CN109456402A - 一种索玛鲁肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种索玛鲁肽的合成方法,属于多肽合成领域。该方法采用固相合成索玛鲁肽主序列的第1‑31位氨基酸,第10位Val与第11位Ser采用Fmoc‑Val10‑Ser11(Psi(Me,Me)pro)‑OH;第20位Lys侧链采用Fmoc‑Lys(X)‑OH。经裂解沉淀得到索玛鲁肽粗肽;经纯化得到索玛鲁肽。该方法通过引入Fmoc‑Val10‑Ser11(Psi(Me,Me)pro)‑OH来解决索玛鲁肽困难序列合成问题,使得困难序列的合成变的简单易操作,同时极大的提高了收率和粗肽的纯度,大大降低了生产成本,利于进行工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域,特别涉及GLP-1受体激动素一种索玛鲁肽的合成方法。
背景技术
中文名:索玛鲁肽;英文名:Sermaglutide;肽序列为:
H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Octadecanedioic-γ-Glu-PEG2-PEG2)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
索玛鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的新型长效GLP-1类似物,从氨基酸序列上看,肽序2位为非天然氨基酸氨基异丁酸,肽序20位的Lys侧链氨基经过了PEG、γ-Glu和十八烷二酸的修饰。与利拉鲁肽相比,修饰后的索玛鲁肽亲水性增强,抑制DPP-4酶的水解,延长生物半衰期,长效降低血糖,促进胰岛细胞再生,延长胃排空等多种作用,应用前景广泛。
中国公开专利文献CN 201511027176公开了索玛鲁肽的制备方法,固相逐一合成索玛鲁肽直链肽,合成侧链修饰基团,脱去Lys的保护基,并偶联侧链修饰基团,最终裂解得到该多肽产物。该方法采用氨基酸逐个偶联的方式,随着直链肽的延长,大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用,部分活性基团被包裹其中,直连肽的偶联会异常困难,工艺中产生不易除去的缺陷肽,增加投料和延长时间无法从根本上解决问题。
中国公开专利文献CN 201610926972公开了一种合成索玛鲁肽的固相合成方法,同样采用的是逐一偶联的办法。
因此,本领域迫切需要提供一种索玛鲁肽的合成方法,以解决现有索玛鲁肽合成过程中存在,纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,废液过量的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,不利于工业化生产的问题,提供一种新的索玛鲁肽的合成方法,该方法采用二肽的形式进行偶联,破坏了直链肽的二级结构,解决了偶联困难问题,去除了工艺产生的缺失肽,减少了投料,降低成本,有利于放大生产。
本发明所要解决的技术问题是通过过以下的技术方案来实现的。本发明是一种索玛鲁肽的合成方法,其特点是,其步骤包括:
(1)固相合成索玛鲁肽主序列的第1-31位氨基酸,第10位Val与第11位Ser采用Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH;第20位Lys侧链采用Fmoc-Lys(X)-OH,X选自:Alloc,Dde,ivdde,Mtt,Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH;
(2)当Lys20的侧链为Alloc、Dde、ivdde、Mtt时,需要先脱去这些保护基团后偶联Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH;
(3)经裂解沉淀得到索玛鲁肽粗肽;
(4)索玛鲁肽粗肽经纯化得到索玛鲁肽。
本发明所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是:20位Lys的侧链保护基团选用催化氢化脱除AllocAlloc,Dde,ivdde或者Mtt。
本发明所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是:裂解采用的裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O=90∶3∶3∶2∶2。
本发明所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是:固相合成索玛鲁肽主序列时,采用Fmoc-Gly-Wang树脂,其制备方法如下:
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂;加Fmoc-Gly-OH、HOBt到DMF溶液中搅拌溶解,降温到5~8℃后,加入DIC溶液搅拌,将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应4-6h;抽干溶剂,加入醋酸酐,吡啶,DMF,封闭1.5-2.5h;DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥后,得到Fmoc-Gly-Wang树脂。
本发明所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是:所述的Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH的制备方法如下:
(1)Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备:
取Fmoc-Val-OH、HOBt溶于DCM中,加DIC反应;取H-Ser-OBzl·HCl,溶于DCM中,滴加DIEA;记为溶液A;14℃-16℃滴加溶液A,14℃-16℃反应4-5小时;过滤得固体,DCM洗涤;30~50℃真空干燥,得固体;
(2)Fmoc-Val-Ser(PsiMe,MePro)-OBzl的制备:
取Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于DCM中,升温至30℃,加2,2-二甲氧基丙烷,升温至60℃,回流30~40min后,蒸馏;将反应液倒入饱和NaHCO3溶液中,搅拌,过滤,所得液体静置分层;加入无水乙醇,冷却至室温加晶种,继续降温至15℃,结晶;滤出固体;40℃真空干燥,得固体;
(3)Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH的制备:
将Fmoc-Val-Ser(PsiMe,MePro)-OBzl溶于THF中,加入钯碳,氢气置换;加氢反应1.5-2.5小时,滤除钯碳,加入乙酸乙酯,升温至回流,冷却至30℃加入晶种,降温至17℃结晶;滤出固体,35℃真空干燥,得固体。
本发明所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是:其具体步骤如下:
(1)全保护肽的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应;茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH、进行偶联反应;
取四三苯基膦钯,吗啡啉,THF加入到固相反应器中,反应2-4h,DMF洗涤,茚检结果呈阳性;
取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH,HOBt,DIC加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应2-4h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT=90∶2.5∶2.5∶5,冰浴条件下加入到全保护肽中,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应2-3h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;加入乙醚离心沉淀;粗肽干燥;
(3)索玛鲁肽的纯化
样品处理:将索玛鲁肽粗品样品溶于乙腈水溶液,完全溶解后用0.22μm滤膜过滤;收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用;
第一步HPLC纯化
色谱条件:以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相50mm×250mm,10μm为色谱柱;以0.2%高氯酸为流动相A;以乙腈为流动相B;流速为50mL每分钟;检测波长为230nm;按以下洗脱梯度进行洗脱:
收取纯度大于90%的索玛鲁肽样品的馏分;用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃,真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈;得到索玛鲁肽第一步样品溶液;
第二步HPLC纯化
色谱条件:以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相50mm×250mm,10μm为色谱柱;以0.1%三氟乙酸溶液为流动相A;以乙腈为流动相B;流速为50mL每分钟;检测波长为230nm;按以下洗脱梯度进行洗脱:
收取纯度大于99.5%的索玛鲁肽样品的馏分;用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃,真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈,得索玛鲁肽。
本发明合成方法中,所用的缩合剂可以为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂可以为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂可以为v/v25%哌啶/DMF溶液。如无特殊说明,本发明合成方法中涉及的产品及方法可以采用现有技术中公开的产品或者方法。
与现有技术相比,本发明方法具有以下有益效果:本发明方法采用二肽的形式进行偶联,破坏了直链肽的二级结构,解决了偶联困难问题,去除了工艺产生的缺失肽,减少了投料,降低成本,有利于放大生产。该方法通过引入Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH来解决索玛鲁肽困难序列合成问题,使得困难序列的合成变的简单易操作,同时极大的提高了收率和粗肽的纯度。
附图说明
图1为实施例所制得的索玛鲁肽产品的质谱图。
具体实施方式
以下进一步地对本发明技术方案时行描述,以使本领域技术人员进一步地理解本发明,而不构成对本发明权利的限制。
一、Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
称取Wang树脂110.0g(Sub=0.61mmol/g)加入到固相反应器中,加入360mL DCM溶胀树脂0.5h,抽干溶剂。加Fmoc-Gly-OH 49.1g、HOBt 29.5g到360mlDMF溶液中搅拌溶解,降温到5~8度后,加入DIC 29.5mL溶液搅拌,将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应5h。抽干溶剂,加入醋酸酐11mL,吡啶8mL,DMF 170mL,封闭2h。DCM与甲醇交替洗涤3次,每次170mL。真空干燥后,得到Fmoc-Gly-Wang树脂的替代度约Sub=0.55mmol/g左右。
二、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH的制备
1、Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备
取100g Fmoc-Val-OH、HOBt溶于1000ml DCM中,加DIC,10~15min反应1小时,取70g H-Ser-OBzl·HCl,溶于300ml DCM中,滴加DIEA。记为溶液A。15℃左右,滴加溶液A,5min滴加完毕。15℃反应4.5小时。过滤得固体,DCM洗涤两次,每次200ml;30~50℃真空干燥,得固体137.1g,纯度≥90%,收率73.27%。
2、Fmoc-Val-Ser(PsiMe,MePro)-OBzl的制备
取110g Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于800mlDCM中,升温至30℃,加2,2-二甲氧基丙烷,升温至60℃,回流30~40min后,蒸馏;将反应液倒入饱和NaHCO3溶液中,搅拌20min,过滤,所得液体静置分层。加入130ml无水乙醇(有固体析出),冷却至室温加晶种,继续降温至15℃,结晶。滤出固体;40℃真空干燥,得固体100.92g。收率75.13%
3、Fmoc-Val10-Serl1(Psi(Me,Me)pro)-OH的制备
将Fmoc-Val-Ser(PsiMe,MePro)-OBzl溶于350ml THF中,加入钯碳,氢气置换3次。加氢反应约2小时,滤除钯碳,加入300ml乙酸乙酯,升温至回流(溶清),冷却至30℃加入晶种,降温至17℃结晶。滤出固体,35℃真空干燥,得固体91g。
三、全保护肽的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂25.0g,加入到固相反应器中,加入100mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,分别加入2次90mL v/v 20%哌啶/DMF溶液,反应5min和15min。抽干溶剂,加入DMF 90mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 22g,HOBt 60g,DIC 60mL,加入DMF100mL溶解,冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次100mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH、进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯17g,吗啡啉1mL,100ml THF加入到固相反应器中,反应3h,DMF洗涤3次,每次加入100mL,茚检结果呈阳性。
称取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH 33g,HOBt 6g,DIC6mL加入DMF 100mL溶解,冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应3h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂。加入DMF洗涤3次,每次90mL。DCM与甲醇交替洗涤3次,每次100mL,真空干燥。
四、裂解
配制500mL裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT=90∶2.5∶2.5∶5,冰浴条件下加入到全保护肽中,0.5h后恢复至室温继续反应2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次,每次加入乙醚3L。粗肽进行干燥。所得粗肽63.0g。
五、索玛鲁肽的纯化
溶液经对照品定量含索玛鲁肽27.6g,合成总收率87.2%,粗品纯度71.19%。取索玛鲁肽粗品
样品处理:将含27.6g索玛鲁肽粗品(粗品重量:63.0g)样品溶于乙腈水溶液,完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件:以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相(50mm×250mm,10μm)为色谱柱;以0.2%高氯酸(取1000ml水,加3ml磷酸,混合均匀,用三乙胺调节pH值至7.5)为流动相A;以乙腈为流动相B;流速为50mL每分钟;检测波长为230nm;单针上样量为4.5g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于90%的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃,真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到索玛鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件:以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相(50mm×250mm,10μm)为色谱柱;以0.1%三氟乙酸溶液(取1000ml水加三氟乙酸1ml)∶乙腈=80∶20(V∶V)为流动相A;以乙腈为流动相B;流速为50mL每分钟;检测波长为230nm;上样量为2.0g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于99.5%的索玛鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃,真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈,溶液经对照品定量含索玛鲁肽20.1g,收率达72.8%。所制得的索玛鲁肽产品的质谱图参照图1。
Claims (6)
1.一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于,其步骤包括:
(1)固相合成索玛鲁肽主序列的第1-31位氨基酸,第10位Val与第11位Ser采用Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH;第20位Lys侧链采用Fmoc-Lys(X)-OH,X选自:Alloc,Dde,ivdde,Mtt,Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH;
(2)当Lys20的侧链为Alloc、Dde、ivdde、Mtt时,需要先脱去这些保护基团后偶联Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH;
(3)经裂解沉淀得到索玛鲁肽粗肽;
(4)索玛鲁肽粗肽经纯化得到索玛鲁肽。
2.根据权利要求l所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:20位Lys的侧链保护基团选用催化氢化脱除AllocAlloc,Dde,ivdde或者Mtt。
3.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:裂解采用的裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O=90∶3∶3∶2∶2。
4.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:固相合成索玛鲁肽主序列时,采用Fmoc-Gly-Wang树脂,其制备方法如下:
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂;加Fmoc-Gly-OH、HOBt到DMF溶液中搅拌溶解,降温到5~8℃后,加入DIC溶液搅拌,将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应4-6h;抽干溶剂,加入醋酸酐,吡啶,DMF,封闭1.5-2.5h;DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥后,得到Fmoc-Gly-Wang树脂。
5.根据权利要求1所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:所述的Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH的制备方法如下:
(1)Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备:
取Fmoc-Val-OH、HOBt溶于DCM中,加DIC反应;取H-Ser-OBzl·HCl,溶于DCM中,滴加DIEA;记为溶液A;14℃-16℃滴加溶液A,14℃-16℃反应4-5小时;过滤得固体,DCM洗涤;30~50℃真空干燥,得固体;
(2)Fmoc-Val-Ser(PsiMe,MePro)-OBzl的制备:
取Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于DCM中,升温至30℃,加2,2-二甲氧基丙烷,升温至60℃,回流30~40min后,蒸馏;将反应液倒入饱和NaHCO3溶液中,搅拌,过滤,所得液体静置分层;加入无水乙醇,冷却至室温加晶种,继续降温至15℃,结晶;滤出固体;40℃真空干燥,得固体;
(3)Fmoc-Va110-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH的制备:
将Fmoc-Val-Ser(PsiMe,MePro)-OBzl溶于THF中,加入钯碳,氢气置换;加氢反应1.5-2.5小时,滤除钯碳,加入乙酸乙酯,升温至回流,冷却至30℃加入晶种,降温至17℃结晶;滤出固体,35℃真空干燥,得固体。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的一种索玛鲁肽的合成方法,其特征在于:其具体步骤如下:
(1)全保护肽的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂,加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入哌啶/DMF溶液,反应;抽干溶剂,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Arg(Pbf)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应;茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列,依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me,Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(Trt)-OH、进行偶联反应;
取四三苯基膦钯,吗啡啉,THF加入到固相反应器中,反应2-4h,DMF洗涤,茚检结果呈阳性;
取Octadecanedioic Acid(OtBu)-γ-Glu-OtBu-PEG-PEG-OH,HOBt,DIC加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应2-4h,茚检检测结果呈阴性后,抽干溶剂;加入DMF洗涤,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT=90∶2.5∶2.5∶5,冰浴条件下加入到全保护肽中,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应2-3h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;加入乙醚离心沉淀;粗肽干燥;
(3)索玛鲁肽的纯化
样品处理:将索玛鲁肽粗品样品溶于乙腈水溶液,完全溶解后用0.22μm滤膜过滤;收集过滤后的索玛鲁肽粗肽水溶液备用;
第一步HPLC纯化
色谱条件:以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相50mm×250mm,10μm为色谱柱;以0.2%高氯酸为流动相A;以乙腈为流动相B;流速为50mL每分钟;检测波长为230nm;按以下洗脱梯度进行洗脱:
收取纯度大于90%的索玛鲁肽样品的馏分;用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃,真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈;得到索玛鲁肽第一步样品溶液;
第二步HPLC纯化
色谱条件:以碳十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相50mm×250mm,10μm为色谱柱;以0.1%三氟乙酸溶液为流动相A;以乙腈为流动相B;流速为50mL每分钟;检测波长为230nm;按以下洗脱梯度进行洗脱:
收取纯度大于99.5%的索玛鲁肽样品的馏分;用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃,真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈,得索玛鲁肽。
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