CN106478805A - 一种glp-1衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型GLP-1衍生物的合成方法，可同时进行三个片段的合成，极大地缩短合成周期，提高产品纯度和收率。

Description

一种GLP-1衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新型利拉鲁肽的合成方法，可同时进行三个片段的合成，极大地缩短合成周期，提高产品纯度和收率。
背景技术
利拉鲁肽（商品名Victoza）是由诺和诺德公司于1996年开始研发，2009年最早于丹麦上市的人GLP-1(7-37)的修饰物。从结构上看利拉鲁肽为GLP-1(7-37)链上34位Lys被Arg取代，在26位的Lys上接入经十六烷酸修饰的谷氨酰胺。GLP-1经脂肪链修饰后的，增加了与白蛋白之间的亲和力，从而降低了被DPP-IV的水解速率和肾清除率，延长生物半衰期。利拉鲁肽的生物半衰期达11～15h，每天只需给药一次皮下注射，大大提高了患者的顺应性。在为期6个月的临床研究表明，利拉鲁肽能降低HbA1c1.1%～1.5%，同时体质量也有所减轻。诺和诺德公司是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽；但此项技术难度大，成本相对较高，同时由于Arg34-GLP-1(7-37)-OH的侧链处于未保护状态，和侧链Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu反应时会产生较多杂质，损失较大。
国内外关于利拉鲁肽制备的报道很多，近些年来研究较多的是采用固相合成利拉鲁肽的方法，例如专利CN102286092A公开了一种固相合成方法，采用Wang树脂，按照利拉鲁肽肽序逐个偶联氨基酸，最后经过反向纯化得到利拉鲁肽，此方法需要逐个连接氨基酸，步骤较长，粗肽纯度不高，总收率15%左右。
此后，片段合成法因其在多肽分子合成上的优越性取代了固相逐步合成法。例如，申请号为201210369966.3的中国专利公开了一种合成利拉鲁肽的方法，此方法需要分别和树脂载体合成5个片段，然后再进行偶联，虽然能够缩短合成周期，提高效率，但是其中涉及到多次的连接和裂解树脂载体，在操作程度上并不简便，从成本和时间控制上并不理想。
再比如，申请号为201410265582.6的中国专利公布的合成方法按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第1至第4氨基酸、第15至第16氨基酸以及第17至第31氨基酸的3个多肽片段，然后按C端至N端顺序偶联3个多肽片段以及其余氨基酸合成利拉鲁肽，虽避免过多的和载体树脂的偶联和酸解，但其第三个片段是在树脂上通过逐个接肽得到的粗肽直接用于后续的合成，并未充分体现出片段合成的优点，整体步骤依旧偏长，从成本和时间控制上仍有提高的空间。
还有，申请号为201510079168.0的中国专利公开了一种片段缩合制备利拉鲁肽的方法，固相合成4个侧链保护的肽片段序列，第一肽片段序列为利拉鲁肽序列中的第1-8位氨基酸，第二肽片段序列为第9-16位氨基酸，第三肽片段序列为第17-26位氨基酸，第四肽片段序列为第27-31位氨基酸；然后将各肽片段在溶液体系中逐步偶联得到全保护利拉鲁肽直链多肽，脱去第20位Lys的侧链保护，并完成修饰，形成全保护利拉鲁肽，然后裂解脱除保护基得到利拉鲁肽粗肽，纯化换盐得到利拉鲁肽。虽然该方法结合了固液两种合成方法，减小了片段肽的当量，但其合成方法较为繁冗，液相逐步合成的片段肽纯度不能保证，后处理明显较固相合成复杂，不利于工业化生产。
因此，目前虽然已有大量利拉鲁肽制备的报道，但是由于片段合成方法中片段肽数量和长度不易确定，仍然存在收率低、纯度低、合成成本过高或合成周期过长等不能进一步满足工业化生产的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成利拉鲁肽的方法，在保证其总收率和纯度的前提下，控制合成成本、减短合成周期，使本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。
为了达到上述目的，本发明提供一种利拉鲁肽的合成方法，包括：
步骤1：根据利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，分别合成长度为4-7个氨基酸的3个多肽片段，所述3个多肽片段为：
第1至第7位氨基酸中任选连续的4-7个氨基酸为多肽片段X，
第11至第17位氨基酸中任选连续的4-7个氨基酸为多肽片段Y，以及
第24至第29位氨基酸中任选连续的4-7个氨基酸为多肽片段Z；
步骤2：将上述3个多肽片段与其余氨基酸按照利拉鲁肽的氨基酸顺序连接，得到利拉鲁肽。
本发明采用合理的片段合成策略，是将利拉鲁肽分为三个主要的片段与剩余氨基酸偶联结合，采用适宜的片段数量和长度参与直链的合成。如果直链全都采用片段合成，过少的片段参与反应，则每个片段的长度过长，溶解性差、纯度不好保证，在偶联时效果欠佳而导致收率低，因此片段肽长度控制在4-7个氨基酸为宜；过多的片段参与反应，则涉及到多次的连接和裂解树脂载体，在操作程度上并不简便，而且成本会大大增加，因此片段数量控制在3个为佳。
进一步，所述多肽片段X、多肽片段Y、多肽片段Z分别以第4、16、29位的甘氨酸作为C末端，因为Gly没有手性位点，宜作为片段肽C末端的氨基酸。具体的，在本发明优选的实施方式中，所述3个多肽片段分别为：
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第11至第16位氨基酸，多肽片段Z为第24至第29位氨基酸；或，
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第13至第16位氨基酸，多肽片段Z为第26至第29位氨基酸；或，
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第12至第16位氨基酸，多肽片段Z为第25至第29位氨基酸；或
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第10至第16位氨基酸，多肽片段Z为第23至第29位氨基酸。
进一步，在所述利拉鲁肽的合成过程中，其中第20的赖氨酸是Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu修饰的赖氨酸，上述步骤2为依次连接多肽片段和其余氨基酸后，直接得到利拉鲁肽。
或者，在所述利拉鲁肽的合成过程中，其中第20位的赖氨酸没有脂肪酸侧链修饰，上述步骤2为先合成利拉鲁肽的肽主链，再将所述利拉鲁肽的肽主链与修饰的脂肪链Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，最终得到利拉鲁肽。这样的连接顺序可以避免脂肪链作为片段的一部分参与偶联时反应位阻大的缺陷，进一步提高收率。
再进一步，本发明提供的利拉鲁肽合成方法全程采用固相多肽合成的方法，这样克服了固液混合方法的繁冗和不利于工业化生产的缺陷，有效的保证了片段肽的纯度以及后处理的易操作性，保证总收率和纯度，使本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。所述固相多肽合成的方法、步骤、试剂选择可以为本领域技术人员的常规技术手段。
具体的，上述3个多肽片段是分别由氨基和侧链分别保护的氨基酸依次经偶联和氨基脱保护反应于固相载体上，裂解脱除C端树脂获得多肽片段；其中所使用的树脂载体为2-氯-三苯甲基氯树脂；所使用的氨基脱保护试剂为DBLK；所使用的偶联剂选自HOBt/DIC、Cl-HOBt/DIC、HOAt/DIC或者PyBOP/DIEA；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1%的TFA的DCM溶液。在本发明优选的实施方式中，所述的固相载体为替代度0.8-1.2mmol/g，优选1.0mmol/g的2-氯-三苯甲基氯树脂，所使用的偶联剂优选HOBt/DIC，氨基酸与偶联剂的摩尔比为1:1:1，所用溶剂为体积比1-4:1，优选1:1的DCM和DMF混合。
在所述步骤2的利拉鲁肽的固相多肽合成方法中，所使用的树脂载体为Fmoc-Gly-Wang树脂；所使用的氨基脱保护试剂为DBLK；所使用的偶联剂选自HOBt/DIC、Cl-HOBt/DIC、HOAt/DIC或PyBOP/DIEA；所使用的裂解剂选自TFA:EDT:H2O=90:5:5、或TFA:EDT:PhSMe:TIS:PhOH:H2O=70:10:10:3:5:2、或TFA:EDT:PhOH:H2O=92:3:3:2。在本发明优选的实施方式中，所述的固相载体为替代度0.28-0.41mmol/g，优选0.323mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂；所述多肽片段与多肽树脂的固相合成使用的偶联剂优选PyBOP和DIEA，摩尔比为1:1；所使用的裂解剂为TFA:EDT:PhSMe:TIS:PhOH:H2O =70:10:10:3:5:2。
在本发明所述利拉鲁肽合成方法中，当所述第20位的赖氨酸没有脂肪酸侧链修饰时，所述合成方法为先合成利拉鲁肽的肽主链树脂，再脱去第20位Lys的侧链保护，将所述利拉鲁肽的肽主链树脂与修饰的脂肪链Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu进行偶联反应，其中脱去第20位Lys的侧链保护的试剂为苯基硅烷/Pd(PPh3)4、Ni(CO)4/DMF/H2O或Pd(PPh3)4/Bu3SnH。在本发明优选的实施方式中，脱去第20位Lys的侧链保护的试剂为苯基硅烷/Pd(PPh3)4，所述利拉鲁肽的肽主链树脂、苯基硅烷和Pd(PPh3)4的摩尔比例1:10:0.2；所述利拉鲁肽的肽主链树脂与Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu反应的摩尔比例是1:2，采用体积比为1-4:1，优选1：1的DCM/DMF混合溶液溶解后加入固相合成仪中。
本发明所述的利拉鲁肽合成方法还可进一步包括纯化步骤，所述纯化是采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C8，流动相系统为50mM的醋酸铵/乙腈体系，梯度洗脱。
更进一步，在本发明优选的实施方式中，提供一种合成利拉鲁肽的方法，包括以下步骤：
步骤1：按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，固相合成3个多肽片段，其中多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第11至第16位氨基酸，多肽片段Z为第24至第29位氨基酸；所用固相载体为替代度1.0mmol/g的2-氯-三苯甲基氯树脂，所使用的氨基脱保护试剂为DBLK；所使用的偶联剂为HOBt/DIC，氨基酸与偶联剂的摩尔比为1:1:1，所用溶剂为体积比1:1的DCM和DMF混合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1%的TFA的DCM溶液；
步骤2：按利拉鲁肽主链C端至N端顺序偶联3个多肽片段以及其余氨基酸固相合成利拉鲁肽树脂，包括以下步骤：
1）多肽树脂I的合成：替代度为0.323mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂，固相反应条件同步骤1，与保护的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH固相反应得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂，再与多肽片段Z进行固相合成，其中所使用的偶联剂为PyBOP和DIEA，摩尔比为1:1，所使用的氨基脱保护试剂为DBLK，得到多肽树脂I即H-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
2）多肽树脂II的合成：按步骤1的固相合成条件，保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)的C端与多肽树脂I的N端偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ile-多肽树脂I，再依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc的赖氨酸(Fmoc-Lys(Alloc)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln(Trt)-OH)进行延伸偶联；脱除氨基保护基得到多肽树脂II，即H-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu) -Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
3）多肽树脂III的合成：将多肽片段Y与多肽树脂II，固相合成反应所使用的偶联剂为PyBOP和DIEA，摩尔比为1:1，所使用的氨基脱保护试剂为DBLK，得到多肽树脂III，即H-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
4）多肽树脂IV的合成：按步骤1的反应条件，将保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)进行延伸偶联，脱除氨基保护基得到多肽树脂IV，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
5）多肽树脂V的合成：将多肽片段X与多肽树脂IV，固相合成反应所使用的偶联剂为PyBOP和DIEA，摩尔比为1:1，得到多肽树脂V；即，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu) -Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
6）所述多肽树脂V先脱去第20位Lys的侧链保护，所用试剂为苯基硅烷和Pd(PPh3)4，多肽树脂V：苯基硅烷：Pd(PPh3)4摩尔比例为1:10:0.2，再采用固相合成法与Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu摩尔比例1:2反应，采用体积比为1:1的DCM/DMF混合溶液溶解后加入固相合成仪中得到利拉鲁肽树脂；
步骤3：利拉鲁肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，所述裂解液为TFA:EDT:PhSMe:TIS:PhOH:H2O=70:10:10:3:5:2，粗品纯化是采用高效液相色谱法进行，纯化用色谱填料为10μm的反相C8，流动相系统为50mM的醋酸铵/乙腈体系，梯度洗脱获得利拉鲁肽终产品。
综上所述，本发明采用合理的片段合成策略，即适宜的片段长度和数量参与直链的合成。片段肽长度适宜，利于片段的溶解，进而保证收率和纯度，且整体步骤缩短，简短合成周期，与申请号为201410265582.6的专利相比，避免了长达15个氨基酸的逐个偶联，整体步数减少约1/3，因此从成本和时间控制上都有极大的提高；并且片段数量合理，避免过多的片段参与反应而涉及到多次的连接和裂解树脂载体，在操作程度上更简便，成本上较申请号为201210369966.3的专利方法成本节约5%以上，并且粗收率较该专利的75.2-84.7%进一步提高到85.0-90.2%，纯化后总收率达到31.2-34.0%。
本发明进一步将Gly作为合适的切割位点，避免手性位点或C末端氨基酸位阻过大对片段合成的影响，纯度达到98.7-99.0%，最大单一杂质控制在0.10-0.12%。
本发明首先合成由保护的氨基酸组成的利拉鲁肽主肽段，再与修饰的脂肪链连接形成侧链，克服了反应位阻大，收率低的缺陷。而且全程采用固相合成方法，克服例如申请号为201510079168.0的专利中固液混合方法的繁冗和不利于工业化生产的缺陷，有效的保证了片段肽的纯度以及后处理的易操作性，使本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。本发明具体实施例中所用原料和试剂均可通过市售获得。
本发明所有的英文缩写代表的名称为：
2-CTC树脂 2-氯-三苯甲基氯树脂 DBLK 20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液
HOBt 1-羟基苯并三唑 DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
Cl-HOBt 6-氯-1-羟基苯并三氮唑 DIEA N，N-二异丙基乙胺
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 DCM 二氯甲烷
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷 DMF N,N-二甲基甲酰胺
TFA 三氟乙酸 EDT 1,2-乙二硫醇
TIS 三异丙基硅烷 PhOH 苯酚
PhSMe 苯甲硫醚 Pd(PPh3)4 四三苯基膦钯
Bu3SnH 三叔丁基锡烷 Ni(CO)4 羰基镍
利拉鲁肽主链从N端至C端的氨基酸顺序编号如下式：
NH2-His1-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-COOH。
实施例1：
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第11至第16位氨基酸，多肽片段Z为第24至第29位氨基酸。
1.1多肽片段X的合成
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂50g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取0.1molFmoc-Gly-OH用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入0.4molDIEA，反应6小时后抽干，加入含有150ml无水甲醇，封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC树脂中的Fmoc保护基15分钟2遍，得到H-Gly-2-CTC树脂，然后用DMF洗涤6次。将0.15molFmoc-Glu(OtBu)-OH和0.15molHOBt，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液150ml，搅拌下加入0.15molDIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂。
按照C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH的延伸偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到107g未脱除2-CTC树脂的多肽片段X。配置裂解试剂1200ml（1%TFA的二氯甲烷溶液），将裂解试剂每次200ml分批倒入烧瓶中，反复洗涤，待产品被洗出，收集滤液，加入至3000ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤两次，并且真空干燥，得到35.3g多肽片段X，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH，纯度96.6%，收率87.0%。
1.2：多肽片段Y的合成
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂50g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取0.1molFmoc-Gly-OH用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入0.4molDIEA，反应6小时后抽干，加入含有150ml无水甲醇，封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC树脂中的Fmoc保护基15分钟2遍，得到H-Gly-2-CTC树脂，然后用DMF洗涤6次。将0.15molFmoc-Glu(OtBu)-OH和0.15molHOBt，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液150ml，搅拌下加入0.15molDIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC树脂。
按照C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH的延伸偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到123g未脱除2-CTC树脂的多肽片段Y。配置裂解试剂1400ml（1%TFA的二氯甲烷溶液），将裂解试剂每次200ml分批倒入烧瓶中，反复洗涤，待产品被洗出，收集滤液，加入至3000ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤两次，并且真空干燥，得到48.5g多肽片段Y，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH，纯度98.4%，收率88.0%。
1.3：多肽片段Z的合成
称取替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂50g，加入到固相合成仪反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后抽干，取0.1molFmoc-Gly-OH用DMF溶解，加入上述装有树脂的反应柱中，再加入0.4molDIEA，反应6小时后抽干，加入含有150ml无水甲醇，封闭1小时，用DMF洗涤6次，得到Fmoc-Gly-2-CTC树脂。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-2-CTC树脂中的Fmoc保护基15分钟2遍，得到H-Gly-2-CTC树脂，然后用DMF洗涤6次。将0.15molFmoc-Arg(Pbf)-OH和0.15molHOBt，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液150ml，搅拌下加入0.15molDIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-2-CTC树脂。
按照C端到N端的氨基酸顺序，重复上述脱除保护基和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、和Fmoc-Ala-OH的延伸偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到131g未脱除2-CTC树脂的多肽片段Z。配置裂解试剂1400ml（1%TFA的二氯甲烷溶液），将裂解试剂每次200ml分批倒入烧瓶中，反复洗涤，待产品被洗出，收集滤液，加入至3000ml乙醚中，析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤两次，并且真空干燥，得到55.5g多肽片段Z，Fmoc-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-OH，纯度96.8%，收率87.0%。
1.4：多肽树脂I的合成
称取替代度为0.323mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，每次10分钟，再用DCM溶胀树脂30分钟后，抽走溶剂，再换DMF洗涤一遍。
用DBLK脱除Fmoc-Gly-Wang树脂中的Fmoc保护基15分钟2遍，得到H-Gly-Wang树脂，然后用DMF和DCM交替洗涤共6次。称取32.3mmolFmoc-Arg(Pbf)-OH和32.3mmolHOBt，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，搅拌下加入32.3mmolDIC，继续搅拌反应1小时，加入固相合成仪反应器中，室温反应2h（反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h），得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
然后取32.3mmol实施例3方法合成的多肽片段Z和32.3mmolPyBOP，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，搅拌下加入32.3mmolDIEA，加入到装有Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂的固相合成仪反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，再用DBLK脱Fmoc保护基15分钟2遍，用DMF和DCM交替洗涤共6次，得到多肽树脂I，即H-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
1.5：多肽树脂II的合成
取32.3mmol保护氨基酸和32.3mmolHOBt，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，搅拌下加入32.3mmolDIC，继续搅拌反应1小时，加入装有多肽树脂I的固相合成仪反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，延长偶联反应时间)。
保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)的C端与多肽树脂I的N端偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ile-多肽树脂I，再依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc的赖氨酸(Fmoc-Lys(Alloc)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln(Trt)-OH)进行延伸偶联。反应结束抽掉反应液，树脂用DMF和DCM交替洗涤共6次，用DBLK脱除Fmoc保护基15分钟2遍，然后再用DMF和DCM交替洗涤6次，得到多肽树脂II，即H-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
1.6：多肽树脂III的合成
取32.3mmol实施例2方法合成的多肽片段Y和32.3mmol PyBOP，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，搅拌下加入32.3mmolDIEA，加入到装有多肽树脂II的固相合成仪反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，再用DBLK脱Fmoc保护基15分钟2遍，用DMF和DCM交替洗涤共6次，得到多肽树脂III，即H-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
1.7：多肽树脂IV的合成
取32.3mmol保护氨基酸和32.3mmolHOBt，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，搅拌下加入32.3mmolDIC，继续搅拌反应1小时，加入装有多肽树脂III的固相合成仪反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，延长偶联反应时间)。
保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)进行延伸偶联。反应结束抽掉反应液，树脂用DMF和DCM交替洗涤共6次，用DBLK脱除Fmoc保护基15分钟2遍，然后再用DMF和DCM交替洗涤6次，得到多肽树脂IV，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
1.8：多肽树脂V的合成
取32.3mmol实施例1方法合成的多肽片段X和32.3mmol PyBOP，溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，搅拌下加入32.3mmolDIEA，加入到装有多肽树脂IV的固相合成仪反应器中，室温反应3h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再延长偶联反应时间)，用DMF和DCM交替洗涤共6次，得到多肽树脂V；即，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu) -Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
1.9：利拉鲁肽树脂的合成
将200mL二氯甲烷加入到装有多肽树脂V的固相合成仪反应器中，再加入161.5mmol苯基硅烷，反应3分钟，再加入3.6mmolPd(PPh3)4，室温反应45分钟，抽掉反应液，用DMF和DCM交替洗涤共6次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Alloc已脱除。
称取32.3mmolNα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu用体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液溶解后，加入固相合成仪反应器中，反应2小时，茚三酮检测反应终点。得利拉鲁肽树脂108g，即Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂。
1.10：利拉鲁肽树脂的裂解
将实施例9得到的利拉鲁肽树脂108g，加入到1000ml烧瓶中，配置600ml裂解液TFA:EDT:PhSMe:TIS:PhOH:H2O=70:10:10:3:5:2（三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：三异丙基硅烷：苯酚：水=70:10:10:3:5:2），将裂解液加入到烧瓶中，室温反应3小时，反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到6000ml无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到54.6g利拉鲁肽粗肽，H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr -Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-ε-(Nα-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，粗肽收率90.2%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。
1.11：利拉鲁肽粗肽的纯化
取实施例10所得利拉鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH9至完全溶解，溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用；采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C8，流动相系统为50mM的醋酸铵/乙腈体系，50mm*250mm的色谱柱流速为60mL/min，检测波长：215nm，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，收集主峰进行浓缩、冻干，得到精肽：20.6克，纯度：99.0%，总收率：34.0%，最大单一杂质0.10%。
实施例2：
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第13至第16位氨基酸，多肽片段Z为第26至第29位氨基酸。
采用类似实施例1的合成方法，最终得到53.4g利拉鲁肽粗肽，粗肽收率88.1%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。纯化处理后得到利拉鲁肽精肽：19.8克，纯度：98.7%，总收率：32.7%，最大单一杂质0.12%。
实施例3：
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第12至第16位氨基酸，多肽片段Z为第25至第29位氨基酸。
采用类似实施例1的合成方法，最终得到53.9g利拉鲁肽粗肽，粗肽收率88.1%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。纯化处理后得到利拉鲁肽精肽：20.2克，纯度：99.0%，总收率：33.4%，最大单一杂质0.10%。
实施例4：
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第10至第16位氨基酸，多肽片段Z为第23至第29位氨基酸。
采用类似实施例1的合成方法，最终得到51.5g利拉鲁肽粗肽，粗肽收率85.0%。MALDI-TOF：(M+H)+=3752.1。纯化处理后得到利拉鲁肽精肽：18.9克，纯度：98.9%，总收率：31.2%，最大单一杂质0.11%。

Claims (10)

1.一种利拉鲁肽的合成方法，包括：
步骤1：根据利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，分别合成长度为4-7个氨基酸的3个多肽片段，所述3个多肽片段为：
第1至第7位氨基酸中任选连续的4-7个氨基酸为多肽片段X，
第11至第17位氨基酸中任选连续的4-7个氨基酸为多肽片段Y，以及
第24至第29位氨基酸中任选连续的4-7个氨基酸为多肽片段Z；
步骤2：将上述3个多肽片段与其余氨基酸按照利拉鲁肽的氨基酸顺序连接，得到利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述多肽片段X、多肽片段Y、多肽片段Z分别以第4、16、29位的甘氨酸作为C末端。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述3个多肽片段分别为：
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第11至第16位氨基酸，多肽片段Z为第24至第29位氨基酸；或
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第13至第16位氨基酸，多肽片段Z为第26至第29位氨基酸；或
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第12至第16位氨基酸，多肽片段Z为第25至第29位氨基酸；或
多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第10至第16位氨基酸，多肽片段Z为第23至第29位氨基酸。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述第20位的赖氨酸没有脂肪酸侧链修饰，所述步骤2为先合成利拉鲁肽的肽主链，再将所述利拉鲁肽的肽主链与修饰的脂肪链Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu反应，最终得到利拉鲁肽；或
所述第20位的赖氨酸是Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu修饰的赖氨酸，所述步骤2为依次连接多肽片段和其余氨基酸后，直接得到利拉鲁肽。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述合成方法为固相多肽合成的方法。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，在所述步骤1的3个多肽片段的固相多肽合成方法中，所使用的树脂载体为2-氯-三苯甲基氯树脂；所使用的氨基脱保护试剂为DBLK；所使用的偶联剂选自HOBt/DIC、Cl-HOBt/DIC、HOAt/DIC或者PyBOP/DIEA；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5-1%的TFA的DCM溶液。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，在所述步骤2的利拉鲁肽的固相多肽合成方法中，所使用的树脂载体为Fmoc-Gly-Wang树脂；所使用的氨基脱保护试剂为DBLK；所使用的偶联剂选自HOBt/DIC、Cl-HOBt/DIC、HOAt/DIC或PyBOP/DIEA；所使用的裂解剂选自TFA:EDT:H2O=90:5:5、或TFA:EDT:PhSMe:TIS:PhOH:H2O=70:10:10:3:5:2、或TFA:EDT:PhOH:H2O=92:3:3:2。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述第20位的赖氨酸没有脂肪酸侧链修饰，所述合成方法为先合成利拉鲁肽的肽主链树脂，再脱去第20位Lys的侧链保护，将所述利拉鲁肽的肽主链树脂与修饰的脂肪链Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu进行偶联反应，其中脱去第20位Lys的侧链保护的试剂为苯基硅烷/Pd(PPh3)4、或Ni(CO)4/DMF/H2O、或Pd(PPh3)4/Bu3SnH。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，进一步包括纯化步骤，采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C8，流动相系统为50mM的醋酸铵/乙腈体系，梯度洗脱。
10.一种合成利拉鲁肽的方法，包括以下步骤：
步骤1：按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，固相合成3个多肽片段，其中多肽片段X为第1至第4位氨基酸，多肽片段Y为第11至第16位氨基酸，多肽片段Z为第24至第29位氨基酸；所用固相载体为替代度1.0mmol/g的2-氯-三苯甲基氯树脂，所使用的氨基脱保护试剂为DBLK；所使用的偶联剂为HOBt/DIC，氨基酸与偶联剂的摩尔比为1：1：1，所用溶剂为体积比1：1的DCM和DMF混合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5-1％的TFA的DCM溶液；
步骤2：按利拉鲁肽主链C端至N端顺序偶联3个多肽片段以及其余氨基酸固相合成利拉鲁肽树脂，包括以下步骤：
1）多肽树脂I的合成：替代度为0.323mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂，固相反应条件同步骤1，与保护的氨基酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH固相反应得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂，再与多肽片段Z进行固相合成，其中所使用的偶联剂为PyBOP和DIEA，摩尔比为1：1，所使用的氨基脱保护试剂为DBLK，得到多肽树脂I即H-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
2）多肽树脂II的合成：按步骤1的固相合成条件，保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)的C端与多肽树脂I的N端偶联后脱Fmoc保护基得到H-Ile-多肽树脂I，再依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Alloc的赖氨酸(Fmoc-Lys(Alloc)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln(Trt)-OH)进行延伸偶联；脱除氨基保护基得到多肽树脂II，即H-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile -Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
3）多肽树脂III的合成：将多肽片段Y与多肽树脂II，固相合成反应所使用的偶联剂为PyBOP和DIEA，摩尔比为1：1，所使用的氨基脱保护试剂为DBLK，得到多肽树脂III，即H-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu) -Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
4）多肽树脂IV的合成：按步骤1的反应条件，将保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)进行延伸偶联，脱除氨基保护基得到多肽树脂IV，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang树脂；
5）多肽树脂V的合成：将多肽片段X与多肽树脂IV，固相合成反应所使用的偶联剂为PyBOP和DIEA，摩尔比为1：1，得到多肽树脂V；即，Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe -Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Wang王树脂；
6）所述多肽树脂V先脱去第20位Lys的侧链保护，所用试剂为苯基硅烷和Pd(PPh3)4，多肽树脂V：苯基硅烷：Pd(PPh3)4摩尔比例为1：10:0.2，再采用固相合成法与Nα-Palmotiyl-Glu(ONSu)-OtBu摩尔比例1:2反应，采用体积比为1：1的DCM/DMF混合溶液溶解后加入固相合成仪中得到利拉鲁肽树脂；
步骤3：利拉鲁肽树脂裂解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，所述裂解液为TFA:EDT:PhSMe:TIS:PhOH:H2O=70:10:10:3:5:2，粗品纯化是采用高效液相色谱法进行，纯化用色谱填料为10μm的反相C8，流动相系统为50mM的醋酸铵/乙腈体系，梯度洗脱获得利拉鲁肽终产品。
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