CN105237626A - 一种抗菌肽hjh-3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽HJH-3及其应用。所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列为缬氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸。该抗菌肽HJH-3为直链多肽，含有18个氨基酸残基，2077.52Da，等电点11.05。本发明产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。

Description

一种抗菌肽HJH-3及其应用

一、技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽HJH-3及其应用。

二、背景技术：

近年来，抗生素的滥用使药物残留和细菌耐药性问题日渐突出，严重威胁着畜牧业发展和人类健康，致使新型抗菌药物的研发变得更为迫切。抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)是生物机体在抵御病原微生物时产生的一类防御性小肽，是生物免疫防御系统的重要组成部分。与传统抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广，不易诱发细菌产生耐药性，不会产生药物过敏反应等优点，是目前国际上公认的抗生素最佳替代品。

然而，天然抗菌肽也并非是完美的，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在发挥抑菌效果的同时往往对正常的真核细胞也产生毒性，以及溶血作用，这都限制了抗菌肽的发展应用。因此，目前对抗菌肽的研究重点在于，通过对人工设计的一系列不同抗菌肽类似物的研究，探明其抑菌、细胞毒性、溶血活性的机制，从而为获得抑菌活性高、对正常真核细胞低毒甚至无毒性、无溶血性，高效、安全的抗菌肽奠定理论基础。

目前为止，发现的抗菌肽已有2000多种。已测定了几百种不同抗菌肽的氨基酸序列，这些抗菌肽在长度、结构、序列上各有明显的不同，抗菌肽大多由20～40个氨基酸残基组成，且其一级结构具有明显的特征即：肽链中间富含Pro，C端富含Gly、Val和Ala等非极性氨基酸，而N端多含Arg、Lys等极性的氨基酸。因此，他们都表现两个共同的特征：阳离子肽；活性结构为两亲性。目前对抗菌肽的作用机理还没有统一的认识；但是，大多数的理论都认为其作用机制与其阳离子性和疏水性有关。因此，为了获得安全、高效的抗菌肽，本发明主要根据氨基酸的离子性和疏水性，发明了一种抗菌肽HJH-3。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题是：提供一种抗菌肽HJH-3及其应用。本发明抗菌肽HJH-3含有18个氨基酸残基，不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

本发明提供一种抗菌肽HJH-3，所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列为缬氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸(SEQIDNO：1)。

根据上述的抗菌肽HJH-3，所述抗菌肽HJH-3为直链多肽，含有18个氨基酸残基，2077.52Da，等电点为11.05。

另外，提供一种上述的抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中的应用。

本发明的积极有益效果：

本发明产品抗菌肽HJH-3为直链多肽，含有18个氨基酸残基，2077.52Da，等电点11.05；并且本发明产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。

本发明抗菌肽HJH-3采用自动多肽合成仪进行固相化学合成法合成，合成方向是从C端到N端逐一进行，其制备的详细步骤如下：

a、树脂的溶涨：首先将Fmoc-Leu-Wangresin树脂加入自动多肽合成仪反应器内，并自动加入二甲基甲酰胺DMF进行溶涨，1gFmoc-Leu-Wangresin树脂加入DMF的量约为12mL(保证溶剂DMF能够完全浸没树脂)，溶涨时间为10～30min(溶涨可重复1～2次)；

b、脱保护：树脂溶涨后，按照设定将储罐内的20％哌啶(20％哌啶的配制方法：哌啶溶于二甲基甲酰胺DMF中配制而成的)自动加入到反应器内浸没溶涨后的树脂(1gFmoc-Leu-Wangresin树脂需要加入20％哌啶约为10mL)，使其溶涨后的树脂进行脱保护(脱保护的时间约为30min)，脱保护后自动加入二甲基甲酰胺进行洗涤；

c、接着按照抗菌肽HJH-3氨基酸序列的排序自动加入第二种氨基酸组氨酸Fmoc-His，并自动加入缩合剂HCTU(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂NMM或DIEA(NMM中文名称为N-甲基吗啡啉，DIEA中文名称为N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后自动加入二甲基甲酰胺DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸；

所述组氨酸与Fmoc-Leu-Wangresin树脂的摩尔比为5:1；所述缩合剂HCTU与组氨酸Fmoc-His二者之间的摩尔比为1:1；所述催化剂NMM或DIEA与组氨酸二者之间的摩尔比为4:1；

洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依照步骤c上述同样方法依次自动加入氨基酸Fmoc-Ser、Fmoc-Arg、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Ser、Fmoc-His、Fmoc-Ser、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys、Fmoc-Pro、Fmoc-Asn-和Fmoc-Val进行缩合反应、洗涤，最后一个氨基酸缩合反应、洗涤后，得到多肽产物；每次缩合反应、洗涤后所得产物均按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，然后自动加入下一个氨基酸进行缩合反应、洗涤(每次缩合反应中，所加入氨基酸与Fmoc-Leu-Wangresin树脂的摩尔比均为5:1；所述缩合剂HCTU与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为1:1；所述催化剂NMM或DIEA与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为4:1)；

d、多肽产物的脱保护和裂解：在步骤c所得多肽产物中自动加入20％哌啶到反应器内浸没多肽产物(对1g树脂进行脱保护使用20％哌啶的量约为10mL)，使其多肽产物进行脱保护，脱保护后依次自动加入二甲基甲酰胺DMF、二氯甲烷DCM进行反复洗涤；

洗涤后自动加入三氟乙酸TFA进行裂解(对1g树脂进行裂解使用的裂解液TFA的体积约为20mL)，通过裂解使得多肽从树脂上裂解下来，裂解后进行过滤(使用砂心漏斗进行过滤)，得到滤液；

e、合成多肽的沉淀：

裂解过程结束后，为从三氟乙酸(TFA)裂解后得到的滤液中得到合成的多肽产物，采用冷乙醚对所得滤液进行洗涤离心沉淀的方法，其具体操作过程为：在步骤d得到的滤液中加入3倍体积4℃保存的冷乙醚，密封后颠倒混匀，冰浴10min，在4000r/m下离心10min，回收剩余沉淀，弃上清液体；重取4℃保存的冷乙醚重悬沉淀；上述步骤反复三次，然后将所得沉淀干燥12～16h，得到合成肽粗品；

f、合成肽粗品的纯化：采用半制备型高效液相色谱仪为P2000对合成肽粗品进行过柱纯化，收集纯度≥95％的馏分，即得到纯化后的抗菌肽HJH-3，其产品纯度抗菌肽HJH-3的纯度≥95％(详见附图1分析)。

半制备型高效液相色谱仪为P2000是由北京沃华创新科技有限公司提供，其色谱柱为C18反相柱(4.6*250mm)，洗脱液(流动相)为A溶液0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1mL的三氟乙酸定容到100mL乙腈溶液中)和B溶液0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1mL的三氟乙酸定容到100mL去离子水中)，使用上述处理柱，上样后25min内A溶液的比例由27％逐步调至52％，B溶液的比例由73％逐步调至48％，25.1min时，A溶液的比例变为100％，B溶液变为0％，以1mL/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm，收集纯度≥95％的馏分(详见附图1所示)；

本发明所得抗菌肽HJH-3产品的确认鉴定：

(1)采用分析型液相色谱质谱联用仪(WatersmicromassZQ-2000)测定所得产品抗菌肽HJH-3的分子量，经测定：其分子量为2077.52Da，结果详见附图2。

质谱测定条件：采用正离子化模式，其毛细管电压为3.00KV，毛细管出口电压50V，碎裂电压为5V，干燥气流量为1.5L/min，干燥气温度为350℃，扫描范围为400～1900m/z。

(2)氨基酸序列结构测定：采用自动氨基酸测序仪测定本发明产品抗菌肽HJH-3的氨基酸序列结构，经测定：HJH-3是直链多肽，含有18个氨基酸残基；HJH-3的全序列为：缬氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸(即Val-Asn-Pro-Lys-Leu-Leu-Ser-His-Ser-Leu-Leu-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-His-Leu)。

(3)等电点分析：

打开DNAStar软件中的EditSeq，打开file，点击“new”中的“newprotein”，输入本发明产品HJH-3的氨基酸序列，即可以获得等电点数据。经分析：HJH-3抗菌肽类似物的等电点为11.05。

四、附图说明：

图1本发明抗菌肽HJH-3产品的高效液相色谱图；

图2本发明抗菌肽HJH-3产品的质谱图；

图3本发明抗菌肽HJH-3产品临床分离耐药菌株的抑菌活性测定图；

图4本发明抗菌肽HJH-3产品的细菌形态结构影响分析图。

图4中：a、b、c分别为对数生长期的正常培养大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的电镜扫描图；A、B、C分别为抗菌肽HJH-3作用后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的电镜扫描图。

五、具体实施方式：

以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：

本发明抗菌肽HJH-3产品为SEQIDNO:1中的氨基酸序列，其序列为：Val-Asn-Pro-Lys-Leu-Leu-Ser-His-Ser-Leu-Leu-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-His-Leu。

序列特征：长度为18，类型为氨基酸序列，链型为直链，人工合成。

本实施例抗菌肽HJH-3产品是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相法合成，最终得到的抗菌肽HJH-3经高效液相色谱分析，其纯度≥95％。

实施例2：本发明产品抗菌肽HJH-3的应用实施：

本发明所得产品抗菌肽HJH-3抗菌活性的检测：

1、抗菌肽HJH-3对标准菌株抑菌活性测定：

实验材料：受试菌株为大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90029(受试菌株均购自南京便诊生物科技有限公司)，采用平板扩散法测定人工合成的抗菌肽HJH-3的抑菌活性。

将上述3种测试菌种涂布在已灭菌的含营养物质的下层琼脂培养基【琼脂培养基是由10mL胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤(购自北京索莱宝科技有限公司)、10g琼脂(sigmaA-6013)和1L蒸馏水配制而成，其pH7.2)】上，用打孔器打孔，孔径约2mm，酒精灯稍加热使琼脂融化封底，用移液器向每孔中加入5μL、浓度为0.8μg/mL的本发明合成的抗菌肽HJH-3；阳性对照采用通用的抗生素：多粘霉素B(购自北京索莱宝科技有限公司)针对革兰阴性菌，尼生素(购自北京索莱宝科技有限公司)针对革兰阳性菌，制霉素(购自北京索莱宝科技有限公司)针对白色念珠菌；阴性对照采用灭菌蒸馏水。

将平板静置1h，以使测试液扩散入琼脂中。然后，再添加一层琼脂培养基(50℃左右，营养成分同下层培养基)，平板在37℃培养过夜，记录孔周边的透明圈的直径，每个菌种重复测定三次，计算平均值，结果详见表1。

表1抗菌肽类似物HJH-3抗菌活性分析结果

由表1抗菌活性检测结果显示：本发明产品抗菌肽HJH-3对上述三种测试菌种都具有较强的抗菌活性。因此，本发明产品抗菌肽HJH-3可望在治疗动物细菌性疾病和真菌性疾病药物方面有着很好的应用前景；根据已知抗菌肽的一般特性，抗菌肽类似物HJH-3在抗菌药物的应用以及饲料防霉和牛奶保鲜等方面也具有一定的应用潜能。

2、抗菌肽HJH-3最小抑菌浓度的测定：

测试菌株在TSB液体培养基(购自Solarbio公司即北京索莱宝科技有限公司)中过夜扩大培养，并在OD₆₀₀处测定培养菌液的OD值，当菌液的OD值达到0.6～0.8时，将培养的菌液在6000r/min条件下离心10min，离心后弃上清，收集菌体沉淀，然后用等体积0.01MPBS重悬细菌；再用MH培养基将待测细菌液稀释到2×10⁶CFU/ml。用去离子水稀释抗菌肽溶液浓度为31.25μg/ml～2mg/ml。于细胞培养板，各孔分别添加50μl不同浓度抗菌肽HJH-3稀释液和50μl稀释菌液，每个浓度重复实验3个孔，37℃培养16～20h，以小孔内细菌完全不生长的浓度(肉眼未见孔底部有混浊现象)即为抗菌肽HJH-3最小抑菌浓度，结果详见表2。

表2不同浓度下细菌生长情况

注：“-”表示没有细菌生长；“+”表示有细菌生长

由表2可以看出：本发明产品抗菌肽HJH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度分别0.25mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL。

本发明产品抗菌肽HJH-3的溶血活性检测：

取新鲜牛血液50mL，在3000rpm下离心20min，弃上清，以等渗PBS缓冲液洗涤红细胞，反复离心三次，至上清为无色、透明，制备成牛红细胞悬液；取1.5mL离心管5只，编号1～5；1～3号管分别添加本发明抗菌肽HJH-3干粉2mg、1mg、0.5mg，各管分别添加0.01MPBS(pH7.2)缓冲液800μL。4号管添加800μLPBS缓冲液，为阴性对照组；5号管添加800μL、浓度为1％的TritonX-100去离子水稀释液(可使红细胞完全溶血)，为阳性对照组。1～5每管添加200μL红细胞悬液。静置3h后，将1～5管在1500r/min条件下离心10min，分别取上清150μL至微量板进行吸光度测定；其中，对阳性样品进行全波长扫描，以确定牛血红蛋白最大吸收波长。并以最大吸收波长测定各样品吸收值，计算公式HD＝(A样-A阴)/(A阳-A阴)×100％计算溶血度。

结果显示：血红蛋白在414nm波长处出现明显的吸收峰。采用红细胞计数法对使用的红细胞进行计数，结果显示红细胞的浓度为4.8×10¹³个/ml，抗菌肽浓度为2mg/mL的条件下，抗菌肽HJH-3红细胞的溶血率与阴性对照的溶血率相当，说明本发明所得抗菌肽HJH-3对红细胞的渗透脆性可以忽略不计。

本发明产品抗菌肽HJH-3临床分离耐药菌株的抑菌活性测定：

采用平板扩散法测定人工合成的抗菌肽HJH-3的抑菌活性(受试菌株为本实验从临床中分离的抗大肠杆菌耐药菌株(庆大霉素、氟苯尼考高耐菌株)、金黄色葡萄球菌耐药菌株(甲氧西林高耐菌株))。测试方法同上述抗菌活性检测方法。检测结果详见附图3。

由图3可知：使用5μL、1μg/mL的合成抗菌肽HJH-3能明显抑制上述两种耐药菌株的生长。

本发明产品抗菌肽HJH-3的细菌形态结构影响的观察：

抗菌肽HJH-3作用后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌三种菌悬液的配制：根据上述抗菌肽HJH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度分别为0.25mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/mL，采用pH7.2、10mM的PBS缓冲液将抗菌肽HJH-3分别配制对应的3×0.25mg/mL、3×0.25mg/mL和3×0.5mg/mL的三种抗菌肽HJH-3溶液，即针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌三种菌体，采用pH7.2、10mM的PBS缓冲液将抗菌肽HJH-3分别配制成对应的0.75mg/mL、0.75mg/mL和1.5mg/mL三种抗菌肽溶液；然后分别吸取2mL新鲜培养至对数期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，将三种菌体分别在6000r/min条件下离心15min，离心后所得三种菌体用对应等体积0.75mg/mL、0.75mg/mL和1.5mg/mL的三种抗菌肽溶液进行重新悬浮，悬浮后的三种菌体在37℃条件下孵育30min，得到三种抗菌肽HJH-3作用后的大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和白色念珠菌菌悬液；

以正常生长、不添加抗菌肽的三种细菌(即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)为正常对照；取三种对数生长期的正常培养细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌以及抗菌肽HJH-3作用后的三种菌悬液各3mL，首先在3000r/min条件下离心5min，弃上清；然后分别采用pH7.2、10mM的PBS缓冲溶液洗涤菌体三次，最后分别采用3mL、5％的戊二醛溶液重新悬浮，悬浮后所得菌体分别在4℃条件下固定24h；然后分别在3000r/min条件下离心10min，收集菌体沉淀，接着分别采用30％～100％PBS溶液稀释的乙醇进行梯度脱水(每次脱水时间为20min)，100％的乙醇脱水两次(每次脱水时间为20min)，最后一次脱水完成后，将所得菌液分别滴加在圆形盖玻片上，然后进行真空冷冻干燥，干燥后经离子溅射仪溅射金，最后于扫描电镜下观察样品表面结构变化，详见附图4。

由附图4可知：与正常的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌形态结构相比，经过血红蛋白抗菌肽处理的各种细菌发生较大的变化：大肠杆菌形态发生弯曲、变形、细胞膜出现孔洞结构；金黄色葡萄球菌细胞膜发生明显的破碎，且细菌大小发生不均匀的变化，细胞膜的完整性受到破坏；白色念珠菌细胞膜表面发生皱缩、脱落，细胞发生裂解。由此可以表明，本发明产品抗菌肽HJH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有高效的抗菌作用。

综上所述，本发明多肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中能够得到较佳的应用。

Claims (3)

1.一种抗菌肽HJH-3，其特征在于：所述抗菌肽HJH-3的氨基酸序列为缬氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-精氨酸-丝氨酸-组氨酸-亮氨酸(SEQIDNO：1)。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽HJH-3，其特征在于：所述抗菌肽HJH-3为直链多肽，含有18个氨基酸残基，2077.52Da，等电点为11.05。

3.一种权利要求1所述的抗菌肽HJH-3在制备抗感染革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病药物中的应用。