CN112979763A - 一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法 - Google Patents

一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法 Download PDF

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CN112979763A CN202110234523.2A CN202110234523A CN112979763A CN 112979763 A CN112979763 A CN 112979763A CN 202110234523 A CN202110234523 A CN 202110234523A CN 112979763 A CN112979763 A CN 112979763A
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张娜
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Abstract

本发明具体涉及一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch‑2的液相合成方法。现有抗菌肽Oreoch‑2合成以固相合成方法为主，制备工艺较为繁琐、并且后处理困难。为了克服上述上述问题，本发明提供了一种基于可溶性疏水载体辅助的液相制备抗菌肽Oreoch‑2的方法，将抗菌肽Oreoch‑2划分为若干片段，通过亲脂疏水性载体进行逐个氨基酸偶联合成片段，依次连接所述片段、脱除保护基及tag载体得到所述抗菌肽Oreoch‑2。该合成方法不受规模的限制，反应中可以通过TLC或液相法监测反应是否完全进行，有效避免了缺失或增添单个氨基酸残基杂质的产生，非常有效地降低了纯化难度并提高了原料的利用率。

Description

一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法
技术领域
本发明属于抗菌肽Oreoch-2的合成技术领域，具体涉及一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细菌感染对人体健康有严重威胁。在中国每年至少有300万人受到感染，直接导致约33000人死亡。近年来，由于传统抗生素的滥用以及多重耐药细菌进化速度加快使得许多细菌产生耐药性。加之由于商业利益等原因，相比抗菌药物的研发速度，细菌的抗药性则以惊人的速度发展。因此，迫切需要一种新型抗菌药物来已对耐药菌、特别是多药耐药菌的挑战。
抗菌肽作为天然免疫系统的重要组成部分，在过去的二十年里引起了众多研究者的广泛关注，它凭借其抗菌谱广、作用迅速、热稳定性好、不易产生耐药性等优点，已逐步发展成为生物医学、兽医学相关方面的研究热点。抗菌肽独特的杀菌机制能够完美避开大多数细菌的耐药途径，有望成为新一代的高效抑菌药物。Oreoch-2是从罗非鱼鳃中分离出来的一种抗菌肽样转录物，它具有富含Arg的尾巴，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有良好的抗菌活性。基于其体外和体内功效，它还能抑制多药耐药性胃病菌幽门螺杆菌的生长，是良好的潜在抗菌药物。
抗菌肽Oreoch-2是由25个天然氨基酸残基组成的直链肽，其具体结构以及氨基酸序列如下式所示：
Figure BDA0002960129250000021
H-Phe-Ile-His-His-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Phe-Ser-Ala-Gly-Lys-Ala-Ile-His-Arg-Leu-Ile-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH
针对抗菌肽Oreoch-2的合成，在相关文献中有一种方法是使用巴斯德毕赤酵母GS115进行表达。它首先将抗菌肽Oreoch-2的序列克隆到pPIC9的载体中，然后整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中进行表达。除此之外，就是使用固相合成法来制备Oreoch-2。众所周知，固相合成法存在一些缺点：①它所涉及的反应为非均相反应，反应时间长且反应不完全；投料过量过多，多余的原料不能每一步都除掉，造成原料的浪费以及容易出现副反应。②由于固相合成法受固相树脂载体取代值的限制，总收率较低；且中间产生的缺失或增添单个氨基酸残基的副产物较多，这使得杂质性质与产物接近，难以纯化。因此，固相合成法原料成本较高而产率和纯度较低，纯化难度很大，对于中等长度的多肽来说不是一个很好的选择。
发明内容
针对上述研究现状，本发明目的在于规避一般固相合成法高成本低产出的缺点，基于可溶性疏水载体标记的液相多肽合成法，提供一种高效且低成本的液相制备抗菌肽Oreoch-2的方法。
基于上述技术目的，本发明提供了一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，所述合成方法包括：将抗菌肽Oreoch-2划分为若干片段，通过可溶性疏水载体标记的液相制备法合成每个片段，再依次偶联上述片段得到所述抗菌肽Oreoch-2。
本发明提供的上述合成方法是一种均相合成方法，本领域公知，产物的分离有赖于极性特征，由于目标物的序列是确认的，这意味着所有的多肽都可能适合通过液相方法进行合成。本发明提供了一种适合于抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，相比于传统的固相合成法合成多肽具有以下特点与优势：①本发明合成方法的所有反应均在液相中进行，是均相反应，投料无需像固相合成法(非均相反应)一样原料大大过量，且反应速度快，更易于且更直接地监测反应终点(可以使用TLC法)，既节约了时间成本，又节约了物料成本；②该方法没有规模上的限制，每一步反应完全后只需要向反应液中加入不良溶剂就可以析出产物而且可以把过量的原料直接洗掉，在反应的后处理上本方法更为简便，它结合了固相技术和液相技术的最佳性能，在每一步都能获得优异的沉淀率；③即使因为偶联了困难氨基酸导致产物中出现杂质，因为连接了tag载体的片段具有高度的可溶性，所以可以采用柱层析的办法对产物进行纯化，减少了后续合成中的杂质生成，降低了纯化的难度。
另外，基于本发明的研究思路，本发明合成目标为抗菌肽Oreoch-2，由于目标序列是确定的，这意味着本发明根据氨基酸合成片段的不同，需要对反应的条件进行重新探索和优化。本发明着重优化的技术方向包括：(1)所述氨基酸片段的划分方法；(2)保护基的脱除方式，恰当的保护基脱除方法应当能够不破坏所述氨基酸片段结构，并且简便易行；(3)对所述抗菌肽粗品的纯化方式进行了改进，改进后的纯化方法能够获得高纯度样品的同时，纯化速度更快。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明合成抗菌肽Oreoch-2的方法中，首先将抗菌肽Oreoch-2分成四个片段来分别进行合成，再进行片段间偶联的办法，有效地降低了终产品中缺失或重复单个氨基酸残基的杂质的含量，含有的少量杂质仅为缺失某个片段的杂质，这些杂质与产物抗菌肽Oreoch-2的性质差异较大，易于纯化除去，提高了生产的产率和效率，并在后续的纯化过程中有利于进一步提高产品的纯度。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述片段1的质谱图；
保留Fmoc保护基，脱掉tag载体进行验证，Calcd for C110H152N20O23S5[M+2H]2+＝1142.4,found＝1142.5。
图2为实施例1中所述片段2质谱图；
Calcd for C91H119N13O15S[M+H]+＝1666.87,found＝1667.61。
图3为实施例1中所述片段3质谱图；
Calcd for C44H56N6O10[M-H]-＝827.41,found＝827.6。
图4为实施例1中所述片段4质谱图；
Calcd for C84H97N11O10[M-H]-＝1418.7420,found＝1418.7023。
图5为实施例1中所述片段1液相图。
图6为实施例1中所述片段2液相图。
图7为实施例1中所述片段3液相图。
图8为实施例1中所述片段4液相图。
图9为实施例1中所述精制抗菌肽Oreoch-2液相图。
图10为实施例1中所述精制抗菌肽Oreoch-2质谱图；
Calcd for C135H226N50O27[M+5H]5+＝597.31,found＝597.15。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释：
下表为本发明中所使用的英文字母缩写的含义：
Figure BDA0002960129250000051
正如背景技术所介绍的，现有技术中针对抗菌肽Oreoch-2的合成主要依赖固相合成法，具有方法繁琐、纯化困难并且收率较低。为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种基于可溶性疏水载体辅助的液相制备抗菌肽Oreoch-2的方法。
本发明第一方面，提供一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，所述合成方法包括：将抗菌肽Oreoch-2划分为若干片段，通过可溶性疏水载体标记的液相制备法合成每个片段，再依次偶联上述片段得到所述抗菌肽Oreoch-2。
优选的，所述抗菌肽Oreoch-2片段为长度五到七个氨基酸的残基。
优选的，所述片段的末位氨基酸为精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)或甘氨酸(Gly)。
上述优选技术方案的一种效果较好的实施方式中，所述抗菌肽Oreoch-2划分为四个片段，所述四个片段中氨基酸序列如下：
片段1：Arg-Arg-Arg-Arg-Arg，
片段2：Lys-Ala-Ile-His-Arg-Leu-Ile，
片段3：Gly-Leu-Phe-Ser-Ala-Gly，
片段4：Phe-Ile-His-His-Ile-Ile-Gly。
依据本发明合成方法设计思路，采用可溶性疏水载体作为反应载体克服了传统固相合成法采用非均相合成的弊端。在本发明的均相合成体系中，所述反应物与产物均在液体环境中，所述氨基酸残基的设计对产物能否析出具有重要的影响。经本发明验证，将所述抗菌肽Oreoch-2划分为上述四个片段进行合成，能够兼顾反应效率及收率。
优选的，所述疏水性载体为2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇和/或其标记物。
所述疏水性载体可采用市售产品或自行合成，所述载体来源不影响抗菌肽Oreoch-2的合成效果。本发明优选的技术方案中，还提供了一种2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：将2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷成醚后经还原反应得到2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇。
进一步的，所述合成方法步骤如下：
(1)将2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷以及缚酸剂溶于DMF中，在油浴中惰性气体保护反应过夜；向反应液中加入纯化水析出结晶，过滤得到固体后再用甲醇打浆得到2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛；
(2)将上述得到的2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛与还原剂溶于四氢呋喃与甲醇的混合溶液中，反应2-3h，待反应完成后向反应液中缓慢滴入适量纯化水处理未反应掉的催化剂，过滤，向反应液中加入甲醇析出结晶，经洗涤后得到产物2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)。
更进一步的，步骤(1)中，缚酸剂可以为无水Na2CO3或无水K2CO3。
更进一步的，所述油浴的温度为65～75℃。
更进一步的，步骤(2)中，所述还原剂为硼氢化钠；所使用的混合溶剂为THF:MeOH＝10:1的溶剂；反应中2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛与硼氢化钠的投料比为1:3至1:4。
优选的，所述抗菌肽Oreoch-2的合成具体步骤如下：
(1)通过可溶性疏水载体标记的液相制备法合成四个碳末端连有tag载体的全保护片段，所述片段的结构如下：
片段1结构：Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag，
片段2结构：Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-O-tag，
片段3结构：Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-O-tag，
片段4结构：Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-O-tag；
(2)脱除上述片段2-4的tag载体，得到不含tag载体的全保护片段2-4；
(3)在含有tag载体的片段1上，依次偶联上述不含tag载体的全保护片段2、片段3和片段4，得到全保护的、含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2，脱除保护基以及tag载体得到抗菌肽Oreoch-2粗品；
(4)纯化所述抗菌肽Oreoch-2粗品得到抗菌肽Oreoch-2。
进一步的，所述步骤(1)中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段的方法具体如下：
1)片段碳末端Fmoc保护的氨基酸连接tag载体：将2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)溶于溶剂中，依次加入片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP，室温下反应30min，反应结束后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
更进一步的，反应溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃。
更进一步的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂；tag载体、片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP的投料比为0.8～1.2：1.3～1.7：1.3～1.7：0.1～0.3。
2)脱除Fmoc保护基：将含有Fmoc保护基的未完成整个片段合成的含有tag载体的片段溶于四氢呋喃中，加入哌啶与DBU，室温下反应5min，反应结束后向溶液中加入适量HCl调溶液pH至6-8，向溶液中加入不良溶剂析出产物。
更进一步的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂。
更进一步的，所述片段、哌啶与DBU的投料比为0.8～1.2:1.3～1.7:1.2。
3)氨基酸的偶联：将脱去Fmoc的含有tag载体的片段溶于溶剂中，加入Fmoc-AA-OH(需偶联的氨基酸)、缩合剂以及催化剂，在室温下反应30min，待反应完成后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
更进一步的，缩合剂为HATU、HOAt或HBTU、HOBt，催化剂为DIPEA。优选的，缩合剂使用HBTU和HOBt组合。
更进一步的，反应溶剂选用THF:DMF＝8～10:1的混合溶剂。
更进一步的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂。
更进一步的，所述片段、Fmoc-AA-OH、HBTU、HOBt与DIPEA的投料比为0.8～1.2:1～1.5:1～1.5:1～1.5:4～6。
本发明一种具体的实施方式中，所述片段1～4的合成方法如下：
所述碳末端连有tag载体的全保护片段1的合成方法为：
a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联剩余的四个Fmoc-Arg(Pbf)-OH得到Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag。
所述碳末端连有tag载体的全保护片段2的合成方法为：
a)将Fmoc-Ile-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Ile-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH得到Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-O-tag。
所述碳末端连有tag载体的全保护片段3的合成方法为：
a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Gly-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH得到Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-O-tag。
所述碳末端连有tag载体的全保护片段4的合成方法为：
a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Gly-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Boc-Phe-OH得到Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-O-tag。
进一步的，步骤(2)中，所述tag载体的脱除方法如下：将含有tag载体的全保护的片段溶于DCM中，向溶液中加入TFE与TFA，室温下反应25～35min，待反应完成后过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶，过滤、洗涤得到产物不含tag载体的全保护片段。
更进一步的，所述DCM:TFE:TFA的浓度比为＝90～110:9～11:1.
更进一步的，所述不良溶剂为DIPE。
进一步的，步骤(3)中，所述全保护的、含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2的合成方法如下：
1)脱除含有tag载体的全保护片段的Fmoc保护基：将含有tag载体的全保护片段溶于THF中，向溶液中加入哌啶与DBU，室温下反应3～7min，反应完成后向溶液中加入适量HCl将溶液pH调至6-8后向溶液中加入不良溶剂析出产物。
更进一步的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂。
更进一步的，片段、哌啶与DBU的投料比为1:10-15:3。
2)偶联片段：将上述脱除Fmoc保护基的片段溶于THF:DMF＝9:1的混合溶剂中，加入待偶联的不含有tag载体的全保护片段与缩合剂，室温下反应1-3h，反应完成后向反应液中加入不良溶剂析出产物。
更进一步的，缩合剂可以选择：
①HATU、HOAt、DIPEA，其投料比为含有tag载体的片段:不含有tag载体的片段:HATU:HOAt:DIPEA＝1:1.5:1.5:1.5:5；
②DMT-MM、DIPEA，其投料比为含有tag载体的片段:不含有tag载体的片段:DMT-MM:DIPEA＝1:1.5:1.5:5。
更进一步的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂。
进一步的，步骤(3)中，所述合成全保护的含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2的方法具体为：将含有tag载体的全保护的片段1通过重复上述2)与1)依次偶联不含有tag载体的全保护的片段2、片段3、片段4得到全保护的含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2。
进一步的，步骤(3)中，所述脱除保护基及tag载体的方法为：将全保护的含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2溶于含有2.0～3.0％TIS与2.0-3.0％水的TFA溶液中，室温下反应3-5h；反应完成后，将反应液过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶，经过滤与洗涤得到抗菌肽Oreoch-2粗肽。
更进一步的，所述不良溶剂为DIPE。
本发明研究过程中发现，上述偶联与脱保护步骤中，由于产物的性质原因，产物析出后可能会出现以下问题导致产物难以分离：1)黏度较大，难以抽滤；2)生成无定形的固体，难以洗涤干净；3)颗粒细小，抽滤时会透过滤纸。
针对上述问题，本发明改进了专利CN107406480A中的后处理方式，当反应产物出现难处理的性质时，在加入不良溶剂的结晶液中加入一定量的硅藻土与结晶混匀后抽滤，可以大大改变了产物的性质，使得抽滤得以顺利进行，抽滤后得到产物与硅藻土的混合物，此时使用THF将产物溶出后旋蒸除去溶剂即得产物，当黏度过大使得产物吸附在硅藻土上时，使产物与硅藻土同时投入下一步，待得到黏度降低后，再通过THF将产物溶出。
针对当颗粒细小，抽滤时容易透过滤纸时的产物，在不会使氨基酸保护基脱落的情况下通过适当的调整溶液的PH值，向反应液中缓慢滴加6M的盐酸，调PH＝6～7，改变结晶状态再抽滤。
进一步的，步骤(4)中，所述纯化方法采用反向高效液相色谱法，通过两次洗脱进行纯化。
更进一步的，所述纯化方法步骤如下：
(1)流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈，流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液，洗脱梯度为25％-45％A；
(2)流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈,流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液，洗脱梯度为26％-36％A。
上述两纯化步骤(1)和(2)时间均为25～35min，流速为7～9mL/min，紫外检测波长为220nm。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
(1)2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)的制备：
1)中间体2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛的制备：称取2，4-二羟基苯甲醛(0.6g，4.34mmol)、无水碳酸钾(6.0g，43.4mmol)和1-溴代二十二烷(3.46g，8.9mmol)加入到30mlDMF中，在氮气保护下油浴加热至70℃搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液倒入500ml水中并搅拌1h，过滤，收集滤饼。将滤饼在150ml甲醇中打浆，过滤，收集固体(淡粉色)，干燥得2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛3.03g，收率92.5％。
2)tag载体的制备：称取上述2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛(3.03g，4.01mmol)溶于60ml THF与6ml MeOH的混合溶液中，加入硼氢化钠(441mg，11.7mmol)，在氮气保护下40℃搅拌反应2h。反应完成后，在搅拌下向反应液中逐滴加入纯化水2-3ml至反应液不在冒气泡，同时有棕红色固体产生。将反应液通过硅藻土过滤，滤液浓缩，加入大量MeOH析出结晶，抽滤和真空干燥得产物2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)2.45g，收率80.7％。
TLC鉴定：Rf值＝0.8，石油醚:乙酸乙酯＝4:1。
(2)全保护片段1的制备：
1)Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2.92g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag 4.09g，收率98.3％。
2)H-Arg(Pbf)-O-tag的制备：将上述Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，4.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物H-Arg(Pbf)-O-tag 3.43g，1)与2)两步总收率98.1％。
3)通用的偶联Fmoc保护氨基酸的制备方法：将连有tag载体的片段3mmol溶于THF:DMF＝9:1的混合溶液(60ml)中，依次加入待偶联的Fmoc保护氨基酸(3.6mmol)、HBTU(1.37g，3.6mmol)、HOBt(0.486g、3.6mmol)和DIPEA(1.94g，15mmol)，室温下搅拌反应30min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物。
4)通用的脱除连有tag载体片段的Fmoc保护基的制备方法：将连有tag载体片段(3mmol)溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，4.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物。
C末端连有tag载体全保护片段1的制备：将H-Arg(Pbf)-O-tag通过重复实施例1的(2)中的步骤3)和4)，依次偶联剩余四个相同的精氨酸残基Fmoc-Arg(Pbf)-OH得到产物Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag5.32g，总收率63.3％。
(3)全保护片段2的制备：
1)Fmoc-Ile-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，向溶液中加入Fmoc-Ile-OH(1.59g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物Fmoc-Ile-O-tag 3.21g，收率98.0％。
2)H-Ile-O-tag的制备：将上述Fmoc-Ile-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，4.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物H-Ile-O-tag 2.54g，1)与2)两步总收率97.3％。
3)C末端连有tag载体全保护片段2的制备：将H-Ile-O-tag通过重复实施例1的(2)中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH得到Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-O-tag 5.34g，总收率74.0％。
4)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-O-tag(5.05g，2.1mmol)加入到70ml含有10％TFE与1％TFA的DCM溶液中，室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，过滤，加入适量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤滤饼，真空干燥得产物全保护片段2：Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-OH3.36g，收率96.0％。
(4)全保护片段3的制备：
1)Fmoc-Gly-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，加入Fmoc-Gly-OH(1.34g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤得到产物Fmoc-Gly-O-tag3.04g，收率97.8％。
2)H-Gly-O-tag的制备：将上述Fmoc-Gly-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤得到产物H-Gly-O-tag 2.38g，1)与2)两步总收率97.5％。
3)C末端连有tag载体全保护片段3的制备：将H-Gly-O-tag通过重复实施例1的(2)中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Gly-OH得到Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-O-tag 3.35g，总收率71.3％。
4)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-O-tag(2.35g，1.5mmol)加入到50ml含有10％TFE与1％TFA的DCM溶液中，室温下搅拌反应30min。TLC法监测反应完全后，过滤，加入适量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤滤饼，真空干燥得产物全保护片段3：Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-OH 1.19g，收率95.8％。
(5)全保护片段4的制备：
1)同实施例(4)中的步骤1)与2)，通过两步反应制得H-Gly-O-tag。
2)C末端连有tag载体全保护片段4的制备：将H-Gly-O-tag通过重复实施例1的(2)中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Boc-Phe-OH得到Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-O-tag 4.67g，总收率72.1％。
3)tag载体的脱除：将上述Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-O-tag(4.53g，2.1mmol)加入到70ml含有10％TFE与1％TFA的DCM溶液中，室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，过滤，加入适量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤滤饼，收集并真空干燥得产物全保护片段4：Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-OH 2.87g，收率96.3％。
(6)C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2的制备：
1)通用的偶联全保护片段的制备方法：将连有tag载体片段0.5mmol溶于20mlTHF:DMF＝9:1的混合溶液中，依次加入待偶联的全保护片段0.75mmol、DMT-MM 0.75mmol与DIPEA 2.5mmol，室温下搅拌3h。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，过滤，得到产物。
2)通用的脱除Fmoc保护基的制备方法：将连有tag载体片段0.5mmol溶于50ml THF中，加入PIP(511mg，6mmol)和DBU(228mg,1.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，过滤得到产物。
C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2的制备：将C末端连有tag载体全保护片段1Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag通过重复实施例1中(6)的步骤1)和2)，依次偶联片段2、片段3和片段4得到产物C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2 1.62g，总收率52％。
(7)保护基与tag载体的裂解和抗菌肽Oreoch-2粗肽的制备：
取上述C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2(1.62g，0.26mmol)溶于10ml含有2.5％TIS与2.5％水的TFA溶液中，室温下反应3h。反应完全后过滤，向滤液中加入适量DIPE，析出结晶，抽滤，DIPE洗涤真空干燥得产物Oreoch-2粗肽704mg，收率90.8％。
(8)抗菌肽Oreoch-2粗肽的纯化：
取抗菌肽Oreoch-2粗肽50mg，用反向高效液相色谱法进行两步纯化(使用C18制备柱：250×21.2mm，10A)：第一步，首先对抗菌肽Oreoch-2进行粗略纯化，流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈,流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液，洗脱梯度为25％-45％A；第二步，在第一步的基础上进行精确纯化，流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈，流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液,洗脱梯度为26％-36％A。两次时间均为30min,流速为8ml/min，紫外检测波长为220nm。经浓缩、冻干得到抗菌肽Oreoch-2纯品9.5mg，纯度为98.73％。
对比例1
抗菌肽Oreoch-2序列其他划分方式示例如下：所述抗菌肽Oreoch-2划分为四个片段，所述四个片段中氨基酸序列如下：
片段1：Ile-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg，
片段2：Ala-Ile-His-Arg-Leu，
片段3：Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Phe-Ser-Ala-Gly-Lys，
片段4：Phe-Ile-His-His。
通过可溶性疏水载体标记的液相制备法合成四个碳末端连有tag载体的全保护片段，所述片段的结构如下：
片段1结构：Ile-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag，
片段2结构：Fmoc-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-O-tag，
片段3结构：Fmoc-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-O-tag，
片段4结构：Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-O-tag；
(1)2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)的制备：
1)中间体2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛的制备：称取2，4-二羟基苯甲醛(0.6g，4.34mmol)、无水碳酸钾(6.0g，43.4mmol)和1-溴代二十二烷(3.46g，8.9mmol)加入到30mlDMF中，在氮气保护下油浴加热至70℃搅拌反应过夜。反应完成后，将反应液倒入500ml水中并搅拌1h，过滤，收集滤饼。将滤饼在150ml甲醇中打浆，过滤，收集固体(淡粉色)，干燥得2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛3.03g，收率92.5％。
2)tag载体的制备：称取上述2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛(3.03g，4.01mmol)溶于60ml THF与6ml MeOH的混合溶液中，加入硼氢化钠(441mg，11.7mmol)，在氮气保护下40℃搅拌反应2h。反应完成后，在搅拌下向反应液中逐滴加入纯化水2-3ml至反应液不在冒气泡，同时有棕红色固体产生。将反应液通过硅藻土过滤，滤液浓缩，加入大量MeOH析出结晶，抽滤和真空干燥得产物2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)2.45g，收率80.7％。
TLC鉴定：Rf值＝0.8，石油醚:乙酸乙酯＝4:1。
(2)全保护片段1的制备：
1)Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2.92g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag 4.09g，收率98.3％。
2)H-Arg(Pbf)-O-tag的制备：将上述Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，4.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物H-Arg(Pbf)-O-tag 3.43g，1)与2)两步总收率98.1％。
3)通用的偶联Fmoc保护氨基酸的制备方法：将连有tag载体的片段3mmol溶于THF:DMF＝9:1的混合溶液(60ml)中，依次加入待偶联的Fmoc保护氨基酸(3.6mmol)、HBTU(1.37g，3.6mmol)、HOBt(0.486g、3.6mmol)和DIPEA(1.94g，15mmol)，室温下搅拌反应30min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物。
4)通用的脱除连有tag载体片段的Fmoc保护基的制备方法：将连有tag载体片段(3mmol)溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，4.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物。
C末端连有tag载体全保护片段1的制备：将H-Arg(Pbf)-O-tag通过重复对比例1中(2)的步骤3)和4)，依次偶联剩余四个相同的精氨酸残基Fmoc-Arg(Pbf)-OH以及Fmoc-Ile-OH得到产物Ile-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag 5.34g，总收率61.2％。
(3)全保护片段2的制备：
1)Fmoc-Leu-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，向溶液中加入Fmoc-Leu-OH(1.59g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物Fmoc-Leu-O-tag 3.14g，收率95.8％。
2)H-Leu-O-tag的制备：将上述Fmoc-Leu-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，4.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，抽滤，得到产物H-Leu-O-tag 2.54g，1)与2)两步总收率97.6％。
3)C末端连有tag载体全保护片段2的制备：将H-Leu-O-tag通过重复对比例1中(2)的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Ala-OH得到Fmoc-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-O-tag4.49g，总收率72.5％。
4)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-O-tag(4.33g，2.1mmol)加入到70ml含有10％TFE与1％TFA的DCM溶液中，室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，过滤，加入适量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤滤饼，真空干燥得产物全保护片段2：Fmoc-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-OH2.56g，收率92.0％。
(4)全保护片段3的制备：
1)Fmoc-Lys(Boc)-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(2.11g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤得到产物Fmoc-Lys(Boc)-O-tag 3.50g，收率96.6％。
2)H-Lys(Boc)-O-tag的制备：将上述Fmoc-Lys(Boc)-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤得到产物H-Lys(Boc)-O-tag 2.79g，1)与2)两步总收率94.3％。
3)C末端连有tag载体全保护片段3的制备：将H-Lys(Boc)-O-tag通过重复对比例1中(2)的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ile-OH得到Fmoc-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-O-tag，3.62g，总收率58.0％。
4)tag载体的脱除：将上述Fmoc-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-O-tag(3.12g，1.5mmol)加入到50ml含有10％TFE与1％TFA的DCM溶液中，室温下搅拌反应30min。TLC法监测反应完全后，过滤，加入适量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤滤饼，真空干燥得产物全保护片段3：Fmoc-Ile-Ile-Gly-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-Lys(Boc)-OH 1.88g，收率93.5％。
(5)全保护片段4的制备：
1)Fmoc-His(Trt)-O-tag的制备：称取tag载体(2.27g，3mmol)溶于60mlDCM中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(2.79g，4.5mmol)、DIC(567mg，4.5mmol)和DMAP(73mg，0.6mmol)，在室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤得到产物Fmoc-His(Trt)-O-tag 3.78g，收率92.7％。
2)H-His(Trt)-O-tag的制备：将上述Fmoc-His(Trt)-O-tag溶于60ml含有1％DBU的THF中，加入PIP(384mg，3.6mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入大量乙腈析出结晶，抽滤得到产物H-His(Trt)-O-tag 3.08g，1)与2)两步总收率90.5％。
3)C末端连有tag载体全保护片段4的制备：将H-His(Trt)-O-tag通过重复对比例1的(2)中的步骤3)和4)，依次偶联Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH和Boc-Phe-OH得到Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-O-tag 4.13g，总收率73.5％。
4)tag载体的脱除：将上述Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-O-tag(3.94g，2.1mmol)加入到70ml含有10％TFE与1％TFA的DCM溶液中，室温下搅拌30min。TLC法监测反应完全后，过滤，加入适量DIPE析出结晶，抽滤并用DIPE洗涤滤饼，收集并真空干燥得产物全保护片段4：Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-OH2.20g，收率92.1％。
(6)C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2的制备：
1)通用的偶联全保护片段的制备方法：将连有tag载体片段0.5mmol溶于20mlTHF:DMF＝9:1的混合溶液中，依次加入待偶联的全保护片段0.75mmol、DMT-MM 0.75mmol与DIPEA 2.5mmol，室温下搅拌3h。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，过滤，得到产物。
2)通用的脱除Fmoc保护基的制备方法：将连有tag载体片段0.5mmol溶于50ml THF中，加入PIP(511mg，6mmol)和DBU(228mg,1.5mmol)，室温下搅拌5min。TLC法监测反应完全后，加入适量乙腈析出结晶，过滤得到产物。
C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2的制备：将C末端连有tag载体全保护片段1Ile-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag通过重复对比例1中(6)的步骤1)和2)，依次偶联片段2、片段3和片段4得到产物C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2 1.18g，总收率38％。实验结果证明，更换了起始反应物后对粗肽合成的效率具有较为显著的影响，本实施例中采用了不同的起始反应物进行合成，收率明显的降低，并且后期脱载体、保护基等纯化工作也难以进行。
(7)保护基与tag载体的裂解和抗菌肽Oreoch-2粗肽的制备：
取上述C末端连有tag载体全保护抗菌肽Oreoch-2(1.18g，0.19mmol)溶于10ml含有2.5％TIS与2.5％水的TFA溶液中，室温下反应3h。反应完全后过滤，向滤液中加入适量DIPE，析出结晶，抽滤，DIPE洗涤真空干燥得产物Oreoch-2粗肽468mg，收率82.7％。
(8)抗菌肽Oreoch-2粗肽的纯化：
取抗菌肽Oreoch-2粗肽50mg，用反向高效液相色谱法进行两步纯化(使用C18制备柱：250×21.2mm，10A)：第一步，首先对抗菌肽Oreoch-2进行粗略纯化，流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈,流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液，洗脱梯度为25％-45％A；第二步，在第一步的基础上进行精确纯化，流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈，流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液,洗脱梯度为26％-36％A。两次时间均为30min,流速为8ml/min，紫外检测波长为220nm。经浓缩、冻干得到抗菌肽Oreoch-2纯品5.2mg，纯度为94.6％。
以上所列举和陈述的具体实施方式，仅为了对本发明的目的、操作流程和优化的效果进行详细说明。应当理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施和操作方式，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明所陈述的精神与原则之内所做的任何修改、等义替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：将抗菌肽Oreoch-2划分为若干片段，通过可溶性疏水载体标记的液相制备法合成每个片段，再依次偶联上述片段得到所述抗菌肽Oreoch-2。
2.如权利要求1所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述抗菌肽Oreoch-2片段为长度五到七个氨基酸的残基；
或，所述片段的末位氨基酸为精氨酸、异亮氨酸或甘氨酸；
一种效果较好的实施方式中，所述抗菌肽Oreoch-2划分为四个片段，所述四个片段中氨基酸序列如下：
片段1：Arg-Arg-Arg-Arg-Arg，
片段2：Lys-Ala-Ile-His-Arg-Leu-Ile，
片段3：Gly-Leu-Phe-Ser-Ala-Gly，
片段4：Phe-Ile-His-His-Ile-Ile-Gly。
3.如权利要求1所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述疏水性载体为2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇和/或其标记物；
优选的，所述2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：将2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷成醚后经还原反应得到2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇；
进一步的，所述合成方法步骤如下：
(1)将2，4-二羟基苯甲醛与1-溴代二十二烷以及缚酸剂溶于DMF中，在油浴中惰性气体保护反应过夜；向反应液中加入纯化水析出结晶，过滤得到固体后再用甲醇打浆得到2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛；
(2)将上述得到的2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛与还原剂溶于四氢呋喃与甲醇的混合溶液中，反应2-3h，待反应完成后向反应液中缓慢滴入适量纯化水处理未反应掉的催化剂，过滤，向反应液中加入甲醇析出结晶，经洗涤后得到产物2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)；
更进一步的，步骤(1)中，缚酸剂可以为无水Na2CO3或无水K2CO3；
更进一步的，所述油浴的温度为65～75℃；
更进一步的，步骤(2)中，所述还原剂为硼氢化钠；所使用的混合溶剂为THF:MeOH＝10:1的溶剂；反应中2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醛与硼氢化钠的投料比为1:3至1:4。
4.如权利要求1所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述抗菌肽Oreoch-2的合成具体步骤如下：
(1)通过可溶性疏水载体标记的液相制备法合成四个碳末端连有tag载体的全保护片段，所述片段的结构如下：
片段1结构：Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag，
片段2结构：Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-O-tag，
片段3结构：Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-O-tag，
片段4结构：Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-O-tag；
(2)脱除上述片段2-4的tag载体，得到不含tag载体的全保护片段2-4；
(3)在含有tag载体的片段1上，依次偶联上述不含tag载体的全保护片段2、片段3和片段4，得到全保护的、含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2，脱除保护基以及tag载体得到抗菌肽Oreoch-2粗品；
(4)纯化所述抗菌肽Oreoch-2粗品得到抗菌肽Oreoch-2。
5.如权利要求4所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述碳末端连有tag载体的全保护片段的方法具体如下：
1)片段碳末端Fmoc保护的氨基酸连接tag载体：将2，4-二(二十二烷氧基)苯甲醇(tag载体)溶于溶剂中，依次加入片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP，室温下反应25～35min，反应结束后向反应液中加入不良溶剂析出产物；
优选的，反应溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃；
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂；tag载体、片段碳末端Fmoc保护的氨基酸、DIC、DMAP的投料比为0.8～1.2：1.3～1.7：1.3～1.7：0.1～0.3；
2)脱除Fmoc保护基：将含有Fmoc保护基的未完成整个片段合成的含有tag载体的片段溶于四氢呋喃中，加入哌啶与DBU，室温下反应5min，反应结束后向溶液中加入适量HCl调溶液pH至6-8，向溶液中加入不良溶剂析出产物；
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂；
优选的，所述片段、哌啶与DBU的投料比为0.8～1.2:1.3～1.7:1.2；
3)氨基酸的偶联：将脱去Fmoc的含有tag载体的片段溶于溶剂中，加入Fmoc-AA-OH(需偶联的氨基酸)、缩合剂以及催化剂，在室温下反应30min，待反应完成后向反应液中加入不良溶剂析出产物；
优选的，缩合剂为HATU、HOAt或HBTU、HOBt，催化剂为DIPEA。优选的，缩合剂使用HBTU和HOBt组合；
优选的，反应溶剂选用THF:DMF＝8～10:1的混合溶剂；
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂；
优选的，所述片段、Fmoc-AA-OH、HBTU、HOBt与DIPEA的投料比为0.8～1.2:1～1.5:1～1.5:1～1.5:4～6。
6.如权利要求5所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述碳末端连有tag载体的全保护片段1的合成方法为：
a)将Fmoc-Arg(Pbf)-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Arg(Pbf)-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联剩余的四个Fmoc-Arg(Pbf)-OH得到Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-O-Tag；
或，所述碳末端连有tag载体的全保护片段2的合成方法为：
a)将Fmoc-Ile-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Ile-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH得到Fmoc-Lys(Boc)-Ala-Ile-His(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-O-tag；
或，所述碳末端连有tag载体的全保护片段3的合成方法为：
a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Gly-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH得到Fmoc-Gly-Leu-Phe-Ser(tBu)-Ala-Gly-O-tag；
或，所述碳末端连有tag载体的全保护片段4的合成方法为：
a)将Fmoc-Gly-OH与tag载体在DIC和DMAP存在下合成Fmoc-Gly-O-tag；
b)重复上述步骤2)和3)，依次偶联Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Boc-Phe-OH得到Boc-Phe-Ile-His(Trt)-His(Trt)-Ile-Ile-Gly-O-tag。
7.如权利要求4所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述tag载体的脱除方法如下：将含有tag载体的全保护的片段溶于DCM中，向溶液中加入TFE与TFA，室温下反应25～35min，待反应完成后过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶，过滤、洗涤得到产物不含tag载体的全保护片段。
更进一步的，所述DCM:TFE:TFA的浓度比为＝90～110:9～11:1.
更进一步的，所述不良溶剂为DIPE。
8.如权利要求4所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，步骤(3)中，所述全保护的、含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2的合成方法如下：
1)脱除含有tag载体的全保护片段的Fmoc保护基：将含有tag载体的全保护片段溶于THF中，向溶液中加入哌啶与DBU，室温下反应3～7min，反应完成后向溶液中加入适量HCl将溶液pH调至6-8后向溶液中加入不良溶剂析出产物；
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂；
优选的，片段、哌啶与DBU的投料比为1:10-15:3；
2)偶联片段：将上述脱除Fmoc保护基的片段溶于THF:DMF＝9:1的混合溶剂中，加入待偶联的不含有tag载体的全保护片段与缩合剂，室温下反应1-3h，反应完成后向反应液中加入不良溶剂析出产物；
优选的，缩合剂可以选择：
①HATU、HOAt、DIPEA，其投料比为含有tag载体的片段:不含有tag载体的片段:HATU:HOAt:DIPEA＝1:1.5:1.5:1.5:5；
②DMT-MM、DIPEA，其投料比为含有tag载体的片段:不含有tag载体的片段:DMT-MM:DIPEA＝1:1.5:1.5:5；
优选的，不良溶剂为乙腈、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂；
或，步骤(3)中，所述合成全保护的含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2的方法具体为：将含有tag载体的全保护的片段1通过重复上述2)与1)依次偶联不含有tag载体的全保护的片段2、片段3、片段4得到全保护的含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2；
或，步骤(3)中，所述脱除保护基及tag载体的方法为：将全保护的含有tag载体的抗菌肽Oreoch-2溶于含有2.0～3.0％TIS与2.-3.0％水的TFA溶液中，室温下反应3-5h；反应完成后，将反应液过滤，向滤液中加入不良溶剂析出结晶，经过滤与洗涤得到抗菌肽Oreoch-2粗肽；
优选的，所述不良溶剂为DIPE。
9.如权利要求5-8任一项所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，所述不良溶剂加入反应体系后，想不良溶剂的结晶液中加入一定量的硅藻土与结晶混匀后抽滤。
10.如权利要求4所述基于可溶性疏水载体抗菌肽Oreoch-2的液相合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述纯化方法采用反向高效液相色谱法，通过两次洗脱进行纯化；
优选的，所述纯化方法步骤如下：
(1)流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈，流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液，洗脱梯度为25％-45％A；
(2)流动相A相为体积分数为0.1％TFA-乙腈,流动相B相为体积分数为0.1％TFA-H2O溶液，洗脱梯度为26％-36％A；
所述两纯化步骤(1)和(2)时间均为25～35min，流速为7～9mL/min，紫外检测波长为220nm。
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