CN101538324B - 一种制备艾塞那肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备艾塞那肽的方法，包括如下步骤：1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和替代度为0.1mmol/g～0.8mmol/g的Sieber Amide树脂为起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide树脂；2)采用逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护艾塞那肽-SieberAmide树脂；3)对树脂裂解脱保护基团，冰乙醚沉淀，得到粗肽；粗肽经高压液相纯化、冻干得到艾塞那肽。本发明采用的制备艾塞那肽的工艺方法具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等特点，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，尤其是涉及一种制备艾塞那肽的合成工艺。
背景技术
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，高血糖主要由胰岛素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分两种，胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)，其中II型糖尿病患者占90％以上。WHO统计结果显示，目前全球已经诊断的II型糖尿病达到1.3亿人，我国已超过4000万人，是继印度之后的第二大糖尿病大国。
常用的II型糖尿病治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖甘酶抑制剂、噻唑烷二酮类及胰岛素等。但研究发现，这几类常用药物都有可能造成身体的不良反应，特别是二甲双胍，有导致患者乳酸性酸中毒的危险性；而胰岛素治疗也常导致低血糖的发生。因此，迫切需要研制出新的II型糖尿病治疗药物。
1995年，美国专利US5424286公开了一种从南美大毒蜥(Gilka monster，Heloderma Horridum)的唾液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽，Exendin-4
(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2)。其结构与人的胰高血糖素(Glucagon)有48％的同源性，与人的GLP-1(胰高血糖素样肽-1)有53％的同源性。
研究表明，作为GLP-1的类似物，Exendin-4能够与GLP-1受体作用，通过 刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，减慢胃排空速率，抑制食物摄入。其促胰岛素分泌作用是根据血糖水平进行的，故可降低低血糖的发生率，且对其他促胰岛素分泌剂不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖作用，同时GLP-1还可以减轻II型糖尿病患者的体重，是一类全新的糖尿病治疗药物。
2005年4月，美国礼来公司和Amylin公司共同开发的糖尿病药物倍它(Byetta，化学名Exenatide(人工合成的Exendin-4))获美国FDA批准上市。与此同时，国外许多制药公司如诺和诺德制药公司、默克制药公司也在争相研发与倍它属于同类型的药物。另外，国内外也有对Exendin-4进行PEG修饰的(CN101125207)报道。
最近的Exenatide及其类似物的制备方法主要有两种，其中一种是采用生物合成技术，利用人工基因重组方式得到Exenatide全序列(如CN1635117、CN1693459)；另一种为固相合成方法，如美国专利文献US6902744中采用RinkAmide MBHA Resin为反应载体，HBTU为反应激活剂，Fmoc多肽合成方法合成了Exenatide。但综合这些文献发现，固相方法合成Exenatide时，多采用多肽合成仪直接合成，更多文献关注的是Exenatide的生理活性，基本没有具体研究Exenatide的规模化合成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的艾塞那肽的固相合成工艺以及由此工艺合成的艾塞那肽的衍生物及其盐，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种制备艾塞那肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和替代度为0.1mmol/g～0.8mmol/g的Sieber Amide树脂为起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂；
2)将Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂采用逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护艾塞那肽-SieberAmide树脂；
3)对侧链全保护艾塞那肽-Sieber Amide树脂裂解脱保护基团，冰乙醚沉淀，得到的粗肽；粗肽经高压液相纯化、冻干得到艾塞那肽。
优选的方案是：所述的Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂，是Fmoc-Ser(tBu)-OH与Sieber Amide树脂在HATU和HOAt的作用下生成。
更为优选的方案是：所述的Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂替代度为0.2mmol/g～0.4mmol/g。
更为优选的方案是：所述的具有保护基团的氨基酸采用Fmoc基团保护，各种氨基酸分别以Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的形式应用。
更为优选的方案是：所述的Fmoc保护基通过哌啶处理来除去。
更为优选的方案是：所述的逐一偶联采用的激活剂包括偶联剂和有机碱，偶联剂为DIC+A或B+A，其中A为HOBt或者HOAt；B为HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP；有机碱为TMP或者为DIPEA。
更为优选的方案是：所述的逐一偶联采用的偶联剂为TBTU/HOBt，有机碱为DIPEA。
更为优选的方案是：所述保护氨基酸偶联与脱保护过程中每一步都经过Kaiser Test检测。
更为优选的方案是：所述侧链全保护艾塞那肽-Sieber Amide树脂裂解脱保护基团从固相载体上的裂解剂是三氟乙酸、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醇、苯甲醚的混合液[三氟乙酸∶苯甲硫醚∶1，2-乙二硫醇∶苯甲醚(90∶5∶3∶2v/v)]。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明制备艾塞那肽的工艺方法采用替代度在特定范围内的Sieber Amide树脂，采用方便的固相合成方法合成艾塞那肽，具有规模化生产能力，工艺稳定、反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明制备艾塞那肽的方法总的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明：
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列如表1所示：
表1缩略词表
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺酰基 |
| tBu | 叔丁基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DBLK | 六氢吡啶/DMF溶液 |
| Siber Amide Resin | 9-氨基-呫吨-3-氧-Merrifield树脂 |
| Exenatide | 艾塞那肽 |
实施例1 Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin的制备
将替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Sieber Amide Resin 25g，按照上述操作得到的Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin，检测替代度为0.021mmol/g；将替代度为0.8mmol/g的Fmoc-Sieber Amide Resin 25g，按照上述操作得到的Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin，检测替代度为0.529mmol/g。
本实施例更为优选的方案是将Fmoc-Sieber Amide Resin 25g，替代度为0.535mmol/g，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂30分钟后，用20％DBLK脱Fmoc保护，得到H-Sieber Amide Resin，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。将4.22g Fmoc-Ser(tBu)-OH，4.14gHATU，1.80gHOAt，2.4ml TMP在冰浴情况下溶于DMF中，加入上述树脂中反应45分钟。反应结束后用DMF、甲醇交替洗涤3次得到Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin，检测替代度为0.298mmol/g。
实施例2 Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin的规模制备
将Fmoc-Sieber Amide Resin 2500g，替代度为0.535mmol/g，加入到固相反应中，加入DCM溶胀树脂30分钟后，用20％DBLK脱Fmoc保护，得到H-Sieber Amide Resin，DMF洗涤8次，DCM洗涤4次。
将4220g Fmoc-Ser(tBu)-OH，4140gHATU，1800gHOAt，2.4L TMP在冰浴情况下溶于DMF中，加入上述树脂中反应55分钟。反应结束后用DMF、 甲醇交替洗涤3次得到Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin，检测替代度为0.315mmol/g。
实施例3 侧链全保护Exenatide-Sieber Amide Resin的制备
称取3.2g(1mmol)Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin加入反应器中，用20％DBLK脱Fmoc保护，将1.012g Fmoc-Pro-OH，0.49g HOBt，0.61ml DIC溶于DCM中，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。重复以上步骤，依次完成37位到1位的保护氨基酸的连接，得到侧链全保护Exenatide-Sieber Amide Resin。
实施例4 侧链全保护Exenatide-Sieber Amide Resin的规模制备
称取3200g(1mol)Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide Resin加入反应器中，用20％DBLK脱Fmoc保护，将1012g Fmoc-Pro-OH，490g HOBt，610ml DIC溶于DCM中，加入固相反应器中，室温反应2-3小时，反应终点以茚三酮检测呈阴性为准。重复以上步骤，依次完成37位到1位的保护氨基酸的连接，得到侧链全保护Exenatide-Sieber Amide Resin。
实施例5 Exenatide粗肽的制备及纯化
1).将17.76g侧链全保护Exenatide-Sieber Amide Resin加入到100ml圆底烧瓶中；2).配制新鲜裂解试剂80ml，其中三氟乙酸50ml，苯甲硫醚2ml，1，2-乙二硫醇2ml，苯甲醚6ml，二氯甲烷20ml，放入冰箱中预冷30min；3)将裂解试剂倒入树脂中，冰浴下搅拌。反应30分钟后撤走冰浴，室温下继续反应2小时。过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。
将滤液缓慢加入800ml冰乙醚中，出现白色沉淀。3000转/分钟离心，冰乙醚洗涤5次后，减压干燥得到粗肽5.2g。粗肽收率79.5％。
经过高效液相纯化得到艾塞那肽精肽1.1g，收率21.2％。
实施例6 Exenatide粗肽的规模制备及纯化
1).将1500g侧链全保护Exenatide-Sieber Amide Resin加入到2000ml圆底烧瓶中；2).配制新鲜裂解试剂1000ml，其中三氟乙酸625ml，苯甲硫醚25ml，1，2-乙二硫醇25ml，苯甲醚75ml，二氯甲烷250ml，放入冰箱中预冷30min；3).将裂解试剂倒入树脂中，冰浴下搅拌。反应30分钟后撤走冰浴，室温下继续反应2小时。过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。
将滤液缓慢加入15L冰乙醚中，出现白色沉淀。3000转/分钟离心，冰乙醚洗涤5次后，减压干燥得到粗肽458g。粗肽收率80.6％。
经过高效液相纯化得到艾塞那肽精肽94.2g，收率23.8％。
实施例7 艾塞那肽的衍生物及其盐
阴离子交换法得到艾塞那肽的衍生物及其盐。纯化条件：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：1-2％醋酸水溶液。流速：50-60ml/min。检测波长：280nm。进样量为1.5-2.0g。
转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为30-40ml样品溶液(纯度大于99.0％的艾塞那肽三氟乙酸溶液)。1-2％醋酸水溶液洗脱50min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约100-150mg/mL后转至合适大小容器，后进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的符合要求的醋酸艾塞那肽。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种制备艾塞那肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）由Fmoc-Ser(tBu)-OH和替代度为0.1mmol/g～0.8mmol/g的SieberAmide树脂为起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂；
2）将Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂采用逐一偶联的方式依次连接具有保护基团的氨基酸，所述的具有保护基团的氨基酸采用Fmoc基团保护，合成得到侧链全保护艾塞那肽-Sieber Amide树脂；所述的逐一偶联采用的激活剂包括偶联剂和有机碱，所述偶联试剂为HATU/HOAt或HOBt/DIC，有机碱为TMP；
3）对侧链全保护艾塞那肽-Sieber Amide树脂的Fmoc保护基通过哌啶处理来除去保护基团，从固相载体上裂解之后再进行冰乙醚沉淀，得到的粗肽；粗肽经高压液相纯化、冻干得到艾塞那肽；所述从固相载体上裂解使用的裂解剂是三氟乙酸，苯甲硫醚，1,2-乙二硫醇，苯甲醚，二氯甲烷的混合液。
2.如权利要求1所述制备艾塞那肽的方法，其特征在于：所述的Fmoc-Ser(tBu)-Sieber Amide树脂是Fmoc-Ser(tBu)-OH与Sieber Amide树脂在HATU和HOAt的作用下生成。
3.如权利要求1所述制备艾塞那肽的方法，其特征在于：所述的具有保护基团的氨基酸采用Fmoc基团保护，各种氨基酸分别以Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的形式应用。
4.如权利要求1所述制备艾塞那肽的方法，其特征在于：所述保护氨基酸偶联与脱保护过程中每一步都经过Kaiser Test 检测。
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