CN102286092A - 利拉鲁肽的固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：A）在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）偶联得到Fmoc-Gly-树脂；B）通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH；C）脱除赖氨酸侧链保护基Alloc；D）通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Palmitoyl-Glu-OtBu；E）裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；F）纯化，冻干，得到利拉鲁肽。本发明提供的固相合成方法操作简单，合成周期短，生产成本低，减少了废液的产生，后处理容易，副产物少，产品收率高，利于利拉鲁肽的大规模生产。

Description

利拉鲁肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及多肽的合成方法，尤其涉及一种利拉鲁肽的固相合成方法。
背景技术
利拉鲁肽，英文名称为liraglutide，其肽序为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-
Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-
γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH。利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，是胰高血糖素样肽-1（G LP-1）的受体激动剂，作为一种皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖作用。
诺和诺德的利拉鲁肽主要是通过基因工程等生物学方法进行制备，技术难度大，生产成本高，不利于利拉鲁肽的大规模生产。US6268343B1和US6458924B2报道了利拉鲁肽的固液合成法，中间体GLP-1(7-37)-OH 均需要反相HPLC纯化，再在液相条件下与Nα-alkanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，并且由于GLP-1(7-37)-OH  N端未保护以及侧链保护基全部脱除，会导致产生许多杂质，难以纯化，操作繁琐。利拉鲁肽的现有合成方法存在操作繁琐，需两步纯化，合成周期长，废液多，不利于环保，需花费大量乙腈，成本高昂以及不利于大规模生产的缺点。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利拉鲁肽的固相合成方法。
一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：
A） 在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
B）  通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH；
C）  脱除赖氨酸侧链保护基Alloc；
D） 通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Palmitoyl-Glu-OtBu；
E）  裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；
F）   纯化，冻干，得到利拉鲁肽。
采用上述技术方案，通过固相合成法进行利拉鲁肽的制备，操作简单，合成周期短，成本不高，减少了废液的产生，副产物少，产品收率高，利于利拉鲁肽的大规模生产。
作为本发明的进一步改进，所述步骤A）中，所述树脂固相载体采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-树脂为0.15~0.28 mmol/g替代度的Fmoc-Gly-CTC树脂。
作为本发明的进一步改进，所述步骤A）中，所述树脂固相载体采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Gly-树脂为0.12~0.24 mmol/g替代度的Fmoc-Gly-王树脂。
作为本发明的进一步改进，所述步骤B）包括如下步骤：
B1）采用DBLK使所述Fmoc-Gly-树脂脱除Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂，所述DBLK由体积比为1：4的哌啶和DMF组成；
B2）在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
B3）重复步骤B1、B2，按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联。
在进行氨基酸的偶联时，色氨酸通过Boc保护基进行侧链的保护；谷氨酸通过OtBu保护基进行侧链的保护；赖氨酸通过Alloc保护基进行侧链的保护；谷氨酰胺通过Trt保护基进行侧链的保护；酪氨酸通过tBu保护基进行侧链的保护；丝氨酸通过Trt或tBu保护基进行侧链的保护，丝氨酸采用不同的保护基Trt或tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率；天冬氨酸通过OtBu保护基进行侧链的保护；苏氨酸通过tBu保护基进行侧链的保护；组氨酸通过Trt保护基进行侧链的保护，通过Boc保护基进行N端的保护。
作为本发明的进一步改进，所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOAt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
作为本发明的进一步改进，所述步骤C）中，脱除赖氨酸侧链保护基Alloc采用0.1~0.4倍合成规模用量的Pd(PPh3)4和10~30倍合成规模用量的苯基硅烷在固相条件下脱除10~65 分钟。
所述步骤D）中，在赖氨酸侧链可以直接偶联Palmitoyl-Glu-OtBu，也可以先偶联Fmoc-Glu-OtBu，脱除Fmoc后，再偶联棕榈酰氯。
所述步骤E）中，裂解，通过本领域常用的“切肽反应”脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽。
作为本发明的进一步改进，所述步骤F）中，纯化为反相高效液相色谱纯化，色谱柱为反相C8柱，柱温为40~50℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种固相合成法进行利拉鲁肽的制备方法，操作简单，合成周期短，成本不高，减少了废液的产生，后处理容易，副产物少，产品收率高，利于利拉鲁肽的大规模生产。
附图说明
图 1为本发明利拉鲁肽的固相合成工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
王树脂和CTC树脂购自天津南开和成有限公司，各种保护氨基酸购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中。
Figure 2011102713423100002DEST_PATH_IMAGE001
实施例一  替代度为0.15 mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成。
称取替代度为0.5 mmol/g的2-CTC树脂20 g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取4.3 g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入4.78 mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8 mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.15 mmol/g。
实施例二  替代度为0.28 mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成。
称取替代度为0.9 mmol/g的2-CTC树脂11.1 g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取5.78 g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.94 mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8 mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.15 mmol/g。
实施例三  替代度为0.24 mmol/g 的Fmoc-Gly-王树脂的合成。
称取替代度为0.75 mmol/g的王树脂13.1 g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取4.3 g Fmoc-Gly-OH、3.78 g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入2.84 mL DIC活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入268 mg DMAP，反应2小时后，DMF洗涤3次，DCM洗3次，用100 mL醋酸酐/吡啶封闭过夜，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.24 mmol/g。
实施例四  替代度为0.12 mmol/g 的Fmoc-Gly-王树脂的合成。
称取替代度为1.1 mmol/g的王树脂9.2 g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取2.9 g Fmoc-Gly-OH、1.78 g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.65 mL DIC活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入137 mg DMAP，反应2小时后，DMF洗涤3次，DCM洗3次，用80 mL醋酸酐/吡啶封闭过夜，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.12 mmol/g。
实施例五  直链利拉鲁肽CTC树脂的制备。
称取替代度为0.15 mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂10 g，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用20％DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。将3.89 g Fmoc- Arg（Pbf）-OH（6.0 mmol），0.97 g HOBt（7.2 mmol），0.91 g DIC（7.2 mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH 、Fmoc-Ser(Trt)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH 、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt）-OH的偶联。其中Fmoc-Ile-OH 采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1:4的DMSO与DMF混合液；Fmoc-Ala-OH 采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为DCM；Fmoc-Gln(Trt)-OH采用 PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1:4的DMSO与NMP混合液；Fmoc-Ser(Trt)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH采用HATU/HOAt/TMP体系，反应溶剂为NMP，丝氨酸采用不同的保护基Trt和tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率。将直链利拉鲁肽CTC树脂用DMF洗涤3次，DCM洗5次，用于后续合成反应。
实施例六  直链利拉鲁肽王树脂的制备。
称取替代度为0.12 mmol/g 的Fmoc-Gly-王树脂12.5 g，加入反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用20％DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。将3.89 g Fmoc- Arg（Pbf）-OH(6.0mmol)，0.97 g HOBt(7.2mmol)，0.91 g DIC(7.2mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH 、Fmoc-Ser(Trt)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH 、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt）-OH的偶联。其中Fmoc-Ile-OH 采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1:4的DMSO与DMF混合液；Fmoc-Ala-OH 采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为DCM；Fmoc-Gln(Trt)-OH采用 PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1:4的DMSO与NMP混合液；Fmoc-Ser(Trt)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH采用HATU/HOAt/TMP体系，反应溶剂为NMP，丝氨酸采用不同的保护基Trt和tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率。将树脂用DMF洗涤3次，DCM洗5次，用于下步反应。
实施例七  N α -Palmotiyl-Glu-OtBu的合成。
称取H-Glu-OtBu（20.3 g，100 mmol），加入到盛有200 mL二氯甲烷的三口瓶中，冰水浴冷却到5℃，加入5.7 mL（50 mmol）三乙胺，20分钟后慢慢滴加棕榈酰氯32.88 g（120 mmol），在30分钟内滴加完毕，滴加完毕后自然升温到室温，再反应2小时，薄层色谱（TLC）监测，原料反应完全，反应溶液依次用饱和NaHCO3100 mL萃取2次，去离子水100 mL萃取2次，饱和食盐水100 mL萃取3次，弃去水相，有机相用无水硫酸钠干燥30分钟，用旋转蒸发仪旋掉DCM，得到油状物，油状物加入200 mL乙酸乙酯/石油醚混合液，冰箱中放置2小时，析出白色固体，该白色固体用同样的方法重结晶1次，过滤，真空干燥，得到白色固体38.74 g，收率87.72%。
实施例八  利拉鲁肽CTC树脂的合成。
取实施例五中得到的直链利拉鲁肽CTC树脂，加入30 mL 二氯甲烷，再加入2.21 mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入467 mg Pd(PPh3)4，室温反应45分钟，抽掉反应液，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。
称取Fmoc-Glu-OtBu 3.18 g，PyBOP 3.9 g，HOBt 1.22 g，用25 mL 二氯甲烷溶解，冰水浴下加入2.7 mL DIEA活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次，加入棕榈酰氯1.22 g和DIEA 2.1 mL，室温反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。称重得到利拉鲁肽CTC树脂16.5 g (树脂增重率 81.1%)。
实施例九  利拉鲁肽王树脂的合成。
取实施例六中得到的直链利拉鲁肽王树脂，加入30 mL 二氯甲烷，再加入2.21 mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入467 mg Pd(PPh3)4，室温反应45分钟，抽掉反应液，茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。
方法1：称取Palmitoyl-Glu-OtBu 2.18 g，PyBOP 3.9 g，HOBt 1.22 g，用25 mL NMP溶解，冰水浴下加入2.7 mL DIEA活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。称重得到利拉鲁肽王树脂20.1 g (树脂增重率94.7%)。
方法2：称取Fmoc-Glu-OtBu 3.18 g，PyBOP 3.9 g，HOBt 1.22 g，用25 mL二氯甲烷溶解，冰水浴下加入2.7 mL DIEA活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次，加入棕榈酰氯1.22 g和DIEA 2.1 mL，室温反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。称重得到利拉鲁肽树脂19.8 g (树脂增重率91.1%)。
实施例十  利拉鲁肽王树脂的规模化制备。
参照实施例六，称取替代度为0.12 mmol/g 的Fmoc-Gly-王树脂833.3 g，加入反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用20％DBLK脱除Fmoc保护，后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将259.2 g Fmoc- Arg（Pbf）-OH(400 mmol)，64.8 g HOBt(480 mmol)，60.5 g DIC(480 mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利拉鲁肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH 、Fmoc-Ser(Trt)-OH 、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH 、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt）-OH的偶联。将利拉鲁肽王树脂用DMF洗涤3次，DCM洗5次。
往上述得到的直链利拉鲁肽王树脂加入6500 mL二氯甲烷，再加入147.3 mL苯基硅烷，反应3分钟，再加入31.3 g Pd(PPh3)4，室温反应45分钟，抽掉反应液，茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。称取Palmitoyl-Glu-OtBu 145.3 g，PyBOP 260 g，HOBt 81.0 g，用4.5 L NMP溶解，冰水浴下加入174.3 mL DIEA活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。称重得到利拉鲁肽树脂1335.5 g (树脂增重率94.1%)。
实施例十一  利拉鲁肽粗肽的制备。
称取130 g全保护的利拉鲁肽CTC树脂或利拉鲁肽王树脂，加入到2 L反应釜中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚：EDT=90:5:3:2的体积比配制裂解试剂1.3 L，将裂解试剂倒入利拉鲁肽CTC树脂或利拉鲁肽王树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到11L无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到利拉鲁肽粗肽42.72 g，粗肽收率80.5%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。
实施例十二  利拉鲁肽精肽盐酸盐的制备。
称取42.7 g 利拉鲁肽粗肽用25%乙腈+25%DMSO+50%水的混合溶剂1000 mL溶解后，采用Waters 2545 RP-HPLC系统，波长214 nm，色谱柱为50×250 mm 反相C8柱，柱温为45℃，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters 2545 RP-HPLC系统，色谱柱为50×250 mm 反相C8柱，0.1%盐酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利拉鲁肽盐酸盐精肽6.75 g，HPLC纯度99.1%，纯化收率52.7%，总收率15.32%。
实施例十三  利拉鲁肽精肽醋酸盐的制备。
称取42.7 g 利拉鲁肽粗肽用25%乙腈+25%DMSO+50%水的混合溶剂1000 mL溶解后，采用Waters 2545 RP-HPLC系统，波长214 nm，色谱柱为50×250 mm 反相C8柱，柱温为45℃，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250 mm 反相C8柱，0.2%醋酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到利拉鲁肽醋酸盐精肽6.83 g，HPLC纯度99.23%，纯化收率54.7%，总收率15.68%。。
实施例十四  利拉鲁肽精肽三氟醋酸盐的制备。
称取42.7 g 利拉鲁肽粗肽用25%乙腈+25%DMSO+50%水的混合溶剂1000 mL溶解后，采用Waters 2545 RP-HPLC系统，波长214 nm，色谱柱为50×250 mm 反相C8柱，柱温为45℃，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters 2545 RP-HPLC系统，色谱柱为50×250 mm 反相C8柱，0.1%三氟醋酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到利拉鲁肽醋酸盐精肽6.88 g，HPLC纯度99.17%，纯化收率55.2%，总收率15.87%。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
A）在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）偶联得到Fmoc-Gly-树脂；
B）通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH；
C）脱除赖氨酸侧链保护基Alloc；
D）通过固相合成法，在赖氨酸侧链偶联Palmitoyl-Glu-OtBu；
E）裂解，脱除保护基和树脂得到利拉鲁肽粗肽；
F）纯化，冻干，得到利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述步骤A）中，所述树脂固相载体采用2-CTC树脂，所述活化剂系统选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-树脂为0.15~0.28 mmol/g替代度的Fmoc-Gly-CTC树脂。
3.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述步骤A）中，所述树脂固相载体采用王树脂，所述活化剂系统由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Gly-树脂为0.12~0.24 mmol/g替代度的Fmoc-Gly-王树脂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述步骤B）包括如下步骤：
B1）采用DBLK使所述Fmoc-Gly-树脂脱除Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂，所述DBLK由体积比为1：4的哌啶和DMF组成；
B2）在偶联剂系统的存在下，H-Gly-树脂和Fmoc保护且侧链保护的精氨酸偶联得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
B3）重复步骤B1、B2，按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联。
5.根据权利要求4所述的利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOAt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。
6.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述步骤C）中，脱除赖氨酸侧链保护基Alloc采用0.1~0.4倍合成规模用量的Pd(PPh3)4和10~30倍合成规模用量的苯基硅烷在固相条件下脱除10~65 分钟。
7.根据权利要求1所述的利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于：所述步骤F）中，纯化为反相高效液相色谱纯化，色谱柱为反相C8柱，柱温为40~50℃。
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