-OH、43.90gHOBt、54.88g DIC溶于600mlDCM和600mlDMF混合溶液,加入固相反应柱中,控制反应温度0℃反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。然后加入168ml吡啶和296ml乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次,DCM洗涤2次后,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂,检测替代度为0.512mmol/g。
实施例十一:替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber Resin的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Sieber树脂300g(300mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,取111.90g Fmoc-Cys(Acm)-OH、43.90gHOBt、54.88g DIC溶于600mlDCM和600mlDMF混合溶液,加入固相反应柱中,控制反应温度10℃反应2h。反应结束后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。然后加入168ml吡啶和296ml乙酸酐混合液封闭树脂6h。用DMF洗涤4次,DCM洗涤2次后,甲醇收缩抽干,得到Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂,检测替代度为0.504mmol/g。
实施例十二:NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-Sieber树脂的制备
称取替代度为0.504mmol/g的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber树脂396.82g(200mmol),加入固相反应柱中,用DMF洗涤2次,用DMF溶胀树脂30分钟后,用DBLK脱除Fmoc保护,然后用DMF洗涤4次,DCM洗2次。将202.5g Fmoc-Pro-OH(600mmol),97.27g HOBt(720mmol),121.9g DIC(780mmol)溶于400mlDCM和400mlDMF混合溶液,加入固相反应柱中,室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准,如果树脂无色透明,则反应完全,树脂显色,表示反应不完全,需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤,按照片段的顺序,继续完成Fmoc-Trp(Boc)-OH偶联 并脱除保护。反应结束后用甲醇收缩,树脂真空干燥过夜,称重NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-Sieber树脂511.6g。
实施例十三:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OH的制备
将637g Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-2CTC Resin树脂裂解反应其中,加入6370ml裂解液(体积比,TFE∶DCM=1∶4),室温反应2h。反应结束,过滤树脂,收集滤液。将滤液体积旋蒸至﹤25vol%后,滴加至15L沉淀试剂中(体积比,正己烷:乙醚=1∶4),离心,无水乙醚洗涤,并且真空干燥,得到Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OH片段238g。收率为95.5%,纯度为94.5%。
实施例十四:NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2的制备
将511.6g NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-Sieber Resin树脂裂解反应其中,加入5116ml裂解液(体积比,TFA∶DCM=2∶98),室温反应2h。反应结束,过滤树脂,收集滤液。将滤液体积旋蒸至﹤25vol%后,滴加至15L沉淀试剂中(体积比,正己烷∶乙醚=1∶4),离心,无水乙醚洗涤,并且真空干燥,得到NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2片段107.8g。收率为96.0%,纯度为95.6%。
实施例十五:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2全保护线性肽制备
称取106.5g(200mmol)NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2加入圆底烧瓶中,用2000ml DCM溶解并加50ml DMF助溶,称取171.4g(200mol)Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OH加入烧杯中,用1500mlDCM溶解并加100mlDMF助溶,称取104.2g PyAOP,32.66g HOAt,51.08g DIPEA一并加入烧杯溶解,在0℃冰浴条件下活化15min后,加入平衡加液漏斗,缓慢滴加到圆底烧瓶,并搅拌反应,滴加完成后室温继续反应2小时,用HPLC监测反应终点。反应结束旋干反应液,得到Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2全保护肽。
实施例十六:【Mpa-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys-CONH2】全保护肽环肽制备
称取266g M Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2加入圆底烧瓶,用2L CH3OH和500ml DCM溶解,并加50ml冰醋酸,称取254g I2,加入圆底烧瓶室温搅拌反应2h。HPLC监测反应终点,反应结束旋干反应液,得到【Mpa-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys-CONH2】全保护环肽。
实施例十七:爱啡肽的制备
将238g【Mpa-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys-CONH2】全保护环肽置于裂解反应其中,加入2000ml裂解试剂(TFA∶苯甲硫醚∶EDT∶苯酚∶水∶TIS=81.5∶5∶5∶5∶2.5∶1,体积比),室温搅拌2h。反应结束后加入20L冰冻的无水乙醚沉淀,用无水乙醚洗涤3次,真空干燥得到白色粉末固体,即爱啡肽粗肽165.5g。收率为99.2%,HPLC纯度为85.6%。其中杂质EP-D-Asp为0.08%,EP-D-Cys为0.12%。
实施例十八:爱啡肽精肽的制备
1.样品处理:粗肽用Φ0.45μm滤膜过滤,收集滤液备用。
2.第一次纯化:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:5cm*25cm。流动相:A相:0.1%三氟乙酸水溶液;B相:乙腈。流速:70-80ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:15%~35%(60min)。进样量为1.5-2.0g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样,上样量为1.5-2.0g。线性梯度洗脱60min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。
3.第二次纯化:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:5cm*25cm。流动相:A相:40mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至6.5;B相:乙腈。流速:70-80ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:15%~30%(45min)。进样量为1.0-1.5g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样,上样量为50-200ml样品溶液。线性梯度洗脱45min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。
4、转盐:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:5cm*25cm。流动相:A相:0.1%醋酸水溶液;B相:色谱纯乙腈。流速:70-80ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:20%~50%(30min)。进样量为1.5-2.0g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为75-200ml样品溶液。线性梯度洗脱30min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约20-30mg/ml后转至合适大小西林瓶。后进行冷冻干燥,即可得到纯度大于98.5%的符合内控标准的爱啡肽,纯化收率可达40%以上。
实施例十九:
1.样品处理:粗肽用Φ0.45μm滤膜过滤,收集滤液备用。
2.第一次纯化:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:15cm*25cm。流动相:A相:0.1%三氟乙酸水溶液;B相:乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:15%~35%(60min)。进样量为15-20g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样,上样量为15-20g。线性梯度洗脱60min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。
3、第二次纯化:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:15cm*25cm。流动相:A相:40mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至6.5;B相:乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:15%~30%(60min)。进样量为10-15g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样,上样量为500-2000ml样品溶液。线性梯度洗脱45min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。
4、转盐:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:15cm*25cm。流动相:A相:0.1%醋酸水溶液;B相:色谱纯乙腈。流速:450-550ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:20%~50%(30min)。进样量为15-20g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为750-2000ml样品溶液。线性梯度洗脱30min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约20-30ml/g后转至合适大小西林瓶。后进行冷冻干燥,即可得到纯度大于98.5%的符合内控标准的爱啡肽,纯化收率可达35%以上。
实施例二十:
1.样品处理:粗肽用Φ0.45μm滤膜过滤,收集滤液备用。
2.第一次纯化:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:30cm*25cm。流动相:A相:0.1%三氟乙酸水溶液;B相:乙腈。流速:1900-2200ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:15%~35%(60min)。进样量为55-75g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样,上样量为55-75g。 线性梯度洗脱60min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。
3、第二次纯化:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:30cm*25cm。流动相:A相:40mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至6.5;B相:乙腈。流速:1900-2200ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:15%~30%(45min)。进样量为45-55g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样,上样量为1750-3500ml样品溶液。线性梯度洗脱45min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。
4、转盐:纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:30cm*25cm。流动相:A相:0.1%醋酸水溶液;B相:色谱纯乙腈。流速:1900-2200ml/min。检测波长:230nm。梯度:B%:20%~50%(30min)。进样量为60-75g。
纯化过程:将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为2200-4000ml样品溶液。线性梯度洗脱30min,收集目的峰,将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约20-30ml/g后转至合适大小西林瓶。后进行冷冻干燥,即可得到纯度大于98.5%的符合内控标准的爱啡肽,纯化收率可达30%以上。
综上所述,用以上方法纯化爱啡肽操作简单可行、纯度高、收率好,达到产业化要求。
Claims (9)
1.一种爱啡肽的制备方法,包括以下步骤:
1)固相制备肽树脂片段A:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂,其中,固相制备肽树脂片段A的第一步是制备Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂,制备Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂采用Fmoc-Asp(OtBu)-OH与2-CTC树脂在-5℃~10℃反应获得,再与Fmoc-Gly-OH,Fmoc-HArg(Pbf)-OH、Mpa(Acm)偶联得到固相制备肽树脂片段A;
2)固相制备肽树脂片段B:NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-Sieber树脂;
3)裂解肽树脂片段A得到全保护肽片段A1:Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OH;
4)裂解肽树脂片段B得到全保护肽片段B1:NH2-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2;
5)将全保护肽片段A1与全保护肽片段B1采用液相片段缩合得到爱啡肽全保护线性肽Mpa(Acm)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-CONH2;
6)将爱啡肽全保护线性肽在液相中采用I2氧化形成分子内的二硫键全保护环肽:Mpa-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys-CONH2;
7)加入含有TFA切割试剂,裂解得到爱啡肽粗肽。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:Fmoc-Asp(OtBu)-OH与2-CTC树脂反应,得到的Fmoc-Asp(OtBu)-2CTC树脂替代度范围小于1.0mmol/g。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:固相制备片段B的第一步是制备Fmoc-Cys(Acm)-Sieber-树脂,制备Fmoc-Cys(Acm)-Sieber-树脂采用Fmoc-Cys(Acm)-OH与Seiber树脂在低温-5℃~10℃反应获得。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于:Fmoc-Cys(Acm)-OH与Seiber树脂偶反应,得到的Fmoc-Cys(Acm)-Sieber-树脂替代度范围小于0.6mmol/g。
5.如权利要求1至4任意一项所述的制备方法,其特征在于:所述的步骤3)裂解肽树脂片段A得到全保护肽片段A1使用切割试剂,切割试剂为20%TFE/DCM。
6.如权利要求1至4任意一项所述的制备方法,其特征在于:所述的步骤4)裂解肽树脂片段B得到全保护肽片段B1使用切割试剂,切割试剂为2%TFA/DCM。
7.如权利要求1至4任意一项所述的制备方法,其特征在于:所述步骤5)全保护肽片段A1与B1采用液相片段缩合,其中缩合采用偶联剂,偶联剂为PyAOP和HOAT。
8.如权利要求1至4任意一项所述的制备方法,其特征在于:所述步骤7)中含有TFA的切割试剂为三氟乙酸、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、二巯基乙醇和水的混合试剂,混合溶剂的配比为:三氟乙酸体积比例为82%-87%,三异丙基硅烷体积比例为2%-3%,苯甲硫醚体积比例为3%-7%、二巯基乙醇体积比例为3%-7%、余量为水。
9.如权利要求1至4任意一项所述的制备方法,其特征在于:得到的爱啡肽粗肽纯化为精肽,纯化的步骤为:第一步纯化:将合成所得粗肽经过滤后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,以三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相,进行梯度洗脱纯化;第二步纯化:将第一步纯化所得目的肽溶液浓缩后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相,以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相,进行梯度洗脱纯化;第三步转盐:采用反向高效液相色谱法将磷酸盐转成醋酸盐。
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