WO2013078889A1 - 自然偶联法制备艾塞那肽的方法 - Google Patents

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WO2013078889A1
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glu
pro
exenatide
gly
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宓鹏程
唐洋明
刘建
马亚平
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深圳翰宇药业股份有限公司
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to a method for preparing a polypeptide medicament, in particular to a method for preparing exenatide by a natural coupling method.
  • Exenatide is the first incretin analog developed by Eli Lilly and Amylin. It is a synthetic 39 amino acid peptide with endogenous incretin such as pancreatic hyperglycemia.
  • the peptide-like peptide-1 (GLP-1) acts similarly, promotes glucose-dependent insulin secretion, restores first-phase insulin secretion, inhibits glucagon secretion, slows gastric emptying, and improves pancreatic ⁇ -cells. The function and so on.
  • the resin used is an amino resin or a 2-CTC resin, wherein the amino resin is suitable for solid phase synthesis containing the C-terminal amide structure of exenatide.
  • Amino resin including Sieber resin, Rink Amide resin or Rink
  • 2-CTC resin is suitable for solid phase synthesis of peptide fragments with a C-terminal structure of 1 ⁇ 2.
  • the N-terminal amino protecting group is removed, and the exenatide is purified, and the N-terminal amino protecting group is Fmoc, which is removed by DBLK, and the DBLK is 1 by volume ratio. : 4 piperidine and DMF consisting. Purification treatment is a technical means commonly used in the art, and may include lyophilization if necessary.
  • the amino acid side chain of the peptide chain fragment When the liquid phase fragments of the prior art polypeptide are coupled, the amino acid side chain of the peptide chain fragment must be protected from errors in the coupling site due to the problem of selectivity during synthesis. Since the amino acid side chain of the fragment needs to be protected, the solubility of the peptide fragment is very low; if the side chain is not protected for synthesis, it must be that the peptide chain contains the coupling site of Cys, and since the peptide chain containing Cys is relatively small, the technique is limited. usage of.
  • the Exenatide peptide chain contains a plurality of Ser/Thr
  • the surprising discovery of the present invention is that the peptide chain containing Ser or Thr at the N-terminus can selectively perform fragment coupling without protecting the side chain, acetal
  • the main function of the structure is to ensure the selectivity of the fragment coupling.
  • the advantage of performing side chain unprotected synthesis is that the problems of dissolution, purification, and the like of the fragments are solved, and the yield is improved. And the efficiency of coupling has been greatly improved.
  • the invention has the beneficial effects of: operating the single cylinder, short synthesis cycle, low cost, easy intermediate purification, easy post-treatment, less by-products, high product yield, high purity of the final product, and good for Ai Mass production of ceratin.
  • FIG. 1 is a general process flow diagram of the present invention. detailed description
  • the invention discloses a method for preparing exenatide by a natural coupling method, and those skilled in the art can learn from the contents of the paper and appropriately improve the process parameters. It is to be understood that all such alternatives and modifications are obvious to those skilled in the art and are considered to be included in the present invention.
  • the method of the present invention has been described by way of a preferred embodiment, and it is obvious that the method and application described herein may be modified or appropriately modified and combined without departing from the spirit, scope and scope of the invention.
  • the techniques of the present invention are implemented and applied.
  • exenatide is divided into SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, and SEQ ID No. 3 as an example.
  • Example 1 Preparation of Fmoc protected full protective peptide fragment 11 at the N-terminus
  • SEQ ID No. 11 also referred to as peptide fragment 11 in the present invention, and its molecular structure is
  • peptide fragment 11 refers to a peptide fragment 11 containing a protective group tBu, OtBu protection, in the present invention
  • Senamin (1-10) has the same meaning.
  • Fmoc-exenatide (1-10)-OH crude peptide (10. 9 g, 6 mmol), salicylaldehyde (3.1 ml, 30 mmol) and DCC (2.5 g, 12 mmol) were dissolved in 400 ml of DCM and allowed to react at room temperature for 2 h. After the reaction was completed, the volume of the reaction solution was steamed to a volume ratio of ⁇ 25%, and then added to 100 times of anhydrous diethyl ether, centrifuged, washed with anhydrous diethyl ether, and dried in vacuo to give Fmoc-Essinide (1-10)- 0-salicylaldehyde 10.73 g.
  • Example 3 Removal of Fmoc-exenatide (1-10) -0-salicyl aldehyde protecting group
  • SEQ ID No. 12 which is also referred to as peptide fragment 12, refers to the 11-31 peptide fragment of the C-terminus of Exenatide, and has a molecular structure;
  • fully protected peptide fragment 12 refers to a peptide fragment 12 containing a protecting group Trt, OtBu, Pbf, tBt, Boc, in the present invention with "exenatide (11-31) "The meaning is the same.
  • the reaction is carried out for 2 h (the end point of the reaction is determined by the ninhydrin method. If the resin is colorless and transparent, the reaction is complete, the resin develops color, indicating that the reaction is incomplete, and the coupling reaction is further required). The above steps of removing Fmoc protection and adding the corresponding amino acid coupling are repeated, and Fmoc-Gly-OH is sequentially completed in the order of peptide fragment 12,
  • Fmoc-Arg(Pbf)-OH Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Met-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Boc-Ser(tBu)-OH, wherein the N-terminal protecting group of the last amino acid Ser is Boc.
  • Boc-exenatide (11-31)-OH crude peptide (23.31 g, 6 mmol), salicylaldehyde (3.1 ml, 30 mmol) and DCC (2.5 g, 12 mmol) were dissolved in 400 ml of DCM and allowed to react at room temperature for 2 h. After the reaction was completed, the volume of the reaction solution was steamed to a volume ratio of ⁇ 25%, and then added to 50 times of anhydrous diethyl ether, centrifuged, washed with anhydrous diethyl ether, and dried in vacuo to give Boc-Essinide (11-31) - 0-salicylaldehyde ester 22.13 g.
  • Example 6 Removal of Exenatide (11-31) -0-7 aldehyde ester protecting group
  • SEQ ID No. 3 which is also referred to as peptide fragment 3, refers to a peptide fragment of C-terminal 32-39 of exenatide, the molecular structure of which is Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser- NH 2 ; fully protected peptide fragment 3 is Refers to a peptide fragment containing a protective group tBu, which has the same meaning as "exenatide (32-39)" in the present invention.
  • Exenatide (1-31) fragment refers to a fragment of 1-31 peptides starting from the C-terminus according to the composition sequence of exenatide.
  • the acid salt was 2.33 g, and the HPLC purity was 98.9%.

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Abstract

本发明公开了一种制备艾塞那肽的方法，包括以下步骤：1）将艾塞那肽分成若干条肽片段，其中有N端为Thr或Ser肽片段以及构成艾塞那肽所需的其他肽片段，用固相合成方法获得；2）将偶联于步骤1）中N端为Thr或Ser肽片段N端的肽片段的C端形成酸酯结构；脱除侧链保护基团；3）脱除N端为Thr或Ser肽片段的侧链保护基团和N端保护基团；4）利用步骤2）所述的肽片段以及步骤3）所述肽片段在液相中偶联得到N端保护的艾塞那肽；5）除去N端氨基保护基，纯化处理得艾塞那肽。该方法具有反应操作简单、中间体可控、反应周期短、收率高、成本低的特点。

Description

自然偶联法制备艾塞那肽的方法
本申请要求于 2011年 12月 2日提交中国专利局、 申请号为
201110396050.2、 发明名称为"自然偶联法制备艾塞那肽的方法"的中国专利申 请的优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请中。 技术领域
本发明涉及一种多肽药物的制备方法，尤其涉及自然偶联法制备艾塞那肽 的方法。 背景技术
艾塞那肽， 英文名为 exenatide, 其分子结构为
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va 1-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pr o-Ser-NH
艾塞那肽是由美国礼来公司与 Amylin公司共同研发的第一个肠降血糖素 类似物， 是人工合成的由 39个氨基酸组成的多肽， 与内源性肠降血糖素如胰 高血糖素样肽 -1 ( GLP-1 )作用相似， 具有促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌， 恢 复第一时相胰岛素分泌， 抑制胰高血糖素的分泌， 减慢胃内容物的排空， 改善 胰腺 β细胞的功能等作用。
现有技术 US6924264、 US7157555 , US6902744中， 艾塞那肽的制备均采 用固相合成的方法。 此种方法由于艾塞那肽是含有 39个氨基酸的长肽， 存在 技术难度大、 合成周期长、 生产成本高、 过程中间体因为不能纯化带来的产物 纯度不高， 不利于大规模生产等问题。
WO2011006644A2专利中报道了采用固液结合的方法进行艾塞那肽的合 成。 将艾塞那肽分为 1-10、 11-21、 22-29、 30-39四个片段, 固相方法分别合 成出每个全保护肽片段， 然后将几个片段在液相中偶联得到艾塞那肽。这种方 法由于每个片段都是全保护肽， 因此存在疏水性强、 肽链溶解性差、 片段纯化 困难、 片段间偶联效率低下等问题。
艾塞那肽的现有合成方法存在操作繁瑣， 合成周期长， 废液多， 不利于环 保， 成本高昂以及不利于大规模生产的缺点。 发明内容
1 )将艾塞那肽分成 M条肽片段， M=2或 3; 其中有 L条 N端为 Thr或 Ser肽片段， L=l或 2, T条构成艾塞那肽所需的其他肽片段， L+T=M; 用固 相合成方法获得所述的 M条侧链全保护的肽片段 ；
2 )将偶联于步骤 1 ) N端为 Thr或 Ser肽片段 N端的肽片段 C端形成乙 缩醛结构； 脱除侧链保护基团， 形成肽片段 C端乙缩醛结构；
3 )脱除 N端为 Thr或 Ser肽片段的侧链保护基团和 N段保护基团， 得 N 端为 Thr或 Ser肽片段；
4 )利用步骤 2 )所述的肽片段 C端乙缩醛结构以及步骤 3 )所述的 N端 为 Thr或 Ser肽片段在液相中偶联得到 N端保护的艾塞那肽；
5 ) 除去 N端氨基保护基， 纯化处理得艾塞那肽；
作为本发明的进一步改进， 所述步骤 1 )所述固相合成方法， 所使用的树 脂为氨基树脂或 2-CTC树脂， 其中氨基树脂适用于含有艾塞那肽 C端酰胺结 构的固相合成， 氨基树脂包括 Sieber树脂、 Rink Amide树脂或 Rink
Amide-MBHA树脂。
2-CTC树脂适用于 C端为 ½结构的肽片段固相合成。
在片段肽合成过程中需要在弱酸情况下将肽链片段从树脂裂解下来而不 影响氨基酸侧链保护基团。 而这些侧链保护基团在 C端的羧基结构转化为乙
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09.080/ZT0ZN3/X3d 6888.0/CT0Z OAV 作为本发明的进一步改进， 所述步骤 5 )中， 除去 N端氨基保护基， 纯化 处理得艾塞那肽； N端氨基保护基为 Fmoc, 采用 DBLK脱除， 所述 DBLK由 体积比为 1: 4的哌啶和 DMF组成。 纯化处理为本领域常用的技术手段， 必 要时可以包括冻干。
现有技术多肽液相片段偶联时， 由于合成时选择性的问题， 肽链片段的氨 基酸侧链必须保护以防止偶联位点出现差错。由于片段的氨基酸侧链是需要保 护的， 肽片段溶解度很低； 如果侧链不保护进行合成， 必须是肽链含有 Cys 这个偶联位点， 由于含有 Cys的肽链相对较少， 限制了技术的使用。 艾塞那肽 肽链中含有多个 Ser/Thr, 本发明意外的发现， 采用 N端含有 Ser或 Thr的肽 链可以在不保护侧链的情况下选择性的进行片段偶联，乙缩醛结构主要的作用 在于保证片段偶联时的选择性。进行侧链不保护合成的优点在于，解决了片段 的溶解、 纯化等问题， 提高了收率。 并且对偶联时的效率有了极大的提高。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：操作筒单，合成周期短，成本低， 中间体易纯化， 后处理容易， 副产物少， 产品收率高， 最终产品纯度高， 利于 艾塞那肽的大规模生产。 附图说明
图 1为本发明总的工艺流程图。 具体实施方式
本发明公开了一种自然偶联法制备艾塞那肽的方法，本领域技术人员可以 借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本 发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明 内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来 实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案， 下面结合具体 实施例对本发明作进一步的详细说明。 氨基树脂和 2-CTC树脂购自天津南开和成有限公司， 各种保护氨基酸购 自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表 中：
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
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下面以艾塞那肽分为 SEQ ID No.ll、 SEQ ID No.12, SEQ ID No.3为例作 具体说明。 实施例 1: 在 N端有 Fmoc保护的全保护肽片段 11制备
SEQ ID No.ll , 本发明中也称为肽片段 11 , 其分子结构为
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OH;全保护的肽片段 11是指含有保 护基团 tBu, OtBu保护的肽片段 11 , 在本发明中与 "艾塞那肽（ 1-10 ) "含义相 同。
Fmoc-Leu-CTC树脂的制备
称取替代度为 0.5 mmol/g的 2-CTC树脂 20g,加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟； 取 7.1g Fmoc-Leu-OH用 DMF溶解， 冰水浴 下加入 5.22mL DIEA活化； 然后加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小时； 加入 8mL无水甲醇封闭 1小时。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 用无水甲醇封闭 30分钟， 收缩抽干， 得到 Fmoc-Leu-CTC树脂， 检测替代度为 0.42mmol/g。
B. N端有 Fmoc保护的全保护肽片段 11的制备
1. 氨基酸的偶联
称取替代度为 0.42mmol/g的 Fmoc-Leu-CTC树脂 19 g, 加入固相反应柱 中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Leu-CTC树脂 30分钟， 用 DBLK 脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。 将 10.21g
Fmoc-Asp(OtBu)-OH ( 24mmol ), 3.89 g HOBt ( 28.8 mmol ), 3.63g DIC ( 28.8 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 加入固相反应柱中， 室 温反应 2 h (反应终点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶联反应 lh )。 重复上述脱除 Fmoc保护和 加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照肽片段 11的顺序， 依次完成
Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-His(Trt)-OH偶联， 其中最后一个氨基酸 His偶联结束后不用脱除 Fmoc。反应结束后用甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到 Fmoc-全保护的肽片段 11-CTC树脂 30.91g。 2.裂解 Fmoc-全保护的肽片段 11-CTC树脂， 得到全保护的肽片段 11 称取 Fmoc-艾塞那肽（1-10 ) -CTC树脂 30g, 加入至 500ml烧瓶中。 配置裂 解试剂 300ml (体积比， TFE: DCM=1:4 ), 将裂解试剂倒入烧瓶中， 室温反 应 2h。 反应结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至体积比 < 25%后， 滴加至 500ml沉淀试剂中 （正己烷： 乙醚体积比 =1:4 ), 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥， 得到 Fmoc-艾塞那肽（ 1-10 ) -OH粗肽 14.28g。 实施例 2: Fmoc-艾塞那肽（ 1-10 ) -0-水杨醛酯的制备
将 Fmoc-艾塞那肽 ( 1-10 ) -OH粗肽 ( 10.9g, 6mmol )、 水杨醛 ( 3.1ml, 30mmol )和 DCC ( 2.5g, 12mmol )溶于 400ml DCM中 , 室温反应 2h。 反应 结束，将反应液体积旋蒸至体积比 < 25%后，加入 100倍量无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到 Fmoc-艾塞那肽（ 1-10 )-0-水杨醛酯 10.73g。 实施例 3: 脱除 Fmoc-艾塞那肽（ 1-10 ) -0-水杨醛酯保护基
将 Fmoc-艾塞那肽（ 1-10 ) -0-水杨醛酯（ 9.6g, 5mmol )置于反应容器中， 加入 200ml裂解液中（TFA: H20: TIS体积比 =95:2.5:2.5 ), 室温搅拌反应 2h。 反应结束后， 将反应液倒入 2L无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空 干燥， 得到 Fmoc-肽片段 11-0-水杨醛酯， 即
Fmoc-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-O-salicylaldehyde ester,产物重 量 6.85g。 实施例 4: 在 N端有 Boc保护艾塞那肽（ 11-31 ) 的制备
SEQ ID No.12, 本发明也称为肽片段 12, 是指艾塞那肽 C端的 11-31肽 片段， 分子结构为；
Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gl y-Gly-Pro-OH; 全保护的肽片段 12是指含有保护基团 Trt, OtBu、 Pbf、 tBt、 Boc保护的肽片段 12, 在本发明中与 "艾塞那肽（11-31 ) "含义相同。
Fmoc-Pro-CTC树脂的制备
称取替代度为 0.4 mmol/g的 2-CTC树脂 25g,加入到固相反应柱中，用 DMF 洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟； 取 6.75g Fmoc-Pro-OH用 DMF溶解， 冰水浴 下加入 5.22mL DIEA活化， 加入上述装有树脂的反应柱中， 反应 2小时后； 加 入 8mL无水甲醇封闭 1小时。 用 DMF洗涤 3次， DCM洗 3次， 用无水甲醇封闭 30 分钟， 收缩抽干， 得到 Fmoc-Pro-CTC树脂， 检测替代度为 0.35mmol/g。
B. N端有 Boc保护的全保护片段 12的制备
1. 氨基酸的偶联
称取替代度为 0.35mmol/g的 Fmoc-Pro-CTC树脂 25.7 g,加入固相反应柱 中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Pro-CTC树脂 30分钟， 用 DBLK 脱除 Fmoc保护，然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。将 8.03 g Fmoc-Gly-OH ( 27mmol ), 4.38 g HOBt ( 32.4 mmol ), 4.08 g DIC ( 32.4 mmol )溶于体积比 为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反应终 点以茚三酮法检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反 应不完全， 需再偶联反应 lh )。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶 联的步骤， 按照肽片段 12的顺序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH 、
Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH , Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Leu-OH、
Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Lys(Boc)-OH、 Boc-Ser(tBu)-OH, 其中最后一个氨基酸 Ser的 N端保护 基为 Boc。反应结束后用甲醇收缩， 树脂真空干燥过夜， 称重得到 Boc-艾塞那 肽（ 11-31 ) -CTC树脂 50.77g。 2. 裂解 Boc-艾塞那肽（11-31 ) -CTC树脂， 得到全保护肽片段 12 称取 Boc-艾塞那肽（ 11-31 ) -CTC树脂 50.0g, 加入至 1000ml烧瓶中。 配置裂解试剂 500ml ( TFE: DCM体积比 =1:4 ), 将裂解试剂倒入烧瓶中， 室 温反应 2h。 反应结束， 过滤树脂， 收集滤液。 将滤液体积旋蒸至体积比 < 25% 后， 滴加至 2000ml沉淀试剂中 （正己烷： 乙醚体积比 =1:4 ), 离心， 无水乙醚 洗涤， 并且真空干燥， 得到 Boc-艾塞那肽（11-31 ) -OH粗肽 29.22 g。 实施例 5: 制备 Boc-艾塞那肽（ 11-31 ) -OH的水杨醛酯
将 Boc-艾塞那肽（ 11-31 ) -OH粗肽（23.31 g, 6mmol )、 水杨醛（3.1ml, 30mmol )和 DCC ( 2.5g, 12mmol )溶于 400ml DCM中 , 室温反应 2h。 反应 结束，将反应液体积旋蒸至体积比 < 25v%后，加入 50倍量无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到 Boc-艾塞那肽（11-31 ) -0-水杨醛酯 22.13 g。 实施例 6: 艾塞那肽（ 11-31 ) -0-7^醛酯保护基的脱除
将 Boc-艾塞那肽（ 11-31 ) -0-水杨醛酯粗肽（ 19.94 g, 5mmol )置于反应 容器中， 加入 300ml裂解液中 （TFA: H20: TIS体积比 =95:2.5:2.5 ), 室温搅 拌反应 2h。反应结束后，将反应液倒入 3L无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥， 得到肽片段 12-0-水杨醛酯， 即
Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gl y-Gly-Pro-O-salicylaldehyde ester , 产物重量 11.65g。 实施例 7: 肽片段 3制备
SEQ ID No.3 , 本发明也称为肽片段 3 , 是指艾塞那肽 C端 32-39的肽片 段， 其分子结构为 Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2; 全保护的肽片段 3是 指含有保护基团 tBu保护的肽片段， 在本发明中与 "艾塞那肽（32-39 ) "含义 相同。
l. Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Sieber树脂的制备
称取替代度为 0.3 mmol/g的 sieber树脂 33.3 g, 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 2次， 用 DMF溶胀树脂 30分钟， 用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后 用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。将 Fmoc-Pro-OH ( 10.12 g , 30mmol ), HOBt ( 4.86 g , 36 mmol ), DIC ( 4.54 g, 36 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反应终点以茚三酮法检测 为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需再偶 联反应 lh )。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照肽 片段 3的顺序， 依次完成 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Boc-Ser(tBu)-OH, 其中最后 一个氨基酸 Ser的 N端保护基为 Boc。反应结束后用甲醇收缩， 树脂真空干燥 过夜， 称重得到 Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Sieber树脂 42.04g。
2. Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Sieber树脂的裂解
将 Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Sieber树脂 42g置于反应容器中， 加入 420ml 裂解液中 （TFA: H20: TIS体积比 =95:2.5:2.5 ), 室温搅拌反应 2h。 反应结束 后， 将反应液倒入 4.2L无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥， 得到产物 Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 6.26g。 实施例 8: 肽片段 3制备
l. Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide树脂的制备
称取替代度为 0.38 mmol/g的 Rink Amide树脂 26.3 g, 加入到固相反应柱 中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟，用 DBLK脱除 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。 将 Fmoc-Pro-OH ( 10.12 g , 30mmol ), HOBt ( 4.86 g , 36 mmol ), DIC ( 4.54 g, 36 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM 和 DMF混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反应终点以茚三酮法 检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需 再偶联反应 lh )。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按 照肽片段 3的顺序， 依次完成 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Boc-Ser(tBu)-OH。 其中最后 一个氨基酸 Ser的 N端保护基为 Boc。反应结束后用甲醇收缩， 树脂真空干燥 过夜， 称重得到 Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide树脂 35.03g。
2. BOC-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide树脂的裂解
将 Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide树脂 35g置于反应容器中， 加入
350ml裂解液中 （TFA: H20: TIS体积比 =95:2.5:2.5 ), 室温搅拌反应 2h。 反 应结束后， 将反应液倒入 3.5L无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空 干燥， 得到产物 Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 6.32g。 实施例 9: 肽片段 3制备
1. Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂的制备
称取替代度为 0.43 mmol/g的 RinkAmide-MBHA树脂 23.2 g,加入到固相 反应柱中，用 DMF洗涤 2次，用 DMF溶胀树脂 30分钟，用 DBLK脱除 Fmoc 保护，然后用 DMF洗涤 4次， DCM洗 2次。将 Fmoc-Pro-OH( 10.12 g , 30mmol ), HOBt ( 4.86 g , 36 mmol ), DIC ( 4.54 g, 36 mmol )溶于体积比为 1:1的 DCM 和 DMF混合溶液， 加入固相反应柱中， 室温反应 2 h (反应终点以茚三酮法 检测为准， 如果树脂无色透明， 则反应完全， 树脂显色， 表示反应不完全， 需 再偶联反应 lh )。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按 照肽片段 3的顺序， 依次完成 Fmoc-Pro-OH 、 Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Boc-Ser(tBu)-OH。 其中最后 一个氨基酸 Ser的 N端保护基为 Boc。反应结束后用甲醇收缩， 树脂真空干燥 过夜， 称重得到 Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂 31.2g。
2. Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂的裂解
将 Boc-艾塞那肽（ 32-39 ) -Rink Amide-MBHA树脂 31g置于反应容器中， 加入 310ml裂解液中（ TFA: H20: TIS体积比 =95:2.5:2.5 ), 室温搅拌反应 2h。 反应结束后， 将反应液倒入 3.1L无水乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真 空干燥， 得到产物 Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 6.23g。 实施例 10: 在 N端有 Fmoc保护的艾塞那肽（1-31 ) 片段的制备
艾塞那肽（ 1-31 ) 片段是指按照艾塞那肽组成顺序从 C端开始 1-31个 肽的片段。
将实施例 3中制备的
Fmoc-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-O-salicylaldehyde ester
( 5.56g, 4mmol )与实施例 6中制备得到的
Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gl y-Gly-Pro-O-salicylaldehyde ester ( 10.26g, 4mmol ) 混合溶解于 40ml吡啶 /醋 酸（摩尔比， 1:1 ), 室温搅拌反应 4h。 将反应液中醋酸旋干， 加入至 200ml 乙醚中， 离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥得到白色固体。然后，加入 100ml 反应液（TFA: H20: TIS体积比 =94: 5: 1 ) 室温反应 5min后， 将反应液加 入至 1000ml乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥得到产物
Fmoc-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-O-salicylaldehyde ester 12.36g, 收率 80.6%。 MALDI-TOF: ( M+H ) +=3833.2。 实施例 11: 在 N端有 Fmoc保护的艾塞那肽的制备
将实施例 10中制备的 Fmoc-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-O-salicylaldehyde ester ( 11.50g, 3mmol )与上述实施例中制备得到的
H-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 ( 2.09g, 3mmol )混合溶解于 40ml吡 醋酸（摩尔比， 1:1 ),室温搅拌反应 4h。将反应液中醋酸旋干，加入至 200ml 乙醚中， 离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥得到白色固体。然后，加入 100ml 反应液（TFA: H20: TIS体积比 =94: 5: 1 ) 室温反应 5min后， 将反应液加 入至 1000ml乙醚中， 离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥得到产物
Fmoc-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro -Pro-Pro-Ser-NH2 10.31g, 收率 77.9%。 MALDI-TOF: ( M+H ) +=4409.0。 实施例 12: 艾塞那肽的制备
将实施例 11中得到的
Fmoc-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro -Pro-Pro-Ser-NH2 8.82 g 溶于 50ml DBLK中，室温反应 30min后，加入 1000ml 无水乙醚中， 析出白色沉淀离心， 无水乙醚洗涤， 并且真空干燥得到产物艾塞 那肽
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va 1-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pr o-Ser-NH2, 产物重量 8.23g, 收率 98.3%。 MALDI-TOF: ( M+H ) +=4186.9。 实施例 13 艾塞那肽精肽醋酸盐的制备
称取 8.0 g 艾塞那肽粗肽用 400 ml水溶解后， 采用 Waters 2545 RP-HPLC 系统， 波长 230nm, 色谱柱为 50x250 mm反相 C18柱， 常规 0.2%TFA/乙腈 流动相纯化， 收集目的峰愤分， 得到纯度大于 98.5%精肽。 将精肽溶液采用 Waters 2545 RP-HPLC系统， 色谱柱为 50x250 mm反相 C18柱， 0.2%醋酸溶 乙腈流动相转盐， 收集目的峰愤分， 旋转蒸发浓缩， 冻干得到艾塞那肽醋 酸盐精肽 2.33g, HPLC纯度 98.9%。 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不 能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干筒单推演或替 换， 都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种艾塞那肽的制备方法， 包括以下步骤：
1 )将艾塞那肽分成 M条肽片段， M=2或 3; 其中有 L条 N端为 Thr或 Ser肽片段， L=l或 2, T条构成艾塞那肽所需的其他肽片段， L+T=M; 用固 相合成方法获得所述的 M条侧链全保护的肽片段 ；
2 )将偶联于步骤 1 ) N端为 Thr或 Ser肽片段 N端的肽片段 C端形成乙 缩醛结构； 脱除侧链保护基团， 形成肽片段 C端乙缩醛结构；
3 )脱除 N端为 Thr或 Ser肽片段的侧链保护基团和 N段保护基团， 得 N 端为 Thr或 Ser肽片段；
4 )利用步骤 2 )所述的肽片段 C端乙缩醛结构以及步骤 3 )所述的 N端 为 Thr或 Ser肽片段在液相中偶联得到 N端氨基保护的艾塞那肽；
5 ) 除去 N端氨基保护基， 纯化处理得艾塞那肽；
2. 根据权利要求 1所述的制备方法， 其特征在于： 步骤 1 )所述固相合 成方法， 所使用的树脂为氨基树脂或 2-CTC树脂， 其中氨基树脂适用于含有 艾塞那肽 C端酰胺结构的固相合成， 2-CTC树脂适用于 C端为羧基结构的肽 片段固相合成。
3. 根据权利要求 2所述的制备方法， 其特征在于： 氨基树脂包括 Sieber 树脂、 Rink Amide树脂或 Rink Amide-MBHA树脂。
4. 根据权利要求 1所述的制备方法， 其特征在于： 参与片段偶联的 Thr 或 Ser使用氨基保护基团， 氨基保护基团为 Boc。
5. 根据权利要求 1所述的制备方法， 其特征在于： 肽片段 C端形成乙缩 醛结构， 所使用的醛为水杨醛。
6. 根据权利要求 1所述的制备方法， 其特征在于： 步骤 5 )所述 N端 氨 基保护基为 Fmoc, 脱除试剂为 DBLK。 ΗΟ-ο¾-^ΪΟ-^
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09.080/ZT0ZN3/X3d 6888.0/ClOZ OAV SEQ ID No.13:
Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gl y-Gly-Pro-Ser-OH
SEQ ID No.14:
Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gl y-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
SEQ ID No.15:
Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp -Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
SEQ ID No.16:
Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Le u-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
8、 根据权利要求 1所述的制备方法， 其特征在于： N端为 Thr或 Ser肽 片段为 SEQ ID No.3或 SEQ ID No.12,构成艾塞那肽所需的其他肽片段 SEQ ID No.ll。
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