CN112175067B - 一种替度鲁肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽药物制备技术领域，特别涉及一种替度鲁肽的制备方法。本发明的所述方法按照替度鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序，分别合成全保护的1‑3肽片段、4‑8肽片段、9‑13肽片段、14‑18肽片段、19‑23肽片段、24‑27肽片段、28‑33肽树脂，然后以28‑33肽树脂为起始树脂，与上述片段进行缩合，得到替度鲁肽树脂，最后裂解得到粗肽，经纯化得到纯品。本发明所述方法能有效解决D‑1His消旋、Asp‑Gly结构导致Asu副反应、长肽副反应累积三方面问题。本发明所述工艺，以较简便的工艺步骤同时实现了在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面的较高水平，与现有技术相比反应操作简单、工期短、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场前景。

Description

一种替度鲁肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，特别涉及一种替度鲁肽的制备方法。
背景技术
替度鲁肽，英文名为Teduglutide，具体肽序如下：
H-His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-Ile31-Thr32-Asp33-OH。
替度鲁肽(teduglutide)为重组胰高血糖素样肽-2(GLP-2)类似物，主要用于减少胃排空和分泌、并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。临床上用于治疗因严重肠部疾病或小肠大部切除导致营养成分不能吸收的短肠综合征。
替度鲁肽主链氨基酸有33个，其肽链较长且序列特殊结构导致在制备该产品的过程中多处容易发生副反应，进而对产品的收率、分离纯化、产品质量等产生较大的影响，如N端的His在缩合过程中容易产生消旋副反应，形成[D-1His]-替度鲁肽杂质；Asp-Gly结构在碱性环境下通过天冬酰亚胺结构容易发生消旋副反应，形成[3Asu]-替度鲁肽杂质、[D-3Asp]-替度鲁肽杂质、[iso-3Asp]替度鲁肽杂质；并且较长的肽序在每步反应不完全的情况下，累积的副反应容易导致较多的杂质。因此，需要设计合理的制备路线来避开上述副反应的发生，提高粗肽纯度、降低反相制备的难度，从而提高总收率、降低总成本。
专利CN104072603A公开了一种合成替度鲁肽的方法，其首先按照替度鲁肽肽序合成2-33片段，然后再用2-33多肽片段与由特定保护基保护的His合成原料在特定的偶联体系下偶联得到替度鲁肽。该专利针对D-1His-替度鲁肽杂质进行控制和检测，但未针对其他副反应进行针对性得研究和控制。
专利CN104072605A公开了一种替度鲁肽的合成方法，该方法以Asp-Gly片段中Gly以Hmb或Dmb为保护基来避免Asp-Gly形成的5元环[3Asu]-替度鲁肽杂质副反应，并且分片段来避免肽序偶联过长造成每步副反应的积累造成纯化困难，但未针对D-His偶联消旋杂质进行针对性得研究和控制。
专利CN104817638A公开了一种替度鲁肽得合成方法，该方法按照替度鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成1-2为片段、3-4位片段、5-33位片段，然后按照C端至N端顺序偶联3个多肽片段合成替度鲁肽。该专利针对D-His消旋副反应和Asp-Gly肽序副反应进行了研究，但是在偶联完成3-33片段，在碱性环境下依旧可以发生Asu副反应。
如何全面解决D-1His消旋、Asp-Gly结构导致Asu副反应、长肽副反应累积三方面问题，提高粗肽的纯度，从而提高反相制备的收率及产品的质量，是合成替度鲁肽的重点。
发明内容
为了克服现有技术领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于：提供替度鲁肽的制备工艺，本发明不仅合成周期短、粗肽纯度高、纯化收率高、而且容易实现工业化放大生产。
其具体步骤如下：
步骤1：全保护1-3肽片段R1-His(R2)-Gly-Asp(OtBu)-OH的合成：将固相载体依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、R1-His(R2)-OH或其盐在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到R1-His(R2)-Gly-Asp(OtBu)-Resin，经过裂解液裂解得到全保护1-3肽片段。
步骤2:全保护4-8肽片段Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH的合成：将固相载体依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Resin，经过裂解液裂解得到全保护4-8肽片段。
步骤3：全保护9-13肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-OH的合成：将固相载体依次与Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Resin，经过裂解液裂解得到全保护9-13肽片段。
步骤4：全保护14-18肽片段Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的合成：将固相载体依次与Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Resin，经过裂解液裂解得到全保护14-18肽片段。
步骤5：全保护19-23肽片段Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的合成：将固相载体依次与Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Resin，经过裂解液裂解得到全保护19-23肽片段。
步骤6：全保护24-27肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的合成：
将固相载体依次与Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Resin，经过裂解液裂解得到全保护24-27肽片段。
步骤7：28-33肽树脂Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin的合成：将固相载体依次与Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到得到28-33肽树脂。
步骤8:以28-33肽树脂为起始树脂，依次与全保护24-27肽片段、全保护19-23肽片段、全保护14-18肽片段、全保护9-13肽片段、全保护4-8肽片段、全保护1-3肽片段进在缩合剂存在下进行缩合，得到全保护肽树脂
R1-His(R2)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin。
步骤9：全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到替度鲁肽粗品。
步骤10：粗肽用乙腈/水混合溶解后，经过反相C18填料高效液相色谱柱纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到产品醋酸替度鲁肽。
具体地，步骤1-8所述的固体载体选自CTC Resin、Wang Resin。同时，作为优选，CTCResin的替代度0.4mmol/g～3.0mmol/g，wangresin的替代度为0.5mm ol/g～3.0mmol/g。
优选地，步骤1-8中所述的缩合剂选自HOBt、HOAT、DIC、DCC、EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、Py.BOP、Py.AOP、DPPA。作为优选方案，步骤1中的缩合剂选自HOBt、HOAT、DPPA。由于D-1His用常规的缩合剂缩合容易发生消旋副反应，产生D-1His消旋杂质。HOBt、HOAT、DPPA都可以特异地抑制消旋反应的发生，从而很好的避免D-His消旋杂质的产生。
作为优选方案，步骤1-7中所用的碱为DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡林、氢氧化钠。
在实际生产应用中，R1-His(R2)-OH氨基酸可以选择Boc-His(Boc)-OH或其盐、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Boc)-OH。同时，氨基酸的投料量比为1.5～3.0eq，氨基酸和缩合剂的比值以1：1.1为佳。
具体地，步骤1-7的肽片段只需脱除N端保护基，因此所选的裂解液是体积百分比为15％～30％的TFA/二氯甲烷组成的混合溶液。步骤8的替度鲁肽的全保护肽需要脱除N端保护基及侧链保护基，因此所选的裂解液是体积百分比为80％～95％的TFA、体积百分比1-10％的乙二硫醇、余量为纯化水组成的混合酸液。
纯化替度鲁肽粗品的方法优选为：将粗肽用20％ACN进行溶解，三乙胺调pH至8，超声，0.45μm有机膜过滤。滤液经C18柱纯化，流动相：A为0.1％-0.3％的三乙胺水溶液磷酸调PH值2-3；B为乙腈；梯度：B相为20％-40％，流速400mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合并合格样品峰。
本发明根据替度鲁肽的肽序及合成情况，将33肽合理拆分为7个片段，解决了D-1His消旋、Asp-Gly结构导致Asu副反应、长肽副反应累积三方面问题。本发明所述工艺，以较简便的工艺步骤同时实现了在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面的较高水平，与现有技术相比反应操作简单、工期短、成本低、收率高，容易达到产业化的要求，具有广泛的市场前景。
本发明权利要求书及说明书中涉及的英文缩写对应的中文名称如下表：
Figure GDA0002048511320000051
附图说明
图1所示为实施例9替度鲁肽粗肽的HPLC峰图。
图2所示为实施例10替度鲁肽精肽的HPLC峰图。
图3所示为实施例10替度鲁肽精肽的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1：全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH的合成
称取CTC Resin(100.00g，loading：1.0mmol/g)用800mL干燥DMF洗涤1次，抽干，800mL干燥DMF溶胀2h，抽干。
称取82.29g Fmoc-Asp(OtBu)-OH，冰浴下加入77.54g DIEA于溶液中，倒入反应柱中。室温下搅拌反应8h，加入甲醇100mL,继续反应0.5小时，抽去反应液，800mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 136.5g,替代度0.586mmol/g.
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取47.57gFmoc-Gly-OH，23.78g HOBt用800mLDMF溶解，冰浴下加入26.25g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取79.61g Boc-His(Trt)-OH用800mL DMF溶解，冰浴下加入110.1g DPPA、51.70gDIEA于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，-5℃下搅拌反应5h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干；再分别用800mLMeOH和800mL/次DCM各洗涤2次，取出树脂，烘干，得到肽树脂580.3g。
配置20％三氟乙醇的二氯甲烷溶液4.64L(体积比)，降温至0℃，加入上述肽树脂143.3g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，用甲醇/二氯甲烷体系重结晶后得到片段1白色粉末483.56g，纯度98.8％。
实施例2：全保护4-8肽片段Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH的合成
称取CTC Resin(100.00g，loading：1.0mmol/g)用800mL干燥DMF洗涤1次，抽干，800mL干燥DMF溶胀2h，抽干。
称取82.29g Fmoc-Asp(OtBu)-OH，冰浴下加入77.54g DIEA于溶液中，倒入反应柱中。室温下搅拌反应8h，加入甲醇100mL,继续反应0.5小时，抽去反应液，800mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 138.6g,替代度0.58mmol/g.
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取61.35g Fmoc-Ser(tBu)-OH，23.78g HOBt用800mL DMF溶解，冰浴下加入26.25g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH得到肽树脂721.2g。
配置20％三氟乙醇的二氯甲烷溶液5.77L(体积比)，降温至0℃，加入上述肽树脂721.2g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，用甲醇/二氯甲烷体系重结晶后得到片段1白色粉末542.3g，纯度98.2％。
实施例3：全保护9-13肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-OH的合成
称取CTC Resin(100.00g，loading：1.0mmol/g)用800mL干燥DMF洗涤1次，抽干，800mL干燥DMF溶胀2h，抽干。
称取70.68g Fmoc-Ile-OH，冰浴下加入51.70g DIEA于溶液中，倒入反应柱中。室温下搅拌反应8h，加入甲醇100mL,继续反应0.5小时，抽去反应液，800mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Ile-CTC Resin130.60g，替代度0.61mmol/g。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取63.59g Fmoc-Thr(tBu)-OH，23.78g HOBt用800mL DMF溶解，冰浴下加入26.25g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH得到肽树脂970.35g。
配置20％三氟乙醇的二氯甲烷溶液7.76L(体积比)，降温至0℃，加入上述肽树脂970.3g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，用甲醇/二氯甲烷体系重结晶后得到片段1白色粉末701.1g，纯度98.5％。
实施例4：全保护14-18肽片段Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的合成
称取CTC Resin(100.00g，loading：1.0mmol/g)用800mL干燥DMF洗涤1次，抽干，800mL干燥DMF溶胀2h，抽干。
称取62.27g Fmoc-Ala-OH，冰浴下加入51.70g DIEA于溶液中，倒入反应柱中。室温下搅拌反应8h，加入甲醇100mL,继续反应0.5小时，抽去反应液，800mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Ala-CTC Resin125.48g，替代度0.64mmol/g。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取56.55g Fmoc-Leu-OH，23.78gHOBt用800mL DMF溶解，冰浴下加入26.25g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH得到肽树脂913.82g。
配置20％三氟乙醇的二氯甲烷溶液7.31L(体积比)，降温至0℃，加入上述肽树脂913.8g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，用甲醇/二氯甲烷体系重结晶后得到片段1白色粉末630.6g，纯度98.7％
实施例5：全保护19-23肽片段Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的合成
称取CTC Resin(100.00g，loading：1.0mmol/g)用800mL干燥DMF洗涤1次，抽干，800mL干燥DMF溶胀2h，抽干。
称取70.68g Fmoc-Ile-OH，冰浴下加入51.70g DIEA于溶液中，倒入反应柱中。室温下搅拌反应8h，加入甲醇100mL,继续反应0.5小时，抽去反应液，800mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Ile-CTC Resin133.10g，替代度0.60mmol/g。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取56.55gFmoc-Phe-OH，23.78g HOBt用800mLDMF溶解，冰浴下加入26.25g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH得到肽树脂953.67g。
配置20％三氟乙醇的二氯甲烷溶液7.63L(体积比)，降温至0℃，加入上述肽树脂953.6g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，用甲醇/二氯甲烷体系重结晶后得到片段1白色粉末597.72g，纯度98.1％
实施例6：全保护24-27肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的合成
称取CTC Resin(100.00g，loading：1.0mmol/g)用800mL干燥DMF洗涤1次，抽干，800mL干燥DMF溶胀2h，抽干。
称取70.68g Fmoc-Ile-OH，冰浴下加入51.70g DIEA于溶液中，倒入反应柱中。室温下搅拌反应8h，加入甲醇100mL,继续反应0.5小时，抽去反应液，800mL DMF洗涤3次，再分别用500mLMeOH和500mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Ile-CTC Resin135.80g，替代度0.59mmol/g。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取56.55g Fmoc-Leu-OH，23.78gHOBt用800mL DMF溶解，冰浴下加入26.25g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH得到肽树脂930.17g。
配置20％三氟乙醇的二氯甲烷溶液7.44L(体积比)，降温至0℃，加入上述肽树脂930.1g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，用甲醇/二氯甲烷体系重结晶后得到片段1白色粉末585.68g，纯度98.3％。
实施例7：全保护28-33肽树脂
Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin的合成
称取Wang Resin(109.6g，loading：0.46mmol/g)用400mL DMF洗涤1次，抽干，400mLDMF溶胀2h，抽干。
称取70.68g Fmoc-Asp(OtBu)-OH 51.84g,HOBt 14.98g,1.5g DMAP用400mL DMF溶解，冰浴下加入16.54g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应6h，加入乙酸酐20mL，继续反应0.5h，抽去反应液，400mL DMF洗涤3次，再分别用400mLMeOH和400mL/次DCM各洗涤3次，取出树脂，烘干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-WangResin 130.2g，替代度0.31mmol/g。
加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，400mL/次/min，抽干，茚三酮检测，K+。
称取31.80g Fmoc-Thr(tBu)-OH、11.89g HOBt用400mL DMF溶解，冰浴下加入13.12g DIC于溶液中活化约5min，倒入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，400mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和保护氨基酸偶联操作依次偶联Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH,得到Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin湿树脂直接用于下步反应(规模40mmol)。
实施例8：替度鲁肽全保护树脂的制备
全保护28-33肽湿树脂加入20％的哌啶/DMF溶液(DBLK溶液)脱保护两次，800mL/次，5min+15min。脱保护完毕，DMF洗涤6次，800mL/次/min，抽干。
称取88.74g全保护24-27肽片段、3.46g HATU用800mLDMF溶解后，冰浴下加入,22.75g DIEA于溶液中活化约5min，入反应柱中，室温下搅拌反应2h，取样，茚三酮检测，K-；用DMF洗涤树脂3次，800mL/次/min，抽干。
按照此脱保护操作和全保护24-27肽片段偶联操作依次偶联全保护19-23肽片段、全保护14-18肽片段、全保护9-13肽片段、全保护4-8肽片段、全保护1-3肽片段得到替度鲁肽全保护肽树脂洗涤干燥后为340.16g。
实施例9：替度鲁肽粗肽的制备
配置裂解液(TFA/PhSMe/TIS/H2O,V/V/V/V,90/2.5/2.5/2.5)2.7L,降温至0℃，加入上述肽树脂340.16g，在0-5℃搅拌30min，恢复室温搅拌反应1.5h，反应完毕，减压浓缩，异丙醚沉降，过滤，得到粗肽148.08g，纯度87.84％。
实施例10：替度鲁肽的纯化
将粗肽用20％ACN进行溶解，溶解浓度25g/L，样品不溶，呈浑浊状，滴加三乙胺调pH至8，超声溶清0.45um有机膜过滤。滤液经C18柱纯化，流动相：A0.1％-0.3％的三乙胺水溶液磷酸调PH值2-3；B相：乙腈；B相梯度：20％-40％流速400mL/min，检测波长230nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的馏分，合格样品峰合并浓缩后醋酸转盐，浓缩冻干，得到96.53g白色絮状产品，纯度：99.67％，D-His替度鲁肽杂质0.22％；MS检测：1876.46(1/2M)、1251.3(1/3M+H)。

Claims (10)

1.一种替度鲁肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将固相载体依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、R1-His(R2)-OH或其盐在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到R1-His(R2)-Gly-Asp(OtBu)-Resin，经过裂解液裂解得到全保护1-3肽片段R1-His(R2)-Gly-Asp(OtBu)-OH，其中，R1选自Boc、Fmoc，R2选自Boc、Trt；
步骤2:将固相载体依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Resin，经过裂解液裂解得到全保护4-8肽片段Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH；
步骤3：将固相载体依次与Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Resin，经过裂解液裂解得到全保护9-13肽片段Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-OH；
步骤4：将固相载体依次与Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Resin，经过裂解液裂解得到全保护14-18肽片段Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH；
步骤5：将固相载体依次与Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Resin，经过裂解液裂解得到全保护19-23肽片段Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH；
步骤6：将固相载体依次与Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到Fmoc-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Resin，经过裂解液裂解得到全保护24-27肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH；
步骤7：将固相载体依次与Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH在碱或者缩合剂存在下进行缩合，得到全保护28-33肽树脂Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
步骤8:以28-33肽树脂为起始树脂，依次与全保护24-27肽片段、全保护19-23肽片段、全保护14-18肽片段、全保护9-13肽片段、全保护4-8肽片段、全保护1-3肽片段在缩合剂存在下进行缩合，得到全保护肽树脂
R1-His(R2)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
步骤9：全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到替度鲁肽粗品；
步骤10：替度鲁肽粗品经纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到醋酸替度鲁肽。
2.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的制备方法，其特征在于，步骤1-7所述的固相载体选自CTC Resin、Wang Resin。
3.根据权利要求2所述的一种制备替度鲁肽的方法，其特征在于：CTC Resin的替代度0.4mmol/g～3.0mmol/g，wang resin的替代度为0.5mm ol/g～3.0mmol/g。
4.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的制备方法，其特征在于：步骤1-8中所述的缩合剂选自HOBt、HOAT、DIC、DCC、EDC.HCl、HATU、HBTU、HCTU、Py.BOP、Py.AOP、DPPA。
5.根据权利要求1或4所述的所述的一种替度鲁肽的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的缩合剂选自HOBt、HOAT、DPPA。
6.根据权利要求1所述的一种制备替度鲁肽的方法，其特征在于，步骤1-7中所用的碱为DIEA、吡啶、碳酸氢钠、碳酸钠、吗啡林、氢氧化钠。
7.根据权利要求1所述的一种制备替度鲁肽的方法，其特征在于，氨基酸的投料量比为1.5～3.0eq，氨基酸和缩合剂的比值为1：1.1。
8.根据权利要求1所述的一种制备替度鲁肽的方法，其特征在于，步骤1-7所述裂解液采用体积百分比为15％～30％的TFA/二氯甲烷组成的混合溶液。
9.根据权利要求1所述的一种制备替度鲁肽的方法，其特征在于，步骤8所述裂解液采用体积百分比为80％～95％的TFA、体积百分比1-10％的乙二硫醇、余量为纯化水组成的混合酸液。
10.根据权利要求1所述的一种制备替度鲁肽的方法，其特征在于，步骤10纯化粗肽的方法为：粗肽用乙腈/水混合溶解后，用高效液相色谱法进行纯化，色谱柱为反相C18填料高效液相色谱柱，流动相：A为0.1％-0.3％的三乙胺水溶液磷酸调PH值2-3；B为乙腈；梯度：B相为20％-40％。
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