CN111116731A - 一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法 - Google Patents

一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法 Download PDF

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CN111116731A CN202010022349.0A CN202010022349A CN111116731A CN 111116731 A CN111116731 A CN 111116731A CN 202010022349 A CN202010022349 A CN 202010022349A CN 111116731 A CN111116731 A CN 111116731A
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Abstract

本发明提供一种基于可溶性载体的液相法制备索马鲁肽的方法，解决了现有的固相法制备索马鲁肽等长链多肽中方法繁琐、难以纯化、收率较低的技术问题。本发明首先将索马鲁肽划分为六个片段，通过逐个偶联的方法以亲脂疏水的2，4‑二(二十二烷氧基)苯甲醇为载体制备这六个片段，本发明有别于传统的固相法，反应中可以通过TLC或液相法简单地监测反应是否完全进行，有效地避免了缺失或增添单个氨基酸残基杂质的产生，非常有效地降低了纯化难度并提高了原料的利用率，符合现今推行的绿色化学理念。本发明也可以广泛地应用于其他多肽药物的制备技术领域。

Description

一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备技术领域，具体一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
II型糖尿病是目前危害人类健康的一大顽疾，其主要特点是人体自身可以分泌胰岛素，但由于胰岛素抵抗使得人体细胞很难或无法对胰岛素产生反应，是胰岛素的效果显著下降，导致血糖升高。目前针对II型糖尿病的药物主要有盐酸二甲双胍、磺酰脲类以及噻唑烷二酮类等一系列降糖药。但是人类对这些药物的耐受性有限，长期持续加大给药剂量可能会导致耐药以及潜在的心血管风险，导致治疗不能达到预期的目标。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂是近年来针对II型糖尿病药物的研究热点，其中索马鲁肽(semaglutide)是胰高血糖素样肽-1的衍生物之一，与2017年12月被FDA在美国批准上市。对先导化合物胰高血糖素样肽-1的氨基酸残基替换以及结构修饰使得索马鲁肽在体内具有更好的白蛋白亲和力以及不易被DDP-4酶代谢而失活，显著延长了类胰岛素药物通常很短的半衰期。索马鲁肽在人体内的半衰期高达惊人的165小时，这使得它成为了目前唯一一个可以一周给药一次的长效胰高血糖素样肽-1激动剂。此外，索马鲁肽的安全性良好，不会产生其他类胰岛素药物常见的重复用药导致的低血糖休克风险，且兼具减肥功效。索马鲁肽是目前用于治疗II型糖尿病最具希望的药物。
索马鲁肽的结构中是主链含有31个氨基酸残基，侧链含有4个类氨基酸单位的支链多肽，其具体结构以及氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0002361259020000021
目前已有的制备方法专利如下所述，无论是CN106928343A、CN104356224A、CN101133082A、CN106478806A和CN105753964A采用的Fmoc法固相逐个偶联制备索马鲁肽，还是CN106749613A与CN109456401A采用的固相片段缩合方法制备索马鲁肽，其中涉及的主要技术均为固相法制备多肽。众所周知，固相法存在以下的问题：1.所涉及的反应均为非均相反应，其反应时间较长且不易进行完全；投料量过量较大使得其对反应物的浪费较多；并且反应容易出现副反应等。2.固相法受固相树脂载体的取代值的限制，总收率较低；且中间产生的缺失或增添单个氨基酸残基的副产物较多，这使得杂质性质与产物接近，难以纯化。综上两条可以得出结论，固相法的原料消耗大但产率与纯度却相对较低，导致成本较高，尤其是在索马鲁肽其中一部分原料较为昂贵的情况下，这种对原料的浪费会体现在高昂的成本上。且固相法逐个偶联会导致难分离的杂质出现，降低了纯化效率甚至有可能会影响产物的品质。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供基于可溶性疏水标记载体的液相多肽制备方法，有效地避免了缺失或增添单个氨基酸残基杂质的产生，非常有效地降低了纯化难度并提高了原料的利用率，符合现今推行的绿色化学理念。同时，本发明也可以广泛地应用于其他多肽药物的制备技术领域。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法，包含以下步骤：
在tag载体上依次偶联氨基酸制备6个碳末端连有tag载体的全保护片段；其中6个碳末端连有tag载体的全保护片段的结构如下：
片段1结构：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag；
片段2结构：Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag；
片段3结构：Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag；
片段4结构：Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag；
片段5结构：Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag；
片段6结构：Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag；
脱去上述片段1-5的tag载体，得到不含tag载体的全保护片段1-5。
脱去含有tag载体的片段6的Fmoc保护基，依次偶联上述不含tag载体的全保护片段5、片段4、片段3、片段2、片段1，得到全保护的含有tag载体的索马鲁肽；脱去上述全保护的含有tag载体的索马鲁肽的所有保护基以及tag载体并精制即得索马鲁肽精品。
其中，所述tag载体为2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇，其是一种亲脂疏水性标记载体，可通过市售购得，或者可通过2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷成醚后经还原反应制备得到。
本发明与现有的通过固相法制备索马鲁肽的技术相比，具有以下的特点与有益效果：
1.本发明完全改变了过往制备索马鲁肽均采用固相法作为基础技术的情况，采用了一种新型的基于疏水标记载体的液相法完成了索马鲁肽的制备，本方法相比于传统的固相肽法具有以下特点与优势：①本方法的所有反应均在液相中进行，是均相反应，投料无需像固相法(非均相反应)一样大量过量，且反应速度快，更易于监测反应终点(可以使用TLC法)，既节约了时间成本，又节约了物料成本；②反应完全后只需要向反应液中加入不良溶剂就可以析出产物，在反应的后处理上本方法更为简便；③即使因为偶联了困难氨基酸导致产物中出现杂质，因为连接了tag载体的片段具有高度的可溶性，所以可以采用柱层析的办法对产物进行纯化，减少了后续制备中的杂质生成，降低了纯化的难度。
2.在本发明制备索马鲁肽的方法中，首先将索马鲁肽分成六个片段来分别进行制备，再进行片段间偶联的办法，有效地降低了终产品中缺失或重复单个氨基酸残基的杂质的含量，含有的少量杂质仅为缺失某个片段的杂质，这些杂质与产物索马鲁肽的性质差异较大，易于纯化除去，提高了生产的产率和效率，并在后续的纯化过程中有利于进一步提高产品的纯度，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为片段1质谱(Calcd.C45H56N6O9＝824.41,founded M+H+＝825.7)；
图2为片段2质谱(Calcd.C55H77N5O13＝1015.55,founded M+NH4 +＝1033.8)；
图3为片段3质谱(Calcd.C64H93N7O15＝1199.67,founded M-H+＝1199.2)；
图4为片段4质谱(Calcd.C112H157N11O24＝2040.14,founded 1/2M+H3O+＝1038.7)；
图5为片段5质谱(Calcd.C46H57N5O9＝823.42,founded M-H+＝822.7)；
图6为片段6质谱(脱去tag载体对片段进行验证)(Calcd.C62H83N11O14S2＝1269.56,founded M-H+＝1269.1)；
图7为片段1液相图；
图8为片段2液相图；
图9为片段3液相图；
图10为片段4液相图；
图11为片段5液相图；
图12为片段6液相图(脱去tag载体对片段进行验证)；
图13为精制索马鲁肽液相图。
图14为精制索马鲁肽质谱图(Calcd.C187H291N45O59＝4113.64,founded M+H+＝4114.94)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，固相法的原料消耗大但产率与纯度却相对较低，导致成本较高，尤其是在索马鲁肽其中一部分原料较为昂贵的情况下，这种对原料的浪费会体现在高昂的成本上。且固相法逐个偶联会导致难分离的杂质出现，降低了纯化效率甚至有可能会影响产物的品质。
有鉴于此，本发明将索马鲁肽分为数个长度不等的片段，通过基于可溶性疏水标记载体的液相法逐个制备片段，然后偶联这些片段得到并处理，得到产物索马鲁肽。
本发明的一个典型实施方式中，提供一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法，包含以下步骤：
在tag载体上依次偶联氨基酸制备6个碳末端连有tag载体的全保护片段。其中6个碳末端连有tag载体的全保护片段的结构如下：
片段1结构：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag，
片段2结构：Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag，
片段3结构：Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag，
片段4结构：Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag，
片段5结构：Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag，
片段6结构：Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag；
需要说明的是，所述全保护的索马鲁肽片段的选择，包括但不限于上述的序列，任意的可以完成全保护的索马鲁肽的制备的序列均在本发明的选择范围内。
脱去上述片段1-5的tag载体，得到不含tag载体的全保护片段1-5；
脱去含有tag载体的片段6的Fmoc保护基，依次偶联上述不含tag载体的全保护片段5、片段4、片段3、片段2、片段1，得到全保护的含有tag载体的索马鲁肽；
脱去上述全保护的含有tag载体的索马鲁肽的所有保护基以及tag载体，得索马鲁肽粗品，经纯化得索马鲁肽精品。
本发明的又一具体实施方式中，所述tag载体为2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇，其是一种疏水标记载体，可通过市售购得，或者可通过2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷成醚后经还原反应自行制备得到。
本发明的又一具体实施方式中，成醚反应为：将2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷以及缚酸剂溶于DMF中，在70℃中氮气保护反应过夜，后向反应液中加入纯化水析出结晶，再使用甲醇打浆得到2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛。其中，缚酸剂可以为Na2CO3或K2CO3。
本发明的又一具体实施方式中，还原反应为：将上述得到的2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛与还原剂溶于四氢呋喃与甲醇的混合溶液中，在40℃下反应2-3小时，向反应液中缓慢滴入纯化水处理未反应的催化剂，过滤后向反应液中加入甲醇析出结晶，经洗涤后得到产物2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)。
本发明的又一具体实施方式中，反应中的还原剂选用硼氢化钠；所使用的混合溶剂为THF:MeOH＝10:1的溶剂；反应中2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛与硼氢化钠的投料比为1:3-4。
本发明的又一具体实施方式中，制备碳末端连有tag载体的全保护片段的具体方法为：
1)片段碳末端Fmoc保护的氨基酸连接tag载体：将2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)溶于反应溶剂中，依次加入片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP，在10-30℃下反应20-30min，反应结束后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
优选的，反应溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃；不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；tag载体、片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP的摩尔质量比为1:1.5-2:1.5-2:1.5-2。
2)脱除Fmoc保护基：向含有tag载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段中加入哌啶与DBU，在10-30℃下反应3-5min，反应结束后向溶液中加入HCl调溶液pH至7-8，向溶液中加入不良溶剂析出产物。
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；含有载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段、哌啶的反应的摩尔质量比为1:1.2-2，DBU在溶液中的含量为1％-2％。
优选的，所述tag载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段首先溶解于四氢呋喃中，然后向其中加入哌啶与DBU。
3)氨基酸的偶联：向脱去Fmoc保护基的含有tag载体的多肽(或氨基酸)片段溶于反应溶剂中，加入Fmoc-AA-OH(需偶联的氨基酸)、缩合剂，在室温下反应10-30min，反应结束后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
其中，缩合剂为HATU、HOAt、DIPEA或HBTU、HOBt、DIPEA。
优选的，缩合剂使用HBTU、HOBt、DIPEA组合。
优选的，反应溶剂为THF和DMF的混合溶剂，优选选用THF:DMF＝8-9:1(v/v)的混合溶剂；
Fmoc-AA-OH、脱去Fmoc保护基的含有tag载体的多肽(或氨基酸)片段、HBTU、HOBt与DIPEA的摩尔质量比为1:1.1-1.5:1.1-1.5:3-10。
不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段1的制备方法为：a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Gly-O-tag；b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(trt)-OH得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag。
本发明的又一具体实施方式中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段2的制备方法为：a)将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Asp(OtBu)-O-tag；b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag。
本发明的又一具体实施方式中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段3的制备方法为：a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Gly-O-tag；b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH得到Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag。
本发明的又一具体实施方式中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段5的制备方法为：a)将Fmoc-Leu-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Leu-O-tag；b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH得到Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag。
本发明的又一具体实施方式中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段6的制备方法为：a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Gly-O-tag；b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH得到Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag。
需要说明的是，由于片段4结构特殊，本发明中赖氨酸残基采用的原料为Alloc-Lys(Fmoc)-OH。在片段4的制备中，连接此赖氨酸后首先脱除Fmoc保护基，偶联侧链的四个类氨基酸单位，方法与上述一致。然后脱除Alloc保护基，继续偶联剩余氨基酸得到Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag(片段4)，其中脱除Alloc保护基的方法如下：
本发明的又一具体实施方式中，将此含有Alloc的片段溶于DCM中，加入苯硅烷与四(三苯基膦)钯，10-30℃氮气保护下反应5-20min，反应完全后，向反应液中加入不良溶剂析出结晶，抽滤，洗涤得到产物。
优选的，不良溶剂为乙腈，洗涤时使用水(洗涤一到二次)；
Alloc-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag、苯硅烷与四(三苯基膦)钯的投料比为1:8-10:0.1-0.3。
本发明的又一具体实施方式中，脱除tag载体的反应为：将含有tag载体的全保护的片段溶于反应溶剂中，向溶液中加入TFE与TFA，在10-30℃条件下反应30min，反应完成后过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶，过滤、洗涤得到产物不含tag载体的全保护片段即Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-OH。
优选的，所述反应溶剂为DCM，所述DCM、TFE与TFA的浓度比为1:8％-15％:0.8％-1.5％；不良溶剂为乙醚、异丙醚或甲基叔丁基醚，优选为异丙醚。
本发明的又一具体实施方式中，制备全保护的含有tag载体的索马鲁肽的方法为：
1)脱除含有tag载体的全保护的片段的Fmoc保护基：向含有tag载体的全保护的片段中加入哌啶与DBU，10-30℃条件下反应5-60min，得到脱保护的含有载体的多肽片段；
更具体的，所述tag载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段首先溶解于四氢呋喃中，然后向其中加入哌啶与DBU；
上述反应完成后向溶液中加入适量6M HCl将溶液pH调至7-8后向溶液中加入不良溶剂析出产物。
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；含有载体的Fmoc保护的多肽片段、哌啶的反应的摩尔质量比为1:1.5-10，DBU在溶液中的含量为1％-2％。
2)偶联片段：将上述脱除Fmoc保护基的片段溶于反应溶剂，向其中加入待偶联的不含有tag载体的全保护片段与缩合剂，在10-30℃条件下反应0.5-3h，反应完成后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
反应溶剂为THF和DMF的混合溶剂，优选选用THF:DMF＝8-9:1(v/v)的混合溶剂；
优选的，缩合剂可以选择A)HATU、HOAt、DIPEA、DIC；B)HATU、HOAt、DIPEA；C)DMT-MM、DIPEA中的任意一种；
其中，以含有载体的多肽片段作为1个单位，全保护的索马鲁肽片段与缩合体系A)的反应的摩尔质量比为1.05-1.5:1.05-1.5:1.05-1.5:3-10:1-2；
其中，以含有载体的多肽片段作为1个单位，全保护的索马鲁肽片段与缩合体系B)的反应的摩尔质量比为1.5-2:1.5-2:1.5-2:3-10；
其中，以含有载体的多肽片段作为1个单位，全保护的索马鲁肽片段与缩合体系C)的反应的摩尔质量比为1.5-2:1.5-2:3-10。
本发明的又一具体实施方式中，制备全保护的含有tag载体的索马鲁肽的方法具体为：将含有tag载体的全保护的片段6通过1)的方法脱除Fmoc保护基，重复上述1)与2)依次偶联含有tag载体的全保护的片段5、片段4、片段3、片段2、片段1得到全保护的含有tag载体的索马鲁肽。
本发明的又一具体实施方式中，制备索马鲁肽粗品的方法为：将上述全保护的含有tag载体的索马鲁肽溶于含有TIS与水的TFA溶液中，10-30℃下反应3-6小时，反应完成后，将反应液过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶索马鲁肽粗品。
本发明的又一具体实施方式中，TFA、TIS与水的体积比为95:2.5:2.5；所述结晶中使用的不良溶剂为乙醚、异丙醚或甲基叔丁基醚。
本发明的又一具体实施方式中，所述纯化方法优选为使用制备液相进行纯化，更进一步优选使用反向高效液相色谱法对索马鲁肽粗品进行两步纯化。
本发明的又一具体实施方式中，具体方法为：第一步，首先对索马鲁肽粗品进行纯化：流动相A相为体积分数为0.25％乙酸-H2O溶液，流动相B相为乙腈；第二步为转盐：流动相A相为体积分数为0.25％乙酸-H2O溶液，流动相B相为乙腈；两步纯化均为梯度洗脱，第一步条件为80％-70％A，20分钟；第二步条件为70％-40％A，60分钟。流速为8ml/分钟，紫外检测波长为230nm。
需要说明的是，上述偶联与脱保护步骤中由于产物的性质原因，产物可能会有以下的性质：1)黏度较大，难以抽滤；2)生成无定形的固体，难以洗涤干净；3)颗粒细小，抽滤时会透过滤纸。优选的，本发明改进了专利CN107406480A中的后处理方式，当反应产物出现难处理的性质时，在加入不良溶剂的结晶液中加入硅藻土与结晶混匀后抽滤，可以显著改变了产物的性质，使得抽滤得以顺利进行，抽滤后得到产物与硅藻土的混合物，此时使用THF将产物溶出后旋蒸除去溶剂即得产物。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。所使用的原料如无特别说明，均为市售的常规产品。
下表为本发明中所使用的英文字母缩写的含义：
Figure BDA0002361259020000111
Figure BDA0002361259020000121
实施例1
2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)的制备：
1)中间体2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛的制备：称取2，4-二羟基苯甲醛(0.6g，4.34mmol)、碳酸钾(6.0g，43.4mmol)、1-溴代二十二烷(3.5g，9mmol)加入到DMF(30ml)中，在氮气保护下70℃搅拌过夜。反应完成后，将此反应液倒入水(400ml)中并搅拌，过滤，收集滤饼，干燥得2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛(3.20g，收率97.5％)。
2)tag载体的制备：称取上述2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛(3.0g，3.97mmol)溶于THF(60ml)与MeOH(6ml)的混合溶液中，向溶液中加入硼氢化钠(400mg，10.57mmol)，在氮气保护下40℃搅拌反应2小时。向反应液中逐滴加入纯化水(2-3ml)至反应液中析出棕红色固体，过滤，浓缩，向浓缩液中加入大量MeOH析出结晶，经抽滤和减压干燥得产物2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)2.85g，收率95.2％。
TLC鉴定：Rf值＝0.8，极性为石油醚:乙酸乙酯＝4:1。
实施例2
全保护片段1的制备：
1)Fmoc-Gly-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于DCM(60ml)中，向溶液中加入Fmoc-Gly-OH(1.34g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)、DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物Fmoc-Gly-O-tag(3.07g，收率98.8％)。
2)H-Gly-O-tag的制备：将上述Fmoc-Gly-O-tag溶于含有1％DBU的THF(60ml)中，向溶液中加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min，TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物H-Gly-O-tag(2.40g)，1)与2)两步总收率98.3％。
3)通用的偶联Fmoc保护的氨基酸的制备方法：将连有tag载体的片段3mmol溶于60ml(THF:DMF＝9:1)的混合溶液中，依次加入待偶联的Fmoc保护的氨基酸(3.6mmol)、HBTU(1.37g，3.6mmol)、HOBt(0.486g、3.6mmol)、DIPEA(1.94g，15mmol)，室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物。
4)通用的脱除连有tag载体的片段的Fmoc保护基的制备方法：将连有tag载体的片段3mmol溶于含有1％DBU的THF(60ml)中，向溶液中加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min，通过TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物。
C末端连有tag载体的全保护片段1的制备：将H-Gly-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(trt)-OH得到产物Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag(3.21g，总收率68.4％)。
5)tag载体的脱除：将上述Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag(2g，1.28mmol)加入到含有10％TFE与1％TFA的DCM(40ml)溶液中，室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。过滤，向滤液中加入大量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤得到的固体，收集固体减压干燥得产物全保护片段1：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(981mg，收率93.0％)。
实施例3
全保护片段2的制备：
1)Fmoc-Asp(OtBu)-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于DCM(60ml)中，向溶液中加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(1.86g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)、DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物Fmoc-Asp(OtBu)-O-tag(3.40g，收率98.5％)。
2)H-Asp(OtBu)-O-tag的制备：将上述Fmoc-Asp(OtBu)-O-tag溶于含有1％DBU的THF(60ml)中，向溶液中加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min，TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物H-Asp(OtBu)-O-tag(2.73g)，1)与2)两步总收率97.8％。
3)C末端连有tag载体的全保护片段2的制备：将H-Asp(OtBu)-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH得到产物Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag(3.77g，总收率71.7％)。
4)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag(3g，1.71mmol)加入到含有10％TFE与1％TFA的DCM(60ml)溶液中，室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。过滤，向滤液中加入大量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤得到的固体，收集固体减压干燥得产物全保护片段2：Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH(1.67g，收率96.2％)。
实施例4
全保护片段3的制备：
1)同实施例2中的步骤1)与2)，通过两步反应制得H-Gly-O-tag。
2)C末端连有tag载体的全保护片段3的制备：将H-Gly-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH得到产物Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag(4.73g，总收率81.5％)。
3)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag(3g，1.55mmol)加入到含有10％TFE与1％TFA的DCM(50ml)溶液中，室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。过滤，向滤液中加入大量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤得到的固体，收集固体减压干燥得产物全保护片段3：Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH(1.83g，收率98.8％)。
实施例5
全保护片段5的制备：
1)Fmoc-Leu-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于DCM(60ml)中，向溶液中加入Fmoc-Leu-OH(1.59g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)、DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物Fmoc-Leu-O-tag(3.25g，收率99.2％)。
2)H-Leu-O-tag的制备：将上述Fmoc-Leu-O-tag溶于含有1％DBU的THF(60ml)中，向溶液中加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min，TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物H-Leu-O-tag(2.57g)，1)与2)两步总收率98.8％。
3)C末端连有tag载体的全保护片段5的制备：将H-Leu-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH得到产物Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag(3.96g，总收率84.6％)。
4)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag(3g，1.92mmol)加入到含有10％TFE与1％TFA的DCM(60ml)溶液中，室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。过滤，向滤液中加入大量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤得到的固体，收集固体减压干燥得产物全保护片段5：Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH(1.55g，收率97.9％)。
实施例6
C末端连有tag载体的全保护片段6的制备：
1)同实施例2中的步骤1)与2)，通过两步反应制得H-Gly-O-tag。
2)C末端连有tag载体的全保护片段6的制备：将H-Gly-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH得到产物Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag(4.62g，总收率76.7％)。
实施例7
全保护片段4的制备：
1)Fmoc-Phe-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于DCM(60ml)中，向溶液中加入Fmoc-Phe-OH(1.74g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)、DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物Fmoc-Phe-O-tag(3.33g，收率98.6％)。
2)H-Phe-O-tag的制备：将上述Fmoc-Phe-O-tag溶于含有1％DBU的THF(60ml)中，向溶液中加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min，TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物H-Phe-O-tag(2.63g)，1)与2)两步总收率96.9％。
3)Alloc-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag的制备：将H-Phe-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Alloc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-Glu-OtBu、Oct(OtBu)得到产物Alloc-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag(4.62g，总收率76.7％)。
4)Alloc保护基的脱除：称取上述Alloc-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag(2g，0.939mmol)溶于20ml DCM中，向溶液中加入苯硅烷(820mg，7.578mmol)、Pd(PPh3)4(220mg，0.190mmol)，在氮气保护下室温搅拌15min，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物H-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag(1.61g，收率83.8％)。
5)C末端连有tag载体的全保护片段4的制备：将上述H-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag通过重复实施例2中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH得到产物Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag(3.27g，总收率39.2％)
6)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag(2g，0.720mmol)加入到含有10％TFE与1％TFA的DCM(25ml)溶液中，室温下搅拌30min，TLC法监测反应终点。过滤，向滤液中加入大量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤得到的固体，收集固体减压干燥得产物全保护片段4：Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-OH(1.46g，收率99.3％)。
实施例8
C末端连有tag载体的全保护索马鲁肽的制备：
1)H-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag的制备：将Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag(1g，0.5mmol)溶于含有1％DBU的THF(20ml)中，向溶液中加入PIP(64mg，0.6mmol)，室温下搅拌5min，TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物H-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag(890mg，收率99.7％)。
2)通用的偶联全保护片段的制备方法：将连有tag载体的片段0.5mmol溶于THF(20ml):DMF＝9:1的混合溶液中，依次加入待偶联的全保护片段(0.525mmol)、HATU(0.525mmol)、HOAt(0.525mmol)、DIPEA(2.5mmol)与DIC(0.5mmol)，室温下搅拌2小时，TLC法监测反应终点。向溶液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物。
3)通用的脱除Fmoc保护基的制备方法：将连有tag载体的片段0.5mmol溶于含有1％DBU的THF(20ml)中，向溶液中加入PIP(64mg，0.6mmol)，室温下搅拌5min，TLC法监测反应终点。向反应液中加入大量乙腈析出结晶，滤集结晶得到产物。
C末端连有tag载体的全保护索马鲁肽的制备：将H-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag通过重复实施例8中的步骤2)和3)，依次偶联片段2、片段3、片段4、片段5、片段6得到产物C末端连有tag载体的全保护索马鲁肽(2.28g，总收率67.9％)。
实施例9
保护基和tag载体的裂解与索马鲁肽粗品的制备：
取上述C末端连有tag载体的全保护索马鲁肽(1g，0.149mmol)溶于含有2.5％TIS与2.5％水的TFA(10ml)溶液中，室温下反应3小时，反应完全后过滤，浓缩滤液，向滤液中加入大量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤得到的固体，收集固体减压干燥得产物索马鲁肽粗品(609mg，收率99.4％)。
实施例10
索马鲁肽粗品的纯化：
取索马鲁肽粗(15mg)用反向高效液相色谱法对索马鲁肽粗品进行两步纯化：使用C18制备柱(50×250mm，10μm)；第一步，首先对索马鲁肽粗品进行纯化：流动相A相为体积分数为0.25％乙酸-H2O溶液，流动相B相为乙腈；第二步为转盐：流动相A相为体积分数为0.25％乙酸-H2O溶液，流动相B相为乙腈；两步纯化均为梯度洗脱，第一步条件为80％-70％A，20分钟；第二步条件为70％-40％A，60分钟。流速为8ml/分钟；紫外检测波长为230nm。两步中间需经浓缩冻干。经浓缩、冻干得到索马鲁肽精品4.97mg，纯度为98.31％。
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (10)

1.一种基于可溶性疏水标记载体的液相法制备索马鲁肽的方法，其特征在于，包含以下步骤：
在tag载体上依次偶联氨基酸制备6个碳末端连有tag载体的全保护片段；其中6个碳末端连有tag载体的全保护片段的结构如下：
片段1结构：Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag，
片段2结构：Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag，
片段3结构：Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag，
片段4结构：Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag；
片段5结构：Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag，
片段6结构：Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag；
脱去上述片段1-5的tag载体，得到不含tag载体的全保护片段1-5；
脱去含有tag载体的片段6的Fmoc保护基，依次偶联上述不含tag载体的全保护片段5、片段4、片段3、片段2、片段1，得到全保护的含有tag载体的索马鲁肽；
脱去上述全保护的含有tag载体的索马鲁肽的所有保护基以及tag载体，得索马鲁肽粗品，经纯化得索马鲁肽精品。
2.如权利要求1所述的制备索马鲁肽的方法，其特征在于，所述tag载体为2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇。
3.如权利要求1所述的制备索马鲁肽的方法，其特征在于，制备碳末端连有tag载体的全保护片段的具体方法为：
1)片段碳末端Fmoc保护的氨基酸连接tag载体：将2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)溶于反应溶剂中，依次加入片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP，在10-30℃下反应20-30min，反应结束后向反应液中加入不良溶剂析出产物；
2)脱除Fmoc保护基：向含有tag载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段中加入哌啶与DBU，在10-30℃下反应3-5min，反应结束后向溶液中加入HCl调溶液pH至7-8，向溶液中加入不良溶剂析出产物；
3)氨基酸的偶联：向脱去Fmoc保护基的含有tag载体的多肽(或氨基酸)片段溶于反应溶剂中，加入Fmoc-AA-OH(需偶联的氨基酸)、缩合剂，在室温下反应10-30min，反应结束后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
4.如权利要求3所述的制备索马鲁肽的方法，其特征在于，
步骤1)中，
反应溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃；不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；tag载体、片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP的摩尔质量比为1:1.5-2:1.5-2：1.5-2；
或，步骤2)中，
不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；
含有载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段、哌啶的反应的摩尔质量比为1：1.2-2，DBU在溶液中的含量为1％-2％；
所述tag载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段首先溶解于四氢呋喃中，然后向其中加入哌啶与DBU；
或，步骤3)中，
反应溶剂为THF和DMF的混合溶剂，优选选用THF:DMF＝8-9:1(v/v)的混合溶剂；
缩合剂为HATU、HOAt、DIPEA或HBTU、HOBt、DIPEA；
缩合剂使用HBTU、HOBt、DIPEA的组合；
Fmoc-AA-OH、脱去Fmoc保护基的含有tag载体的多肽(或氨基酸)片段、HBTU、HOBt与DIPEA的摩尔质量比为1:1.1-1.5:1.1-1.5:3-10；
不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；
优选的，碳末端连有tag载体的全保护片段1的制备方法为：a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Gly-O-tag；b)重复权利要求3或4所述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH、Boc-His(trt)-OH得到Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-O-tag；
优选的，碳末端连有tag载体的全保护片段2的制备方法为：a)将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Asp(OtBu)-O-tag；b)重复权利要求3或4所述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH得到Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-O-tag；
优选的，碳末端连有tag载体的全保护片段3的制备方法为：a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Gly-O-tag；b)重复权利要求3或4所述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH得到Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-O-tag；
优选的，碳末端连有tag载体的全保护片段5的制备方法为：a)将Fmoc-Leu-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Leu-O-tag；b)重复权利要求3或4所述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH得到Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-O-tag；
优选的，碳末端连有tag载体的全保护片段6的制备方法为：a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下制备Fmoc-Gly-O-tag；b)重复权利要求3或4所述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH得到Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-O-Tag；
优选的，碳末端连有tag载体的全保护片段4的制备方法为：赖氨酸残基采用的原料为Alloc-Lys(Fmoc)-OH，连接Alloc-Lys(Fmoc)-OH后首先脱除Fmoc保护基，重复权利要求3或4所述步骤2)和3)，偶联侧链的四个类氨基酸单位，然后脱除Alloc保护基，继续偶联剩余氨基酸得到Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag。
5.如权利要求4所述的制备索马鲁肽的方法，其特征在于，制备碳末端连有tag载体的全保护片段4中：
脱除Alloc保护基的方法具体为：
将含有Alloc的片段溶于DCM中，加入苯硅烷与四(三苯基膦)钯，10-30℃氮气保护下反应5-20min，反应完全后，向反应液中加入不良溶剂析出结晶，抽滤，洗涤得到产物；
优选的，
不良溶剂为乙腈，使用水进行洗涤；
优选的，
Alloc-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-O-tag、苯硅烷与四(三苯基膦)钯的投料比为1:8-10:0.1-0.3；
脱除tag载体的方法为：
将含有tag载体的全保护的片段溶于反应溶剂中，向溶液中加入TFE与TFA，在10-30℃条件下反应30min，反应完成后过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶，过滤、洗涤得到产物不含tag载体的全保护片段即Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys{-AEEA-AEEA-Glu[Oct(OtBu)]-OtBu}-Glu(OtBu)-Phe-OH；
优选的，所述反应溶剂为DCM，所述DCM、TFE与TFA的浓度比为1:8％-15％:0.8％-1.5％；不良溶剂为乙醚、异丙醚或甲基叔丁基醚，优选为异丙醚。
6.如权利要求1所述制备索马鲁肽的方法，其特征在于，制备全保护的含有tag载体的索马鲁肽的方法为：
1)脱除含有tag载体的全保护的片段的Fmoc保护基：向含有tag载体的全保护的片段中加入哌啶与DBU，10-30℃条件下反应5-60min，得到脱保护的含有载体的多肽片段；
2)偶联片段：将上述脱除Fmoc保护基的片段溶于反应溶剂，向其中加入待偶联的不含有tag载体的全保护片段与缩合剂，在10-30℃条件下反应0.5-3h，反应完成后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
7.如权利要求6所述制备索马鲁肽的方法，其特征在于，
所述步骤1)中，
所述tag载体的Fmoc保护的多肽(或氨基酸)片段首先溶解于四氢呋喃中，然后向其中加入哌啶与DBU；
反应完成后向溶液中加入HCl将溶液pH调至7-8后向溶液中加入不良溶剂析出产物；
所述步骤2)中，
反应溶剂为THF和DMF的混合溶剂，优选选用THF:DMF＝8-9:1(v/v)的混合溶剂；
不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述不良溶剂中任意一种或其混合溶剂；
含有载体的Fmoc保护的多肽片段、哌啶的反应的摩尔质量比为1：1.5-10，DBU在溶液中的含量为1％-2％；
优选的，缩合剂为如下A)-C)中的任意一种：
A)HATU、HOAt、DIPEA、DIC；
B)HATU、HOAt、DIPEA；
C)DMT-MM、DIPEA；
其中，以含有载体的多肽片段作为1个单位，全保护的索马鲁肽片段与缩合体系A)的反应的摩尔质量比为1.05-1.5:1.05-1.5:1.05-1.5:3-10:1-2；
其中，以含有载体的多肽片段作为1个单位，全保护的索马鲁肽片段与缩合体系B)的反应的摩尔质量比为1.5-2:1.5-2:1.5-2:3-10；
其中，以含有载体的多肽片段作为1个单位，全保护的索马鲁肽片段与缩合体系C)的反应的摩尔质量比为1.5-2:1.5-2:3-10。
8.如权利要求7所述制备索马鲁肽的方法，其特征在于，
制备全保护的含有tag载体的索马鲁肽的方法具体为：将含有tag载体的全保护的片段6通过1)的方法脱除Fmoc保护基，重复上述1)与2)依次偶联含有tag载体的全保护的片段5、片段4、片段3、片段2、片段1得到全保护的含有tag载体的索马鲁肽。
9.如权利要求1所述制备索马鲁肽的方法，其特征在于，
制备索马鲁肽粗品的方法为：将全保护的含有tag载体的索马鲁肽溶于含有TIS与水的TFA溶液中，10-30℃下反应3-6小时，反应完成后，将反应液过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶索马鲁肽粗品；
优选的，TFA、TIS与水的体积比为95:2.5:2.5；
所述结晶中使用的不良溶剂为乙醚、异丙醚或甲基叔丁基醚。
10.如权利要求1所述制备索马鲁肽的方法，其特征在于，索马鲁肽粗品纯化方法具体为使用制备液相进行纯化，进一步优选使用反向高效液相色谱法对索马鲁肽粗品进行两步纯化；
具体方法为：第一步，首先对索马鲁肽粗品进行纯化：流动相A相为体积分数为0.25％乙酸-H2O溶液，流动相B相为乙腈；第二步为转盐：流动相A相为体积分数为0.25％乙酸-H2O溶液，流动相B相为乙腈；两步纯化均为梯度洗脱，第一步条件为80％-70％A，20分钟；第二步条件为70％-40％A，60分钟；流速为8ml/分钟，紫外检测波长为230nm。
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