CN103087181A

CN103087181A - 一种利拉鲁肽的固相合成方法

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Publication number: CN103087181A
Application number: CN2013100167630A
Authority: CN
Inventors: 刘卫; 杨树耀
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，包括步骤如下：1）选择Fmoc-Gly-Wang树脂，N端Fmoc保护和侧链保护的氨基酸为原料，其中26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH，N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH。2）1%TFA选择性脱除赖氨酸上的Mtt或Mmt保护基。3）侧链上依次偶联一个g-谷氨酸和棕榈酸。4）TFA切割树脂得到利拉鲁肽粗品，制备型液相纯化、冻干得到纯品。本发明采取的合成利拉鲁肽的方法步骤简单，省时省力，偶联过程中的困难序列少，侧链脱保护简单易行，副产物少，收率高，适合工业化生产。

Description

一种利拉鲁肽的固相合成方法

技术领域本发明涉及制药技术领域，尤其是涉及合成利拉鲁肽的方法。

背景技术

II型糖尿病是一种常见的慢性疾病，目前常用的口服治疗药物包括：双胍类、磺脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类， DPP-4抑制剂等。对于口服降糖药效果不好的患者，常采用联合胰岛素治疗。由于目前的治疗方案大多侧重于对血糖的控制，而忽略了对胰岛功能的保护，多数患者最终会出现β细胞功能严重衰退，机体胰岛素敏感性逐渐下降，无论采用饮食控制、二甲双胍还是磺脲类药物，对β细胞受损速度均无影响。利拉鲁肽属于新型降糖药GLP-1类似物，多项试验证明此类药物可以刺激胰岛β细胞的增殖、分化及抑制凋亡作用，这就意味着糖尿病的病情得到明显缓解，是II型糖尿病治疗领域的一个革命性的突破。

利拉鲁肽是根据天然的GLP-1(7-37)序列合成的药物，其氨基酸序列为：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys*(gGlu-棕榈酸)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly。与GLP-1有95%的同源性，保留了GLP-1(7-37) 的生物活性，其分子结构与天然GLP-1分子不同的是第34位赖氨酸被精氨酸取代，第26位赖氨酸上增加一个由g谷氨酸连接的16碳棕榈酰脂肪酸侧链，使其在体内与血浆白蛋白结合后形成可逆的药物-白蛋白复合体，复合体不易被降解，还可以缓慢释放药物使分布时间延长，克服了天然GLP-1(7-37) 易降解的缺点，半衰期达到13小时。

利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司研制，其母链是利用基因重组技术生产，再侧链缩合谷氨酸和棕榈酸。2010年1月25日美国食品与药物管理局批准利拉鲁肽在美国上市。2011年10月9日在我国上市。诺和诺德公司制备利拉鲁肽的方法技术难度大，成本及设备要求高，US6458924B2和US6268343B1报道的合成方法中间体需要用液相纯化，步骤繁琐副反应多，并且产生的废液不好处理，试剂使用成本也高。国内报道的利拉鲁肽固相合成专利方法（CN102286092）26位赖氨酸采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH，而选择性脱除Alloc需要重金属催化剂Pd(Ph3P)4，一般需要氮气保护下反应，在工业上生产会受到限制。本发明26位赖氨酸采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH，Mtt/Mmt 的选择性保护只需要1%TFA/5%Tis在DCM中，简单易行，工业化生产也不受限制。本发明侧链的缩合采用简单易行的Fmoc-Glu-OtBu和棕榈酸的分步缩合得到利拉鲁肽，而CN102286092专利方法采用特殊的Palmiyoyl-Glu-OtBu试剂缩合侧链。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反应步骤简单、所用试剂单一、条件温和、收率高成本低、能实现工业化生产的固相合成工艺，解决现有工艺的一些问题。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种利拉鲁肽的固相合成方法，包括如下步骤：

1）选择Fmoc-Gly-Wang树脂，利用N端具有Fmoc保护和侧链保护的氨基酸为原料，按照利拉鲁肽直链的氨基酸序列从第二个精氨酸开始到第31个组氨酸逐步偶联。26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH，N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH。

2）1%TFA选择脱除赖氨酸上的Mtt/Mmt保护基。

3）侧链上依次偶联一个g-谷氨酸和棕榈酸。

4）TFA切割树脂得到利拉鲁肽粗品，制备型液相纯化、冻干得到纯品。

作为本发明的进一步改进，所述步骤1）中，所述的固相载体树脂为取代度0.1-1.0mmol/L的Fmoc-Gly-Wang树脂。所有的Fmoc保护氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-Val-OH；Fmoc-Gly-OH；Fmoc-Leu-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH； Fmoc-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Tyr(tBu)-OH； Fmoc-Ser(tBu)-OH；Fmoc-Asp(OtBu)-OH； Fmoc-Thr(tBu)-OH；Boc-His(Trt)-OH；Boc-His(Boc)-OH ; Fmoc-Ile-OH；Fmoc-Phe-OH；Fmoc-Glu-α-OtBu；Fmoc-Ala-OH。Fmoc-Gly-Wang。

作为本发明的进一步改进，逐一偶联采用的缩合剂是HOBt/DIC 或Cl-HOBt/DIC，缩合溶剂为DMF。Fmoc的脱保护试剂为25%哌啶/DMF溶液。

作为本发明的进一步改进，所述步骤1）中具体步骤为：25%哌啶/DMF溶液洗脱Fmoc-Gly-Wang树脂的Fmoc保护基，加入缩合剂和Fmoc-Arg(Pbf)-OH室温反应。重复脱Fmoc保护基、缩合、洗涤步骤至N-端His，His的Boc保护基留在树脂上。

作为本发明的进一步改进，所述步骤2）中脱除Lys20上的Mtt或Mmt保护基所采用的切割试剂A的组成为：TFA 1mL；Tis 5 mL；DCM 96 mL。室温振荡反应5次，每次5min，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM 各洗2次，抽干。

作为本发明的进一步改进，所述步骤3）侧链上偶联一个由谷氨酸介导的棕榈酸：加入的原料是Fmoc-Glu-α-OtBu，缩合剂偶联后，25%哌啶/DMF溶液脱Fmoc 2次，抽干，洗涤，加入10倍量棕榈酸/HOBt/DIC 反应5小时，洗涤抽干。

作为本发明的进一步改进，所述步骤4）切割树脂（0.5-1克）：加入切割试剂TFA 9mL；苯甲醚 0.25mL；苯酚 0.25g；Tis 0.25mL；水 0.25mL室温反应2小时后取滤液，无水乙醚沉淀得粗品，半制备型高效液相梯度洗脱，收集产物峰，冷冻干燥得到纯品。

与现有技术相比，本合成方法步骤简单，试剂使用种类和数量都较少，合成周期短且副产物少，利于工业化生产。

附图说明

图1为利拉鲁肽固相合成流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

Fmoc保护氨基酸、棕榈酸及Fmoc-Gly-Wang树脂均购自上海吉尔生化有限公司。说明书和权力要求书所使用的英文缩写的含义见下表。

Figure 2013100167630100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例一直链利拉鲁肽的缩合

称取370mg(0.1mmol) Fmoc-Gly-Wang树脂（0.27mmol/g）装入反应器，DMF溶液溶胀30min。事先称好每步待反应的氨基酸，用量为树脂的5倍（0.5mmol）。C端第一个氨基酸Gly已在树脂上，反应从Arg开始。反应步骤：25%哌啶/DMF溶液脱树脂Fmoc保护基2次，每次15min ，依次用DMF、甲醇、DCM洗涤树脂各2次，抽干，加入第一步反应物Fmoc-Arg(Pbf)-OH及缩合剂：1.1mL的Cl-HOBt 和 DIC 溶液（DIC溶液：8mL DIC 加DMF至100mL；Cl-HOBt溶液：8.5g Cl-HOBt 加DMF溶解至100mL；），室温振荡反应2h，DMF、甲醇、DCM洗涤树脂2次，抽干。按照利拉鲁肽直链的氨基酸序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys*-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly。重复以上脱Fmoc保护基、缩合、洗涤步骤至N-端His，His的 Boc 保护基留在树脂上。在每一次缩合及脱保护结束后需鉴定一下反应是否完全，检测试剂为茚三酮试剂，茚三酮试剂可与游离氨基反应程蓝色。取小米粒大小树脂颗粒放于试管中，分别加入茚三酮试剂，100℃水浴加热3分钟，缩合反应时，若树脂颗粒为亮黄色说明游离氨基全被缩合，反应完全，若显蓝色或淡蓝色，说明反应不完全，需减半剂量重新反应。脱保护反应时则相反。

实施例二脱除Lys20上的Mtt保护基和缩合侧链g-谷氨酸和棕榈酸

加入约10mL新配的切割试剂A：（TFA 1mL；Tis 5 mL；DCM 96 mL），室温振荡反应5次，每次5min，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM 各洗2次，抽干。加Fmoc-Glu-OtBu（0.213克）及缩合剂（1.1mL的Cl-HOBt和DIC溶液）反应2h ，25%哌啶/DMF溶液脱Fmoc 2次，抽干，DMF、甲醇、DCM洗涤树脂2次，抽干，加入10倍量棕榈酸（0.256克），2.2mL 的 Cl-HOBt 和 DIC溶液反应3h，洗涤抽干多肽树脂。

实施例三将多肽从树脂上切割下来

利拉鲁肽多肽树脂，加入切割试剂B：（TFA：9mL；苯甲醚：0.25mL；苯酚：0.25g；Tis：0.25mL；水：0.25mL）室温反应2小时，取滤液至50mL离心管中，用少量TFA（1mL）洗2次树脂，合并滤液。与离心管中直接加入无水乙醚（事先冰中冷却）至45mL以上，立即可见略带粉色的白色沉淀，充分混匀后放置此离心管于冰中冷却30min。离心，倒掉上清液，用乙醚洗涤粗品多肽沉淀2-3次后空气中干燥。最终得粗品332.7mg，粗肽收率为88.7%。

实施例四纯化多肽

将粗肽溶解于醋酸：乙腈：水（3:3:4）中，离心，取上清液准备进样。半制备型高效液相梯度洗脱，采用安捷伦ZORBAX SB-C18型半制备色谱柱(9.4*250mm)，流速：4mL/min；波长：220nm；进样量：1mL；流动相A：乙腈（含0.1%TFA）；流动相B：水（含0.1%TFA），梯度洗脱：初始梯度A占15%，A的比例在5min内升到30%，然后再25min内由30%升到50%，保持50% 10min，再在10min内升到100%并保持10min。利拉鲁肽的产物峰在33min左右出现，收集产物峰，冷冻干燥得到纯品39.4mg，收率为10.5%。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种利拉鲁肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

选择Fmoc-Gly-Wang树脂，利用N端具有Fmoc保护和侧链保护的氨基酸为原料，按照利拉鲁肽直链的氨基酸序列从第二个精氨酸开始到第31个组氨酸逐步固相偶联氨基酸；26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH，N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH；

1%TFA选择性脱除26位赖氨酸上的Mtt或Mmt保护基；

侧链上依次偶联g-谷氨酸和棕榈酸；

TFA切割树脂得到利拉鲁肽粗品，制备型液相纯化、冻干得到纯品。

2.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中所述的固相载体树脂为取代度0.1-1.0mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂。

3.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中所述26位上的赖氨酸采用的是Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH，N-末端的组氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH或Boc-His(Boc)-OH。

4.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中所述逐一偶联采用的缩合剂是HOBt/DIC或Cl-HOBt/DIC；每步的脱保护试剂为25%哌啶/DMF溶液。

5.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中所述脱除赖氨酸上的Mtt/Mmt 保护基采用的脱保护试剂为1%TFA/5%Tis/DCM 。

6.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中所述侧链上偶联g-谷氨酸为Fmoc-Glu-OtBu。

7.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中所述加入切割树脂剂为：90%TFA/2.5%苯甲醚/2.5%苯酚/2.5%Tis/2.5%水。

8.如权利要求1所述的利拉鲁肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中所述制备型液相纯化利拉鲁肽采用流动相A：乙腈（含0.1%TFA）；流动相B：水（含0.1%TFA），粗肽溶解于醋酸：乙腈：水（3:3:4）中，梯度洗脱；波长：220nm；收集产物峰，冷冻干燥得到纯品。