CN107529532A - R9抗菌多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种R9抗菌多肽及其制备方法，具体的本发明公开了采用多肽固相合成法制备所述R9抗菌多肽，与之前的固相合成法相比，本发明中的方法可以将氨基酸连接至树脂的时间减少到6.5小时，大大缩短了制备的时间。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地本发明涉及一种抗菌多肽及其制备方法。
背景技术
抗菌多肽是一类具有抗菌活性的小分子多肽，分子量在2000～7000左右，由数个至数十个氨基酸残基组成。抗菌多肽与传统抗生素相比，具有不同的作用靶位点及作用时间，故不会使病原菌产生抗药性，可作为消灭“超级病菌”的药物。抗菌多肽杀菌机理主要是作用于细菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的C端插入膜内疏水区并改变膜的构象，多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗菌多肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡，亦有学者提出抗菌多肽是否存在特异性的膜受休及有无其它因子的协同作用等问题。不同类别的抗菌多肽的作用机理可能不一样。R9抗菌肽最早发表于Zhang,L.；Parente,J.；Harris,S.M.；Woods,D.E.；Hancock,R.E.W.；Falla,T.J.Antimicrobial Peptide Therapeutics for CysticFibrosis.Antimicrob.Agents Chemother.2005,49,2921-2927.，(文中代号HB146，是一种合成抗菌肽)对革兰氏阴性菌尤其是绿脓杆菌具有强杀菌活力。
抗菌多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。某些抗菌多肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。但是抗菌多肽在生物体内含量极微，从生物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这是制约抗菌多肽进入实际应用的最大障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种R9抗菌多肽及其制备方法。
本发明公开了R9抗菌多肽的合成方法，以Rink Amide AM树脂为载体，包括步骤一到步骤十二的氨基酸缩合反应，步骤十三将链接有13个氨基酸的树脂进行切割得到R9抗菌多肽。
本发明的第一方面，提供了一种制备R9抗菌多肽的方法，所述R9抗菌多肽的结构如式(I)所示：
Lys-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-NH2(I)；
所述方法采用多肽固相合成法(SPPS，solid phase peptide synthesis)制备所述R9抗菌多肽。
进一步地，所述多肽固相合成法中使用的多肽连接试剂选自2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯骈三唑中的一种或者多种。
进一步地，所述方法中采用Rink Amide AM树脂为载体进行多肽固相合成反应。
进一步地，所述多肽固相合成反应采用Fmoc法。
进一步地，所述Fmoc法中的脱芴甲氧羰基保护过程中加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(优选地，加入树脂1/4体积的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺)，并且在加热条件下进行反应；优选地，所述加热条件为采用水浴、油浴或者微波加热反应2-5分钟。
进一步地，所述多肽固相合成反应中每一次反应完成后均使用N,N-二甲基甲酰胺进行清洗2-3次。
进一步地，所述多肽固相合成反应中的氨基酸在树脂上的缩合反应均在50-90℃条件下进行反应；优选地，反应时间为10-30分钟。
进一步地，所述多肽固相合成反应中氨基酸缩合反应完成后进行切割反应前先以氮气吹干树脂。
进一步地，所述切割反应中添加的三氟乙酸的纯度为95％，切割温度是25℃，切割反应时间是1-2小时。
进一步地，在所述多肽固相合成反应之前，先对树脂进行溶胀处理；优选地，所述溶胀处理是以DCM浸泡芴甲氧羰基氨甲基树脂5-15分钟。
进一步地，所述多肽固相合成反应中，氨基酸的用量为树脂的摩尔量的两倍以上。
进一步地，在所述多肽固相合成反应中，多肽连接试剂的量是树脂的摩尔量的两倍以上。
附图说明
图1是R9抗菌多肽纯化后的HPLC表征图；
图2是R9抗菌多肽纯化后的质谱图；
图3是R9抗菌多肽结构式的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
表1氨基酸的缩写对照表
| 名称 | 三字母符号 | 单字母符号 |
| 丙氨酸 | Ala | A |
| 亮氨酸 | Leu | L |
| 赖氨酸 | Lys | K |
| 络氨酸 | Tyr | Y |
表2英文名或缩写与中文名的对照表
为了获得更高的产率，提高反应速率，反应更安全，本发明提供一种R9抗菌肽的合成方法，包括以下步骤：
步骤一、制备芴甲氧羰基-亮氨酸-氨甲基树脂：
将清洗、溶胀和脱芴甲氧羰基保护处理后的芴甲氧羰基氨甲基树脂与芴甲氧羰基-亮氨酸-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤二、制备芴甲氧羰基-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤一得到的芴甲氧羰基-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-亮氨酸-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤三、制备芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤二得到的芴甲氧羰基-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)(2-氯三苯基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤四、制备芴甲氧羰基-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤三得到的芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-丙氨酸-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤五、制备芴甲氧羰基-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤四得到的芴甲氧羰基-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-亮氨酸-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤六、制备芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤五得到的芴甲氧羰基-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤七、制备芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤六得到的芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤八、制备芴甲氧羰基-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤七得到的芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-亮氨酸-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤九、制备芴甲氧羰基-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤八得到的芴甲氧羰基-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-丙氨酸-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤十、制备芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤九得到的芴甲氧羰基-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤十一、制备芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤十得到的芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤十二、制备芴甲氧羰基-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤十一得到的芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-络氨酸(叔丁基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到芴甲氧羰基-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤十三、制备赖氨酸(2-氯三苯基)-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂：
将步骤十二得到的芴甲氧羰基-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，与芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-0H2在多肽连接试剂的条件下进行缩合反应，得到赖氨酸(2-氯三苯基)-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂；
步骤十四、制备芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-NH2：
将所述步骤十三得到的芴甲氧羰基-赖氨酸(2-氯三苯基)-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂脱芴甲氧羰基保护和清洗后，用三氟乙酸切割树脂，然后离心或者过滤得到赖氨酸-络氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-NH2，即R9抗菌多肽；
其中，多肽连接试剂选自2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯骈三唑中的一种或者多种。
进一步地，步骤一到十三中的脱芴甲氧羰基保护都是加入1/4体积的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，在水浴/油浴或者微波加热反应2-5分钟。
进一步地，步骤一到十三中的清洗都是用N,N-二甲基甲酰胺进行清洗2-3次，3-10mL/次。
进一步地，步骤一到十三中的氨基酸在树脂上的缩合反应都是通过水浴/油浴或者微波加热，在50-90℃下，反应10-30分钟。
进一步地，步骤十四在将赖氨酸(2-氯三苯基)-络氨酸(叔丁基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸(2-氯三苯基)-亮氨酸-亮氨酸-氨甲基树脂进行切割前先以氮气吹干。
进一步地，步骤十四中三氟乙酸的纯度为95％，切割温度是25℃，反应时间是1-2小时。
进一步地，步骤一中的溶胀是以DCM浸泡芴甲氧羰基氨甲基树脂5-15分钟。
本发明提供了一种高效，高产率的工艺合成方法，副产物更少，具有以下的优点：
通过水浴或者油浴以及微波对氨基酸在载体树脂上缩合时进行加热，每次缩合反应在10分钟至30分钟之间，Fmoc脱保护反应在2分钟至5分钟之间。之前的固相合成法中，都以常温进行，每一步缩合反应需要90分钟-120分钟；每一步Fmoc脱保护反应需要10分钟-15分钟。因此，之前的固相合成法，13步氨基酸的连接至少需要26小时的反应时间，而本发明中的方法可以将氨基酸连接至树脂的时间减少到6.5小时，大大缩短了制备的时间。
实施例1
1.制备Fmoc-Leu-Rink Amide-AM树脂：将800mLFmoc-Rink Amide-AM树脂(购自南开合成公司，货号：HCRAm05-1-1)用10mL DMF洗过两次(5mL DMF/次)；然后用DCM浸泡10分钟左右，使树脂充分溶胀，加入1/4体积的哌啶/DMF，以水浴/油浴或者微波加热，在50℃到60℃下反应2分钟，抽干，用15mL DMF洗三遍(5mL DMF/次)，加入用DMF溶解好的Fmoc-Leu-0H2、HObT和DIC的混合物5mL，以水浴/油浴或者微波加热，在50℃到70℃下反应15分钟左右，抽干，然后用15mL DMF洗三遍(5mL DMF/次)，就得到了Fmoc-Leu-Linker-AM树脂。Oxyma也可用HOBt代替，所用的氨基酸和缩合试剂的量是树脂的摩尔系数的两倍过量，以下过程相同。
2.制备Fmoc-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂,在上面的步骤后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Leu-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，就得到了Fmoc-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂
3.制备Fmoc-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂，在步骤2后，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Trt)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，就得到了Fmoc-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM
4.制备Fmoc-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂，在步骤3后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Ala-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂
5.制备Fmoc-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂，在步骤4后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Leu-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
6.制备Fmoc-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂树脂，在步骤5后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Trt)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM。
7.制备Fmoc-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂：在步骤6后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Trt)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
8.制备Fmoc-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂：在步骤7后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Leu-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
9.制备Fmoc-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-RinkAmide-AM树脂：在步骤8后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Ala-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
10.制备Fmoc-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂：在步骤9后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Trt)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
11.制备Fmoc-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂：在步骤10后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Trt)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
12.制备Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂：在步骤11后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Tyr(tBu)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂。
13.制备Fmoc-Lys(Trt)-Tyr(tBu)-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂：在步骤12后，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，加入用DMF溶解好的Fmoc-Lys(Trt)-0H2/Oxyma/DIC的混合物，在水浴/油浴或者微波加热下反应10-30分钟抽干，然后用DMF洗三遍，即得到Fmoc-Lys(Trt)-Tyr(tBu)-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂
14.制备Lys-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-NH2：把Fmoc-Lys(Trt)-Tyr(tBu)-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Ala-Leu-Lys(Trt)-Lys(Trt)-Leu-Ala-Lys(Trt)-Leu-Leu-Rink Amide-AM树脂，加入1/4体积的哌啶/DMF，在水浴/油浴或者微波加热下反应2分钟，抽干，用DMF洗三遍，以氮气吹干，加入95％的三氟乙酸，3％EDT，2％三异丙基硅烷的混合液在25℃左右进行切割，大概切割1.5个小时，把切割后的母液用冰甲叔丁基醚进行沉淀，然后过滤或者离心得到白色的固体，即得线性Lys-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-NH2。
纯化：以C18制备柱(公司及型号：Kromasil公司，C18，10um，3cm*25cm)，进行色谱纯化，以水-乙腈为流动相，梯度淋洗30分钟，将纯化组分冻干，得R9抗菌肽，产率可达50％以上。通过HPLC和质谱检测纯化后的产物(见图1和图2)，确定其为R9抗菌多肽。其结构如图3所示。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 兰州瑞贝药物研发有限公司
<120> R9抗菌多肽及其制备方法
<130> 01682-17001PIX
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Lys Tyr Lys Lys Ala Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Leu
1 5 10
Claims (10)
1.一种制备R9抗菌多肽的方法，其特征在于，所述R9抗菌多肽的结构如式(I)所示：
Lys-Tyr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Lys-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu-NH2 (I)；
其中，所述方法采用多肽固相合成法(SPPS，solid phase peptide synthesis)制备所述R9抗菌多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述多肽固相合成法中使用的多肽连接试剂选自2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯骈三唑中的一种或者多种。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法中采用Rink Amide AM树脂为载体进行多肽固相合成反应。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述多肽固相合成法采用Fmoc法。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述Fmoc法中加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，并且在加热条件下进行脱芴甲氧羰基保护反应。
6.如权利要求1所述的方法，其中，多肽固相合成反应中每一次反应完成后均使用N,N-二甲基甲酰胺进行清洗2-3次。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述多肽固相合成反应中的氨基酸在树脂上的缩合反应均在50-90℃条件下进行反应。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述多肽固相合成反应中氨基酸缩合反应完成后进行切割反应前先以氮气吹干树脂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述切割反应中添加的三氟乙酸的纯度为95％，切割温度是25℃，切割反应时间是1-2小时。
10.如权利要求1所述的方法，其中，在多肽固相合成反应之前，先对树脂进行溶胀处理。
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