CN109280078A - 一种制备维拉卡肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备维拉卡肽的方法和装置，解决了现有合成过程中存在多肽链间二硫键错配的反应，工艺较长，副反应和副产物的种类较多的问题。本发明采用固相合成的策略，合成维拉卡肽主链树酯，且主链中用Fmoc‑D‑Ala‑D‑Arg(pbf)、Ac‑D‑Cys(SS‑Boc‑L‑Cys(Ot‑Bu))和Fmoc‑D‑Arg(pbf)为起始原料参与合成。本发明经裂解得到维拉卡肽的粗品，整个过程不用纯化，所获得粗太纯度为88.2％，且纯化后收率为57.8％，大大提高了收率。

Description

一种制备维拉卡肽的方法
技术领域
本发明涉及合成领域，具体涉及一种制备维拉卡肽的方法。
背景技术
维拉卡肽英文名：Velcalcetide或AMG416，氨基酸序列结构如下：
维拉卡肽可以在进行血液透析的同时通过静脉给药，这对于每天都需要使用大量药物的 慢性肾病患者来说是一个福音。因此，velcalcetide很有可能会超过Sensipar。分析师预期 velcalcetide的年销售峰值出现在2023年，为10亿美元。
目前已有的专利有CN106795201、CN107434820A、CN105504012A、CN106928320A、CN106928321A等专利。
但是在现有的合成工艺路线中，虽然公开了采用固相合成的策略，但是在合成过程中存 在多肽链间二硫键错配的反应，并且工艺较长，副反应和副产物的种类较多，收率和纯度都 不理想。
发明内容
本发明目的在于提供一种制备维拉卡肽的方法，解决了现有合成过程中存在多肽链间二 硫键错配的反应，工艺较长，副反应和副产物的种类较多的问题，本发明通过原料、步骤和 参数的合理优化，能有效避免工艺合成中存在的二硫键反应，操作简便，大大缩短了工艺的 合成步骤，提高了多肽维拉卡肽的收率和纯度，减少了副反应的发生和副产物的种类，同时 也减少了工艺杂质的研究。
本发明通过下述技术方案实现：
一种制备维拉卡肽的方法，包括：
步骤一、采用Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH、Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))和Fmoc-D-Arg(pbf)-OH为起始原料；先取Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH与树脂偶联制得D-Ala-D-Arg(pbf)-树脂；
步骤二、再将起始原料Fmoc-D-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH， Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH依次偶联到D-Ala-D-Arg(pbf)-树脂上，获得 D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂；
步骤三、将起始原料X-D-Cys(SS-Y-L-Cys(Ot-Bu))偶联在 D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂上，获得 X-D-Cys(SS-Y-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂；
步骤四、通过裂解后得到目标产品维拉卡肽；
其中，X为Fmoc或Ac，Y为Fmoc或Boc。
本发明是采用固相合成的策略合成维拉卡肽主链树酯，本发明的主链中用 Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)、Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))和Fmoc-D-Arg(pbf)为起始原料 参与合成，减少了固相合成中合成步骤，减短了合成时间。并且，本发明通过整体工艺的优 化设置，提高了多肽维拉卡肽的收率和纯度；本发明经裂解得到维拉卡肽的粗品，整个过程不用纯化，所获得粗品纯度可以达到88.2％，且当纯化后纯度达到99％以上时收率能达到57.8％，大大提高了收率。
本发明的方法为纯固相工艺，操作简便，步骤短，工艺合成时间短。同时，本发明合成 工艺中能有效对巯基进行保护，避免了合成中存在的多肽链间二硫键错配的反应，避免产生 肽链间反应，减少了副反应的发生和副产物的种类，同时也减少了工艺杂质的研究。
进一步，所述偶联的过程为：
首先，将树脂加入到固相反应柱中，对树脂进行洗涤和溶胀，再采用DBLK脱除Fmoc保护，再次洗涤；
其次，取起始原料和Cl-HOBt溶于DMF中，冰浴下加入HBTU或PyBop，以及DIEA 活化；
最后，将活化后的起始原料加入到固相反应柱中与树脂进行偶联。
或者，所述偶联的过程为：
首先，将树脂加入到固相反应柱中，对树脂进行洗涤和溶胀，再采用DBLK脱除Fmoc保护，再次洗涤；
其次，取起始原料和HOBt溶于DMF中，冰浴下加入HBTU或PyBop，以及DIEA活化；
最后，将活化后的起始原料加入到固相反应柱中与树脂进行偶联。
更进一步，所述DBLK由体积浓度为20％哌啶的DMF溶液组成。
进一步，所述步骤一和步骤三中的偶联完成后，加入封闭试剂进行封闭，封闭试剂采用 摩尔比为1:1的DIPEA和乙酸酐组成。
进一步，所述裂解中采用的裂解试剂由质量比为83:5:5:5:2的TFA、PhSMe、EDT、TIS 和H2O组成。
进一步，所述裂解试剂的加入量为10mL/g树脂。
进一步，所述步骤一中的树脂为Rink Amide Resin、Rink Amide-MBHA Resin或Rink Amide-AM Resin。
进一步，所述树脂的取代度为1.1mmol/g～0.2mmol/g。
进一步，所述步骤四中裂解后再采用高效液相色谱法进行纯化并转盐，最后经过浓缩干 燥后制成成品。
本发明中所用氨基酸及试剂均可由市场购得。本发明中的缩写和英文含义对应如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
HOBt 1-羟基苯并三唑
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
TFA 三氟乙酸
PhSMe 苯甲硫醚
TIS 三异丙基硅烷
EDT 乙二硫醇
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
HBTU 苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯
t-Bu 叔丁基。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明能有效避免工艺合成中存在的二硫键反应，操作简便，并且大大缩短了工艺的 合成步骤；
2、本发明提高了多肽维拉卡肽的收率和纯度，减少了副反应的发生和副产物的种类，同 时也减少了工艺杂质的研究。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不 构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为实施例1的合成线路图。
图2为实施例1中维拉卡肽纯品HPLC图谱。
图3为实施例2的合成线路图。
图4为实施例2中维拉卡肽纯品HPLC图谱。
图5为实施例3的合成线路图。
图6为实施例3中维拉卡肽纯品HPLC图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明 作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本 发明的限定。
实施例1
一种制备维拉卡肽的方法，如图1所示，包括：
步骤一：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide-MBHA树脂的合成
称取替代度为0.502mmol/g的Rink Amide-MBHA resin 50g为原料，加入到固相反应柱中， 用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护， 然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取36.0g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(50mmol) 和8.2g的HOBt(60mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入22.8g的HBTU(60mmol)活化 10min，再加入DIEA(17.4ml,100mmol)活化5min，再将活化液体加入固相反应柱中，室温反 应6小时。用DMF洗涤3次，加入174ml封闭试剂(DIPEA/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封 闭0.5小时。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.499mmol/g。
步骤二：
Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf) -树脂的制备(Rink Amide-MBHA resin)
称取步骤一中替代度为0.499mmol/g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide-MBHA树脂 (25mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％ 哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取 Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)，Cl-HOBt(60mmol)，溶于DMF合溶液，冰水浴下加入 HBTU(60mmol)和DIEA(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三 酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完 全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重 复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从C端到N 端依次完成Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH、Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys (Ot-Bu))的偶联，用DMF洗涤4次，DCM洗4次。得到Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys (Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂。
步骤三：维拉卡肽的制备
将步骤二中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂，裂解试 剂为TFA/PhSMe/EDT/TIS/H2O＝83:5:5:5:2，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液， 树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁基醚沉淀， 用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗品28.6g，纯度 为88.2％。
步骤四：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备
称取步骤三种任意25.0g维拉卡肽粗品用10L水溶解后，采用汉邦(DAC-HB80)，波长230nm，色谱柱为80×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰 馏分，得到纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(DAC-HB80)，色谱柱为80×250mm 反相C18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干 得到维拉卡肽盐酸盐精肽16.8g，计算总收率为57.8％，RP-HPLC纯度为99.364％。维拉卡 肽三氟乙酸盐精肽的HPLC图谱如图2所示。
实施例2
一种制备维拉卡肽的方法，如图3所示，包括：
步骤一：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA resin的合成
称取替代度为0.502mmol/g的Rink Amide-MBHA resin 50g，加入到固相反应柱中，用 DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然 后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取36.0g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)和 8.2g的HOBt(60mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入22.8g的HBTU(60mmol)和 DIEA(100mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应6小时。用DMF洗涤3次，加入 174ml封闭试剂(DIPEA/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用DMF洗涤4次，DCM 洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA resin树脂。用常规固相替代度 检测方法检测替代度为0.498mmol/g。
步骤二：
Fmoc-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(p bf)-(Rink Amide-MBHA resin)的合成
称取步骤一中替代度为0.498mmol/g的Fmoc-D-Arg(pbf)-OH-MBHA resin(25mmol)，加入 到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱 除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)，Cl-HOBt(60mmol)，溶于DMF合溶液，冰水浴下加入HBTU(60mmol)和DIEA(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无 色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标 准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从C 端到N端依次完成Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))的偶联，用DMF洗涤4次，DCM洗4次。得到 Fmoc-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)- MBHAresin。
步骤三：
Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf) -MBHAresin的合成
称取步骤二中的Fmoc-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D- Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-MBHAresin(25mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用 DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取加入174ml封闭试剂(DIPEA/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭2小时。用 DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys (Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-MBHAresin。
步骤四：维拉卡肽的制备
将实步骤三中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂，裂解 试剂由TFA/PhSMe/EDT/TIS/H2O＝83:5:5:5:2组成，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤， 收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁 基醚沉淀，用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗肽27.6 g，纯度为86.2％。
步骤五：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备
步骤四任意25.0g维拉卡肽粗品用10L水溶解后，采用汉邦(DAC-HB80)，波长230nm， 色谱柱为80×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到 纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(DAC-HB80)，色谱柱为80×250mm反相C18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到维拉卡 肽三氟乙酸盐精肽158.6g，计算总收率为55.32％，RP-HPLC纯度为99.343％。维拉卡肽三 氟乙酸盐精肽的HPLC图谱如图4所示。
实施例3
一种制备维拉卡肽的方法，如图5所示，包括：
步骤一：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHAresin的合成
称取替代度为0.502mmol/g的Rink Amide-MBHAresin 50g，加入到固相反应柱中，用 DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后 用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取36.0g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)和8.2g 的HOBt(60mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入22.8g的HBTU(60mmol)和DIEA(100mmol) 活化10min后加入固相反应柱中，室温反应6小时。用DMF洗涤3次，加入174ml封闭试 剂(DIPEA/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用DMF洗涤4次，DCM洗4次， 甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHAresin树脂。用常规固相替代度检测方法 检测替代度为0.499mmol/g。
步骤二：
Ac-D-Cys(SS-Fmoc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pb f)-(Rink Amide-MBHAresin)的合成
称取步骤一中替代度为0.499mmol/g的Fmoc-D-Arg(pbf)-OH-MBHAresin(25mmol)，加入 到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱 除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(50mmol)，Cl-HOBt(60mmol)，溶于DMF合溶液，冰水浴下加入HBTU(60mmol)和DIEA(75mmol)活化10min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标 准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照维拉卡肽主链肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH、Ac-D-Cys(SS-Fmoc-L-Cys(Ot-Bu))的偶联，用DMF洗涤4次，DCM洗4次。得到Ac-D-Cys(SS-Fmoc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA resin。
步骤三：
Ac-D-Cys(SS-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-MB HAresin的合成
称取步骤二中的Ac-D-Cys(SS-Fmoc-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D- Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA resin(250mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次， 用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次甲醇收缩抽干，得到Ac-D-Cys(SS-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf) -D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA resin。
步骤四：维拉卡肽的制备
将实步骤三中的肽树脂置于裂解反应瓶中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA/PhSMe/EDT/TIS/H2O＝80:5:5:5:5)，室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水甲基叔丁基醚沉淀， 用无水甲基叔丁基醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即维拉卡肽粗肽27.6g，纯度 为86.2％。
步骤五：维拉卡肽三氟乙酸盐精肽的制备
步骤四任意25.0g维拉卡肽粗品用10L水溶解后，采用汉邦(DAC-HB80)，波长230nm， 色谱柱为80×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到 纯度大于98.8％精肽。将精肽溶液采用汉邦(DAC-HB80)，色谱柱为80×250mm反相C18柱，0.1％三氟乙酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到维拉卡 肽三氟乙酸盐精肽15.1g，计算总收率为52.46％，RP-HPLC纯度为99.358％。维拉卡肽三氟 乙酸盐精肽的HPLC图谱如图6所示。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，步骤一中Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-树脂的合成过程不 同，可以采用如下几种合成方式中的任意一种。
第一种合成方式：
称取替代度为0.8mmol/g的Rink Amide resin 50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2 次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗 涤4次，DCM洗2次。称取57.6g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(80mmol)和13.0g的HOBt (96mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入36.4g的HBTU(96mmol)活化10min，再加入 DIEA(28ml，160mmol)活化5min，将活化液体加入固相反应柱中室温反应6小时。用DMF 洗涤3次，加入174ml封闭试剂(吡啶/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用DMF洗 涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide树脂。用常 规固相替代度检测方法检测替代度为0.798mmol/g。
或者，以替代度为0.807mmol/g的Rink Amide-MBHA resin 50g为原料，采用以上相同的 方法，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为 0.799mmol/g。
或者，以替代度为0.805mmol/g的Rink Amide-AM resin 50g为原料，采用以上相同的方 法，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-AM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.798mmol/g。
第二种合成方式：
称取替代度为0.310mmol/g的Rink Amide resin 50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤 2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取21.6g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(30mmol)和4.8g的HOBt(36mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入13.6g的HBTU(36mmol)活化10min，再将 DIEA(10.4ml，60mml)活化5min，将活化液加入固相反应柱中，室温反应6小时。用DMF 洗涤3次，加入174ml封闭试剂(吡啶/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用DMF洗 涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide树脂。用常 规固相替代度检测方法检测替代度为0.298mmol/g。
或者，以替代度为0.304mmol/g的Rink Amide-MBHA resin 50g为原料，采用以上相同的 方法，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为 0.298mmol/g。
或者，以替代度为0.305mmol/g的Rink Amide-AM resin 50g为原料，采用以上相同的方 法，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-AM树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为 0.292mmol/g。
第三种合成方式：
称取替代度为0.201mmol/g的Rink Amide resin 50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤 2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。称取14.4g的Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH(20mmol)和3.2g的HOBt(24mmol)溶于DMF溶液中，冰浴下加入9.2g的HBTU(24mmol)活化10min后,再将 DIEA(7.0ml，40mmol)活化5min，再将活化液体加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF 洗涤3次，加入174ml封闭试剂(吡啶/乙酸酐＝1:1，1mol：1mol)封闭0.5小时。用DMF 洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide树脂。 用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.196mmol/g。
或者，以替代度为0.205mmol/g的Rink Amide-MBHA resin 50g为原料，采用以上相同的 方法，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为 0.198mmol/g。
或者，以替代度为0.211mmol/g的Rink Amide-AM resin 50g为原料，采用以上相同的方 法，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-MBHA树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为 0.192mmol/g。
第四种合成方式：
采用替代度为0.8mmol/g的Rink Amide resin替换步骤一中替代度为0.502mmol/g的Rink Amide-MBHA resin，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide树脂，用常规固相替代度检测 方法检测替代度为0.499mmol/g。
或者，采用替代度为0.504mmol/g的Rink Amide-AM resin替换步骤一中替代度为0.502mmol/g的Rink Amide-MBHA resin，得到Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide-AM树脂， 用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.498mmol/g。
实施例5
采用对比文件CN201410526197.2中记载的工艺制成成品，工艺过程为：取Arg与树脂 偶联，制得Arg-树脂；取Arg-树脂，逐个偶联Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)后，将氮 端氨基乙酰化，得到第一肽树脂；脱除第一肽树脂中Cys(X)的侧链保护基X，再与Y-Cys偶 联，获得第二肽树脂，裂解，即得。
该方法采用特殊的侧链保护基Npys，一方面防止合成原料之间的二硫键合成，另一方面 Npys属于良好的离去基团，能有效提高原料与链间Cys的偶联。提高了多肽Velcalcetide的 收率和纯度，减少副反应的发生。
虽然采用该方法防止了原料之间二硫键合成，提高了收率和纯度，但根据其实施例中数 据可知，其粗品的纯度仅仅只达到63.35％，当纯度达到99.34％时的总收率仅仅只有26.1％， 收率较低。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，包括：
步骤一、采用Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH、Ac-D-Cys(SS-Boc-L-Cys(Ot-Bu))和Fmoc-D-Arg(pbf)-OH为起始原料；先取Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH与树脂偶联制得D-Ala-D-Arg(pbf)-树脂；
步骤二、再将起始原料Fmoc-D-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH，Fmoc-D-Ala-D-Arg(pbf)-OH依次偶联到D-Ala-D-Arg(pbf)-树脂上，获得D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂；
步骤三、将起始原料X-D-Cys(SS-Y-L-Cys(Ot-Bu))偶联在D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂上，获得X-D-Cys(SS-Y-L-Cys(Ot-Bu))-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-Ala-D-Arg(pbf)-树脂；
步骤四、通过裂解后得到目标产品维拉卡肽；
其中，X为Fmoc或Ac，Y为Fmoc或Boc。
2.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述偶联的过程为：
首先，将树脂加入到固相反应柱中，对树脂进行洗涤和溶胀，再采用DBLK脱除Fmoc保护，再次洗涤；
其次，取起始原料和Cl-HOBt溶于DMF中，冰浴下加入HBTU或PyBop，以及DIEA活化；
最后，将活化后的起始原料加入到固相反应柱中与树脂进行偶联。
3.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述偶联的过程为：
首先，将树脂加入到固相反应柱中，对树脂进行洗涤和溶胀，再采用DBLK脱除Fmoc保护，再次洗涤；
其次，取起始原料和HOBt溶于DMF中，冰浴下加入HBTU或PyBop，以及DIEA活化；
最后，将活化后的起始原料加入到固相反应柱中与树脂进行偶联。
4.根据权利要求2或3所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述DBLK由体积浓度为20％哌啶的DMF溶液组成。
5.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述步骤一和步骤三中的偶联完成后，加入封闭试剂进行封闭，封闭试剂采用摩尔比为1:1的DIPEA和乙酸酐组成。
6.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述裂解中采用的裂解试剂由质量比为83:5:5:5:2的TFA、PhSMe、EDT、TIS和H2O组成。
7.根据权利要求6所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述裂解试剂的加入量为10mL/g树脂。
8.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述步骤一中的树脂为Rink Amide Resin、Rink Amide-MBHA Resin或Rink Amide-AM Resin。
9.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述树脂的取代度为1.1mmol/g～0.2mmol/g。
10.根据权利要求1所述的一种制备维拉卡肽的方法，其特征在于，所述步骤四中裂解后再采用高效液相色谱法进行纯化并转盐，最后经过浓缩干燥后制成成品。
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