CN110156870A - 一种快速加热辅助下的固相合成多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速加热辅助下的固相合成多肽的方法。本发明的方法包括：以Wang Resin作为起始树脂，以Fmoc氨基保护的氨基酸溶液作为中间原料，通过缩合反应合成多肽；其中，缩合反应温度控制为70℃～100℃，缩合反应时间为30秒～120秒。本发明的方法可提高反应速率，缩短反应时间，提高了产物的纯度，最终降低了多肽的生产成本。该方法对常温难以合成的多肽具有良好的效果。
Description
技术领域
本发明是关于一种固相合成多肽的方法，具体地说，是关于一种快速加热辅助下的固相合成多肽的方法，属有机化学和药物化学领域。
背景技术
多肽的固相合成一般以树脂为起始原料，逐个连接氨基酸得到多肽粗品，为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的。而反应物的羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。现阶段本领域多采用固相合成法，其优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离，工艺简单，是化学合成多肽的首选方法。
目前，多肽的固相合成中存在的主要问题，一是由于固液之间的传质问题而使得反应速度较慢，每个氨基酸的连接时间在两个小时或以上，肽制备工艺时间长；二是由于氨基酸过量倍数高而增加了肽合成成本。
发明内容
本发明的主要目的在于针对现有的固相合成多肽的工艺技术进行改进，提供一种固相快速加热合成多肽的方法，缩短反应时间，减少氨基酸的过量倍数，提高产物的纯度，降低多肽的生产成本。
为实现上述目的，本发明提供了一种固相合成多肽的方法，该方法包括：
以Wang Resin作为起始树脂，以Fmoc氨基保护的氨基酸溶液作为中间原料，快速加热通过缩合反应合成多肽；
其中，缩合反应温度控制为70℃～100℃，缩合反应时间为30秒～120秒。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法包括：
以Wang Resin作为起始树脂，在溶剂DMF作用下溶胀；加入加热后的脱保护试剂，得到脱保护后的树脂，并进行加热冲洗；
以Fmoc氨基保护的氨基酸溶液作为中间原料，在DMF溶剂中加入活化剂对羧基预活化；
将活化后的Fmoc保护的第一氨基酸溶液加热，与脱保护后的树脂产物混合，进行缩合反应，得到带有产物的固相树脂；对带有产物的固相树脂进行加热冲洗；
按照目标多肽氨基酸序列从C端到N端的顺序，依序进行第二及后续氨基酸的缩合，得到多肽固相树脂；
多肽固相树脂通过切割试剂进行切割反应，然后采用冰乙醚沉淀，得到多肽。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，所述起始树脂的取代度为0.3～0.5mmol/g。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，所述起始树脂在溶剂DMF作用下溶胀时，溶剂的使用量为起始树脂全部尽在溶剂中的量，溶胀0.5～1小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，所述脱保护试剂选自Fmoc的脱保护试剂，Fmoc的脱保护试剂选用体积溶度为15％-25％哌啶/DMF溶液，脱保护试剂的使用量为树脂体积的2～5倍。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，脱保护反应温度为70℃～100℃，脱保护反应时间为30秒～120秒。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，对羧基预活化过程中，所述活化剂选自脲正离子型缩合剂HATU，活化剂的使用量与氨基酸投料量的摩尔数相同。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，对羧基预活化过程中，中间原料在70～100℃的加热模块中加热5秒～15秒，DMF溶剂的使用量为使溶质溶解的量。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，对羧基预活化过程中，DMF溶剂的使用量为溶质与溶剂的质量体积比为100mg:2～5ml。
根据本发明的具体实施方案，本发明的固相合成多肽的方法中，缩合反应步骤中，保护氨基的投料量与脱保护后的树脂产物的混合的摩尔比为4～10:1。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的固相合成多肽的方法包括：
1)以Wang Resin作为起始树脂，在溶剂DMF作用下在容器中溶胀；起始树脂WangResin的取代度为0.3～0.5mmol/g。溶剂的使用量为起始树脂全部浸在溶剂中的量，溶胀时间0.5～1小时。起始树脂的溶胀是反应试剂分子进入树脂内部与功能基反应的先决条件，在反应进行中固相载体的充分溶胀对反应试剂分子、可溶的构件分子的自由运动十分有利，因而能达到充分反应的效果。
2)在容器中加入脱保护试剂后，然后对脱保护后的树脂进行冲洗备用；脱保护试剂选自Fmoc的脱保护试剂，Fmoc的脱保护试剂选用体积溶度为15％-25％优选20％哌啶/DMF溶液，脱保护试剂的使用量为树脂体积的2～5倍。脱保护反应温度为70℃～100℃，脱保护反应时间为30秒～120秒。
3)以Fmoc氨基保护的氨基酸溶液作为中间原料，在DMF溶剂中加入活化液对羧基预活化；活化剂选自脲正离子型缩合剂，使用量为氨基酸溶液：HATU的摩尔比为1:1，活化剂的使用量与氨基酸投料量的摩尔数相同，中间原料在70～100℃的恒温摇床中预活化5～15秒，DMF溶剂的使用量为使溶质溶解的量，常规为溶质与溶剂的质量体积比为100mg:2～5ml，以能够完全溶解原料为宜，体积越小越好。
4)将活化后的Fmoc保护的氨基酸溶液与步骤2)得到的产物混合，进行缩合反应；保护氨基的投料量与步骤2)产物的摩尔比为4～10:1；缩合反应温度为70℃～100℃，缩合反应时间为30秒～120秒。
将活化的Fmoc保护氨基酸与经溶胀、脱氨基保护的多肽固相树脂混合，则树脂上中间产物多肽的脱保护氨基与溶液中的带保护氨基酸的活化羧基间发生缩合反应，固相树脂上形成更长链的Fmoc保护的多肽片段。
5)抽取步骤4)的产物通过茚三酮监测缩合反应完成的程度，直到步骤4)完成反应，然后对步骤4)的产物进行冲洗；通过茚三酮监测缩合反应完成的完成程度，直到反应完成。经洗涤，得到了具有更长肽片段的Fmoc保护氨基片段固相树脂。茚三酮监测步骤为：茚三酮检测液A、B、C液各1滴，加热到100℃并保持1～2min，如果溶液有蓝色，或固相树脂出现红色、红褐色，表明还有游离氨基，反应尚未完成，否则说明反应完全。
6)将步骤5)的产物放入容器中，反复步骤2)～5)，按照氨基酸序列从C端到N端的顺序进行新的氨基酸的缩合，最后，经过洗涤得到多肽树脂。
7)对步骤6)得到的特异性多肽固相树脂通过切割试剂进行切割反应，然后采用冰乙醚沉淀得到多肽粗产品；切割反应的切割试剂的使用量为每100mg树脂添加切割试剂1～2ml，切割试剂中各组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H2O＝92.5:2.5:2.5:2.5，切割时先冰浴0.5～1小时，切割温度室温，切割时间3～5小时，然后过滤，收集滤液并冲洗，在除去部分TFA后的滤液加入冰乙醚中，得到的沉淀用3000转5分钟离心，冲洗离心3次得到多肽粗产品，冰乙醚与滤液的体积比例为5～10:1。
本发明的上述实施方案中，得到的粗肽产品通过质谱检测，确定最终多合成的多肽分子量。
本发明的上述实施方案中，所述的冲洗采用加热的DMF洗涤。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明的固相合成多肽的方法，提高了反应温度，缩短了反应时间，反应速度快，减少了杂肽的产生，降低了生产成本，能够带来广泛的经济效益及社会效益；每个氨基酸合成一轮操作仅需两分钟，相比于常温合成的多肽每轮操作为1小时，大大节省了生产时间；对一些常温难以合成的多肽实用性很好。
附图说明
图1为本发明实施例1的快速加热合成多肽的质谱结果图。
图2为本发明实施例1的常温合成多肽的质谱结果图。
图3为本发明实施例2的快速加热合成多肽的质谱结果图。
图4为本发明实施例2的常温合成多肽的质谱结果图。
具体实施方案
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
实施例1：
本实施例中，所合成的目标多肽的序列为Fmoc～WWWWWWWW。合成方法如下：
1)称取取代度为0.3mmol/g的起始树脂Wang Resin 100mg，加入到固相反应容器中，在容器中加入溶剂DMF，使起始树脂完全浸在DMF溶剂中，溶胀30min；
2)在上述容器中加入2.5ml浓度为20％哌啶/DMF脱保护试剂脱除Fmoc保护基，在温度为90℃下反应30s，然后用90℃加热的DMF洗涤；
3)以Fmoc～TrP(Boc)～OH为中间原料，将分别为0.6mmol的Fmoc～TrP(Boc)～OH、HATU起在DMF:DIEA(24:1)溶剂中90℃加热活化5s；
4)将活化后的Fmoc～TrP(Boc)～OH投入到步骤2)的容器中，反应温度控制在90℃，反应时间30s；
5)通过茚三酮监测至反应结束后(如未完成需要清洗重新操作偶联)，用90℃加热的DMF洗涤三次；茚三酮监测步骤为：茚三酮检测液A、B、C液各1滴，加热到100℃并保持1～2min，如果溶液有蓝色，或固相树脂出现红色、红褐色，表明还有游离氨基，反应尚未完成，否则说明反应完全；
6)取步骤5)制备的产物，重复步骤2)～5)，依次连接下面所述具有Fmoc保护基团的氨基酸：
Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH；直到反应结束后，用70℃～100℃加热的DMF洗涤三次，用甲醇收缩树脂得到多肽树脂；
7)取上述粗肽树脂，以每100mg树脂加入切割试剂2ml为比例，切割试剂中各组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H2O＝92.5:2.5:2.5:2.5，切割时先冰浴切割试剂0.5～1小时，切割温度室温，切割时间3小时，然后过滤，收集滤液并冲洗，把除去部分TFA后的滤液加入冰乙醚中，得到的粗肽沉淀溶液用3000转5分钟离心，冲洗离心3次得到多肽产品，冰乙醚与滤液的体积比例为10:1；
8)得到的多肽，用质谱检测分子量，理论值为1729，检测结果为1729.32(质谱如图1)。
采用常温(室温)按照上述方法合成多肽，质谱如图2。
比较图1和图2，可以看出快速加热可以合成常温难以合成的多肽。
实施例2
本实施例中，所合成的目标多肽的序列为Fomc～FWYTLCRK。合成方法如下：
1)称取取代度为0.3mmol/g的起始树脂Wang Resin 100mg，加入到固相反应容器中，在容器中加入溶剂DMF，使起始树脂完全浸在DMF溶剂中，溶胀30min。
2)在上述容器中加入2.5ml浓度为20％哌啶/DMF脱保护试剂脱除Fmoc保护基，在温度为70℃下反应50s，然后用70℃加热的DMF洗涤三次。
3)以Fmoc～Lys(Boc)～OH为中间原料，将分别为0.6mmol的Fmoc～Arg(Pbf)～OH、HATU在DMF:DIEA(24:1)溶剂中70℃加热活化10s。
4)将活化后的Fmoc～Arg(Pbf)～OH投入到步骤2)的容器中，反应温度控制在70℃，反应时间50s。
5)通过茚三酮监测至反应结束后，用70℃加热的DMF洗涤三次；茚三酮监测步骤为：茚三酮检测液A、B、C液各1滴，加热到100℃并保持2min，如果溶液有蓝色，或固相树脂出现红色、红褐色，表明还有游离氨基，反应尚未完成，否则说明反应完全。
6)取步骤5)制备的产物，重复步骤2)～5)，依次连接下面所述具有Fmoc保护基团的氨基酸：Fmoc～Gly～OH、Fmoc～Leu～OH、Fmoc～Thr(tBu)～OH、Fmoc～Tyr(tBu)～OH、Fmoc～TrP(Boc)～OH、Fmoc～Phe～OH；直到反应结束后，用70℃加热的DMF洗涤三次，用甲醇收缩树脂得到粗肽树脂。
7)取上述粗肽树脂，以每100mg树脂加入切割试剂2ml为比例，切割试剂中各组分的体积比为TFA:TIS:EDT:H2O＝92.5:2.5:2.5:2.5，切割时先冰浴切割试剂0.5小时，切割温度室温，切割时间3小时，然后过滤，收集滤液并冲洗，把除去部分TFA后的滤液加入冰乙醚中，得到的粗肽沉淀溶液用3000转5分钟离心，冲洗离心3次得到多肽粗产品，冰乙醚与滤液的体积比例为10:1。
8)得到的多肽，用质谱检测分子量，理论值为1338，检测结果为1336.71(质谱如图3)。
采用常温按照上述方法合成多肽，质谱如图4，检测分子量为1336.86。
比较图3和图4，从图谱上看快速加热合成的多肽对比于常温合成的多肽相对杂质较少。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。本技术领域技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种固相合成多肽的方法，该方法包括：
以Wang Resin作为起始树脂，以Fmoc氨基保护的氨基酸溶液作为中间原料，通过缩合反应合成多肽；
其中，缩合反应温度控制为70℃～100℃，缩合反应时间为30秒～120秒。
2.根据权利要求1所述方法，该方法包括：
以Wang Resin作为起始树脂，在溶剂DMF作用下溶胀；加入加热后的脱保护试剂，得到脱保护后的树脂，并进行加热冲洗；
以Fmoc氨基保护的氨基酸溶液作为中间原料，在DMF溶剂中加入活化剂对羧基预活化；
将活化后的Fmoc保护的第一氨基酸溶液加热，与脱保护后的树脂产物混合，进行缩合反应，得到带有产物的固相树脂；对带有产物的固相树脂进行加热冲洗；
按照目标多肽氨基酸序列从C端到N端的顺序，依序进行第二及后续氨基酸的缩合，得到多肽固相树脂；
多肽固相树脂通过切割试剂进行切割反应，然后采用冰乙醚沉淀，得到多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述起始树脂的取代度为0.3～0.5mmol/g。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述起始树脂在溶剂DMF作用下溶胀时，溶剂的使用量为起始树脂全部尽在溶剂中的量，溶胀0.5～1小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述脱保护试剂选自Fmoc的脱保护试剂，Fmoc的脱保护试剂选用体积溶度为15％-25％哌啶/DMF溶液，脱保护试剂的使用量为树脂体积的2～5倍。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，脱保护反应温度为70℃～100℃，脱保护反应时间为30秒～120秒。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，对羧基预活化过程中，所述活化剂选自脲正离子型缩合剂HATU，活化剂的使用量与氨基酸投料量的摩尔数相同。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，对羧基预活化过程中，中间原料在70～100℃的加热模块中加热5～15秒，DMF溶剂的使用量为使溶质溶解的量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，DMF溶剂的使用量为溶质与溶剂的质量体积比为100mg:2～5ml。
10.根据权利要求2所述的方法，其中，缩合反应步骤中，保护氨基的投料量与脱保护后的树脂产物的混合的摩尔比为4～10:1。
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