CN108484735B - 一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽类化合物合成领域，公开了一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A‑D的合成方法。Reniochalistatin A‑D的结构式如下所示，该方法采用多肽固相合成方法，以芴甲氧羰酰基脯氨酸为原料链接在2‑氯树脂上，然后封闭树脂上的反应位点，重复脱Fmoc保护、与下一个带Fmoc保护的氨基酸发生缩合反应，直至得到线性七肽‑树脂复合物，切断树脂，经环合试剂进行环合反应得到最终产物环七肽Reniochali statin A‑D。该方法操作简便，产率高，原料便宜，缩合试剂均为常见试剂。

Description

一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法
技术领域
本发明属于多肽类化合物合成领域，特别涉及一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法。
背景技术
多肽类化合物是组成海洋活性化合物的主要结构类型之一，每年新发现的海洋多肽类化合物在海洋天然产物中占有很大的比例，是海洋活性物质研究的重要组成部分(管华诗，韩玉谦，冯晓梅.中国海洋大学学报,2004，34(5):761)。海洋药物越来越受到科学家们关注，特别是其中的环肽，环肽在生物体内具有良好的抗肿瘤(Senter PD，SieversEL.Nature Biotechnology，2012，30:631.)、抗炎、细胞毒活性(Gulavita,N.K.；Gunasekera,S.P.；Pomponi,S.A.；Robinson,E.V.J.Org.Chem.1992,57,1767)抗菌以及酶抑制的活性(Tripathi A,Puddick J.J.Nat Prod,2010,73(11)1810-1814),因为在自然界分离获得的环肽量非常少，远远不能满足实际应用，所以人工合成环肽成为现在最热的课题之一。
Reniochalistatin A-D是从我国南海西沙永兴岛采集的海绵Reniochalinastalagmitis中分离得到的一类新型环七肽，它对多种癌细胞株系都表现出非常好的活性，R-B对于抗肿瘤和抗COX活性表现出较好的活性，如人前列腺癌细胞LNCaP、子宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、抗COX-1活性和抗COX-2活性，IC50值分别为3.37μM，2.55μM，3.56μM，2.80μM和1.05μM。
R-B表现出更好的和更广泛的生物活性，如人前列腺癌细胞LNCaP、人类肺泡基底上皮细胞A549、子宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人早幼粒白血病细胞HL60、人结肠癌细胞HT29、人乳腺癌细胞SK-BR-3、人肝癌细胞HepG2、抗COX-1活性、抗COX-2活性和抗结核菌活性，IC50值分别为6.11μM，1.21μM，9.14μM，1.09μM，1.05μM，1.46μM，1.29μM，1.26μM，1.49μM，4.12μM和1.42μM
R-D也表现出很好的生物活性，人前列腺癌细胞LNCaP、人类肺泡基底上皮细胞A549、子宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞MDA-MB-231和人肝癌细胞HepG2，IC50值分别为3.49μM，3.01μM，2.59μM，3.55μM和3.11μM。
正因为其对于广泛的癌细胞都有抑制作用，该化合物可能成为新型的海洋药物。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法。
Reniochalistatin A-D是一类环七肽，其中Reniochalistatin A-D的分子式依次为C37H62N8O8、C46H65N7O8、C49H64N7O8、C48H59N7O7。其结构式分别如下式所示：
Figure BDA0001581783780000021
本发明的目的通过下述方案实现：
一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其主要包括以下步骤：
(1)向2-氯树脂中加入二氯甲烷溶胀30min，然后抽干滤液并加入芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、二异丙基乙胺(DIEA)和溶剂二氯甲烷，搅拌反应4h，得带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物；
(2)向步骤(1)中得到的带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物中加入二异丙基乙胺(DIEA)的甲醇溶液，搅拌反应30min，使带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物的树脂上残余的反应位点封闭；
(3)将步骤(2)中得到的反应位点封闭的产物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)存在条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-2发生缩合反应，得到带Fmoc保护基的二肽-树脂复合物；
(4)将步骤(3)得到的带Fmoc保护基的二肽-树脂复合物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-3发生缩合反应，得到三肽-树脂复合物；
(5)将步骤(4)所得产物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-4发生缩合反应，得到四肽-树脂复合物；
(6)将步骤(5)所得产物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-5发生缩合反应，得到五肽-树脂复合物；
(7)将步骤(6)所得产物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-6发生缩合反应，得到六肽-树脂复合物；
(8)将步骤(7)所得产物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂(N,N-二甲基甲酰胺)存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-6发生缩合反应，得到七肽-树脂复合物；
(9)将步骤(8)所得产物用20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，脱保护后的产物与2％的TFA/DCM溶液反应以切断树脂，反应结束后将所得反应液纯化即得获得线性七肽；
(10)将步骤(9)所得的产物线性七肽溶于DCM中，然后加入环合试剂PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)，并用DIEA调节pH＝8，发生环合反应，将环合反应后的反应液纯化即得目标产物环七肽；
当带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中有至少一个氨基酸带有别的非Fmoc的保护基团时，则在步骤(10)后还包括以下的步骤(11)：
(11)向步骤(10)的产物中加入95％的TFA/H2O溶液，搅拌反应脱除非Fmoc的保护基团，反应结束后将所得反应液纯化即得目标产物。
当合成产物为Reniochalistatin A时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、芴甲氧羰酰基缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、芴甲氧羰酰基天冬酰胺氨酸(三苯基甲基)(Fmoc-Asn(Trt)-OH)；由于带Fmoc氨基保护基的氨基酸Fmoc-Asn(Trt)-OH带有保护基团Trt，经环合试剂PyBOP环合后还包括一个用95％的TFA/DCM溶液除去保护基团Trt的步骤；
当合成产物为Reniochalistatin B时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、芴甲氧羰酰基(叔丁基)酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)；由于带Fmoc氨基保护基的氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH带有保护基团tBu，经环合试剂PyBOP环合后还包括一个用95％的TFA/DCM溶液除去保护基团tBu的步骤；
当合成产物为Reniochalistatin C时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、芴甲氧羰酰基(叔丁基)酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)；由于带Fmoc氨基保护基的氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH带有保护基团tBu，经环合试剂PyBOP环合后还包括一个用95％的TFA/DCM溶液除去保护基团tBu的步骤；
当合成产物为Reniochalistatin D时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH)、芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)、芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)；由于所用的带Fmoc氨基保护基的氨基酸均不带有非Fmoc的保护基团，在经环合试剂PyBOP环合后不需要包括除去保护基团的步骤。
当带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中的任意一种带Fmoc氨基保护基的氨基酸为芳香族氨基酸或脯氨酸时，其所对应的缩合试剂为Oxyma(2-肟氰乙酸乙酯)/DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)；此时对应的步骤(3)～(8)中所述的脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x和缩合试剂Oxyma/DIC的用量满足脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x、Oxyma和DIC的摩尔比为1:1-5:1-5:1-5；
当所述的带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中的任意一种带Fmoc氨基保护基的氨基酸为非脯氨酸的脂肪族氨基酸时，所对应的缩合试剂为3-(二乙氧基邻酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)/N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，此时对应的步骤(3)～(8)中所述的脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x和缩合试剂DEPBT/DIEA的用量满足脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x、DEPBT和DIEA的摩尔比为1:1-5:1-5:1-5；
步骤(3)-(8)中所述的缩合反应均指在20-29℃搅拌反应1.5-5h，优选为在20-29℃反应3h；
步骤(1)中所述的2-氯树脂指2-氯三苯基甲基氯树脂；
步骤(1)中所加入的2-氯树脂、芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)和二异丙基乙胺的用量满足2-氯树脂、芴甲氧羰酰基脯氨酸和二异丙基乙胺的用量比为1g:1-3mmol:1-3mmol；步骤(1)中所用的2-氯树脂和二氯甲烷的用量满足每1g的2-氯树脂对应加入10-30mL二氯甲烷；
步骤(2)中，所述的二异丙基乙胺(DIEA)的甲醇溶液是指二异丙基乙胺(DIEA)的甲醇溶液中二异丙基乙胺的体积百分数为10％；所述的带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物和二异丙基乙胺(DIEA)的甲醇溶液的用量满足每1mmol带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物对应加入10-20ml二异丙基乙胺(DIEA)的甲醇溶液；
步骤(3)-(9)中所述的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护是指向每1mmol需要脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护的原料中加入10-30ml的20％哌啶的DMF溶液，然后在室温下搅拌反应10min；
步骤(1)-(8)中所述的反应结束后均包括一个将所得反应液过滤，然后用二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰胺(DMF)交替冲洗的纯化步骤；
步骤(9)中所述的反应是指在20-29℃搅拌反应30-60min；步骤(9)中所述的脱保护后的产物与三氟乙酸的二氯甲烷溶液的用量满足每1mmol脱保护后的产物对应使用10-30ml的2％三氟乙酸的DCM溶液；
步骤(9)中所述的纯化是指将所得反应液过滤，所得滤液经减压旋干后加入过量的冰冻乙醚，有白色固体析出，离心分离后将所得白色固体真空干燥即得纯化后的线性六肽；
步骤(10)中所用的线性七肽和环合试剂的摩尔比为1:1-10，优选为1:6；步骤(10)中所述的环合反应是指在20-29℃搅拌反应10-48h，优选为24h；
步骤(10)中所述的纯化是指将环合反应后的反应液减压旋干得粗产物，粗产物用高效液相色谱进行提纯。
步骤(11)中所述的步骤(10)的产物和95％的TFA/H2O溶液的用量满足每1mmol步骤(10)的产物对应加入10-30ml 95％的TFA/H2O溶液；所述的搅拌反应是指在20-29℃搅拌反应30-60min；步骤(11)中所述的纯化是将反应液减压旋干后经高效液相色谱进行纯化。
步骤(1)-(11)中未指明温度的均指在20-29℃；步骤(1)-(11)中所述的搅拌反应均指在100-420r/min速度下搅拌反应；
本发明的机理为：
本发明合成过程均为酰胺反应，不同氨基酸的连接采用不同的缩合试剂得到产率最优的合成路线。加入非Fmoc的保护基团可以保护氨基，防止发生分子间反应，以便提高反应产率以及减少副反应的发生。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明方法简便，原料便宜易得、产率高。
本发明提供几种先导化合物，具有高效的抗肿瘤活性及抗氧化性。
本发明可以促使减少海洋生物的开采，有利于保护海洋生物的多样性以及海洋生态环境。
本大明可以提供一类环七肽Reniochalistatin A-D合成方法，以及此类化合物的衍生物的合成方法。
附图说明
图1为实施例1中Reniochalistatin A的合成路线图；
图2为实施例2中Reniochalistatin B的合成路线图；
图3为实施例3中Reniochalistatin C的合成路线图；
图4为实施例4中Reniochalistatin D的合成路线图；
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
本发明中所述的“x％的A/B溶液”或者“x％A的B溶液”均指A和B的混合溶液中A的体积分数为x％，如实施例1的步骤(3)中“20％哌啶的DMF溶液”指哌啶和DMF的混合溶液中哌啶的体积分数为20％；步骤(11)中“95％TFA/H2O溶液”指TFA和H2O的混合溶液中TFA的体积分数为95％。实施例中未标明温度均指在20-29℃，未指出搅拌速度的搅拌指在100-420r/min速度下搅拌。
实施例1:Reniochalistatin A的合成
Reniochalistatin A的合成路线图如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)芴甲氧羰酰基脯氨酸的树脂复合物(Fmoc-Pro-resin)
取1.00g的2-氯三苯基甲基氯树脂(负载量0.985mmol/g)于100ml的多肽合成管中，加入20ml的二氯甲烷(DCM)溶胀30分钟。抽干滤液，将芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH，0.84g，3mmol)溶解于20ml的DCM中，然后加入到滤渣中，再向滤渣中加入1mL二异丙基乙胺(DIEA),搅拌反应4小时，抽干滤液，用二氯甲烷(DCM,10ml)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10ml)交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-resin。
(2)树脂上残余位点封闭
将10％二异丙基乙胺(DIEA，2ml)的甲醇(MeOH，18ml)溶液加入步骤(1)的产物中，搅拌反应30min，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得残余位点封闭的Fmoc-Pro-resin。
(3)带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Pro-resin)
向步骤(2)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH，1.06g，3mmol)和3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT，0.9g，3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成混合液，所得混合物加入到经脱保护后的步骤(2)的产物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10mL的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Pro-resin)。
(4)带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Leu-Pro-resin)
向步骤(3)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.06g的Fmoc-Leu-OH(3mmol)和0.9g的DEPBT(3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成的混合液，将混合液加入到脱保护后的线性二肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Leu-Pro-resin)。
(5)带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)
向步骤(4)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.01g的Fmoc-Pro-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性三肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)。
(6)带保护的线性五肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)
向步骤(5)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH，1.06g，3mmol)和0.9g的DEPBT(3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性四肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液,得到带保护的线性五肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)。
(7)带保护的线性六肽-树脂复合物(Fmoc-Val-Ile-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)
向步骤(6)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.02g的Fmoc-Val-OH和0.9g的DEPBT于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性五肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到带保护的线性六肽-树脂复合物(Fmoc-Val-Ile-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)。
(8)带保护的线性七肽-树脂复合物(Fmoc-Asn(Trt)-Val-Ile-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)
向步骤(7)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基天冬酰胺氨酸(三苯基甲基)(Fmoc-Asn(Trt)-OH，1.79g，3mmol)和0.9g的DEPBT于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性六肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到带保护的线性七肽-树脂复合物(Fmoc-Asn(Trt)-Val-Ile-Pro-Leu-Leu-Pro-resin)。
(9)树脂切割
向步骤(8)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
取20ml的2％三氟乙酸的DCM溶液，加入到脱保护后的线性七肽-树脂复合物中，搅拌反应30分钟，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到天冬酰胺氨酸带Trt保护的线性七肽。
(10)肽链环合
将0.5mmol的步骤(9)中的天冬酰胺氨酸带Trt保护的线性七肽溶解于1L的DCM中，加入3mmol的环合试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)，用DIEA调节pH＝8，室温下反应24小时，减压旋干，得到天冬酰胺氨酸带Trt保护的环七肽。
(11)脱除天冬酰胺氨酸带Trt的保护
将步骤(10)中得到的带保护的环七肽置于50ml的圆底烧瓶，加入20ml的95％TFA/H2O溶液，搅拌反应1小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物提纯，得到白色固体环七肽Reniochalistatin A，产率81％，纯度99％以上。其核磁氢谱数据和核磁碳谱数据如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.71(d,J＝4.6Hz,1H),8.20(dd,J＝23.0,8.6Hz,1H),7.81(t,J＝8.6Hz,2H),7.42(s,1H),7.11(d,J＝7.3Hz,1H),4.55(d,J＝6.9Hz,1H),4.52–4.45(m,1H),4.23–4.11(m,2H),4.02(t,J＝7.9Hz,2H),3.69(d,J＝8.2Hz,1H),3.42(s,1H),3.02(h,J＝3.8Hz,2H),2.74(dq,J＝11.4,6.5Hz,1H),2.20(ddd,J＝31.7,11.1,6.1Hz,2H),1.99(d,J＝8.7Hz,3H),1.87(q,J＝8.1,7.5Hz,3H),1.74(td,J＝7.8,6.7,4.5Hz,5H),1.52(dd,J＝11.8,5.3Hz,5H),1.01(d,J＝5.0Hz,3H),0.85(dtd,J＝15.2,11.5,10.8,7.4Hz,25H).
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ172.96,172.59,172.42,171.70,171.20,170.94,170.90,62.86,61.20,57.96,57.25,54.30,49.91,49.03,46.35,46.29,41.43,36.46,35.82,30.82,29.08,26.43,26.33,25.59,25.12,24.96,24.69,23.88,23.45,21.89,21.62,21.40,19.91,18.78,15.16,11.33
说明实施例1成功合成了Reniochalistatin A。
实施例2：Reniochalistatin B的合成
Reniochalistatin B的合成路线图如图2所示，具体包括以下步骤：
(1)芴甲氧羰酰基脯氨酸的树脂复合物(Fmoc-Pro-resin)
取1.00g的2-氯三苯基甲基氯树脂(负载量0.985mmol/g)于100ml的多肽合成管中，加入20ml的二氯甲烷(DCM)溶胀30分钟。抽干滤液，将芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH，0.84g，3mmol)溶解于20ml的DCM中，然后加入到滤渣中，再向滤渣中加入1mL二异丙基乙胺(DIEA),搅拌反应4小时，抽干滤液，用二氯甲烷(DCM,10ml)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10ml)交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-resin。
(2)树脂上残余位点封闭
将10％二异丙基乙胺(DIEPA，2ml)的甲醇(MeOH，18ml)溶液加入步骤(1)的产物中，搅拌反应30min，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得残余位点封闭的Fmoc-Pro-resin。
(3)带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Pro-resin)
向步骤(2)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基亮氨酸(Fmoc-Leu-OH，1.06g，3mmol)和3-二乙氧基磷酰基-1,2,3-苯唑4(3H)-酮(DEPBT，0.9g，3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)，所得混合物加入到经脱保护后的步骤(2)的产物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Leu-Pro-resin。
(4)带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Leu-Pro-resin)
向步骤(3)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.01g的Fmoc-Pro-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成的混合液，将混合液加入到脱保护后的线性二肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-Leu-Pro-resin。
(5)带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-Leu-Pro-Leu-Pro-resin)
向步骤(4)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.06g的Fmoc-Leu-OH和0.9g的DEPBT于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.492ml DIEA形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性三肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Leu-Pro-Leu-Pro-resin。
(6)带保护线性五肽-树脂复合物(Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Pro-Leu-Pro-resin)
向步骤(5)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基(叔丁基)酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH，1.38g，3mmol)和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性四肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Pro-Leu-Pro-resin。
(7)带保护的线性六肽-树脂复合物(Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Leu-Pro-Leu-Pro-resin)
向步骤(6)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH，1.16g，3mmol)和0.43gOxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性五肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Leu-Pro-Leu-Pro-resin。
(8)带保护的线性七肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Phe-Tyr(tBu)-Leu-Pro-Leu-Pro-resin)
向步骤(7)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基异亮氨酸(Fmoc-Ile-OH，1.06g，3mmol)和0.9g的DEPBT(3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性六肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液,得到Fmoc-Ile-Phe-Tyr(tBu)-Leu-Pro-Leu-Pro-resin。
(9)树脂切割
向步骤(8)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
取20ml的2％三氟乙酸的DCM溶液，加入到脱保护后的线性七肽-树脂复合物中，搅拌反应30分钟，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到酪氨酸带tBu保护的线性七肽。
(10)肽链环合
将0.5mmol的步骤(9)中的酪氨酸带tBu保护的线性七肽溶解于1L的DCM中，加入3mmol的环合试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)，用DIEA调节pH＝8，室温下反应24小时，减压旋干，得到酪氨酸带tBu保护的环七肽。
(11)脱除酪氨酸带tBu的保护
将步骤(10)中得到的带保护的环七肽于50ml的圆底烧瓶，加入20ml的95％TFA/H2O溶液，搅拌反应1小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物提纯，得到白色固体环七肽Reniochalistatin B，产率78％，纯度99％以上。其核磁氢谱数据和核磁碳谱数据如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.05(s,1H),8.70(d,J＝4.6Hz,1H),8.66(d,J＝7.7Hz,1H),8.51(d,J＝7.0Hz,1H),7.87(d,J＝7.3Hz,1H),7.24(dt,J＝14.9,7.1Hz,4H),7.09(d,J＝7.4Hz,2H),6.99(d,J＝8.1Hz,2H),6.60–6.51(m,3H),4.61(q,J＝5.8Hz,1H),4.37(tt,J＝13.3,5.9Hz,3H),4.24–4.10(m,2H),3.99(dd,J＝8.3,4.3Hz,1H),3.82(dt,J＝11.9,6.0Hz,1H),3.62(q,J＝8.1,6.3Hz,2H),3.09–2.96(m,1H),2.86(dd,J＝14.5,4.7Hz,1H),2.72(dd,J＝13.8,4.5Hz,1H),2.38(dd,J＝12.1,6.0Hz,1H),2.11(d,J＝10.1Hz,1H),1.98–1.85(m,3H),1.78(tq,J＝11.2,6.5Hz,3H),1.36(dd,J＝11.6,7.1Hz,2H),1.25(q,J＝8.7,7.0Hz,2H),1.10–0.99(m,1H),0.97–0.80(m,15H),0.68(t,J＝6.9Hz,1H),0.52(dq,J＝18.2,11.5,9.3Hz,6H).
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ172.02,171.48,171.41,171.22,171.19,170.74,170.71,156.22,137.98,131.85,129.06,128.77,126.94,126.85,114.51,60.77,60.62,60.40,56.20,53.10,51.33,50.85,47.14,46.94,38.89,38.57,38.14,37.71,35.48,31.29,29.60,25.26,25.21,24.53,23.97,23.43,23.35,22.17,21.08,20.82,15.35,11.79
说明实施例2成功合成了Reniochalistatin B。
实施例3：Reniochalistatin C的合成
Reniochalistatin C的合成路线图如图3所示，具体包括以下步骤：
(1)芴甲氧羰酰基脯氨酸的树脂复合物(Fmoc-Pro-resin)
取1.00g的2-氯三苯基甲基氯树脂(负载量0.985mmol/g)于100ml的多肽合成管中，加入20ml的二氯甲烷(DCM)溶胀30分钟。抽干滤液，将芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH，0.84g，3mmol)溶解于20ml的DCM中，然后加入到滤渣中，再向滤渣中加入1mL二异丙基乙胺(DIEA),搅拌反应4小时，抽干滤液，用二氯甲烷(DCM,10ml)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10ml)交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-resin。
(2)树脂上残余位点封闭
将体积比为10％二异丙基乙胺(DIEA，2ml)的甲醇(MeOH，18ml)溶液加入步骤(1)的产物中，搅拌反应30min，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得残余位点封闭的Fmoc-Pro-resin。
(3)带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-Phe-Pro-resin)
向步骤(2)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取芴甲氧羰酰基苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH，1.16g，3mmol)和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC，所得混合物加入到经脱保护后的步骤(2)的产物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Pro-resin。
(4)带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin)
向步骤(3)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.38g Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成的混合液，将混合液加入到脱保护后的线性二肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin。
(5)带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin)
向步骤(4)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.06g Fmoc-Ile-OH，和0.9gDEPBT(3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入DIEA(0.492ml，3mmol)形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性三肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，得到Fmoc-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin。
(6)带保护线性五肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin)
向步骤(5)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.01g的Fmoc-Pro-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性四肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin。
(7)带保护的线性六肽-树脂复合物(Fmoc-Phe-Pro-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin)
向步骤(6)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称1.16g Fmoc-Phe-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性五肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Pro-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin。
(8)带保护的线性七肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Phe-Pro-Ile-Tyr(tBu)-Phe-Pro-resin)
向步骤(7)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.06g Fmoc-Ile-OH和0.9g的DEPBT(3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.492ml DIEA形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性六肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液,得到Fmoc-Ile-Tyr(tBu)Phe-Pro-Ile-Phe-Pro-resin。
(9)树脂切割
向步骤(8)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
取20ml的2％三氟乙酸的DCM溶液，加入到脱保护后的线性七肽-树脂复合物中，搅拌反应30分钟，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到酪氨酸带tBu保护的线性七肽。
(10)肽链环合
将0.5mmol的步骤(9)中的酪氨酸带tBu保护的线性七肽溶解于1L的DCM中，加入3mmol的环合试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)，用DIEA调节pH＝8，室温下反应24小时，减压旋干，得到酪氨酸带tBu保护的环七肽。
(11)脱除酪氨酸带tBu的保护
将步骤(10)中得到的带保护的环七肽于50ml的圆底烧瓶，加入20ml的95％TFA/H2O溶液，搅拌反应1小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物提纯，得到白色固体环七肽Reniochalistatin C，产率75％，纯度99％以上。其核磁氢谱数据和核磁碳谱数据如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.21(s,2H),9.18(s,1H),7.37(d,J＝7.5Hz,2H),7.30(d,J＝2.1Hz,4H),7.28(s,1H),7.27(s,2H),7.24(s,2H),7.05–6.99(m,2H),6.67–6.63(m,2H),4.37(d,J＝4.7Hz,1H),4.35–4.27(m,2H),4.26–4.20(m,1H),4.13(q,J＝5.2Hz,2H),3.88(d,J＝8.7Hz,1H),3.77(d,J＝7.2Hz,1H),3.56(d,J＝13.4Hz,1H),3.17(d,J＝5.2Hz,3H),2.93(d,J＝6.2Hz,1H),2.89(s,1H),2.64(d,J＝12.7Hz,2H),1.91(s,2H),1.71(s,2H),1.24(s,4H),0.80(tt,J＝12.5,5.6Hz,12H),0.67(t,J＝7.1Hz,6H),0.30(d,J＝6.7Hz,3H)
13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.53,171.90,171.15,170.74,170.71,170.57,169.97,156.19,137.27,137.01,130.44,129.64,129.21,129.09,128.89,128.71,128.25,127.09,115.40,63.52,60.91,60.88,57.10,55.95,54.97,53.58,49.07,47.53,36.56,36.32,36.11,35.58,29.49,29.45,29.31,25.57,25.09,24.51,23.97,21.85,15.89,15.66,12.23,10.67
说明实施例3成功合成了Reniochalistatin C。
实施例4：ReniochalistatinD的合成
Reniochalistatin D的合成路线图如图4所示，具体包括以下步骤：
(1)芴甲氧羰酰基脯氨酸的树脂复合物(Fmoc-Pro-resin)
取1.00g的2-氯三苯基甲基氯树脂(负载量0.985mmol/g)于100ml的多肽合成管中，加入20ml的二氯甲烷(DCM)溶胀30分钟。抽干滤液，将芴甲氧羰酰基脯氨酸(Fmoc-Pro-OH，0.84g，3mmol)溶解于20ml的DCM中，然后加入到滤渣中，再向滤渣中加入1mL二异丙基乙胺(DIEA),搅拌反应4小时，抽干滤液，用二氯甲烷(DCM,10ml)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10ml)交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-resin。
(2)树脂上残余位点封闭
将10％二异丙基乙胺(DIEPA，2ml)的甲醇(MeOH，18ml)溶液加入步骤(1)的产物中，搅拌反应30min，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得残余位点封闭的Fmoc-Pro-resin。
(3)带保护的线性二肽-树脂复合物(Fmoc-Phe-Pro-resin)
向步骤(2)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.16g Fmoc-Phe-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC，所得混合物加入到经脱保护后的步骤(2)的产物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Pro-resin。
(4)带保护的线性三肽-树脂复合物(Fmoc-Ile-Phe-Pro-resin)
向步骤(3)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.06g Fmoc-Ile-OH和0.9g的DEPBT(3mmol)于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.492ml DIEA形成的混合液，将混合液加入到脱保护后的线性二肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液,得到Fmoc-Pro-Phe-Pro-resin。
(5)带保护的线性四肽-树脂复合物(Fmoc-Phe-Ile-Phe-Pro-resin)
向步骤(4)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称1.16g Fmoc-Phe-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性三肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Ile-Phe-Pro-resin。
(6)带保护线性五肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Phe-Ile-Phe-Pro-resin)
向步骤(5)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.01g的Fmoc-Pro-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性四肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Pro-Pro-Phe-Pro-resin。
(7)带保护的线性六肽-树脂复合物(Fmoc-Phe-Pro-Phe-Ile-Phe-Pro-resin)
向步骤(6)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称1.16g Fmoc-Phe-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性五肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Phe-Pro-Phe-Ile-Phe-Pro-resin。
(8)带保护的线性七肽-树脂复合物(Fmoc-Pro-Phe-Pro-Phe-Ile-Phe-Pro-resin)
向步骤(7)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
称取1.01g的Fmoc-Pro-OH和0.43g的Oxyma于50ml的三角锥形瓶中，加入10ml的DMF溶解后，再加入0.466ml的DIC形成混合液，将混合液加入到脱保护后的线性六肽-树脂复合物中，搅拌反应3小时，抽干滤液，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，得到Fmoc-Pro-Phe-Pro-Phe-Ile-Phe-Pro-resin。
(9)树脂切割
向步骤(8)的产物中加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液；为更彻底的脱除芴甲氧羰酰基(Fmoc)保护，可再次重复前面的步骤，即向抽干滤液后的滤渣中再次加入10ml的20％哌啶的DMF溶液，反应10分钟，分别用10ml的DCM、DMF交替冲洗3次，抽干滤液，即完成脱保护作用；
取20ml的2％三氟乙酸的DCM溶液，加入到脱保护后的线性七肽-树脂复合物中，搅拌反应30分钟，滤出切肽液，经减压旋干，加入过量的冰冻乙醚，白色固体析出，离心分离，真空干燥，得到线性七肽。
(10)肽链环合
将0.5mmol的步骤(9)中的线性七肽溶解于1L的DCM中，加入3mmol的环合试剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)，用DIEA调节pH＝8，室温下反应24小时，减压旋干，经高效液相色谱对粗产物提纯，得到白色固体环七肽Reniochalistatin D，产率87％，纯度99％以上。其核磁氢谱数据和核磁碳谱数据如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.04(s,1H),7.82(s,1H),7.43(d,J＝7.3Hz,2H),7.27(ddd,J＝24.4,12.2,7.0Hz,15H),4.71(s,1H),4.61(d,J＝11.1Hz,1H),4.44(d,J＝7.5Hz,1H),4.32(t,J＝7.2Hz,1H),4.19(s,1H),4.05(d,J＝8.7Hz,1H),3.89(q,J＝9.0,7.9Hz,3H),3.56(d,J＝8.0Hz,1H),3.36–3.16(m,5H),3.16–2.94(m,4H),2.72(d,J＝9.1Hz,1H),2.18(dt,J＝12.3,5.9Hz,2H),2.01(s,1H),1.90–1.69(m,6H),1.54(d,J＝18.7Hz,3H),0.98(p,J＝7.3,6.9Hz,1H),0.81–0.70(m,6H).
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ171.40,171.02,170.68,170.52,170.15,169.98,168.99,138.77,138.55,136.58,130.72,129.65,128.65,128.48,128.43,127.05,126.87,126.73,61.99,61.18,60.85,59.52,55.36,53.49,53.27,47.92,47.47,46.51,37.93,36.16,30.81,29.42,28.61,25.38,25.07,24.72,21.70,15.62,10.78
说明实施例4成功合成了Reniochalistatin D。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一类广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于主要包括以下步骤：
（1）向2-氯树脂中加入二氯甲烷溶胀30min，然后抽干滤液并加入芴甲氧羰酰基脯氨酸、二异丙基乙胺和溶剂二氯甲烷，搅拌反应4h，得带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物；
（2）向步骤（1）中得到的带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物中加入二异丙基乙胺的甲醇溶液，搅拌反应30min，使带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物的树脂上残余的反应位点封闭；
（3）将步骤（2）中得到的反应位点封闭的产物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂N,N-二甲基甲酰胺存在条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-2发生缩合反应，得到带Fmoc保护基的二肽-树脂复合物；
（4）将步骤（3）得到的带Fmoc保护基的二肽-树脂复合物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂N,N-二甲基甲酰胺存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-3发生缩合反应，得到三肽-树脂复合物；
（5）将步骤（4）所得产物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂N,N-二甲基甲酰胺存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-4发生缩合反应，得到四肽-树脂复合物；
（6）将步骤（5）所得产物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂N,N-二甲基甲酰胺存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-5发生缩合反应，得到五肽-树脂复合物；
（7）将步骤（6）所得产物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂N,N-二甲基甲酰胺存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-6发生缩合反应，得到六肽-树脂复合物；
（8）将步骤（7）所得产物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物在缩合试剂和溶剂N,N-二甲基甲酰胺存在的条件下与带Fmoc保护基的氨基酸-6发生缩合反应，得到七肽-树脂复合物；
（9）将步骤（8）所得产物用体积分数为20%的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除芴甲氧羰酰基保护，脱保护后的产物与体积分数为2%的TFA/DCM溶液反应以切断树脂，反应结束后将所得反应液纯化即得获得线性七肽;
（10）将步骤（9）所得的产物线性七肽溶于DCM中，然后加入环合试剂PyBOP，并用DIEA调节pH=8，发生环合反应，将环合反应后的反应液纯化即得目标产物环七肽；
当带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中有至少一个氨基酸带有别的非Fmoc的保护基团时，则在步骤（10）后还包括以下的步骤（11）：
（11）向步骤（10）的产物中加入体积分数为95%的TFA/H2O溶液，搅拌反应脱除非Fmoc的保护基团，反应结束后将所得反应液纯化即得目标产物；
当合成产物为Reniochalistatin A时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH；
当合成产物为Reniochalistatin B时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH；
当合成产物为Reniochalistatin C时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH；
当合成产物为Reniochalistatin D时，带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7依次对应为Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH；
当带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中的任意一种带Fmoc氨基保护基的氨基酸为芳香族氨基酸或脯氨酸时，其所对应的缩合试剂为Oxyma /DIC；
当所述的带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中的任意一种带Fmoc氨基保护基的氨基酸为非脯氨酸的脂肪族氨基酸时，所对应的缩合试剂为DEPBT/ DIEA;
步骤（1）中所述的2-氯树脂指2-氯三苯基甲基氯树脂。
2.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
当带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中的任意一种带Fmoc氨基保护基的氨基酸为芳香族氨基酸或脯氨酸时，其所对应的缩合试剂为Oxyma /DIC；此时对应的步骤（3）~（8）中所述的脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x和缩合试剂Oxyma/DIC的用量满足脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x、Oxyma和DIC的摩尔比为1:1-5:1-5:1-5；
当所述的带Fmoc氨基保护基的氨基酸-2、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-3、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-4、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-5、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-6、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-7中的任意一种带Fmoc氨基保护基的氨基酸为非脯氨酸的脂肪族氨基酸时，所对应的缩合试剂为DEPBT/ DIEA，此时对应的步骤（3）~（8）中所述的脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x和缩合试剂 DEPBT/ DIEA的用量满足脱保护后的产物、带Fmoc氨基保护基的氨基酸-x、DEPBT和DIEA的摩尔比为1:1-5:1-5:1-5；
步骤（3）-（8）中所述的缩合反应均指在20-29℃搅拌反应1.5-5h。
3.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（1）中所加入的2-氯树脂、芴甲氧羰酰基脯氨酸和二异丙基乙胺的用量满足2-氯树脂、芴甲氧羰酰基脯氨酸和二异丙基乙胺的用量比为1g:1-3mmol:1-3mmol；
步骤（1）中所用的2-氯树脂和二氯甲烷的用量满足每1g的2-氯树脂对应加入10-30 mL二氯甲烷;
步骤（2）中，所述的二异丙基乙胺的甲醇溶液是指二异丙基乙胺的甲醇溶液中二异丙基乙胺的体积百分数为10%；所述的带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物和二异丙基乙胺的甲醇溶液的用量满足每1mmol带Fmoc保护基的氨基酸-树脂复合物对应加入10-20ml二异丙基乙胺的甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（3）-（9）中所述的脱除芴甲氧羰酰基保护是指向每1mmol需要脱除芴甲氧羰酰基保护的原料中加入10-30ml的体积分数为20%的哌啶的DMF溶液，然后在室温下搅拌反应10min。
5.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（1）-（8）中所述的反应结束后均包括一个将所得反应液过滤，然后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替冲洗的纯化步骤。
6.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（9）中所述的反应是指在20-29℃搅拌反应30-60min；步骤（9）中所述的脱保护后的产物与三氟乙酸的二氯甲烷溶液的用量满足为每1mmol脱保护后的产物对应使用10-30ml的体积分数为2%的三氟乙酸的DCM溶液；
步骤（9）中所述的纯化是指将所得反应液过滤，所得滤液经减压旋干后加入过量的冰冻乙醚，有白色固体析出，离心分离后将所得白色固体真空干燥即得纯化后的线性六肽。
7.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（10）中所用的线性七肽和环合试剂的摩尔比为1:1-10；步骤（10）中所述的环合反应是指在20-29℃搅拌反应10-48h；
步骤（10）中所述的纯化是指将环合反应后的反应液减压旋干得粗产物，粗产物用高效液相色谱进行提纯。
8.根据权利要求1所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（11）中所述的步骤（10）的产物和体积分数为95%的TFA/H2O溶液的用量满足每1mmol步骤（10）的产物对应加入10-30ml 体积分数为95%的TFA/H2O溶液；所述的搅拌反应是指在20-29℃搅拌反应30-60min；
步骤（11）中所述的纯化是将反应液减压旋干后经高效液相色谱进行纯化。
9.根据权利要求1-8任一项所述的广泛活性环七肽Reniochalistatin A-D的合成方法，其特征在于：
步骤（1）-（11）中未指明温度的均指在20-29℃；步骤（1）-（11）中所述的搅拌反应均指在100-420r/min速度下搅拌反应。
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