CN111057129B - 一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，该方法通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽。现有的技术中主要采用固相合成将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，但效果较差，收率偏低，为此，申请人通过大量的实验对如何将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽作了针对性地研究，发现采用通过氧化反应以及液相合成的方式可以一步将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，避免线性肽成环步骤在溶液中分两次进行，导致溶液中成分复杂，分离纯化难度大而且收率低，本技术方案采用氧化反应加液相合成的方式来合成具有两对二硫键的多肽是具有很高的创新性，是一项创造性成果。

Description

一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂 盒，以及普利卡那肽的制备方法
技术领域
本发明属于制药技术领域，尤其是涉及一种通过对线性肽进行氧化反应，将其液相合成为具有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒。
背景技术
普利卡那肽是一种鸟苷酸环化酶C(GC-C)受体激动剂，其治疗机理与利尿钠肽尿鸟苷素相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠动力。普利卡那肽为一类新的口服制剂，无需注射就可以直接口服用药，可为众多患者接受。这类制剂模仿利钠肽Uroguanylin的作用，诱导肠液分泌的胃肠道进入管腔。其作为一种可模拟胃肠液体调节肽效应的新药，对成人慢性特发性便秘的客观指标和患者自评转归有效。但是，普利卡那肽的制备方法目前在国际上仍属空白，至今尚无适合大规模生产且收率高、杂质含量低的普利卡那肽的制备方法报道。如深圳翰宇药业首先报道的普利卡那肽的制备方法(专利号为CN103694320A)，采用了固相合成线性多肽，然后在溶液中分两步分别成环得到。由于该方法成环在溶液中分两次进行，溶液中成分复杂，分离纯化难度较大，收率较低。随后，南京工业大学报道了另一种合成普利卡那肽的方法(专利号为CN104628827A)，采用Fmoc固相合成路线，先合成线性肽，然后在树脂上定向氧化形成两对二硫键，最后切割纯化后直接得到普利卡那肽，而上述方案由于在固相上合成两对二硫键，收率同样不高。因此，急需提供一种合成条件温和、工艺简单、具有高收率的用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法，该方法工艺简单、稳定并且具有相对高的收率。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽。应理解所述线性肽为内部没有成环的多肽。
需要说明的是，现有的技术中主要是采用固相氧化合成为具有两对二硫键的多肽，但效果较差，收率偏低，在专利号为CN103694320A的专利中，提到了其产物的收率只有30％左右，为此，申请人通过大量的实验对如何将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽作了针对性地研究，发现采用通过氧化反应以及液相合成的方式可以一步将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，避免线性肽成环步骤在溶液中分两次进行，导致溶液中成分复杂，分离纯化难度大而且收率低，本技术方案采用氧化反应加液相合成的方式来合成具有两对二硫键的多肽是具有很高的创新性，是一项创造性成果。
通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，加入氧化剂；
优选的，所述氧化剂为DHS以及NCS，最优为DHS；
优选地，所述氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g；
更加优选的，当氧化剂为DHS时，氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g，最优为60.75g/g；
更加优选的，当氧化剂为NCS时，氧化剂与线性肽的质量比为30g/g-90g/g，最优为60.75g/g。
经过申请人大量的实验验证，与其它氧化剂(双氧水、空气、二甲亚砜等氧化剂)相比，氧化剂为DHS、NCS时技术效果相对较好，具有相对高的收率。
优选的，所述线性肽具有四个(两对)Cys，每两个Cys通过氧化反应形成一对二硫键，更加优选的，线性肽中的4个Cys同时通过氧化反应形成两对二硫键。对于线性普利卡那肽来说，本方案通过氧化反应使得4位的Cys与12位的Cys形成一对二硫键，7位的Cys与15位的Cys形成一对二硫键。应理解除了线性普利卡那胎之外的线性肽也可以通过相同方法制备两对二硫键。
通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，依次加入纯化水、变性剂、pH调节剂，然后加入稳定剂、氧化剂，接着降低温度，最后加入线性肽进行反应得到具有两对二硫键的多肽；
优选的，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为50，000-200，000质量份、50-500质量份、10-100质量份以及20-200质量份，优选为90，000质量份、200质量份、50质量份、50质量份以及82.3质量份；
优选的，所述变性剂为盐酸胍、精氨酸、尿中的一种或多种；更加优选的，所述变性剂为盐酸胍；
优选的，pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水中的一种或多种；更加优选的，PH调节剂为碳酸氢钠；
优选的，稳定剂为乙二醇、木糖醇、肌醇其中的一种或多种；更加优选的，稳定剂为乙二醇；
优选的，温度降低为-25至-30℃，更加优选的，温度降低到-10℃至-15℃；优选的，反应时的PH值为7.5-13，更加优选为9-11，最好为10。
更加优选的，在通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽之前，还包括通过裂解含有线性肽的树脂制得线性肽；或通过氨基酸液相合成制得线性肽。应理解除了上述两种方式制备得到的线性肽外，通过购买商业化的线性肽来合成具有两对二硫键的多肽的方式也应纳入到本申请的保护范围内。
所述含有线性肽的树脂通过树脂逐一偶联氨基酸制得；应理解在偶联氨基酸时，氨基酸上优选是具有保护基。
优选的，所述含有线性肽的树脂通过在固相树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Leu、Cys 15、Gly、Thr、Cys 12、Ala、Val、Asn、Val、Cys 7、Leu、Glu、Cys 4、Glu、Asp、Asn制备得到。
优选的，所述多肽为普利卡那肽，所述线性肽为线性普利卡那肽。
应理解本申请可用于其它线性肽合成具有两对二硫键的多肽，不仅限于将线性普利卡那肽合成为普利卡那肽。
一种用于合成含有两对二硫键的多肽的试剂盒，包括，纯化水、变性剂、pH调节剂、稳定剂、氧化剂以及线性肽；
优选的，所述氧化剂为DHS以及NCS，最优为DHS；
优选的，所述线性肽为线性普利卡那肽；
优选的，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为50，000-200，000质量份、50-500质量份、10-100质量份以及20-200质量份，优选为90，000质量份、200质量份、50质量份、50质量份以及82.3质量份；
优选的，所述变性剂为盐酸胍、精氨酸、尿中的一种或多种；更加优选的，所述变性剂为盐酸胍；
优选的，pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水中的一种或多种；更加优选的，PH调节剂为碳酸氢钠；
优选的，稳定剂为乙二醇、木糖醇、肌醇其中的一种或多种；更加优选的，稳定剂为乙二醇。
优选的，温度降低为-25至-30℃，更加优选的，温度降低到-10℃至-15。
优选的，反应时的PH值为7.5-13，更加优选为9-11，最好为10。
一种普利卡那肽的制备方法，包括以下步骤：
S1：在树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Leu、Cys 15、Gly、Thr、Cys 12、Ala、Val、Asn、Val、Cys 7、Leu、Glu、Cys 4、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂；
S2：裂解线性普利卡那肽的肽树脂制得线性普利卡那肽；
S3：通过氧化反应将线性普利卡那肽液相合成为普利卡那肽；
S4：分离纯化在步骤S3中制备得到的普利卡那肽。
优选的，步骤S1包括，
步骤S11：树脂偶联Leu制得Leu-树脂；
步骤S12：Leu-树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Cys、Gly、Thr、Cys、Ala、Val、Asn、Val、Cys、Leu、Glu、Cys、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂。
优选的，Leu-树脂的替代度为0.1-1.0mmol/g，更优选为0.2-0.8mmol/g，更好为0.2-0.5mmol/g；
优选的，所述Cys 4、Cys 7、Cys 12以及Cys 15的侧链保护基为三苯甲基、二苯甲基或4-甲氧基三苯甲基。
优选的，所述固化树脂为wang树脂或2-氯树脂；
优选的，在步骤S2中加入裂解液来裂解线性普利卡那肽的肽树脂；
更加优选的，所述裂解液为TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚按不同比例混合得到；所述裂解液的最优体积比为TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝(85-95):(10-5):4:1。
相比起现有技术，本申请的优势在于：
(1)采用通过氧化反应以及液相合成的方式可以一步将线性肽合成为具有两对二硫键的多肽，避免线性肽的成环步骤在溶液中分两次进行，导致溶液中成分复杂，分离纯化难度大而且收率低，使得最终产物的收率大幅上升。
(2)经过申请人大量的实验证明，氧化过程中采用DHS或者NCS作为氧化剂能有效提高线性肽一次形成两个二硫键的可能性，具有相对高的收率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的色谱图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下：
本发明包括以下步骤：
S0：选择树脂作为固相载体；
S1：按照Fmoc固相合成策略，在树脂上依次偶联Fmoc-AA-OH；
S2、通过裂解液脱除含有线性普利卡那肽的肽树脂上的树脂和保护基，制备线性普利卡那肽；
S3、通过氧化反应将线性普利卡那肽液相合成普利卡那肽；
S4、纯化在步骤S3中得到的普利卡那肽。
在步骤S0中，所述的固相载体为wang树脂或2-氯树脂，树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.2-0.5mmol/g。
在步骤S1中，按照Fmoc固相合成策略，依次偶联Fmoc-AA-OH时，树脂按照C端到N端的顺序偶联Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。
每进行一次偶联时，先脱除已经偶联到树脂上的氨基酸的Fmoc(第一个氨基酸偶联到树脂时不需要脱除Fmoc)，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；接着将合适量的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；3)重复1)和2)。其中脱除Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶：DMF(体积比)为1:4的混合溶液。
在步骤S1中，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
在本实施例中，步骤S1的反应在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
在本实施例中，步骤S1的反应优选将树脂在偶联之前进行溶胀，所述洗涤和溶胀的步骤本领域可采用实现该目的的任何试剂进行，包括DMF、NMP、二氯甲烷等，优选DMF。所述反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的胺，即胺上无保护基。选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一。
在步骤S2中，所述的裂解液为TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚的不同比例混合物。优选TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝(85-95):(10-5):4:1(V:V)。
在步骤S3中，在氧化液相反应中，溶剂为水溶液；变性剂为：盐酸胍、精氨酸、尿，优选盐酸胍；pH为7.5-13，优选10；pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水，优选碳酸氢钠；氧化剂为DHS、NCS，优选DHS；稳定剂为乙二醇、木糖醇、肌醇，优选乙二醇；液相反应温度为-25--30℃，优选温度-10℃--15℃。
在步骤S4中，所述纯化步骤可采用反相高压液相色谱法。进一步地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，流动相体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈的比例优选为98:2至50:50，更优选80:20至60:40，最优选70:30。收集目的峰馏分，浓缩冻干。
实施例1：
替代度为0.50mmol Fmoc-Leu-Wang树脂的制备
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Leu-OH 35.4克(100mmol)、HOBt16.2克(120mmol)、DMAP 1.2克(10mmol)，用DMF溶解，0℃下加入20.3mLDIC,活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Leu-Wang树脂130克，检测替代度为0.50mmol/g。
肽树脂的制备
称取替代度为0.50mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂50g于固相反应柱中，加入50mLDMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用50mL DBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤6次。称取(75mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH和11.7g(75mmol)HOBT用50mL DMF溶解，冰水浴下加入13mL(75mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用100mLDMF洗涤树脂3次，加入50mLDBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。每种氨基酸、HOBT及DIC每次分别投料75mmol。偶联结束，用100mL甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂100.5克。
线性普利卡那肽制备
将得到的肽树脂100.5g加入到1L三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝90:5:4:1(V:V)1000mL，室温反应2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚5L洗涤5次，减压干燥得到粗肽82.3克。
氧化反应得到普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS25g(136.6mmol),然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述得到的混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.6g，纯度为99.0％，收率80％。
实施例2：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时加入不同量的DHS50g，
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS50g(273.2mmol),然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述得到混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品34.6g，纯度为99.0％，收率82％。
实施例3：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时加入不同量的DHS68.6g.
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS68.6g(375mmol),然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述得到混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品34.6g，纯度为99.0％，收率81％。
实施例4：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时加入不同量的DHS30g.
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS30g,然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述得到混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品32.9g，纯度为99.0％，收率78％。
实施例5：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时加入不同量的DHS40g。
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS40g,然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述得到混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.1g，纯度为99.0％，收率78％。
实施例6：
与实施例2不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在对线性普利卡那肽氧化反应来液相合成普利卡那肽时温度降低到-15℃。
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS50g,然后将溶液温度降至-15℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述得到的混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品31.5g，纯度为99.0％，收率73％。
实施例7：
与实施例2不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在对线性普利卡那肽氧化反应来液相合成普利卡那肽时氧化剂采用的是NCS50g。
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、NCS50g,然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽82.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将由上述方法得到的混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品30.5g，纯度为99.0％，收率71％。
实施例8
为了研究树脂的替代度对于产物收率的影响，申请人还在2-氯树脂的基础上制备了普利卡那肽：
替代度为0.20mmol Fmoc-Leu-Wang树脂的制备
称取替代度为0.7mmol/g的Wang树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Leu-OH 35.4克(100mmol)、HOBt16.2克(120mmol)、DMAP 1.2克(10mmol)，用DMF溶解，0℃下加入20.3mLDIC,活化5分钟，加入反应柱。反应一小时后，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，混合封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Leu-Wang树脂125克，检测替代度为0.20mmol/g。
肽树脂的制备
称取制备得到的替代度为0.20mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂125g于固相反应柱中，加入50mLDMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用50mL DBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤6次。称取(75mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH和11.7g(75mmol)HOBT用50mL DMF溶解，冰水浴下加入13mL(75mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用100mLDMF洗涤树脂3次，加入50mLDBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。每种氨基酸、HOBT及DIC每次分别投料75mmol。偶联结束，用100mL甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂95.5克。
线性普利卡那肽制备
将由上述方法得到的肽树脂95.5g加入到1L三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝90:5:4:1(V:V)1000mL，室温反应2小时，减压过滤肽树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚5L洗涤5次，减压干燥得到粗肽80.1克。普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS50g,然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽80.1g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将由上述方法得到的混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.6g，纯度为99.5％，收率80％。
实施例9
为了研究树脂类型对于产物收率的影响，申请人还在2-氯树脂的基础上制备了普利卡那肽：
替代度为0.50mmol Fmoc-Leu-2-氯树脂的制备
称取替代度为0.8mmol/g的2-氯树脂100g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；称取Fmoc-Leu-OH 35.4克(100mmol)，用DMF溶解，0℃下加入21.2mLDIPEA,活化5分钟，加入反应柱。反应两小时后，加入30mL甲醇封闭24小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Leu-2-氯树脂120克，检测替代度为0.50mmol/g。
肽树脂的制备
称取由上述方法制备得到的替代度为0.50mmol/g的Fmoc-Leu-2-氯树脂50g于固相反应柱中，加入50mLDMF，氮气鼓泡溶胀60分钟；然后用50mL DBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤6次。称取(75mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH和11.7g(75mmol)HOBT用50mL DMF溶解，冰水浴下加入13mL(75mmol)DIPCDI活化3min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用100mLDMF洗涤树脂3次，加入50mLDBLK脱保护6min+8min，100mLDMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。每种氨基酸、HOBT及DIC每次分别投料75mmol。偶联结束，用100mL甲醇收缩树脂，抽干，得到肽树脂101.6克。
线性普利卡那肽制备
将有上述方法得到的肽树脂101.6g加入到1L三口瓶中，加入预先配置好的TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝90:5:4:1(V:V)1000mL，室温反应2小时，减压过滤肽树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入10L冰乙醚中沉淀，离心，冰乙醚5L洗涤5次，减压干燥得到粗肽83.3克。
普利卡那肽的制备
在100L的反应釜中依次加入纯化水90L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入乙二醇50g、DHS25g,然后将溶液温度降至-10℃，最后加入线性普利卡那肽83.3g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将由上述方法得到的混合液直接上样15cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品33.8g，纯度为99.5％，收率81％。
为探究氧化剂的种类对于收率的影响，申请人还做了以下实验：
实施例10：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时不加入氧化剂依靠空气氧化线性普利卡那肽：
普利卡那肽的制备
在10L的反应釜中依次加入纯化水9L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入制得的线性普利卡那肽8.2g，反应48小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将上述方法得到的混合液直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品1.3g，纯度为99.5％，收率30％。
实施例11：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时加入的氧化剂为二甲亚砜：
普利卡那肽的制备
在10L的反应釜中依次加入纯化水9L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入线性普利卡那肽8.2g，最后加入二甲亚砜0.4L,反应40小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将实施例24得到混合液直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品1.5g，纯度为99.5％，收率35％。
实施例12：
与实施例1不同的是：在制备完线性普利卡那肽后，在氧化反应时加入的氧化剂为双氧水：
普利卡那肽的制备
在10L的反应釜中依次加入纯化水9L、盐酸胍200g、碳酸氢钠300g,使得溶液的pH＝10,然后加入线性普利卡那肽8.2g，最后加入30％双氧水0.4L,反应40小时后，混合液直接进行下一步。
纯化普利卡那肽
将由上述方法制备得到的混合液直接上样10cm×25cm制备柱高效液相纯化制备。以反相十八烷基硅烷为固定相，以体积比0.1％醋酸水溶液/乙腈为流动相，比例为70:30；等梯度洗脱制备；流速：70-80ml/min；检测波长：280nm；收集目的峰馏分，浓缩冻干，得纯品1.4g，纯度为99.5％，收率32％。
缩写及英文含义
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Claims (29)

1.一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法，其特征在于，通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽，所述氧化反应时加入氧化剂，所述氧化剂为DHS或NCS，所述多肽为普利卡那肽，所述线性肽为线性普利卡那肽，所述氧化剂与线性肽的质量比为0.6075g/g，所述制备方法通过氧化反应将线性肽液相合成为具有两对二硫键的多肽时，加入纯化水、变性剂、pH调节剂，然后加入稳定剂、氧化剂，接着降低温度，最后加入线性肽进行反应得到具有两对二硫键的多肽，所述稳定剂为乙二醇，所述温度降低到-10℃至-15℃，所述反应时的pH值为9-11。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为DHS。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述线性肽具有四个Cys，每两个Cys通过氧化反应形成一对二硫键。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述线性肽中的两对Cys同时通过氧化反应形成两对二硫键。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为50，000-200，000质量份、50-500质量份、10-100质量份以及20-200质量份。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化水、变性剂、稳定剂、氧化剂以及线性普利卡那肽的加入量分别为90，000质量份、200质量份、50质量份、50质量份以及82.3质量份。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为DHS时，DHS与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为(1-20)：1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为DHS时，DHS与普利卡那肽线性粗肽的摩尔比为(5-15)：1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为NCS时，NCS与线性普利卡那肽的摩尔比为(1-20)：1。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为NCS时，NCS与线性普利卡那肽的摩尔比为(5-15)：1。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述变性剂为盐酸胍、精氨酸、尿素中的一种或多种。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述变性剂为盐酸胍。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述pH调节剂为碳酸铵、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PH调节剂为碳酸氢钠。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应时的PH值为10。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括通过裂解含有线性肽的树脂制得线性肽。
17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括通过氨基酸液相合成制得线性肽。
18.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述含有线性肽的树脂通过树脂逐一偶联氨基酸制得。
19.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述含有线性肽的树脂通过在固相树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Leu、Cys 15、Gly、Thr、Cys 12、Ala、Val、Asn、Val、Cys 7、Leu、Glu、Cys 4、Glu、Asp、Asn制备得到。
20.一种普利卡那肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：树脂偶联Leu制得Leu-树脂，在Leu-树脂上按照碳端到氮端的顺序逐一偶联Cys15、Gly、Thr、Cys 12、Ala、Val、Asn、Val、Cys 7、Leu、Glu、Cys 4、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂；
S2：裂解线性普利卡那肽的肽树脂制得线性普利卡那肽；
S3：通过氧化反应将线性普利卡那肽液相合成为普利卡那肽；
S4：分离纯化普利卡那肽；
所述Leu-树脂的替代度为0.1-1.0mmol/g；
所述树脂为wang树脂或2-氯树脂；
所述步骤S3中，所述氧化反应时加入氧化剂，所述氧化剂为DHS或NCS，所述氧化剂与线性普利卡那肽的质量比为0.6075g/g，所述通过氧化反应将线性普利卡那肽液相合成为普利卡那肽时，加入纯化水、变性剂、pH调节剂，然后加入稳定剂、氧化剂，接着降低温度，最后加入线性普利卡那肽进行反应得到普利卡那肽，所述稳定剂为乙二醇，所述温度降低到-10℃至-15℃，所述反应时的pH值为9-11。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述Leu-树脂的替代度为0.2-0.8mmo l/g。
22.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述Leu-树脂的替代度为0.2-0.5mmo l/g。
23.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述Cys 4、Cys7、Cys 12以及Cys15的侧链保护基为三苯甲基、二苯甲基、4-甲氧基三苯甲基。
24.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中的偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中，化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物。
26.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1，
DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
27.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中加入裂解液来裂解线性普利卡那肽的肽树脂。
28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述裂解液为TFA、H2O、PhOMe、苯甲硫醚按不同比例混合得到。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其特征在于所述裂解液的最优体积比为TFA:H2O:PhOMe:苯甲硫醚＝(85-95):(10-5):4:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112194708A (zh) * 2020-10-28 2021-01-08 杭州信海医药科技有限公司 一种普卡那肽的制备方法
CN113512091B (zh) * 2021-05-08 2023-06-27 漳州未名博欣生物医药有限公司 一种普卡那肽的合成方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103694320A (zh) * 2013-12-11 2014-04-02 深圳翰宇药业股份有限公司 一种普利卡那肽的制备方法
CN104628827A (zh) * 2015-03-10 2015-05-20 南京工业大学 一种普利卡那肽的制备方法
CN106554391A (zh) * 2015-09-29 2017-04-05 深圳翰宇药业股份有限公司 一种海洋生物肽Xen2174的合成方法
CN106892968A (zh) * 2015-12-18 2017-06-27 深圳翰宇药业股份有限公司 一种利那洛肽的合成方法
CN108250265A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 北京中科亚光生物科技有限公司 一种合成含有分子内二硫键的多肽的新工艺
CN108440652A (zh) * 2018-04-02 2018-08-24 杭州固拓生物科技有限公司 一种普卡那肽的固相合成方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103694320A (zh) * 2013-12-11 2014-04-02 深圳翰宇药业股份有限公司 一种普利卡那肽的制备方法
CN104628827A (zh) * 2015-03-10 2015-05-20 南京工业大学 一种普利卡那肽的制备方法
CN106554391A (zh) * 2015-09-29 2017-04-05 深圳翰宇药业股份有限公司 一种海洋生物肽Xen2174的合成方法
CN106892968A (zh) * 2015-12-18 2017-06-27 深圳翰宇药业股份有限公司 一种利那洛肽的合成方法
CN108250265A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 北京中科亚光生物科技有限公司 一种合成含有分子内二硫键的多肽的新工艺
CN108440652A (zh) * 2018-04-02 2018-08-24 杭州固拓生物科技有限公司 一种普卡那肽的固相合成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Discovery,structure,and chemical synthesis of disulfide-rich peptide toxins and their analogs;FANG等;《Chinese chemical letters》;20180205;第29卷;第1033-1042页 *
天然芋螺毒素肽的化学合成;安婷婷等;《中国海洋药物杂志》;20100630;第29卷(第3期);第42-47页 *
抗菌肽IB-367的固相合成与抑菌活性;王小青等;《合成化学》;20161231;第24卷(第7期);第600-603页 *

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