CN105175509A - 一种抗菌肽xyz-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽XYZ-1，所述抗菌肽XYZ-1为直链多肽，含有19个氨基酸残基，分子量为2288.81Da，等电点为10.83，其氨基酸序列为精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸(SEQ？ID？NO.1)。本发明的抗菌肽XYZ-1不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用，因此，在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病感染的药物中能够得到较佳的应用，其临床应用效果较佳，而且还可以用于制备饲料添加剂或食品添加剂。

Description

一种抗菌肽XYZ-1及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽XYZ-1及其应用。

背景技术

抗菌肽是(Antimicrobialpeptides，AMPs)是生物机体在抵御病原微生物时产生的一类防御性小肽，是生物免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽除了具有广谱的抗菌(革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌)活性外，还对真菌、病毒和寄生虫等具有极强的杀灭能力。与传统抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广，不易诱发细菌产生耐药性，不会产生药物过敏反应等优点，是目前国际上公认的抗生素最佳替代品。

然而，天然抗菌肽也并非是完美的，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在发挥抑菌效果的同时往往对正常的真核细胞也产生毒性，以及溶血作用，这都限制了抗菌肽的发展应用。因此，目前对抗菌肽的研究重点在于，通过对人工设计的一系列不同抗菌肽类似物的研究，探明其抑菌、细胞毒性、溶血活性的机制，从而为获得抑菌活性高、对正常真核细胞低毒甚至无毒性、无溶血性，高效、安全的抗菌肽奠定理论基础。

目前为止，发现的抗菌肽已有2000多种。已测定了几百种不同抗菌肽的氨基酸序列，这些抗菌肽在长度、结构、序列上各有明显的不同，抗菌肽大多由20～40个氨基酸残基组成，且其一级结构具有明显的特征即：肽链中间富含Pro，C端富含Gly、Val和Ala等非极性氨基酸，而N端多含Arg、Lys等极性的氨基酸。因此他们都表现两个共同的特征：阳离子肽；活性结构为两亲性。目前对抗菌肽的作用机理还没有统一的认识；但是，大多数的理论都认为其作用机制与其阳离子性和疏水性有关。因此，为了获得安全、高效的抗菌肽，本发明主要根据氨基酸的离子性和疏水性，发明了一种抗菌肽XYZ-1。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种抗菌肽XYZ-1及其应用。本发明抗菌肽XYZ-1不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明的抗菌肽XYZ-1在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾病感染的药物中能够得到较佳的应用，其临床应用效果较佳。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

本发明提供一种抗菌肽XYZ-1，所述抗菌肽XYZ-1的氨基酸序列为精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸(SEQIDNO.1)。

根据上述的抗菌肽XYZ-1，所述抗菌肽XYZ-1为直链多肽，含有19个氨基酸残基，分子量为2288.81Da，等电点为10.83。

本发明还提供一种抗菌肽XYZ-1在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌感染的药物中的应用。

另外，本发明还提供了一种抗菌肽XYZ-1在制备饲料添加剂或食品添加剂中的应用。

本发明所述的抗菌肽XYZ-1采用自动多肽合成仪进行固相化学合成法合成，合成方向是从C端到N端逐一进行，其制备的详细步骤如下：

a、树脂的溶涨：首先将Fmoc-Lys-Wangresin树脂加入自动多肽合成仪反应器内，并自动向反应器内加入DMF(二甲基甲酰胺)溶剂，对树脂进行溶胀处理；其中，对1g树脂进行溶胀需加入DMF的量约为12mL，保证DMF溶剂能够浸没树脂，溶涨时间为10～30min(溶涨可重复1～2次)；

b、脱保护：树脂溶涨后，按照设定将储罐内的20％哌啶(20％哌啶是将哌啶溶于DMF中配制而成的)自动加入到反应器内浸没溶涨后的树脂，对溶涨后的树脂进行脱保护，脱保护后自动加入DMF进行反复洗涤；其中，对1gFmoc-Lys-Wangresin树脂脱保护需要加入20％哌啶的量约为10mL，脱保护的时间为30min；

c、接着按照抗菌肽XYZ-1氨基酸序列的排序自动加入第二种氨基酸精氨酸(Fmoc-Arg)，并自动加入缩合剂HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)和催化剂的NMM(N-甲基吗啡啉)或DIEA(N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后自动加入DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸；洗涤后所得产物按照与步骤b相同的方法进行脱保护、洗涤处理；其中，所述Fmoc-Arg与Fmoc-Lys-Wangresin树脂的摩尔比为5:1；所述缩合剂HBTU与Fmoc-Arg二者之间的摩尔比为1:1；所述催化剂NMM或DIEA与Fmoc-Arg二者之间的摩尔比为4:1；

依照步骤c上述的同样方法依次自动加入氨基酸Fmoc-Gly、Fmoc-Val、Fmoc-Cys、Fmoc-Val、Fmoc-Cys、Fmoc-Pro、Fmoc-Arg、Fmoc-Arg、Fmoc-Arg、Fmoc-Cys、Fmoc-Tyr、Fmoc-Cys、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg、Fmoc-Gly、Fmoc-Gly和Fmoc-Arg进行缩合反应、洗涤，最后一个氨基酸缩合反应、洗涤后，得到多肽产物(其中，每次缩合反应、洗涤后所得产物均按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，然后自动加入下一个氨基酸进行缩合反应、洗涤)；

d、多肽产物的脱保护和裂解：向所得多肽产物中自动加入20％哌啶对多肽产物进行脱保护处理，脱保护后依次自动加入DMF、DCM(二氯甲烷)进行反复洗涤；其中，对1g树脂进行脱保护需加入20％哌啶的量约为10mL，保证哌啶能够浸没多肽产物；

洗涤后自动加入三氟乙酸TFA进行裂解(对1g树脂进行裂解使用的裂解液TFA的体积约为20mL)，通过裂解使得多肽从树脂上裂解下来，裂解后进行过滤(使用砂心漏斗进行过滤)，得到滤液；

e、合成多肽的沉淀：裂解过程结束后，为从三氟乙酸(TFA)裂解后得到的滤液中得到合成的多肽产物，采用冷乙醚对所得滤液进行洗涤离心沉淀的方法，其具体操作过程为：在步骤d得到的滤液中加入3倍体积4℃保存的冷乙醚，密封后颠倒混匀，冰浴10min，在4000r/m下离心10min，回收剩余沉淀，弃上清液体；重取4℃保存的冷乙醚重悬沉淀；上述步骤反复三次，然后将所得沉淀干燥12～16h，得到合成肽粗品；

f、合成肽粗品的纯化：采用半制备型高效液相色谱仪P2000对合成肽粗品进行过柱纯化，收集纯度≥95％的馏分，既得到纯化后的抗菌肽XYZ-1，其纯化结果见附图1；其中，色谱条件为：色谱柱为C18反相柱(4.6*250mm)，洗脱液为A溶液和B溶液，其中，A溶液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1％的三氟乙酸乙腈溶液是将0.1ml的三氟乙酸定容到100mL乙腈溶液中配制而成)，B溶液为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1％的三氟乙酸水溶液是将0.1ml的三氟乙酸定容到100mL去离子水中配制而成)，使用上述处理柱，上样后25min内A溶液的比例由10％逐步调至35％，B溶液的比例由90％逐步调至65％，25.1min时，A溶液的比例变为100％，B溶液变为0％，以为1ml/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm，收集纯度≥95％的馏分。

上述方法中所用到的试剂说明如下：

Fmoc-Lys-Wangresin(树脂的取代值为0.3～0.8mmol/g，粒度为100～200目)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、Fmoc-Gly、Fmoc-Val、Fmoc-Cys、Fmoc-Pro、Fmoc-Arg、Fmoc-Tyr和Fmoc-Leu均购自上海吉尔生化有限公司；二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、乙酸酐、哌啶、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、N-甲基吗啡啉(NMM)和N,N二异丙基乙胺(DIEA)购自国药集团化学试剂有限公司。

本发明的积极有益效果：

本发明产品抗菌肽XYZ-1为直链多肽，含有19个氨基酸残基，2288.81Da，等电点10.83；并且本发明产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽XYZ-1在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌感染的药物中能够得到较佳的应用，其临床应用效果较佳；而且本发明的抗菌肽XYZ-1还可以用于制备饲料添加剂或食品添加剂。

附图说明

图1本发明抗菌肽XYZ-1产品的高效液相色谱图；

图2本发明抗菌肽XYZ-1产品的质谱图；

图3本发明抗菌肽XYZ-1产品临床分离耐药菌株的抑菌活性检测结果图；

图4为本发明抗菌肽XYZ-1作用后的菌体形态结构电镜扫描图(其中，a，b，c分别为对数生长期的正常培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌体形态结构电镜扫描图；A，B，C分别为对数生长期的抗菌肽XYZ-1作用后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌体形态结构电镜扫描图)。

具体实施方式

以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：

一种抗菌肽XYZ-1，所述抗菌肽XYZ-1的氨基酸序列为精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸(SEQIDNO.1)。

所述抗菌肽XYZ-1为直链多肽，含有19个氨基酸残基，分子量为2288.81Da，等电点为10.83。

本实施例抗菌肽XYZ-1产品是采用自动多肽合成仪按照常规固相法合成，最终得到的抗菌肽XYZ-1经半制备型高效液相色谱仪进行纯化分析处理，其纯度为95％。

本发明所得抗菌肽XYZ-1产品的鉴定：

(1)分子量测定：采用液相色谱质谱联用仪(WatersmicromassZQ-2000)测定抗菌肽XYZ-1的分子量大小，具体的检测条件为：①色谱条件：色谱柱为C18反相柱(4.6*250mm)，洗脱液为A溶液和B溶液，其中，A溶液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1％的三氟乙酸乙腈溶液是将0.1ml的三氟乙酸定容到100mL乙腈溶液中配制而成)，B溶液为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1％的三氟乙酸水溶液是将0.1ml的三氟乙酸定容到100mL去离子水中配制而成)，使用上述处理柱，上样后25min内A溶液的比例由10％逐步调至35％，B溶液的比例由90％逐步调至65％，25.1min时，A溶液的比例变为100％，B溶液变为0％，以为1ml/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm，收集纯度≥95％的馏分；②质谱条件：离子源为电喷雾电离(ESI)离子源，正离子方式检测，质量扫描范围m/z400～1900，干燥气流量为1.5L/min，干燥气温度350℃，喷雾电压3000V，裂解电压5V。

经过检测，抗菌肽XYZ-1的分子量为2288.81Da，结果详见附图2。

(3)氨基酸序列结构测定：采用自动氨基酸测序仪测定抗菌肽XYZ-1的氨基酸序列结构。经测定，抗菌肽XYZ-1是直链多肽，含有19个氨基酸残基；抗菌肽XYZ-1的氨基酸序列为：精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸。

(4)等电点分析：

打开DNAStar软件中的EditSeq，打开file，点击“new”中的“newprotein”，输入抗菌肽XYZ-1的氨基酸序列，即可以获得等电点数据。经测定，抗菌肽XYZ-1的等电点为10.83。

实施例2：本发明抗菌肽XYZ-1的应用实施

1、本发明抗菌肽XYZ-1抗菌活性的检测：

(1)抗菌肽XYZ-1对标准菌株抑菌活性测定：

实验材料：受试菌株为大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90029，购自南京便诊生物科技有限公司，采用琼脂平板扩散法测定人工合成的抗菌肽XYZ-1的抑菌活性。

将上述3种测试菌株涂布在已灭菌的含营养物质的下层琼脂培养基上，用打孔器打孔，孔径约2mm，酒精灯稍加热使琼脂融化封底，用移液器向每孔中加入5μL浓度为0.8μg/mL的本发明合成的抗菌肽XYZ-1；阳性对照采用通用的抗生素：多粘霉素B(针对革兰阴性菌)、尼生素(针对革兰阳性菌)和制霉素(针对白色念珠菌)；阴性对照采用灭菌蒸馏水；其中，所述下层琼脂培养基是由10mL胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤、10g琼脂和1L蒸馏水配制而成，其pH7.2。将平板静置1h，以使测试液扩散入琼脂中。然后，再添加一层琼脂培养基(50℃左右，营养成分同下层琼脂培养基)，平板在37℃培养过夜，记录孔周边的透明圈的直径，每个菌种重复测定三次，计算平均值，结果详见表1。

表1抗菌肽XYZ-1抗菌活性分析结果

由表1抗菌活性检测结果显示：本发明产品抗菌肽XYZ-1对上述三种测试菌种都具有较强的抗菌活性。因此，抗菌肽XYZ-1可望在制备治疗动物细菌性疾病和真菌性疾病的药物方面有着很好的应用前景；根据已知抗菌肽的一般特性，抗菌肽XYZ-1在抗菌药物的应用以及饲料防霉和牛奶保鲜等方面也具有一定的应用潜能。

(2)抗菌肽XYZ-1最小抑菌浓度的测定：

测试菌株在TSB液体培养基中过夜扩大培养，并在OD₆₀₀处测定培养菌液的OD值，当菌液的OD值达到0.6～0.8时，将培养的菌液于6000r/min离心10min，离心后弃上清，收集菌体沉淀，然后先用等体积的0.01MPBS缓冲液(pH7.2)重悬菌体，再用MH培养基将待测菌液稀释到2×10⁶CFU/ml。用去离子水将抗菌肽XYZ-1溶液的浓度稀释为31.25μg/ml～2mg/ml。于细胞培养板，各孔分别添加50μl不同浓度抗菌肽XYZ-1稀释液和50μl稀释菌液，每个浓度重复实验3个孔，37℃培养16～20h，以小孔内菌体完全不生长的浓度(肉眼未见孔底部有混浊现象)即为抗菌肽XYZ-1最小抑菌浓度，结果详见表2。

表2不同浓度的抗菌肽下细菌生长情况

注：“-”表示没有菌体生长；“+”表示有菌体生长

由表2可以看出：本发明产品抗菌肽XYZ-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度分别0.25mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL。

2、本发明产品抗菌肽XYZ-1的溶血活性检测：

取新鲜牛血液50mL，在3000rpm下离心20min；弃上清，以等渗PBS缓冲液(pH7.2)洗涤红细胞，反复离心三次，至上清为无色、透明，制备成牛红细胞悬液；取1.5mL离心管5只，编号1～5；1～3号管分别添加本发明抗菌肽XYZ-1干粉2mg、1mg、0.5mg，并分别加入800μl0.01MPBS缓冲液(pH7.2)。4号管添加800μlPBS缓冲液(pH7.2)，为阴性对照组；5号管添加800μl浓度为1％的TritonX-100去离子水稀释液(可使红细胞完全溶血)，为阳性对照组。1～5每管添加200μL红细胞悬液，室温静置3h；然后将1～5管于1500r/min离心10min，分别取上清150μL至微量检测板进行吸光度测定；其中，首先对阳性样品进行全波长扫描，以确定牛血红蛋白最大吸收波长，然后以最大吸收波长测定各上清样品的吸收值，然后根据计算公式HD＝(A样-A阴)/(A阳-A阴)×100％计算溶血度。

结果显示：红细胞的浓度为4.8×10¹³个/ml，抗菌肽浓度为2mg/mL的条件下，抗菌肽XYZ-1红细胞的溶血率为4.65％，与阴性对照的溶血率3.86％相差不大，说明本发明所得抗菌肽XYZ-1对红细胞的渗透脆性可以忽略不计。

3、本发明产品抗菌肽XYZ-1临床分离耐药菌株的抑菌活性测定：

采用琼脂平板扩散法测定人工合成的抗菌肽XYZ-1的抑菌活性(受试菌株为本实验从临床中分离的抗大肠杆菌耐药菌株(庆大霉素、氟苯尼考高耐菌株)、金黄色葡萄球菌耐药菌株(甲氧西林高耐菌株))。测试方法同上述抗菌活性检测方法。检测结果见附图3。

由图3可知：使用1μg/mL的合成的抗菌肽XYZ-15μL能明显抑制上述两种耐药菌株的生长。

4、本发明产品抗菌肽XYZ-1对菌体形态结构影响的观察：

采用扫描电镜分别观察抗菌肽作用后的大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90029的菌体形态结构，并以正常培养的三种菌的菌体形态为对照，分析抗菌肽XYZ-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌体形态结构影响。

(1)抗菌肽XYZ-1对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90029的具体作用过程为：根据上述抗菌肽XYZ-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度(分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL)，采用10mMPBS缓冲液(pH7.2)将抗菌肽XYZ-1分别配制成对应的3×0.25mg/mL、3×0.5mg/mL和3×1.0mg/mL的三种抗菌肽XYZ-1溶液；然后分别取2ml新鲜培养至对数期的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌液，6000r/min离心15min，弃上清，得到三种菌体沉淀，然后向三种菌体沉淀中分别对应加入2ml浓度为3×0.25mg/mL、3×0.5mg/mL和3×1.0mg/mL的抗菌肽溶液进行重新悬浮，然后在37℃条件下孵育30min，得到抗菌肽XYZ-1作用后的三种菌悬液；

(2)扫描电镜观察的细胞样品的制备：取对数生长期的正常培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌以及抗菌肽XYZ-1作用后的三种菌悬液各3mL，3000r/min离心5min，弃上清，用10mMPBS缓冲液(pH7.2)洗涤菌体三次，然后分别采用3ml5％的戊二醛溶液对菌体重新悬浮，悬浮后所得菌液分别在4℃条件下固定24h；3000rpm离心10min，收集菌体沉淀，接着分别采用PBS溶液稀释的系列梯度乙醇对菌体梯度脱水(梯度脱水的顺序为30％、50％、60％、70％、80％和90％的乙醇各脱水一次，每次20min；100％的乙醇脱水两次，每次20min)处理，最后一次脱水完成后，将所得菌液分别滴加在圆形盖玻片上，然后进行真空冷冻干燥，干燥后经离子溅射仪溅射金，最后于扫描电镜下观察样品表面结构变化，详见附图4。

由图4可知，与正常的菌体形态结构相比，经过抗菌肽XYZ-1处理的菌体的形态发生较大的变化：大肠杆菌形态发生弯曲、变形、细胞膜出现孔洞结构；金黄色葡萄球菌细胞膜发生明显的破碎，且细菌大小发生不均匀的变化，细胞膜的完整性受到破坏；白色念珠菌细胞膜表面发生皱缩、脱落，细胞发生裂解。由此也可以看出，抗菌肽XYZ-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有高效的抑菌作用。

综上所述，本发明多肽产品不产生溶血性，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都具有高效的抗菌作用。所以，本发明产品抗菌肽XYZ-1在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌疾感染的药物中能够得到较佳的应用。

Claims (4)

1.一种抗菌肽XYZ-1，其特征在于，所述抗菌肽XYZ-1的氨基酸序列为精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸(SEQIDNO.1)。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽XYZ-1，其特征在于：所述抗菌肽XYZ-1为直链多肽，含有19个氨基酸残基，分子量为2288.81Da，等电点为10.83。

3.一种权利要求1所述的抗菌肽XYZ-1在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或/和真菌感染的药物中的应用。

4.一种权利要求1所述的抗菌肽XYZ-1在制备饲料添加剂或食品添加剂中的应用。