CN106554391B

CN106554391B - 一种海洋生物肽Xen2174的合成方法

Info

Publication number: CN106554391B
Application number: CN201510626591.8A
Authority: CN
Inventors: 陈学明; 伍柯瑾; 宓鹏程; 陶安进; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN106554391A

Abstract

本发明涉及一种Xen2174肽的合成方法，先固相合成线性肽，然后定向形成两对二硫键，即通过固相氧化形成第一对二硫键(即4‑13二硫键)，通过液相辣根过氧化物酶氧化形成第二对二硫键(即5‑10二硫键)，粗肽经纯化得到Xen2174精肽。该方法具有操作简单、工艺简化、合成条件温和、环境友好、经济效益高、可规模化生产等优点。

Description

一种海洋生物肽Xen2174的合成方法

技术领域

本申请涉及多肽合成技术领域，具体而言涉及一种海洋生物肽Xen2174的合成方法。

背景技术

Xen2174肽是一种由13个氨基酸组成且含有两对二硫键的多肽，肽序如下：

pGlu-Gly-Val-Cys-Cys-Gly-Tyr-Lys-Leu-Cys-His-4Hyp-Cys-NH₂，二硫键连接方式为4-13和5-10，分子量为1404.68。

Xen2174肽属于χ-芋螺毒素，是由海洋腹足纲软体动物芋螺(Conus)分泌的生物活性肽类毒性物质，这类生物活性肽被统称为芋螺毒素(conotoxin或conopeptide)。Xen2174肽是高选择性的去甲肾上腺素转运体(NET)抑制剂，其在动物疼痛模型上具有高的治疗指数，并且没有观察到副作用。Xen2174肽已被澳大利亚Xenome公司开发成药物并已进入II期临床试验，该药物通过鞘内注射来减轻神经性疼痛。

到目前为止，只有专利文献US 20090088389A1和非专利文献(Chem.Commun.，2014，50，8408-8411)公开了两种制备Xen2174肽的方法.

第一种方法(见图1)：使用氨基树脂，通过标准的Fmoc固相肽合成制备线性肽，然后在液相中通过DMSO氧化形成两对二硫键(4-13，5-10)，采用反相高效液相色谱法纯化得到Xen2174精肽。此方法的缺点在于不能定向氧化形成两对二硫键，存在二硫键的错配杂质，产率较低.

第二种方法(见图2)：使用氨基树脂，通过标准的Fmoc固相肽合成制备肽树脂，裂解得到线性肽后，在液相中先氧化形成第一对二硫键4-13，然后通过碘氧化形成第二对二硫键5-10。粗肽经反相高效液相色谱法纯化得到Xen2174精肽。此方法的缺点在于通过碘氧化形成第二对二硫键时，很容易将此肽中7号位的Tyr碘代，导致杂质增多，同时过量的碘很难除掉。产率很低。

本发明提供一种Xen2174肽的合成方法，先固相合成线性肽，然后定向形成两对二硫键，即通过固相氧化形成第一对二硫键(即4-13二硫键)，通过液相辣根过氧化物酶氧化形成第二对二硫键(即5-10二硫键)，粗肽经纯化得到Xen2174精肽。该方法具有操作简单、工艺简化、合成条件温和、环境友好、经济效益高、可规模化生产等优点。

发明内容

本发明提供一种止痛药物Xen2174肽的合成方法，其包括以下步骤：

步骤(1)：按照Fmoc固相合成方法，在树脂上依次偶联各Fmoc-AA-OH；

步骤(2)：固相脱除肽链第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基；

步骤(3)：通过固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键；

步骤(4)：脱除树脂，第5位和第10位半胱氨酸残基上的保护基同时被脱除；

步骤(5)：通过液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键；以及

任选的步骤(6)：纯化。

步骤(1)中所使用的树脂为氨基树脂，可选自Rink Amide-AM树脂、MBHA树脂、PAL树脂等。优选地，树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.2-0.5mmol/g，最优选0.303mmol/g.

优选地，在进行偶联反应之前，对树脂进行洗涤和溶胀处理，所用溶剂选自DMF、NMP和DCM，优选DMF。

步骤(1)中按照Xen2174肽的氨基酸顺序，从C-端开始依次偶联Fmoc-AA-OH形式的各个氨基酸.其中对于第13位和第4位的半胱氨酸残基，使用Fmoc-Cys(Mmt)-OH；而对于第10位和第5位的半胱氨酸残基，使用Fmoc-Cys(Dpm)-OH。对于其他氨基酸的Fmoc-AA-OH形式没有特别限定，可以依照本领域的常规知识使用或者不使用保护基，可使用的保护基例如，Trt、Boc和tBu等。

作为优选，可使用以下Fmoc-AA-OH形式的氨基酸，如Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH等.更优选地，所述依次偶联的各Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-4Hyp(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-pGlu-OH。

步骤(1)中所述Fmoc固相合成方法包括以下步骤：1)脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；2)将合适量的Fmoc-AA-OH形式的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到偶联反应终止为止；以及3)重复步骤1)和2)直至偶联上所有的氨基酸。其中脱除Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶与DMF体积比为1∶4的混合溶液。

步骤(1)中所使用的偶联剂为DIC与化合物A的混合物或DIA与化合物A和化合物B的混合物，优选DIC与化合物A的混合物.其中化合物A选自HOBt和HOAt，化合物B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU.进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIC：化合物A＝1.2∶1.1，DIA∶化合物A∶化合物B＝2.0∶1.1∶1.0。

步骤(1)的偶联反应在固相反应柱中进行.对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任何固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在-10℃至60℃范围内进行。在没有特别说明的情况下，本发明的各反应在室温和常压下进行.

步骤(1)的偶联反应中所应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任何方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮。当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的氨基，即氨基上无保护基.

当所使用的第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基为Mmt，步骤(2)中所使用的脱除Mmt保护基的试剂为1％-5％的TFA/CH₂Cl₂溶液，优选2％TFA/CH₂Cl₂溶液.

步骤(3)所使用的氧化剂选自H₂O₂和NCS，优选NCS。

步骤(4)可采用裂解液脱除树脂，所述裂解液为TFA、H₂O、PhOMe和苯甲硫醚的混合物.优选地，TFA、H₂O、PhOMe和苯甲硫醚的体积比为75～95∶20～4∶4～0.1∶1～0.1，更优选为80～90∶15～4∶3～0.1∶1～0.1，最优选90∶5∶4∶1、85∶5∶9∶1或85∶10∶4∶1。

步骤(5)所使用的氧化剂为辣根过氧化酶，辣根过氧化酶的用量为步骤(4)所得环肽重量的0.5％-10％，更优选1.5％-2.5％，最优选1.8％或2.0％。

步骤(6)所述纯化可采用本领域常规的纯化方法进行，例如色谱法进行。优选的色谱法如反相色谱法，特别是反相高效液相色谱法，即RP-HPLC.进一步地，所述反相高效液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相等梯度洗脱，流动相比例优选为98∶2至50∶50，更优选80∶20至60∶40，最优选70∶30或80∶20，收集目标峰馏分，浓缩冻干。

附图说明

图1：现有技术中的Xen2174肽的合成流程图；

图2：现有技术中的Xen2174肽的合成流程图；

图3：本发明的Xen2174肽的示例性合成流程图.

具体实施方式

本文中所使用的英文缩写具有下列含义：

本发明的合成方法可通过下列实施例得到详细说明。

实施例1：Xen2174肽的制备

步骤(1)在树脂上固相偶联各Fmoc-AA-OH：

称取替代度为0.303mmol/g的Rink Amide-AM树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入DBLK脱除树脂上的Fmoc保护基，连续脱除两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤6次。

称取5.21g(6mmol)Fmoc-Cys(Mmt)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时).反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色.称取2.5g(6mmol)Fmoc-4Hyp(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时).反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取5.12g(6mmol)Fmoc-His(Trt)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取5.35g(6mmol)Fmoc-Cys(Dpm)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时).反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取5.00g(6mmol)Fmoc-Leu-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取5.11g(6mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时).反应结束后，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.83g(6mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取3.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色.称取5.35g(6mmol)Fmoc-Cys(Dpm)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。取5.35g(6mmol)Fmoc-Cys(Mmt)-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色.称取2.35g(6mmol)Fmoc-Val-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色.称取3.45g(6mmol)Fmoc-Gly-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护两次，6分钟+8分钟，用DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取4.35g(6mmol)Fmoc-pGlu-OH和0.89g(6.6mmol)HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.2ml(7.2mmol)DIC活化3分钟后，将混合液加入到反应柱中，室温下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。

步骤(2)固相脱除半胱氨酸残基上的保护基Mmt：偶联结束后，用2％的TFA/CH₂Cl₂溶液100ml洗涤树脂，每次2分钟，洗涤10次.

步骤(3)固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键：洗涤结束后，用DMF洗涤3次，然后加入氯代琥珀酰亚胺12mmol(1.60g)的DMF混合液100ml，反应20分钟。氧化结束后，将树脂用甲醇收缩，抽干，得到肽树脂34.72g，备用，树脂增重率72.0％。

步骤(4)脱除树脂：将步骤(3)所得肽树脂34.72g加入到500ml单口瓶中，加入预先配制好的TFA∶H₂O∶PhOMe∶苯甲硫醚＝90∶5∶4∶1(V∶V)混合液280ml，在室温下反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液.将合并后的滤液缓慢加入2800ml冰乙醚中沉淀，离心，用冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到环肽7.58g，HPLC纯度81.6％。

步骤(5)液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键：将步骤(4)所得环肽7.58g溶解于350ml乙腈中，加入磷酸缓冲盐280ml，调节pH＝6.0，然后加入辣根过氧化物酶140mg，反应15分钟，得到粗产物。

步骤(6)纯化：将步骤(5)所得粗产物通过反相高效液相色谱法纯化.所述反相高效液相色谱法以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液∶乙腈＝70∶30为流动相，流速为70ml/min，检测波长为230nm，进样量为1.5g，收集目标峰馏分，浓缩冻干，得纯品6.2g，纯度大于99％，收率82％.

实施例2：Xen2174肽的制备

步骤(1)至(3)与实施例1完全相同.通过步骤(1)至(3)得到肽树脂30.15g，备用，树脂增重率62.5％。

步骤(4)脱除树脂：将步骤(3)所得肽树脂30.15g加入到500ml单口瓶中，加入预先配制好的TFA∶H₂O∶PhOMe∶苯甲硫醚＝85∶5∶9∶1(V∶V)280ml，室温下反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将合并后的滤液缓慢加入2800ml冰乙醚中沉淀，离心，用冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到环肽6.48g，HPLC纯度83.6％。

步骤(5)液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键：将步骤(4)所得环肽6.48g溶解于350ml乙腈中，加入磷酸缓冲盐280ml，调节pH＝6.0，然后加入辣根过氧化物酶130mg，反应30分钟，得到粗产物。

步骤(6)纯化：将步骤(5)所得粗产物通过反相高效液相色谱法纯化。所述反相高效液相色谱法以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液∶乙腈＝80∶20为流动相，流速为80ml/min，检测波长为230nm，进样量为2.0g，收集目标峰馏分，浓缩冻干，得纯品4.8g，纯度大于99％，收率74％.

实施例3：Xen2174肽的制备

步骤(1)与实施例1完全相同。

步骤(2)固相脱除半胱氨酸残基上的保护基Mmt：偶联结束后，用5％的TFA/CH₂Cl₂溶液120ml洗涤树脂，每次2分钟，洗涤5次。

步骤(3)固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键：洗涤结束后，用DMF洗3次，然后加入双氧水20ml的DMF混合液100ml和DIPEA1.2ml，反应120分钟。氧化结束后，树脂用甲醇收缩，抽干，得到肽树脂30.12g，树脂增重率60.0％。

步骤(4)脱除树脂：将步骤(3)所得肽树脂30.12g加入到500ml单口瓶中，加入预先配制好的TFA∶H₂O∶PhOMe∶苯甲硫醚＝85∶10∶4∶1(V∶V)280ml，室温下反应2小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将合并后的滤液缓慢加入2800ml冰乙醚中沉淀，离心，用冰乙醚洗涤5次，减压干燥得到环肽6.0g，HPLC纯度82.1％。

步骤(5)液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键：将步骤(4)所得环肽6.0g溶解于350ml乙腈中，加入磷酸缓冲盐280ml，调节pH＝6.0，然后加入辣根过氧化物酶110mg，反应30分钟，得到粗产物.

步骤(6)纯化：将步骤(5)所得粗产物通过反相高效液相色谱法纯化。所述反相高效液相色谱法以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％醋酸水溶液∶乙腈＝80∶20为流动相，流速为75ml/min，检测波长为230nm，进样量为1.8g，收集目标峰馏分，浓缩冻干，得纯品4.0g，纯度大于99％，收率67％。

Claims

1.一种Xen2174肽的合成方法，包括以下步骤：

步骤(1)：按照Fmoc固相合成方法，在树脂上依次偶联各Fmoc-AA-OH；按照Xen2174肽的氨基酸顺序，从C-端开始依次偶联Fmoc-AA-OH形式的各个氨基酸；所述依次偶联的各Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-4Hyp(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Dpm)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-pGlu-OH；

步骤(3)：通过固相氧化形成第一对二硫键，即4-13二硫键；

步骤(4)：脱除树脂，第5位和第10位半胱氨酸残基上的保护基同时被脱除；采用裂解液进行，所述裂解液为三氟乙酸、水、苯甲醚和苯甲硫醚的混合物；以及

步骤(5)：通过液相氧化形成第二对二硫键，即5-10二硫键，其中所使用的氧化剂为辣根过氧化酶。

2.权利要求1的方法，其中步骤(1)中所使用的树脂为氨基树脂。

3.权利要求2的方法，其中

步骤(1)中所使用的树脂为Rink Amide-AM树脂、MBHA树脂或PAL树脂；

树脂的替代度为0.1-1.0 mmol/g；

在进行偶联反应之前，对树脂进行洗涤和溶胀处理；所用溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷。

4.权利要求3的方法，其中树脂的替代度为0.2-0.8 mmol/g；所用溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。

5.权利要求4的方法，其中树脂的替代度为0.2-0.5 mmol/g。

6.权利要求5的方法，其中树脂的替代度为0.303 mmol/g。

7.权利要求1或2的方法，其中步骤(1)中所述Fmoc固相合成方法包括以下步骤：

1)脱除Fmoc；

2)将合适量的Fmoc-AA-OH形式的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至偶联反应终止；以及

3)重复步骤1)和2)直至偶联上所有的氨基酸。

8.权利要求7的方法，其中脱除Fmoc的试剂为20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液；每种氨基酸的偶联反应时间为1.5-4小时；偶联反应在20±5℃和常压下进行。

9.权利要求8的方法，其中每种氨基酸的偶联反应时间为2-3小时。

10.权利要求1或2的方法，其中步骤(1)中所使用的偶联剂为二异丙基碳二亚胺与化合物A的混合物或N,N-二异丙基乙胺与化合物A和化合物B的混合物；

其中化合物A选自1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑，化合物B选自苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐、(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐或O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸。

11.权利要求10的方法，其中步骤(1)中所使用的偶联剂为N,N-二异丙基乙胺与化合物A和化合物B的混合物；偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为N,N-二异丙基乙胺:化合物A:化合物B=2.0:1.1:1.0。

12.权利要求10的方法，其中步骤(1)中所使用的偶联剂为二异丙基碳二亚胺与化合物A的混合物；偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为二异丙基碳二亚胺:化合物A=1.2:1.1。

13.权利要求1的方法，其中脱除第4位和第13位半胱氨酸残基上的保护基Mmt时所使用的试剂为1%-5%的三氟乙酸/CH₂Cl₂溶液。

14.权利要求13的方法，其中所使用的试剂为2%三氟乙酸/CH₂Cl₂溶液。

15.权利要求1或2的方法，其中步骤(3)所使用的氧化剂为H₂O₂、N-氯代琥珀酰亚胺。

16.权利要求15的方法，其中所使用的氧化剂为N-氯代琥珀酰亚胺。

17.权利要求1或2的方法，其中步骤(4)中所述裂解液为三氟乙酸、水、苯甲醚和苯甲硫醚的混合物。

18.权利要求17的方法，其中三氟乙酸、水、苯甲醚和苯甲硫醚的体积比为90:5:4:1、85:5:9:1或85:10:4:1。

19.权利要求1或2的方法，其中步骤(5)所使用的辣根过氧化酶的用量为步骤(4)所得环肽重量的0.5%-10%。

20.权利要求19的方法，其中步骤(5)所使用的辣根过氧化酶的用量为步骤(4)所得环肽重量的1.5%-2.5%。

21.权利要求20的方法，其中步骤(5)所使用的辣根过氧化酶的用量为步骤(4)所得环肽重量的1.8%或2.0%。

22.权利要求1或2的方法，其还包括步骤(6)纯化。

23.权利要求22的方法，所述纯化采用色谱法进行。

24.权利要求23的方法，所述纯化采用反相色谱法进行。

25.权利要求24的方法，所述纯化采用反相高效液相色谱法进行。

26.权利要求25的方法，所述反相高效液相色谱法以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1%醋酸水溶液/乙腈为流动相等梯度洗脱。

27.权利要求26的方法，其中流动相的比例为98:2至50:50。

28.权利要求27的方法，其中流动相的比例为80:20至60:40。

29.权利要求28的方法，其中流动相的比例为70:30或80:20。