CN114685645A - 一种索玛鲁肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种索玛鲁肽的合成方法，包括以下步骤：肽片段I的合成：
肽片段III的合成：Cys18‑Gly31；中间体I的合成：His1‑Gln17‑Cys18‑Gly31；索玛鲁肽粗肽的合成；或肽片段II的合成：
肽片段IV的合成：Cys19‑Gly31；中间体II的合成：His1‑Ala18‑Cys19‑Gly31；索玛鲁肽粗肽的合成。本发明可以通过对固相合成两个片段肽进行纯化，大大减少最终索玛鲁肽产品消旋、氧化、水解产生的杂质。同时由于两个片段可以同时合成，提高合成效率。在液相进行两段片段肽液相一步反应制得索玛鲁肽粗肽，在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未缩合的部分片段，不会造成纯化上的困难，此外，未缩合的部分肽片段还能回收再利用，节约了成本。
Description
技术领域
本发明属于多肽类药物生产技术领域，涉及一种索玛鲁肽的合成方法。
背景技术
索玛鲁肽(Semaglutide)由Nove Nordisk公司研发的每周一次皮下注射的长效GLP-1类似物，2017年12月5日获美国FDA批准上市。从结构上看，索玛鲁肽是GLP-1(7-37)链上8位的Ala替换成Aib，34位的Lys替换成Arg，26位的Lys接上十八烷酸脂肪链。与利拉鲁肽相比，索玛鲁肽的脂肪链更长，疏水性增加，但是索玛鲁肽经过短链的PEG修饰，亲水性大大增强。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP-4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长循环的效果。
索玛鲁肽化学名为N6,26-{18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctadecanoyl}-[8-(2-amino-2-propanoicacid),34-L-arginine]human glucagon-like peptide 1(7-37)，分子式为C187H291N45O59，分子量为4113.5775，序列为H-His-Aib-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Val10-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu15-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys20(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp25-Leu-Val-Arg-Gly-Arg30-Gly-OH，AEEA为特殊氨基酸2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸。
目前报道关于索玛鲁肽的合成方法主要采用固相逐步偶联法(Fmoc-SPPS)，然而，采用常规的固相逐步偶联法(Fmoc-SPPS)合成索玛鲁肽具有很大的合成挑战性，主要体现在偶联过程中树脂的收缩较为严重，产生了大量的缺失肽，既明显地降低了收率，又增加了终产品的纯化难度，使得研发成本大量增加。因此，全保护肽片段缩合法合成索玛鲁肽应运而生，该方法的基本思路是：首先通过固相合成得到几个全保护的小片段多肽，再在液相中或固相载体上缩合得到全保护的长肽链，最后裂解侧链保护基得到索玛鲁肽。然而，由于所有的多肽片段是全保护的，溶解性差就成为使用此方法碰到的最棘手问题，而且全保护的多肽片段不能通过高效液相色谱纯化，在最终索玛鲁肽粗肽中杂质较多，对分离纯化的技术要求也很高。此外，由于片段末端氨基酸残基在偶联过程中可能发生消旋，偶联位点只能局限于不能发生消旋的Gly和Pro位点或消旋风险比较小的位点。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的技术问题，本发明的目的在于提供一种索玛鲁肽的合成方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种索玛鲁肽的合成方法，包括以下步骤：
肽片段I的合成：
(His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-COSR)；
肽片段III的合成：Cys18-Gly31(Cys-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly)；
中间体I的合成：His1-Gln17-Cys18-Gly31(His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Cys-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly)；
索玛鲁肽粗肽的合成；
或
肽片段II的合成：
(His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu15-Gly-Gln-Ala-COSR)；
肽片段IV的合成：Cys19-Gly31(Cys-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-OctadecanedioicAcid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly)；
中间体II的合成：His1-Ala18-Cys19-Gly31(His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Cys-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Octadecanedioic Acid)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly)；
索玛鲁肽粗肽的合成。
进一步地，所述肽片段I的合成方法包括以下步骤：1)选择Rink Amide、RinkAmide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin树脂为合成起点，制备
2)将
去保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH，得到
3)脱除
主链保护基Allyl，得到
4)将
与硫醇RSH进行偶联，得到
5)将
进行裂解，得到
优选地，步骤1)中所述树脂替代度为0.2-0.8mmol/g，优选为0.4-0.5mmol/g；
优选地，步骤1)具体为：将Rink Amide、Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHAResin树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Glu-OAllyl和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间得到
更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤2)中所述偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(trt)-OH；
优选地，步骤2)具体为：将
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；重复上述步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(trt)-OH；更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤3)中所述脱除主链保护基Allyl的试剂为Pd(PPh3)4和Morpholine的混合物，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.1～0.5：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为5～20：1，所述合成规模是指投入树脂替代度乘以树脂质量得到的量；更优选地，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.3：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为12：1；
优选地，步骤3)具体为：将Pd(PPh3)4和Morpholine在溶剂中溶解，加入到固相反应柱中，脱除Glu上的Allyl保护；更优选地，所述溶剂为DCM、DMF中的一种或多种；
优选地，步骤4)中所述硫醇包括巯基乙酸甲酯、3-巯基丙酸乙酯、3-巯基丙酸甲酯、3-巯基丙酸、三氟乙硫醇等烷基硫醇，优选为3-巯基丙酸乙酯；
优选地，步骤4)具体为：将
树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；将硫醇和偶联剂在溶剂中溶解后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间得到
更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤5)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
进一步地，所述肽片段I为纯化后的肽片段I；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
进一步地，所述肽片段II的合成方法包括以下步骤：1)将Boc-Ala-OH与硫醇进行偶联，得到
将
与氯化氢乙酸乙酯溶液反应，得到
2)选择Rink Amide、Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHAResin树脂为合成起点，制备
3)将
去保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH，得到
4)脱除
主链保护基Allyl，得到
5)将
与
进行偶联，得到
6)将
进行裂解，得到
优选地，步骤1)中所述硫醇包括巯基乙酸甲酯、3-巯基丙酸乙酯、3-巯基丙酸甲酯、3-巯基丙酸、三氟乙硫醇等烷基硫醇，优选3-巯基丙酸乙酯；
优选地，步骤1)中氯化氢乙酸乙酯溶液的浓度为1～2mol/L，优选为2mol/L；
优选地，步骤1)具体为：将Boc-Ala-OH和偶联剂在溶剂中溶解并室温活化，然后将硫醇加入其中，室温反应一段时间得到
将
与氯化氢乙酸乙酯溶液反应，得到
更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为MeCN、NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤2)—步骤4)同权利要求2中步骤1)—步骤3)；
优选地，步骤5)具体为：将
树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；将
和偶联剂在溶剂中溶解后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间得到
更优选地，所述偶联剂为DIPEA+DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIPEA：DIC：A＝1.0：1.2：1.1，DIPEA：A：B＝2.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤6)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
进一步地，所述肽片段II为纯化后的肽片段II；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
进一步地，所述肽片段III的合成方法包括以下步骤：1)选择wang树脂为合成起点，制备Fmoc-Gly-Wang树脂；2)将Fmoc-Gly-Wang树脂脱保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH；3)脱除20位Lys的侧链保护基Alloc，然后依次偶联20位Lys侧链氨基酸，得到
4)将
进行裂解，得到Cys18-Gly31；
优选地，步骤1)中所述wang树脂替代度为0.3-1.0mmol/g，优选为0.6-0.8mmol/g；
优选地，步骤1)具体为：将wang树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间后洗涤，然后加入醋酸酐和吡啶的混合液封闭0.5～2h，得到Fmoc-Gly-Wang树脂；更优选地，所述偶联剂为DIC+A+DMAP或者DIPEA+A+B+DMAP，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A：DMAP＝1.2：1.1：0.1，DIPEA：A：B：DMAP＝1.5：1.1：1.0：0.1；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；更优选地，所述醋酸酐和吡啶的混合液中醋酸酐和吡啶的摩尔比为1:1；更优选地，所述Fmoc-Gly-Wang树脂的替代度为0.2-0.5mmol/g；
优选地，步骤2)中所述偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Cys(Trt)-OH；
优选地，步骤2)具体为：将Fmoc-Gly-Wang树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；重复上述步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Cys(Trt)-OH；更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤3)中所述脱除保护基Alloc的试剂为Pd(PPh3)4和Morpholine的混合物，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.1～0.5：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为5～20：1，所述合成规模是指投入树脂替代度乘以树脂质量得到的量；更优选地，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.3，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为12：1；
优选地，步骤3)中所述偶联20位Lys侧链氨基酸分别为Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)；
优选地，步骤3)具体为：将Pd(PPh3)4和Morpholine在溶剂中溶解，加入到固相反应柱中，反应1～2小时脱除Lys的Alloc保护；然后依次偶联Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)，得到
更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；
优选地，步骤4)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
进一步地，所述肽片段III为纯化后的肽片段III；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
进一步地，所述肽片段IV的合成方法包括以下步骤：1)选择wang树脂为合成起点，制备Fmoc-Gly-Wang树脂；2)将Fmoc-Gly-Wang树脂脱保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH；3)脱除20位Lys的侧链保护基Alloc，然后依次偶联20位Lys侧链氨基酸，得到
4)将
进行裂解，得到Cys19-Gly31；
优选地，步骤1)中所述wang树脂替代度为0.3-1.0mmol/g，优选为0.6-0.8mmol/g；
优选地，步骤1)同权利要求6中的步骤1)；
优选地，步骤2)中所述偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Boc-Cys(Trt)-OH；
优选地，步骤2)具体为：将Fmoc-Gly-Wang树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；重复上述步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Boc-Cys(Trt)-OH；更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤3)中所述脱除保护基Alloc的试剂为Pd(PPh3)4和Morpholine的混合物，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.1～0.5：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为5～20：1，所述合成规模是指投入树脂替代度乘以树脂质量得到的量；更优选地，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.3：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为12：1；
优选地，步骤3)中所述偶联20位Lys侧链氨基酸分别为Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)；
优选地，步骤3)具体为：将Pd(PPh3)4和Morpholine在溶剂中溶解，加入到固相反应柱中，反应1～2小时脱除Lys的Alloc保护；然后依次偶联Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)，得到
更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；
优选地，步骤4)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
进一步地，所述肽片段IV为纯化后的肽片段IV；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
进一步地，所述索玛鲁肽粗肽的合成为：将肽片段Ⅰ与肽片段III或者肽片段II与肽片段IV在液相中经一锅自然片段连接/脱硫反应，得索玛鲁肽粗肽；
优选地，所述索玛鲁肽粗肽的合成包括以下步骤：1)缓冲液的配置：6M Gu·HCl或8M Urea，2.5～5.0M Imidazole，30～50mM TCEP·HCl，调节缓冲液的pH为6.9～7.6；2)将肽片段I与肽片段III或者肽片段II与肽片段IV溶于1)中的缓冲液中，室温反应2～24h，得到中间体I或中间体II；3)待步骤2反应结束后，直接往反应体系中加入TCEP·HCl，还原型谷胱氨酸或MESNa和VA-044，调节反应液pH＝6-7，室温反应8～48h，得到索玛鲁肽粗肽；
优选地，步骤1)中所述缓冲液为6M Gu·HCl、2.5M Imidazole和50mM TCEP·HCl，pH＝7.1；
优选地，步骤2)中所述室温反应为8h；
优选地，步骤3)中所述TCEP·HCl、还原型谷胱氨酸或MESNa和VA-044的摩尔比为2～10：4：2，优选为5：4：2，所述TCEP·HCl、还原型谷胱氨酸或MESNa和VA-044在使用时依次加入；
优选地，步骤3)中所述室温反应为16h。
本发明索玛鲁肽的合成方法存在以下技术难点：1)本发明提供了一种自然化学连接/脱硫方法合成索玛鲁肽。由于索玛鲁肽氨基酸序列中没有自然化学连接所需的半胱氨酸，为解决这一问题，即先将索玛鲁肽中位置合适的第18位或者第19位丙氨酸用半胱氨酸代替作为自然化学连接的位点，在片段连接完成后再使用选择性脱硫将半胱氨酸转换成丙氨酸，从而得到索马鲁肽，这两步反应在同一容器体系中进行，无需纯化中间体。此外，此方法的亮点在于其使用侧链未保护的肽片段，反应过程中不会导致氨基酸差向异构化、易于操作、转化迅速，并且该反应过程也不会产生失去一个或多个氨基酸的缺损肽，解决了纯化困难的问题。
2)由于多肽硫酯片段I和II对哌啶不稳定，不能直接采用Fmoc法固相合成，虽然已经发展出了多种采用固相掩蔽的策略实现多肽硫酯的Fmoc法固相合成的方法，却都存在硫酯化效率低和连接臂合成困难的问题，而本发明提供了一种利用谷氨酰胺主链Allyl保护，侧链连接树脂，通过Fmoc法逐步偶联在固相上完成肽片段合成，再脱掉谷氨酰胺主链Allyl保护基，在固相上偶联硫醇，实现了直接通过Fmoc固相合成法合成硫脂肽片段的方法；
3)由于带烷基侧链肽片段III和IV的强疏水性，不能溶于自然化学连接反应通用的6M盐酸胍连接缓冲液中，本发明发现当使用一定浓度Imidazole作为添加剂时，不仅可以很好的溶解肽片段III和IV，而且可以高效的催化自然化学连接反应，同时对后续的脱硫反应没有任何影响。
现有的索玛鲁肽的专利中，总收率都偏低。同时，无论是通过固相逐步偶联法还是通过全保护肽片段缩合法合成的索玛鲁肽粗肽中，与产品性质相近的杂质较多，对分离纯化的技术要求很高。本发明的有益效果为：(1)本发明提供了一种自然化学连接法合成索玛鲁肽的方法，此连接方法连接效率高，反应条件温和，反应位点无消旋现象。同时，由于所有使用的多肽片段是裸露的，可以通过高效液相色谱进行预先纯化一遍，大大减少最终产品消旋、氧化、水解产生的杂质，减轻了纯化上的难度。(2)由于所使用的多肽片段可以同时合成，提高了合成效率。(3)在液相进行片段肽液相一步反应制得索玛鲁肽粗肽，在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺损肽，而是未缩合的部分片段，不会造成纯化上的困难，此外，未缩合的部分肽片段还能回收再利用，节约了成本。(4)本发明方法合成索玛鲁肽的总收率为30％以上。
附图说明
图1是本发明实施例索玛鲁肽的合成方法流程图；
图2是本发明实施例肽片段I和肽片段II的合成方法流程图；
图3是本发明实施例中间体a的合成方法流程图；
图4是本发明实施例肽片段III和肽片段IV的合成方法流程图；
图5是本发明实施例4中肽片段I精肽MAIDI-TOFMS图；
图6是本发明实施例4中肽片段I精肽HPLC谱图；
图7是本发明实施例6中肽片段II精肽MAIDI-TOFMS图；
图8是本发明实施例6中肽片段II精肽HPLC谱图；
图9是本发明实施例10中肽片段III精肽MAIDI-TOFMS图；
图10是本发明实施例10中肽片段III精肽HPLC谱图；
图11是本发明实施例13中肽片段IV精肽MAIDI-TOFMS图；
图12是本发明实施例13中肽片段IV精肽HPLC谱图；
图13是本发明实施例14中索玛鲁肽精肽MAIDI-TOFMS图；
图14是本发明实施例14中索玛鲁肽精肽HPLC谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
实施例1：制备中间体a
称取Boc-Ala-OH(9.5g，50mmol)，HBTU(19.0g，55mmol)和HOBT(8.1g,50mmol)溶于250mL乙腈中，加入DIPEA(13.5mL,100mmol)，室温活化5mins。加入巯基乙酸甲酯(5.4mL,60mmol)，室温反应16小时。反应结束后旋蒸除去乙腈，加入适量乙酸乙酯溶解产物，分别用4％NaHCO3，1N HCl和饱和食盐水洗涤三次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥过滤后，除去溶剂。加入2.0mol/L氯化氢乙酸乙酯溶液150mL反应2h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，再用乙酸乙酯洗涤三遍，最后得到化合物a，无需纯化，直接用于下一步。
实施例2：制备肽c肽树脂
称取替代度为0.43mmol/g的Rink Amide树脂46.6g于固相反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用200mLx2DBLK脱保护5min+7min，200mLx5DMF洗涤。称取Fmoc-Glu-OAllyl(40.9g,100.0mmol)和HOBT(16.2g,110.0mmol)用150mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(20.4mL,120.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用200mLx3DMF洗涤树脂，加入200mL DBLKx2脱保护5min+7min，200mLx5DMF洗涤树脂，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH，Boc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Aib-OH和Boc-His(trt)-OH。反应结束后用300mLx3DMF洗涤树脂。称取Pd(PPh3)4(6.8g,6mmol,0.3eq.)和12eq.Morpholine(20.4mL,240mmol,12eq.)，用300mL DCM溶解，加入到反应柱中，反应90min脱除Glu上的Alloc保护。反应结束后，分别用300mLx3DCM，300mLx3DMF洗涤树脂，300mLx3 MeOH收缩树脂，抽干后得到c肽树脂88.6g
实施例3：制备肽片段I
称取实施例2得到的c肽树脂44.3g于固相反应柱中，用DMF溶胀30分钟。称取HOBT(8.1g,55.0mmol)，DIC(10.2ml,60mmol)和3-巯基丙酸乙酯(25.2ml,200mmol)，用150mLDMF溶解后加入到反应柱中，室温反应2小时后，再重复一遍。反应结束后，用150mL x5DMF洗涤树脂，150mLx3MeOH收缩，抽干。将抽干后的树脂加入到1L的圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O/PhOMe/PhSMe(90:5:4:1，v/v)500mL，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2.5L冰乙醚中沉淀，离心，2.5Lx3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到21.5g肽片段I粗肽。
实施例4：对肽片段I进行纯化
称取实施例3制得的化合物I粗品5.0g，加入1L蒸馏水溶解，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:22％-42％，60min，收集目的组分。采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图5。对上述浓缩液进行冻干，得到2.75g肽片段I，收率为57.1％。对纯品进行液相分析(使用液相条件：采用Waters e2695系统进行液相分析，波长220nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温35℃，流动相为0.1％的水(A相)和乙腈(B相)，流速1mL/min，梯度：B％：5-95％-5％，0-30-35min)，结果如图6所示，其纯度为94.9％。
实施例5：制备肽片段II
称取实施例2得到的c肽树脂44.3g于固相反应柱中，用DMF溶胀30分钟。称取HOBT(8.1g,55.0mmol)，PyBOP(10.2ml,50mmol)，DIPEA(27.0mL,200mmol)和实施例1合成的化合物a，用150mL DMF溶解后加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束后，用150mLx5DMF洗涤树脂，150mLx3MeOH收缩，抽干。将抽干后的树脂加入到1L的圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O/PhOMe/PhSMe(90:5:4:1，v/v)500mL，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2.5L冰乙醚中沉淀，离心，2.5Lx3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到22.5g肽片段II粗肽。
实施例6：对肽片段II进行纯化
称取实施例5制得的化合物II粗品5.0g，加入1L蒸馏水溶解，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:22％-42％，60min，收集目的组分。采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图7。对上述浓缩液进行冻干，得到2.59g肽片段II，收率为54.4％。对纯品进行液相分析(使用液相条件：采用Waters e2695系统进行液相分析，波长220nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温35℃，流动相为0.1％的水(A相)和乙腈(B相)，流速1mL/min，梯度：B％：5-95％-5％，0-30-35min)，结果如图8所示，其纯度为99.8％。
实施例7：制备替代度为0.50mmol Fmoc-Gly-Wang树脂
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。称取Fmoc-Gly-OH(59.6g,200mmol)，HOBt(32.4g,220mmol)和DMAP(4.8g,4mmol)，溶解于150mL DMF中，冰浴下加入DIC(40.6mL，240mmol)，活化5分钟后加入反应柱中。反应2.5h后，用150mLx3DMF洗涤树脂，加入70mL醋酸酐和60mL吡啶，封闭2h。反应结束后，用150mLx5 DMF洗涤树脂，150mLx3 MeOH收缩，抽干后得到Fmoc-Gly-Wang树脂，测得替代度为0.50mmol/g。
实施例8：肽片段III固相树脂的制备
称取实施例5制备的替代度为0.50mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂20g于固相反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用80mLx2DBLK脱保护5min+7min，100mLx5DMF洗涤树脂。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(32.4g,50.0mmol)和HOBT(8.1g,55.0mmol)用60mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(10.2mL,60.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用80mLx3DMF洗涤树脂，加入80mL DBLKx2脱保护5min+7min，80mLx5DMF洗涤树脂。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-Cys(Trt)-OH。反应结束后依次用150mLx3DMF和150mLx3DCM洗涤树脂。称取Pd(PPh3)4(3.4g,3mmol)和12eq.Morpholine(10.2mL,120mmol)，用150mL DCM溶解，加入到反应柱中，反应1.5小时脱除Lys的Alloc保护。反应结束后，依次用150mLx3DCM和150mLx5DMF洗涤树脂，依次偶联Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)；反应结束后，用200mLx5DMF洗涤树脂，200mLx3MeOH收缩，抽干后得到肽片段III固相树脂。
实施例9：肽片段III的制备
将实施例8得到的树脂加入到1L的圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O/PhOMe/PhSMe(90:5:4:1，v/v)500mL，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2.5L冰乙醚中沉淀，离心，2.5Lx3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到25.3g肽片段III粗肽。
实施例10：对肽片段III进行纯化
称取实施例9制得的化合物III粗品5.0g和TCEP·HCl 2.9g，加入1L 0.6％氨水溶解，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图9。对上述浓缩液进行冻干，得到2.93g肽片段III，收率为60.9％。对纯品进行液相分析(使用液相条件：采用Waters e2695系统进行液相分析，波长220nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温35℃，流动相为0.1％的水(A相)和乙腈(B相)，流速1mL/min，梯度：B％：5-95％-5％，0-30-35min)，结果如图10所示，其纯度为94.2％。
实施例11：肽片段IV固相树脂的制备
称取实施例7制备的替代度为0.50mmol/g的Fmoc-Gly-Wang树脂20g于固相反应柱中，用DMF/DCM(1:1)溶胀30分钟。用80mLx2DBLK脱保护5min+7min，100mLx5DMF洗涤树脂。称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH(32.4g,50.0mmol)和HOBT(8.1g,55.0mmol)用60mL DMF溶解，冰浴下加入DIC(10.2mL,60.0mmol)活化5min后，将混合液加入到反应柱中，室温反应2小时。反应结束，用80mLx3DMF洗涤树脂，加入80mL DBLKx2脱保护5min+7min，80mLx5DMF洗涤树脂。重复上述偶联操作，按照肽序继续依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Boc-Cys(Trt)-OH。反应结束后依次用150mLx3DMF和150mLx3DCM洗涤树脂。称取Pd(PPh3)4(3.4g,3mmol)和12eq.Morpholine(10.2mL,120mmol)，用150mL DCM溶解，加入到反应柱中，反应1.5小时脱除Lys的Alloc保护。反应结束后，依次用150mLx3DCM和150mLx5DMF洗涤树脂，依次偶联Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)；反应结束后，用200mLx5DMF洗涤树脂，200mLx3MeOH收缩，抽干后得到肽片段IV固相树脂。
实施例12：肽片段IV的制备
将实施例11得到的树脂加入到1L的圆底烧瓶中，加入预先配置好的裂解液TFA/H2O/PhOMe/PhSMe(90:5:4:1，v/v)500mL，室温磁力搅拌2小时，减压过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入2.5L冰乙醚中沉淀，离心，2.5Lx3冰乙醚洗涤，氮气吹干得到23.8g肽片段IV粗肽。
实施例13：对肽片段IV进行纯化
称取实施例12制得的化合物IV粗品5.0g和TCEP·HCl 2.9g，加入1L 0.6％氨水溶解，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图11。对上述浓缩液进行冻干，得到2.78g肽片段IV，收率为56.0％。对纯品进行液相分析(使用液相条件：采用Waters e2695系统进行液相分析，波长220nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温35℃，流动相为0.1％的水(A相)和乙腈(B相)，流速1mL/min，梯度：B％：5-95％-5％，0-30-35min)，结果如图12所示，其纯度为96.4％。
实施例14：一锅自然化学连接/脱硫反应
称取实施例4制得的肽片段I(2.5g,1.2mmol)和实施例10制得的肽片段III(2.4g,1.0mmol)或者实施例6制得的肽片段II(2.6g,1.2mmol)和实施例13制得的肽片段IV(2.4g,1.0mmol)溶于预先配置好的缓冲液(6M Gu·HCl,2.5M Imidazole，50mM TCEP·HCl，pH＝7.1)500mL中，室温反应8h。经HPLC检测反应完全之后，依次加入TCEP·HCl(14.3g,50mmol)、还原型谷胱氨酸(12.3g，40.0mmol)和VA-044(6.5g，20mmol)，用5M NaOH溶液调节反应液pH＝6-7，室温继续反应16h。反应结束后，用色谱柱为50×250mm反相C18柱进行半制备纯化，检测波长为220nm，流动相为含有0.1％TFA的水(A相)和乙腈(B相)，流速为70ml/min，梯度：B％:32％-52％，60min，收集目的组分。采用MAIDI-TOFMS进行检测，结果见图13。对上述浓缩液进行冻干，得到2.7g索玛鲁肽精肽，收率为62.7％。对纯品进行液相分析(使用液相条件：采用Waters e2695系统进行液相分析，波长220nm，色谱柱为4.6×250mm的反相C18柱，柱温35℃，流动相为0.1％的水(A相)和乙腈(B相)，流速1mL/min，梯度：B％：5-95％-5％，0-30-35min)，结果如图14所示，其纯度为95.5％。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
肽片段I的合成：
肽片段III的合成：
Cys18-Gly31；
中间体I的合成：
His1-Gln17-Cys18-Gly31；
索玛鲁肽粗肽的合成；
或
肽片段II的合成：
肽片段IV的合成：
Cys19-Gly31；
中间体II的合成：
His1-Ala18-Cys19-Gly31；
索玛鲁肽粗肽的合成。
2.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段I的合成方法包括以下步骤：1)选择Rink Amide、Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin树脂为合成起点，制备
2)将
去保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH，得到
3)脱除
主链保护基Allyl，得到
4)将
与硫醇RSH进行偶联，得到
5)将
进行裂解，得到
优选地，步骤1)中所述树脂替代度为0.2-0.8mmol/g，优选为0.4-0.5mmol/g；
优选地，步骤1)具体为：将Rink Amide、Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHAResin树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Glu-OAllyl和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间得到
更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤2)中所述偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(trt)-OH；
优选地，步骤2)具体为：将
脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Glu(OtBu)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；重复上述步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(trt)-OH；更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤3)中所述脱除主链保护基Allyl的试剂为Pd(PPh3)4和Morpholine的混合物，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.1～0.5：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为5～20：1，所述合成规模是指投入树脂替代度乘以树脂质量得到的量；更优选地，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.3：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为12：1；
优选地，步骤3)具体为：将Pd(PPh3)4和Morpholine在溶剂中溶解，加入到固相反应柱中，脱除Glu上的Allyl保护；更优选地，所述溶剂为DCM、DMF中的一种或多种；
优选地，步骤4)中所述硫醇包括巯基乙酸甲酯、3-巯基丙酸乙酯、3-巯基丙酸甲酯、3-巯基丙酸、三氟乙硫醇，优选为3-巯基丙酸乙酯；
优选地，步骤4)具体为：将
树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；将硫醇和偶联剂在溶剂中溶解后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间得到
更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤5)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
3.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段I为纯化后的肽片段I；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
4.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段II的合成方法包括以下步骤：1)将Boc-Ala-OH与硫醇进行偶联，得到
将
与氯化氢乙酸乙酯溶液反应，得到
2)选择Rink Amide、Rink Amide-AMResin或Rink Amide-MBHA Resin树脂为合成起点，制备
3)将
去保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH，得到
4)脱除
主链保护基Allyl，得到
5)将
与
进行偶联，得到
6)将
进行裂解，得到
优选地，步骤1)中所述硫醇包括巯基乙酸甲酯、3-巯基丙酸乙酯、3-巯基丙酸甲酯、3-巯基丙酸、三氟乙硫醇，优选3-巯基丙酸乙酯；
优选地，步骤1)中氯化氢乙酸乙酯溶液的浓度为1～2mol/L，优选为2mol/L；
优选地，步骤1)具体为：将Boc-Ala-OH和偶联剂在溶剂中溶解并室温活化，然后将硫醇加入其中，室温反应一段时间得到
将
与氯化氢乙酸乙酯溶液反应，得到
更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为MeCN、NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤2)—步骤4)同权利要求2中步骤1)—步骤3)；
优选地，步骤5)具体为：将
树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；将
和偶联剂在溶剂中溶解后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间得到
更优选地，所述偶联剂为DIPEA+DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIPEA：DIC：A＝1.0：1.2：1.1，DIPEA：A：B＝2.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤6)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
5.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段II为纯化后的肽片段II；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
6.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段III的合成方法包括以下步骤：1)选择wang树脂为合成起点，制备Fmoc-Gly-Wang树脂；2)将Fmoc-Gly-Wang树脂脱保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH；3)脱除20位Lys的侧链保护基Alloc，然后依次偶联20位Lys侧链氨基酸，得到
4)将
进行裂解，得到Cys18-Gly31；
优选地，步骤1)中所述wang树脂替代度为0.3-1.0mmol/g，优选为0.6-0.8mmol/g；
优选地，步骤1)具体为：将wang树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间后洗涤，然后加入醋酸酐和吡啶的混合液封闭0.5～h，得到Fmoc-Gly-Wang树脂；更优选地，所述偶联剂为DIC+A+DMAP或者DIPEA+A+B+DMAP，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A：DMAP＝1.2：1.1：0.1，DIPEA：A：B：DMAP＝1.5：1.1：1.0：0.1；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；更优选地，所述醋酸酐和吡啶的混合液中醋酸酐和吡啶的摩尔比为1:1；更优选地，所述Fmoc-Gly-Wang树脂的替代度为0.2-0.5mmol/g；
优选地，步骤2)中所述偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Cys(Trt)-OH；
优选地，步骤2)具体为：将Fmoc-Gly-Wang树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；重复上述步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-Cys(Trt)-OH；更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤3)中所述脱除保护基Alloc的试剂为Pd(PPh3)4和Morpholine的混合物，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.1～0.5：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为5～20：1，所述合成规模是指投入树脂替代度乘以树脂质量得到的量；更优选地，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.3，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为12：1；
优选地，步骤3)中所述偶联20位Lys侧链氨基酸分别为Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)；
优选地，步骤3)具体为：将Pd(PPh3)4和Morpholine在溶剂中溶解，加入到固相反应柱中，反应1～2小时脱除Lys的Alloc保护；然后依次偶联Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)，得到
更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；
优选地，步骤4)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
7.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段III为纯化后的肽片段III；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
8.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段IV的合成方法包括以下步骤：1)选择wang树脂为合成起点，制备Fmoc-Gly-Wang树脂；2)将Fmoc-Gly-Wang树脂脱保护后依次偶联氨基酸Fmoc-AA-OH；3)脱除20位Lys的侧链保护基Alloc，然后依次偶联20位Lys侧链氨基酸，得到
4)将
进行裂解，得到Cys19-Gly31；
优选地，步骤1)中所述wang树脂替代度为0.3-1.0mmol/g，优选为0.6-0.8mmol/g；
优选地，步骤1)同权利要求6中的步骤1)；
优选地，步骤2)中所述偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Boc-Cys(Trt)-OH；
优选地，步骤2)具体为：将Fmoc-Gly-Wang树脂加入到固相反应柱中用溶剂进行溶胀；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；将Fmoc-Gly-OH和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，室温反应一段时间；重复上述步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Boc-Cys(Trt)-OH；更优选地，所述脱除Fmoc保护基所用的试剂为20％的哌啶/DMF溶液；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；
优选地，步骤3)中所述脱除保护基Alloc的试剂为Pd(PPh3)4和Morpholine的混合物，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.1～0.5：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为5～20：1，所述合成规模是指投入树脂替代度乘以树脂质量得到的量；更优选地，所述Pd(PPh3)4与合成规模比例以摩尔比计为0.3：1，所述Morpholine与合成规模比例以摩尔比计为12：1；
优选地，步骤3)中所述偶联20位Lys侧链氨基酸分别为Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)；
优选地，步骤3)具体为：将Pd(PPh3)4和Morpholine在溶剂中溶解，加入到固相反应柱中，反应1～2小时脱除Lys的Alloc保护；然后依次偶联Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-AEEA-OH，Fmoc-Glu-OtBu和Oct(OtBu)，得到
更优选地，所述溶剂为NMP、THF、DCM、DMF和DMSO中的一种或几种；更优选地，所述偶联剂为DIC+A或者DIPEA+A +B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一；更优选地，所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计DIC：A＝1.2：1.1，DIPEA：A：B＝1.5：1.1：1.0；
优选地，步骤4)中所述裂解所用的试剂为TFA、H2O、PhOMe和PhSMe的组合物，更优选地，所述TFA、H2O、PhOMe、PhSMe的体积比为90：5：4：1。
9.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述肽片段IV为纯化后的肽片段IV；
优选地，所述纯化为HPLC制备纯化。
10.根据权利要求1所述的索玛鲁肽的合成方法，其特征在于，所述索玛鲁肽粗肽的合成为：将肽片段Ⅰ与肽片段III或者肽片段II与肽片段IV在液相中经一锅自然片段连接/脱硫反应，得索玛鲁肽粗肽；
优选地，所述索玛鲁肽粗肽的合成包括以下步骤：1)缓冲液的配置：6M Gu·HCl或8MUrea，2.5～5.0M Imidazole，30～50mM TCEP·HCl，调节缓冲液的pH为6.9～7.6；2)将肽片段I与肽片段III或者肽片段II与肽片段IV溶于1)中的缓冲液中，室温反应2～24h，得到中间体I或中间体II；3)待步骤2反应结束后，直接往反应体系中加入TCEP·HCl，还原型谷胱氨酸或MESNa和VA-044，调节反应液pH＝6-7，室温反应8～48h，得到索玛鲁肽粗肽；
优选地，步骤1)中所述缓冲液为6M Gu·HCl、2.5M Imidazole和50mM TCEP·HCl，pH＝7.1；
优选地，步骤2)中所述室温反应为8h；
优选地，步骤3)中所述TCEP·HCl、还原型谷胱氨酸或MESNa和VA-044的摩尔比为2～10：4：2，优选为5：4：2，所述TCEP·HCl、还原型谷胱氨酸或MESNa和VA-044在使用时依次加入；
优选地，步骤3)中所述室温反应为16h。
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