CN115385991A - 一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法 - Google Patents

一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法 Download PDF

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唐洋明
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Abstract

本发明公开了一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法，包括：合成硫酯片段I、片段II或合成硫酯片段III、片段IV；硫酯片段I与片段II或硫酯片段III与片段IV在水相中进行自然片段连接反应，得到普卡那肽线性粗肽M1或M2；普卡那肽线性粗肽M1或M2的半胱氨酸氨基酸残基经两步氧化环化，得到普卡那肽粗肽，经过分离纯化获得普卡那肽纯品。本发明通过自然化学连接法提高了普卡那肽线性肽的纯度，减少在氧化过程中产生的副产物，提高了氧化过程的收率。同时，由于所用多肽片段是裸露的，可预先纯化，大大减少最终产品的杂质，在最终纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未连接的部分片段，减轻纯化难度。

Description

一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法。
背景技术
普卡那肽(plecanatide)由美国Synergy制药公司研发，用于治疗慢性特发性便秘(CIC)及便秘型肠易激综合征(IBS-C)2种常见的胃肠道疾病的药物。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市，商品名为Trulance。普卡那肽是尿鸟苷蛋白(uroguanylin)的类似物，含有16个氨基酸的环状多肽，其序列为：H-Asn-Asp-Glu-Cys4-Glu-Leu-Cys7-Val-Asn-Val-Ala-Cys12-Thr-Gly-Cys15-Leu-OH(两对二硫键：Cys4-Cys12和Cys7-Cys15)，其结构式如下：
Figure BDA0003874487230000011
目前普卡那肽的合成方法主要采用固相逐步偶联法(Fmoc-SPPS)，虽然Fmoc/tBu固相逐步合成具有操作简单，自动化程度高等优点。但采用常规的保护氨基酸进行固相逐步偶联进行合成时发现由于分子间氢键的作用易于聚集，形成如β折叠片等二级结构，导致从Asn9树脂开始收缩，后续氨基酸偶联愈加困难，导致线性主链粗肽的纯度较差、收率低、工业化生产成本高。此外，普卡那肽的合成也可以使用全保护片段通过液相法合成，如：专利US10011637和CN201280021221.6，但是该方法需要提前制备2个以上的片段，且片段之间液相缩合后处理繁琐，工业化生产步骤多，成本高。
发明内容
为了解决现有技术中的不足：无论是固相逐步偶联法还是全保护片段液相法合成普卡那肽，普卡那肽线性肽的粗肽纯度往往都不高，导致在后续氧化过程中产生大量的错配等副产物，本发明旨在提供一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法。
具体技术方案如下：
本发明提供一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法，包括如下步骤：
(1)合成硫酯片段I、片段II或者合成硫酯片段III、片段IV；
所述硫酯片段I为H-Asn-Asp-Glu-Cys4-Glu-Leu-Cys(Acm)7-Val-Asn-Val-Ala-SR；
所述片段II为Cys12-Thr-Gly-Cys(Acm)15-Leu-OH；
所述合成硫酯片段III为H-Asn-Asp-Glu-Cys(Acm)4-Glu-Leu-SR；
所述片段IV为Cys7-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)12-Thr-Gly-Cys15-Leu-OH；
其中，所述SR为硫醇的残基；
(2)硫酯片段I与片段II或者硫酯片段III与片段IV在水相中进行自然片段连接反应，得到普卡那肽线性粗肽M1或者M2；
所述普卡那肽线性粗肽M1为：
H-Asn-Asp-Glu-Cys4-Glu-Leu-Cys(Acm)7-Val-Asn-Val-Ala-Cys12-Thr-Gly-Cys(Acm)15-Leu-OH；
所述普卡那肽线性粗肽M2为：
H-Asn-Asp-Glu-Cys(Acm)4-Glu-Leu-Cys7-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)12-Thr-Gly-Cys15-Leu-OH；
(3)普卡那肽线性粗肽M1或者M2的半胱氨酸氨基酸残基经两步氧化环化，得到普卡那肽粗肽，经过分离纯化获得普卡那肽纯品。
进一步地，所述硫醇为烷基硫醇或芳基硫醇；
优选地，所述烷基硫醇选自巯基乙酸甲酯，3-巯基丙酸乙酯，3-巯基丙酸甲酯和三氟乙硫醇中的一种；
优选地，所述芳基硫醇选自对巯基苯乙酸、对巯基苯酚和苯硫醇中的一种。
进一步地，所述自然化学连接反应的水相体系为Gu·HCl或Urea，芳基硫醇或烷基硫醇或Imidazole或Triazole，TCEP·HCl和Na2HPO4的混合液，所述混合液的pH值在6～8之间；
所述自然化学连接反应的反应温度为室温。
进一步地，所述Gu·HCl或Urea的浓度为6～8M，所述芳基硫醇或烷基硫醇的浓度为50mM～200mM，所述Imidazole或Triazole的浓度为2.0M～5.0M，所述TCEP·HCl的浓度为50mM～100mM，所述Na2HPO4的浓度为0～200mM。
进一步地，所述硫酯片段I与片段II的物质的量比为1.0～2.0：1
所述硫酯片段III与片段IV的物质的量比为1.0～2.0：1。
进一步地，所述氧化环化采用的氧化剂选自空气、O2、H2O2、GSSH、GSH、DMSO和碘中的一种或多种；
优选地，所述氧化剂为空气、DMSO、碘或H2O2。
进一步地，所述硫酯片段I、硫酯片段III通过固相合成、液相合成或固液相结合的合成方法合成得到；
所述片段II、片段IV通过固相合成或液相合成方法合成得到。
进一步地，所述硫酯片段I通过下述方法合成：在Fmoc-Ala-2CTC树脂上，按照肽序依序偶联Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH，偶联结束后裂解，除去溶剂，获得固体，将固体溶于有机溶剂中，加入PyBOP和硫醇，在-20℃以下，滴加DIPEA反应，经裂解纯化得到硫酯片段I。
进一步地，所述硫酯片段III通过下述方法合成：
方法a：在Fmoc-Leu-2CTC树脂上，按照肽序依序偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH，偶联结束后裂解，除去溶剂，获得固体，将固体溶于有机溶剂中，加入PyBOP和硫醇，在-20℃以下，滴加DIPEA反应，经裂解纯化得到硫酯片段III；
方法b：在Fmoc-Glu(wang Resin)-OAll树脂上，按照肽序依序偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH，偶联结束后，脱除Glu上的All保护，然后加入溶于DMF的HOBt，PyBOP，DIPEA和HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et的混合溶液，室温反应结束后，经裂解纯化得到硫酯片段III。
进一步地，所述HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et的合成步骤包括：称取Boc-Leu-OH和HBTU溶于乙腈中，加入DIPEA，0℃下活化，加入硫醇，0℃下反应，反应结束后旋蒸除去乙腈，加入乙酸乙酯溶解产物，分别用4％NaHCO3，1N HCl和饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥过滤，收集滤液，往滤液中加入氯化氢乙酸乙酯溶液室温下搅拌，反应结束后，旋蒸除去溶剂，再用乙酸乙酯洗涤，旋干，即得。
进一步地，所述方法还包括对步骤(2)中所得普卡那肽线性粗肽M1或者M2进行纯化；
优选地，所述纯化采用HPLC纯化。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法，本方法只需要合成两个片段，且在水相中通过自然化学连接得到线性粗肽，最后，线性粗肽的半胱氨酸氨基酸残基经氧化环化以形成普卡那肽。此连接方法连接效率高，反应条件温和，反应位点无消旋现象。通过自然化学连接法大大提高了普卡那肽线性肽的粗肽纯度，减少了在氧化过程中产生的副产物，提高了氧化过程的收率。同时，由于所有使用的多肽片段是裸露的，反应过程中不会导致氨基酸差向异构化、易于操作、转化迅速，并且可以通过高效液相色谱进行预先纯化一遍，大大减少最终产品消旋、缺损、水解产生的杂质，在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未连接的部分片段，减轻了纯化上的难度，具有较强的实际应用价值，适合工业生产。
附图说明
图1为本发明普卡那肽的合成路线图；
图2为普卡那肽精肽液相色谱图；
图3为普卡那肽精肽质谱图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
缩写及英文含义
Figure BDA0003874487230000041
Figure BDA0003874487230000051
实施例1：硫酯片段I的合成
1.Fmoc-Ala-2CTC树脂的合成
称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂50.0g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟后，抽干。称取Fmoc-Ala-OH(37.3g,120.0mmol)用500mLDMF溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIPEA(31.8ml,180.0mmol)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入50ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用500ml DMF x 5DMF洗涤树脂，500mLx3MTBE收缩，抽干后得到Fmoc-Ala-2CTC树脂60.0g，测得替代度为0.54mmol/g。
2.硫酯片段I的合成
称取替代度为0.54mmol/g的Fmoc-Ala-2CTC树脂18.5g于固相反应柱中，用200mLDMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用200ml x 2DBLK脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤。称取Fmoc-Val-OH(13.6g,40.0mmol)和HOBT(6.5g,44.0mmol)用150mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(8.2mL,48.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用200ml x 3DMF洗涤树脂，加入200mLDBLK x 2脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH。反应结束后，分别用200mL x 5DMF，200mL x3 DCM洗涤树脂，量取DCM 160ml和TFE 40ml混合均匀后加入到反应柱中，室温裂解2小时，反应结束后，收集裂解液，用200ml x 2DCM洗涤树脂，合并有机相，减压旋蒸除去大部分溶剂，隔膜泵拉干残留溶剂，得白色固体。将白色固体溶于200ml DMF，加入PyBOP(26.0g,50.0mmol)和3-巯基丙酸乙酯(40.2g，300.0mmol)，降温至-20℃，滴加DIPEA(12.9g,100.0mmol)，-20℃下反应3h。反应结束后，将反应液滴加至预冷的2L纯化水中，产生大量沉淀，通过真空过或离心收集固体，且用水洗涤两次。将产物在真空中干燥至恒重，得到18.5g全保护硫酯片段I。
将得到18.5g全保护硫酯片段I加入到的圆底烧瓶中，加入200mL预先降温至0℃左右的由TFA、TIS、水、EDT(90:5:2.5:2.55，v/v)组成的裂解试剂，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2.0L冰乙醚中沉淀，离心，2.0L x 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到11.3g硫酯片段I，纯度为85.6％。
实施例2：片段II的合成
1.Fmoc-Leu-2CTC树脂的合成
称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂50.0g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟后，抽干。称取Fmoc-Leu-OH(42.4g,120.0mmol)用500mLDMF溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIPEA(31.8ml,180.0mmol)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入50ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用500ml DMF x 5DMF洗涤树脂，500mlx3 MTBE收缩，抽干后得到Fmoc-Leu-2CTC树脂62.5g，测得替代度为0.51mmol/g。
2.片段II的合成
称取替代度为0.51mmol/g的Fmoc-Leu-2CTC树脂19.6g于固相反应柱中，用200mLDMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用200ml x 2DBLK脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(16.6g,40.0mmol)和HOBT(6.5g,44.0mmol)用150mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(8.2ml,48.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用200ml x 3DMF洗涤树脂，加入200ml DBLK x 2脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH。反应结束后，用200ml x 5DMF洗涤树脂，200ml x 3MTBE收缩，抽干，得到9.2g全保护片段II。
将得到9.2g全保护片段II加入到200ml的圆底烧瓶中，加入100ml预先降温至0℃左右的由TFA、TIS、水、EDT(90:5:2.5:2.55，v/v)组成的裂解试剂，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入1.0L冰乙醚中沉淀，离心，1.0L x 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到5.7g片段II，纯度92.5％。
实施例3：硫酯片段III的合成
称取替代度为0.51mmol/g的Fmoc-Leu-2CTC树脂19.6g于固相反应柱中，用200mlDMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用200ml x 2DBLK脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤。称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(17.0g,40.0mmol)和HOBT(6.5g,44.0mmol)用150mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(8.2ml,48.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用200ml x 3DMF洗涤树脂，加入200ml DBLK x 2脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH。反应结束后，分别用200ml x 5DMF，200ml x3 DCM洗涤树脂，量取DCM160ml和TFE 40ml混合均匀后加入到反应柱中，室温裂解2小时，反应结束后，收集裂解液，用200ml x 2DCM洗涤树脂，合并有机相，减压旋蒸除去大部分溶剂，隔膜泵拉干残留溶剂，得白色固体。将白色固体溶于200ml DMF，加入PyBOP(26.0g,50.0mmol)和3-巯基丙酸乙酯(40.2g，300.0mmol)，降温至-20℃，滴加DIPEA(12.9g,100.0mmol)，-20℃下反应3h。反应结束后，将反应液滴加至预冷的2L纯化水中，产生大量沉淀，通过真空过或离心收集固体，且用水洗涤两次。将产物在真空中干燥至恒重，得到14.2g全保护硫酯片段III。
将14.2g全保护硫酯片段III加入到圆底烧瓶中，加入150mL预先降温至0℃左右的由TFA、TIS、水、EDT(90:5:2.5:2.55，v/v)组成的裂解试剂，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入1.5L冰乙醚中沉淀，离心，1.5Lx 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到8.9g硫酯片段III，纯度：89.5％。
实施例4：硫酯片段III的合成：
1.Fmoc-Glu(wang Resin)-OAll树脂的合成：
称取替代度为0.75mmol/g的wang树脂53.3g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟后，抽干。称取Fmoc-Glu-OAll(40.9g,100.0mmol)，DMAP(0.49g,4mmol)和HOBt(16.2g,120.0mmol)用500ml DMF溶解，冰浴下加入DIC(20.3ml,130.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应3小时。反应结束后，用500ml x 3DMF洗涤树脂。量取乙酸酐210ml和吡啶180ml混合均匀后加入到反应柱中，封闭2小时。反应结束后，用500ml x5DMF洗涤树脂，500ml x3 MeOH收缩，抽干后得到Fmoc-Glu(wang Resin)-OAllyl树脂78.0g，测得替代度为0.36mmol/g。
2.制备化学物HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et
称取Boc-Leu-OH(11.5g，50mmol)和HBTU(19.0g，50mmol)溶于100mL乙腈中，加入DIPEA(17.4mL,100mmol)，0℃下活化5min。加入3-巯基丙酸乙酯(7.5mL,60mmol)，0℃下反应2小时。反应结束后旋蒸除去乙腈，加入100ml乙酸乙酯溶解产物，分别用4％NaHCO3，1NHCl和饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥过滤，收集滤液，往滤液中加入2.0mol/L氯化氢乙酸乙酯溶液100ml室温下搅拌2h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，再用乙酸乙酯洗涤三遍，旋干，最后得到13.8g油状化合物HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et，纯度95.6％。
3.硫酯片段III的合成：
称取替代度为0.36mmol/g的Fmoc-Glu(wang Resin)-OAll树脂27.8g于固相反应柱中，通过逐步偶联法依次偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH。偶联结束后分别用300ml x 3DMF和300ml x 3DCM洗涤树脂。称取Pd(PPh3)4(3.4g,3.0mmol,0.3eq.)和12eq.Morpholine(10.2ml,12mmol,12eq.)，用300ml DCM溶解，加入到反应柱中，反应90min脱除Glu上的Alloc保护。反应结束后，分别用300ml x3DCM，300ml x 3DMF洗涤树脂，称取HOBt(8.2g,60.0mmol)，PyBOP(26.0g,50mmol)，DIPEA(21.8ml,125.0mmol)和HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et(13.8g,48.6mmol)，用300ml DMF溶解后加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束后，用300ml x 5DMF洗涤树脂，300ml x 3MeOH收缩，抽干，得到13.5g全保护硫酯片段III。
将13.5g全保护硫酯片段III加入到圆底烧瓶中，加入150mL预先降温至0℃左右的由TFA、TIS、水、EDT(90:5:2.5:2.55，v/v)组成的裂解试剂，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入1.5L冰乙醚中沉淀，离心，1.5L x 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到8.2g硫酯片段III，纯度90.6％。
实施例5：片段IV的合成
称取替代度为0.51mmol/g的Fmoc-Leu-2CTC树脂19.6g于固相反应柱中，用200mlDMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用200ml x 2DBLK脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(23.4g,40.0mmol)和HOBt(6.5g,44.0mmol)用150ml DMF溶解，冰浴下加入DIC(8.2ml,48.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用200ml x 3DMF洗涤树脂，加入200ml DBLK x 2脱保护5min+7min，200ml x 5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH和Boc-Cys(Trt)-OH。反应结束后，用200ml x 5DMF洗涤树脂，200ml x 3MTBE收缩，抽干，得到15.8g全保护片段IV。
将15.8g全保护片段IV加入到圆底烧瓶中，加入150mL预先降温至0℃左右的由TFA、TIS、水、EDT(90:5:2.5:2.55，v/v)组成的裂解试剂，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入1.5L冰乙醚中沉淀，离心，1.5L x 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到9.6g片段IV，纯度88.2％。
实施例6：片段IV的合成
1.Fmoc-Gly-2CTC树脂的合成
称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂50.0g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟后，抽干。称取Fmoc-Gly-OH(36.6g,120.0mmol)用500mLDMF溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIPEA(31.8ml,180.0mmol)，25℃反应2小时。反应完成后，向反应液中继续加入50ml甲醇用于封闭未反应的活性位点，反应1小时。反应完成后，排干溶液，使用500ml DMF x 5DMF洗涤树脂，500mLx3 MTBE收缩，抽干后得到Fmoc-Gly-2CTC树脂55.0g，测得替代度为0.61mmol/g。
2.片段Boc-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-OH的合成
称取替代度为0.61mmol/g的Fmoc-Gly-2CTC树脂16.4g于固相反应柱中，用150mLDMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用150mL x 2DBLK脱保护5min+7min，150mL x 5DMF洗涤。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH(15.9g,40.0mmol)和HOBt(6.5g,44.0mmol)用100mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(8.2mL,48.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用150mL x 3DMF洗涤树脂，加入150mLDBLK x 2脱保护5min+7min，150mL x 5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH和Boc-Cys(Trt)-OH。反应结束后，分别用150mL x 5DMF，150mL x3DCM洗涤树脂，量取DCM 120ml和TFE 30ml混合均匀后加入到反应柱中，室温裂解2小时，反应结束后，收集裂解液，用150mL x 2DCM洗涤树脂，合并有机相，减压旋蒸除去大部分溶剂，隔膜泵拉干残留溶剂，得白色固体12.1g，纯度96.8％。
3.H-Cys(Trt)-Leu-OtBu的合成
称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(11.7g,20mmol)，H-Leu-OtBu·HCl(4.9g,22mmol)，HBTU(7.6g,20mmol)和HOBt(2.8g,22mmol)溶解在100mLDMF中，冷却至-5℃。在搅拌过程中缓慢滴加DIPEA(10.4ml,60mmol)，滴加完毕后，在0℃下反应2h。反应结束后，用200mL EtOAc和100ml 15％柠檬酸水溶液稀释反应液。收集有机相且用200ml EtOAc萃取水相，合并有机相，然后有机相用100ml 15％柠檬酸水溶液x3、饱和的NaHCO3 x3和饱和食盐水x3洗涤。经无水硫酸钠干燥，过滤后，减压旋蒸除去溶剂。最后将产物在石油醚/EtOAc(3:1)打浆后干燥，得到13.6g二肽Fmoc-Cys(Trt)-Leu-OtBu，纯度98.6％
在搅拌下将Fmoc-Cys(Trt)-Leu-OtBu(13.6g,18mmol)溶解在68ml 10％二乙胺/DCM溶液中，25℃下反应2h。反应结束后，减压旋蒸除去溶剂和挥发性物质，得到固体。将固体在石油醚打浆后过滤，再重复两遍，干燥后得到8.2g二肽H-Cys(Trt)-Leu-OtBu，纯度97.5％，收率78.0％。
4.片段IV的合成
将片段Boc-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-OH(12.1g,8.2mmol)，H-Cys(Trt)-Leu-OtBu(5.3g,9.9mmol)和PyBOP(4.7g,9.0mmol)溶于100ml DMF，降温至0℃，滴加DIPEA(2.4ml,14.0mmol)，0℃下继续搅拌30分钟，然后升温至25℃反应1.5h。反应结束后，将反应液滴加至预冷的1L纯化水中，产生大量沉淀，通过真空过或离心收集固体，且用水洗涤两次。将固体在真空中干燥至恒重，得到15.5g全保护片段IV。
将15.5g全保护片段IV加入到圆底烧瓶中，加入150mL预先降温至0℃左右的由TFA、TIS、水、EDT(90:5:2.5:2.55，v/v)组成的裂解试剂，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入1.5L冰乙醚中沉淀，离心，1.5Lx 3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到9.2g片段IV，纯度92.7％。
实施例7：普卡那肽线性肽M1的合成
称取硫酯片段I(1.80g,1.1mmol,85.6％,)和片段II(0.62g,1.0mmol,92.5％)溶于预先配置好的缓冲液(6M Gu·HCl，0.2M Na2HPO4，0.2M MPAA，0.05M TCEP·HCl，pH＝7.0)200mL中，室温反应2h。反应结束后，将反应液稀释过滤后，经HPLC制备纯化冻干后，得0.99g普卡那肽线性肽M1，收率54.4％，纯度92.7％。
实施例8：普卡那肽线性肽M2的合成
称取硫酯片段III(1.10g,1.1mmol,90.6％)和片段IV(1.13g,1.0mmol,92.7％)溶于预先配置好的缓冲液(6M Gu·HCl，0.2M Na2HPO4，0.2M MPAA，0.05M TCEP·HCl，pH＝7.0)200mL中，室温反应2h。反应结束后，将反应液稀释过滤后，经HPLC制备纯化冻干后，得1.14g普卡那肽线性肽M1，收率62.5％，纯度94.2％。
实施例9：普卡那肽线性肽M2的合成
称取硫酯片段III(1.10g,1.1mmol,90.6％)和片段IV(1.13g,1.0mmol,92.7％)溶于预先配置好的缓冲液(6M Gu·HCl,1％v/v巯基乙酸甲酯，0.05M TCEP·HCl，pH＝7.0)200mL中，室温反应2h。反应结束后，将反应液稀释过滤后，经HPLC制备纯化冻干后，得1.09g普卡那肽线性肽M1，收率59.9％，纯度95.1％。
实施例10：普卡那肽线性肽M2的合成
称取硫酯片段III(1.10g,1.1mmol,90.6％)和片段IV(1.13g,1.0mmol,92.7％)溶于预先配置好的缓冲液(6M Gu·HCl,2.5M Imidazole，0.05M TCEP·HCl，pH＝7.1)200mL中，室温反应8h。反应结束后，将反应液稀释过滤后，经HPLC制备纯化冻干后，得1.00g普卡那肽线性肽M1，收率54.8％，纯度93.6％。
实施例11：普卡那肽的合成
称取普卡那肽线性肽M1(0.92g，0.5mmol)用10％乙腈水溶液1000ml溶解，用氨水调pH为8-9，室温搅拌反应24h，HPLC中控反应，至线性肽反应完全。然后用乙酸将溶液pH调至3-4，10分钟内将碘单质(1.5mmol，0.38g)的乙腈溶液80ml缓慢滴加至反应液中，滴加完毕后继续反应0.5h，通过HPLC监控反应结束后。通过添加0.5M抗坏血酸水溶液猝灭多余的碘。然后，用25％氨水溶液将反应液的pH调节至6-7。将反应液过滤后，经HPLC制备纯化冻干后，得0.52g普卡那肽，收率56.2％，纯度99.1％。
实施例12：普卡那肽的合成
称取普卡那肽线性肽M2(0.92g，0.5mmol)用10％乙腈水溶液1000ml溶解，用氨水调pH为8-9，室温搅拌反应24h，HPLC中控反应，至线性肽反应完全。然后用乙酸将溶液pH调至3-4，10分钟内将碘单质(1.5mmol，0.38g)的乙腈溶液80ml缓慢滴加至反应液中，滴加完毕后继续反应0.5h，通过HPLC监控反应结束后。通过添加0.5M抗坏血酸水溶液猝灭多余的碘。然后，用25％氨水溶液将反应液的pH调节至6-7。将反应液过滤后，经HPLC制备纯化冻干后，得0.46g普卡那肽，收率49.7％，纯度99.3％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种通过自然化学连接法合成普卡那肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成硫酯片段I、片段II或者合成硫酯片段III、片段IV；
所述硫酯片段I为H-Asn-Asp-Glu-Cys4-Glu-Leu-Cys(Acm)7-Val-Asn-Val-Ala-SR；
所述片段II为Cys12-Thr-Gly-Cys(Acm)15-Leu-OH；
所述合成硫酯片段III为H-Asn-Asp-Glu-Cys(Acm)4-Glu-Leu-SR；
所述片段IV为Cys7-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)12-Thr-Gly-Cys15-Leu-OH；
其中，所述SR为硫醇的残基；
(2)硫酯片段I与片段II或者硫酯片段III与片段IV在水相中进行自然片段连接反应，得到普卡那肽线性粗肽M1或者M2；
所述普卡那肽线性粗肽M1为：
H-Asn-Asp-Glu-Cys4-Glu-Leu-Cys(Acm)7-Val-Asn-Val-Ala-Cys12-Thr-Gly-Cys(Acm)15-Leu-OH；
所述普卡那肽线性粗肽M2为：
H-Asn-Asp-Glu-Cys(Acm)4-Glu-Leu-Cys7-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)12-Thr-Gly-Cys15-Leu-OH；
(3)普卡那肽线性粗肽M1或者M2的半胱氨酸氨基酸残基经两步氧化环化，得到普卡那肽粗肽，经过分离纯化获得普卡那肽纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫醇为烷基硫醇或芳基硫醇；
优选地，所述烷基硫醇选自巯基乙酸甲酯，3-巯基丙酸乙酯，3-巯基丙酸甲酯和三氟乙硫醇中的一种；
优选地，所述芳基硫醇选自对巯基苯乙酸、对巯基苯酚和苯硫醇中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自然化学连接反应的水相体系为Gu·HCl或Urea，芳基硫醇或烷基硫醇或Imidazole或Triazole，TCEP·HCl和Na2HPO4的混合液，所述混合液的pH值在6～8之间；
所述自然化学连接反应的反应温度为室温。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gu·HCl或Urea的浓度为6～8M，所述芳基硫醇或烷基硫醇的浓度为50mM～200mM，所述Imidazole或Triazole的浓度为2.0M～5.0M，所述TCEP·HCl的浓度为50mM～100mM，所述Na2HPO4的浓度为0～200mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酯片段I与片段II的物质的量比为1.0～2.0：1
所述硫酯片段III与片段IV的物质的量比为1.0～2.0：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化环化采用的氧化剂选自空气、O2、H2O2、GSSH、GSH、DMSO和碘中的一种或多种；
优选地，所述氧化剂为空气、DMSO、碘或H2O2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酯片段I、硫酯片段III通过固相合成、液相合成或固液相结合的合成方法合成得到；
所述片段II、片段IV通过固相合成或液相合成方法合成得到。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酯片段I通过下述方法合成：在Fmoc-Ala-2CTC树脂上，按照肽序依序偶联Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH，偶联结束后裂解，除去溶剂，获得固体，将固体溶于有机溶剂中，加入PyBOP和硫醇，在-20℃以下，滴加DIPEA反应，经裂解纯化得到硫酯片段I。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酯片段III通过下述方法合成：
方法a：在Fmoc-Leu-2CTC树脂上，按照肽序依序偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH，偶联结束后裂解，除去溶剂，获得固体，将固体溶于有机溶剂中，加入PyBOP和硫醇，在-20℃以下，滴加DIPEA反应，经裂解纯化得到硫酯片段III；
方法b：在Fmoc-Glu(wang Resin)-OAll树脂上，按照肽序依序偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Boc-Asn(Trt)-OH，偶联结束后，脱除Glu上的All保护，然后加入溶于DMF的HOBt，PyBOP，DIPEA和HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et的混合溶液，室温反应结束后，经裂解纯化得到硫酯片段III；
优选地，所述HCl·H-Leu-SCH2CH2CO2Et的合成步骤包括：称取Boc-Leu-OH和HBTU溶于乙腈中，加入DIPEA，0℃下活化，加入硫醇，0℃下反应，反应结束后旋蒸除去乙腈，加入乙酸乙酯溶解产物，分别用4％NaHCO3，1N HCl和饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥过滤，收集滤液，往滤液中加入氯化氢乙酸乙酯溶液室温下搅拌，反应结束后，旋蒸除去溶剂，再用乙酸乙酯洗涤，旋干，即得。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤(2)中所得普卡那肽线性粗肽M1或者M2进行纯化；
优选地，所述纯化采用HPLC纯化。
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