CN108003223A - 一种抗菌肽fr-31及其应用 - Google Patents
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Abstract
本方案公开了生物技术领域的一种短肽，抗菌肽FR‑31，其氨基酸序列为：Phe‑Arg‑Ala‑Ser‑Gly‑Gln‑IIe‑Thr‑IIe‑Thr‑Val‑Lys‑Pro‑Arg‑Phe‑Arg‑Arg‑IIe‑Lys‑Arg‑Leu‑Phe‑Arg‑Gly‑Phe‑Arg‑Gly‑Arg‑Gln‑Val‑Leu。本发明抗菌肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有极好的抗菌作用，对真菌也有极好的抑菌效果。所以，本发明产品抗菌肽FR‑31在制备抗感染革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域的一种短肽，具体涉及一种抗菌肽FR-31及其应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码，核糖体合成的一类小分子活性多肽，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。AMPs作为一种生物活性小分子，普遍具有抗细菌、真菌、病毒、原虫等活性。另外，AMPs还可以作为药物传递载体，抗肿瘤剂，免疫调节剂以及信号分子等。
抗生素作为一类重要的抗感染类药物，广泛被应用与临床、畜牧业和水产养殖业等领域，但近年来，由于药物滥用药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，越来越多的国家开始寻求抗生素替代品，而AMPs因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊的作用机理，已成为最具潜力的抗生素替代品之一，同时在新型食品、药品、护肤品以及化妆品防腐剂和饲料添加剂等方面的应用也越来越广泛，具有良好的发展前景。
AMPs的相关研究最早可以追溯到1975年，当时瑞典科学家G.Bomam等在惜古比天蚕蛹中注入大肠杆菌，之后在其血液淋巴细胞中发现了一种具有抗菌活性的碱性多肽类物质，即抗菌肽Ceropins。经过四十几年的研究，目前已从动物、植物、细菌和病毒中发现了超过2500种抗菌肽。
虽然天然AMPs具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足。相当一部分天然的抗菌肽抑菌活性较低、稳定性较差、毒性较高，或者导致真核细胞发生溶血等；另外，部分AMPs对耐药菌的抑制效果差，不能满足实际应用的要求；而通过对天然AMPs进行改造或通过理性设计，合成全新的人工AMPs，可以在很大程度上改善以上某些甚至所有缺点，以适应不同应用需求。
发明内容
本发明意在提供一种对耐药菌具有较强抑制作用的抗菌肽FR-31。
为了达到上述目的，本发明提供如下基础技术方案：一种抗菌肽FR-31，所述抗菌肽FR-31的氨基酸序列为：
Phe-Arg-Ala-Ser-Gly-Gln-IIe-Thr-IIe-Thr-Val-Lys-Pro-Arg-Phe-Arg-Arg-IIe-Lys-Arg-Leu-P he-Arg-Gly-Phe-Arg-Gly-Arg-Gln-Val-Leu。
上述氨基酸序列的中文格式为：丙氨酸-精氨酸-丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-亮氨酸(SEQ ID NO.1)
本发明的抗菌肽FR-31中，F和R是短肽前两个氨基酸的缩写，31是氨基酸数，为本领域的常规命名方法。
本发明的抗菌肽不仅对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，而且对水产品中经常存在的副溶血弧菌和哈氏弧菌也有很好的抑菌效果，同时具有很低的溶血活性，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可作为抗生素替代品使用。
以下是对基础技术方案的优化：
优化方案一：所述抗菌肽FR-31为α螺旋直链多肽，含有31个氨基酸残基，分子量大小为3760.9Da，等电点13.23。
优化方案二，基于基础方案或者优化方案一：所述的抗菌肽FR-31在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或白色念珠菌感染的广谱抗菌药物中的应用。
优化方案三，基于基础方案或者优化方案一：所述的抗菌肽FR-31在制备抗菌剂中的应用。
因为本发明提供的抗菌肽FR-31具有较强的抑菌效果，而且对常见的大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌和四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，所以其可以用于制备抗菌剂和抗菌药物，以便于使用。
优化方案四，基于基础方案或者优化方案一：所述抗菌肽FR-31在制备饲料添加剂中的应用。因为本发明提供的抗菌肽FR-31对副溶血弧菌和哈氏弧菌也具有较强的抑制作用，而这两种病菌常存在与水产中，所以可以将抗菌肽FR-31添加到水产饲料中，通过喂食的过程对副溶血弧菌和哈氏弧菌的滋生繁殖进行有效的抑制，防止水产品感染，甚至患病死亡。
优化方案五，基于基础方案或者优化方案一：所述抗菌肽VK-21在食品添加剂或者化妆品防腐剂中的应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明技术方案作进一步说明：
对比例：以2017年11月24日公布的申请号为2017107796218的中国专利《一种抗菌肽VK-21及其应用》作为对比，该专利的抗菌肽的氨基酸序列为：
Val-Lys-Arg-Lys-Lys-Lys-Pro-Gln-Ser-Trp-Lys-Thr-Trp-Trp-Thr-Lys-Trp-Trp-Thr-Lys-Lys。
抗菌肽VK-21为α螺旋直链多肽，含有21个氨基酸残基，分子量大小为2845.46Da，等电点11.51。
该专利抗菌肽VK-21也可对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、四种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
实施例：本本发明抗菌肽FR-31产品为SEQ ID NO.1中的氨基酸序列，其序列为：Phe-Arg-Ala-Ser-Gly-Gln-IIe-Thr-IIe-Thr-Val-Lys-Pro-Arg-Phe-Arg-Arg-IIe-Lys-Arg-Leu-Phe-A rg-Gly-Phe-Arg-Gly-Arg-Gln-Val-Leu。
序列特征：长度为31，类型为氨基酸序列，链型为直链，人工合成。
本实施例抗菌肽FR-31产品是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相合成，最终得到的抗菌肽FR-31经高效液相色谱分析，其纯度≥98％。其具体的制备步骤如下：
1)树脂溶涨：称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min；
2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h，用DMF和DCM交替清洗6遍；
3)脱保护：加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min；
4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应；
5)洗：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
6)缩合：保护氨基酸Fmoc-L-Val-OH三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min；
7)洗：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
8)重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸；
9)最后一个氨基酸连接后，脱保护，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min；
10)从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS1％，将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温震荡，时间：120min；
11)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干，即得粗品肽序；
12)用HPLC(高效液相色谱)纯化多肽：
(1)取粗品肽200mg放入器皿中，用2-5ml50％的乙腈水溶液溶清，可以稍微超声2min。
(2)用0.45μm滤膜过滤溶解液；
(3)分析：取3μl用分析级HPLC分析粗品，流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％，结束比例水5％，乙腈95％；
(4)制备：将溶解好的样品，做进样准备，制备HPLC平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min；收集从检测器出来的样品；
(5)鉴定：将收集下来的样品，取样进行纯度和MS的鉴定；
13)将纯化后的溶液冻干，得到成品；
14)将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存；
抗菌肽FR-31的制备方法中，DCM指二氯甲烷，DIEA指N,N-二异丙基乙胺，DMF指N,N-二甲基甲酰胺，HBTU指苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，TFA指三氟乙酸，EDT指1,2-乙二硫醇，TIS指三异丙基硅烷。其中的用量取较优值，在本制备方法上通过对原料取用数值进行变换或者选取相似物对原料进行替换，进而获取抗菌肽FR-31，也应该视为本发明的保护范围。
验证试验一：
对抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21的最小抑菌浓度(MIC)进行测定：
分别将大肠杆菌(ATCC8739)，铜绿假单胞菌(CMCC10104)，金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，白色念珠菌(ATCC10231)培养对数期，用2×液体MHB培养基稀释至5×105CFU/mL。在96孔板中依次加入稀释成梯度的抗菌肽母液50μL，向各孔中加入已稀释好的菌液50μL，混匀后于37℃静置培养16小时，震荡后测定600nm处的光吸收值，以100μg/mL氨苄青霉素做阳性对照。结果判定：取检测不到细菌生长的孔作为最小抑菌浓度。结果如表所示。(ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写；中国医学细菌菌种保藏管理中心(CMCC)，两个保存典型菌种的中心)
表1抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21的抑菌效果
从上表可以看出，抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21均对革兰氏阴性和阳性菌都有抑菌效果，其中抗菌肽FR-31对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制效果最好，但是，对比可知实施例组的抗菌肽FR-31的MIC值均明显小于对比例组的抗菌肽VK-21，说明抗菌肽FR-31的抑菌效果比抗菌肽VK-21的抑菌效果更显著，可见本发明抗菌肽FR-31具有较好的研究开发价值。
验证试验二：
本发明产品抗菌肽FR-31的溶血活性检测：
1)采集新鲜的大鼠血液，待静置分层，去除上层血清，加入生理盐水，用吸管轻轻吹散管底的红细胞，1000rpm离心5min，用吸管小心吸取上层生理盐水并弃去，直至上清液没有红色。
2)取底部压实的红细胞2滴，加入2.0ml的等渗PBS重悬红细胞，配置成4％血红细胞悬液。
3)实验组：加入50μl不同浓度的，用等渗PBS溶解的抗菌肽，然后加入50μl配置好的4％血红细胞悬液。
4)阳性对照：每一个孔加入50μl 2％的tritonX-100，50μl配置好的4％血红细胞悬液。阴性对照：每一个孔加入50μl等渗PBS，50μl配置好的4％血红细胞悬液。
5)37℃孵育1h后，1 000g离心96孔板5min后，从各孔吸取50μl上清到96孔板中，415nm波长测定OD值，计算溶血百分比＝[(实验孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值)]×100。
结果表明，531.69μM浓度下，抗菌肽FR-31对红细胞的溶血率仅有6.7％，说明本发明抗菌肽FR-31对红细胞的参透脆性几乎可以忽略不计。
验证试验三：
分别以抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21对临床分离耐药菌株的抑菌活性测定：
采用前面MIC值测定方法，分别测定抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21对对四个不同病人分离到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的抑菌活性，结果见表2。
表2抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌效果
从上表2可以看出抗菌肽FR-31比抗菌肽VK-21对4株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的抑菌效果更好，具有良好的抗生素替代品药物研究开发价值。
验证试验四：
本发明产品抗菌肽FR-31对水产养殖业中常见致病菌的抑菌活性测定：
采用前面MIC值测定方法，分别测定抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21对水产养殖致病菌副溶血弧菌与哈氏弧菌菌株在盐浓度分别为0.5％与1％时的抑菌活性，结果见表3。
表3抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21对副溶血弧菌与哈氏弧菌的抑菌效果
从上表可以看出，抗菌肽FR-31和抗菌肽VK-21对水产养殖致病菌副溶血弧菌与哈氏弧菌菌株都有极好的抑菌效果，且抑菌效果几乎不受盐浓度影响，其中，抗菌肽FR-31比抗菌肽VK-21的抑菌效果更优，具有良好的抗生素替代品药物研究开发价值。
综上所述，本发明抗菌肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有极好的抗菌作用，对真菌也有极好的抑菌效果。所以，本发明产品抗菌肽FR-31在制备抗感染革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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<160> 1
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<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Phe Arg Ala Ser Gly Gln IIe Thr IIe Thr Val Lys Pro Arg Phe Arg
1 5 10 15
Arg IIe Lys Arg Leu Phe Arg Gly Phe Arg Gly Arg Gln Val Leu
20 25 30
Claims (6)
1.一种抗菌肽FR-31，其特征在于，所述抗菌肽FR-31的氨基酸序列为：Phe-Arg-Ala-Ser-Gly-Gln-IIe-Thr-IIe-Thr-Val-Lys-Pro-Arg-Phe-Arg-Arg-IIe-Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Gly-Phe-Arg-Gly-Arg-Gln-Val-Leu。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽FR-31，其特征在于：所述抗菌肽FR-31为α螺旋直链多肽，含有31个氨基酸残基，分子量大小为3760.9Da，等电点13.23。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽FR-31的应用，其特征在于：所述的抗菌肽FR-31在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或白色念珠菌感染的广谱抗菌药物中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的抗菌肽FR-31的应用，其特征在于：所述的抗菌肽FR-31在制备抗菌剂中的应用。
5.根据权利要求1或2所述的抗菌肽FR-31的应用，其特征在于：所述抗菌肽FR-31在制备饲料添加剂中的应用。
6.根据权利要求1或2所述的抗菌肽FR-31的应用，其特征在于：所述抗菌肽VK-21在食品添加剂或者化妆品防腐剂中的应用。
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