KR20150012505A - 용혈현상이 감소된 항생 펩타이드 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양면성 항생 펩타이드를 구성하는 소수성 아미노산 잔기를 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 또는 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법, 및 이를 통해 제조된 항생 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드 라이브러리로부터 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법 및 상기 항생 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 통하여 제조된 펩타이드는 기준이 된 모델 또는 자연 양면성 항생 펩타이드에 비해서 용혈력이 최소 4배에서 최대 8000배 낮아지는데 비하여, 항균력은 비슷하거나 최대 8배까지 증가하는 효과를 보였다. 이에 따라, 해당 항생 펩타이드를 제조하는 전략은 다양한 양면성 항생 펩타이드에 적용할 수 있을 것으로 기대되며, 이렇게 제조된 본 발명의 항생 펩타이드는 숙주세포에 대한 용혈현상은 대폭 감소하는데에 반해 항균효과는 유지되는바, 부작용이 적은 항생 펩타이드로 널리 유용하게 사용될 수 있다.

Description

용혈현상이 감소된 항생 펩타이드 제조방법{A method for designing antimicrobial peptides for reducing the hemolysis thereof}

본 발명은 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 또는 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법, 및 이를 통해 제조된 항생 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드 라이브러리로부터 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법 및 상기 항생 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

항생 펩타이드 (Antimicrobial peptides; AMP)는 생체 내에서 초기 면역반응을 담당하는, 생체의 개체 유지를 위해 스스로 생산해내는 자연 산물이다. 따라서 곤충부터 포유동물에 이르기까지 거의 모든 동물들에서 이와 같은 AMP가 다수 또한 다양하게 발견되고 있다. 항생 펩타이드의 한 종류로 양전자를 띄는 항생 펩타이드 (Cationic antimicrobial peptides; CAP)가 있으며, CAP는 다른 항생 펩타이드에 비해 다음 두 가지 중요한 성질을 가진다. 그 하나는 라이신 및 알지닌을 다수로 포함하고 있으므로 생리 pH에서 양전하를 띄고 있으며, 다른 하나는 친수성 및 소수성을 모두 갖춘 양면적 성질 (amphipathic)을 가진 펩타이드라는 점이다.

양전하는 박테리아의 세포 표면에 존재하는 음전하를 인식하고, 박테리아 근처에 항생 펩타이드가 접근할 수 있도록 만드는데 필요하다. 많은 경우에 항생 펩타이드의 박테리아를 죽이는 능력은 친수성 및 소수성의 두 가지 성질을 모두 갖춘 양면성에서 기인된다. 양면성을 가진 펩타이드는 박테리아의 세포막을 망가뜨릴 수 있는 능력을 가지고 있으므로 항균력의 직접적 원인이기 때문이다. 하지만 이와 같은 양면성은 숙주세포인 진핵세포도 죽일 수 있기 때문에 큰 부작용으로 나타난다. 즉, 양면성을 가진 항생 펩타이드는 진핵세포 표면도 거의 같은 기작으로 통과할 수 있으므로 숙주세포도 박테리아처럼 공격을 받을 수 있다. 양전하로 되어 있는 박테리아의 표면에 비해 중성화되어 있는 진핵세포의 표면은 약간 구별되는 면도 있지만, 양면성을 가진 항생 펩타이드들의 심각한 부작용으로 인하여 아직까지 양면성을 가진 항생 펩타이드가 신약 후보 물질로 도출된 예가 없다.

한편, 양면성을 가진 항생 펩타이드, 특히 양전하를 지니는 CAP는 15-40개 정도의 아미노산을 가지며, 알파나선을 일시적 모양 (conformation) 특징으로 가지고 있는 경우가 많다. 이 알파나선은 특히 막 단백질에서 매우 높은 비율로 존재한다. 또한, 알파나선 자체에서도 양면성을 가지고 있어서 CAP가 박테리아 또는 숙주세포의 막의 안쪽인 소수성을 띈 쪽으로의 접근을 용이하게 한다. CAP의 아미노산 구성을 보면 라이신/알지닌과 같은 양전하를 띌 수 있는 잔기가 있는 반면에 루신/이소루신과 같은 소수성의 잔기 두 가지를 다 함유하고 있으며 이들 두 성질은 크게 나누어져 있다. 적절한 친수성/소수성 잔기의 비율 및 이것들의 상대적 위치가 CAP의 능력을 좌우할 수 있다는 것이 이미 잘 알려져 있다.

펩타이드의 특정위치에 아미노산 잔기가 바뀌어 펩타이드 전체의 소수성을 늘릴 수 있거나 알파나선도를 증가시키면 더욱 항균 능력이 향상되는 것을 알고 있다. 하지만 이와 같은 항균능력이 커질수록 숙주세포를 파괴할 수 있는 부작용도 커지는 사실도 알려졌다. 따라서 CAP가 치료제로 쓰이기 위해선 부작용을 줄이는 방향으로 펩타이드를 제조/선별하여야 한다.

한편, 숙주세포를 죽이는 펩타이드의 부작용은 용혈현상(hemolysis)에 의한 것으로 파악되고 있다. 따라서, 항생 펩타이드의 숙주세포에 대한 용혈현상을 대폭적으로 감소시키면서 항균효과를 유지할 수 있는 적절한 수준의 변화를 위한 돌연변이가 필요하다.

이와 같은 배경하에, 본 발명자들은 지금까지 당업계에서 이루어지던 친수성을 증가시키고 알파나선도를 증가시켜서 항균력을 증진시키는 전략에서 벗어나, 알파나선도를 유지 또는 감소시키면서 소수성 부분만을 변화시킨 결과, 소수성 아미노산의 치환으로 용혈현상은 대폭 감소하고 항균효과는 유지되는 것을 발견하고, 본 발명의 항생 펩타이드가 부작용이 적은 항생 펩타이드로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항생 펩타이드 제조방법으로 제조된 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "항생 펩타이드"는 박테리아나 곰팡이에 항생 효능을 가지는 펩타이드를 의미한다. 지난 30여 년 간 곤충이나 양서류 등 다양한 생명체에서 박테리아나 곰팡이의 감염에 대항하는 새로운 항생 물질들이 발견되었는데, 이러한 물질들이 비교적 그 크기가 작은 단백질이나 펩타이드임이 밝혀졌다. 이러한 숙주 방어 펩타이드(host defense peptide)는 포유류인 소, 돼지 및 인간의 장, 피부, 식균 작용 세포내, 점액질 등 다양한 곳에서도 발견되고 있다. 이러한 방어 펩타이드는 면역세포 식균 작용 세포 및 항체 등과 더불어 세균 감염에 대항하기 위한 중요한 면역요소로 인식되고 있으며, 이러한 펩타이드를 항생 펩타이드라고 지칭하게 되었다. 본 발명에서 항생 펩타이드는 항균 펩타이드와 병용될 수 있다. 본 발명에서 항생 펩타이드는 천연 유래 펩타이드 또는 인공 펩타이드일 수 있다. 인공 펩타이드는 천연 유래 펩타이드의 활성 증대 또는 독성 감소를 위하여 변형이 가해진 펩타이드이거나, 항생 펩타이드의 활성에 영향을 미치는 인자들인 알파나선도, 양전하성, 소수성 등을 고려하여 인위적으로 디자인된 모델 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

항생 펩타이드는 구조상 크게 선형 펩타이드와 원형 펩타이드로 나뉠 수 있다. 또한, 이러한 펩타이드들은 그 아미노산의 서열과 길이 등이 매우 다양하지만 공통적으로 염기성 아미노산인 아르기닌이나 라이신 등의 아미노산을 가지고 있어 중성에서 펩타이드 자체가 양전하를 띌 수 있다.

이러한 펩타이드는 다양한 구조 및 서열을 가지나, 이와 상관없이 일반적으로 대부분이 미생물의 지질막에 작용하여, 미생물 지질막의 투과도를 증가시키는 기작을 통하여 항생 활성을 가진다. 특히, 양면성 펩타이드를 이루는 소수성과 알파나선 구조는 지질막으로 들어가 이온 채널을 형성하거나 지질막을 교란시키는데 매우 중요한 역할을 한다.

이와 더불어, 항생 펩타이드가 박테리아와 숙주인 동물 세포를 구별하여 항생 효과를 보이는 특이성에 관하여, 이에 영향을 미치는 인자들에 대하여 연구가 진행되었다. 박테리아 세포와 숙주 동물 세포를 구별하는 특이성은 두 세포 간의 지질말의 차이에서 비롯된다. 동물 세포 지질막의 표면은 중성인데 반하여 세균의 지질막은 음전하를 띄고 있으며 동물 세포 지질막에는 콜레스테롤이 있는데 반하여 세균의 막은 콜레스테롤이 없다. 이러한 지질막의 차이에 의하여 항생 펩타이드는 박테리아나 곰팡이 세포에 대한 특이성을 가질 수 있으며 이와 관련된 인자로 순 양전하, 소수성과 알파 나선도를 들 수 있다.

본 발명에서 용어, "양면성(amphipathic) 항생 펩타이드"는 구조적으로는 양면성, 즉 소수성과 친수성을 모두 가지는 펩타이드로서, 알파나선(α-helix) 또는 베타 병풍(β-sheet) 구조를 가질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 양면성 항생 펩타이드는 3차원 구조상에서 소수성 부분과 친수성 부분이 각각 결집되어 구성될 수 있으며, 이에 따라 펩타이드의 일 측면 또는 영역이 친수성을 띄고 타 측면 또는 영역이 소수성을 띌 수 있다. 상기 양면성 항생 펩타이드는 친수성 부분과 소수성 부분을 가짐에 따라, 친수성 부분은 지질막의 외부 노출에 면하고, 소수성 부분은 지질막의 소수성을 띄는 내부에 면하여, 지질막에서 이온 채널을 형성하거나 교란하여 지질막의 투과도를 증가시킬 수 있다. 상기 양면성 항생 펩타이드의 친수성 부분과 소수성 부분은 해당 영역을 이루는 아미노산이 친수성 아미노산인지 소수성 아미노산인지에 의하여 결정된다.

본 발명에서 상기 양면성 항생 펩타이드는 알파나선형 또는 베타병풍형 항생 펩타이드일 수 있으며, 특히 알파나선형 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 용어, "알파나선(α-helix)"는 단백질의 2차 구조 중에 하나로, 나선이 수소 결합에 의하여 안정성을 유지하는 구조를 의미한다. 일반적으로 한 펩티드 결합의 C=O 기와 4번째 있는 다른 펩티드 결합의 N-H 기 사이에 형성되는 수소 결합에 의하여 이루어진다. 한 회전에는 3.6 개의 아미노산이 있고 한 회전당 길이는 0.54 nm를 가지고 있는 2차 구조 모양일 수 있다.

또한, 본 발명의 용어, "베타 병풍(β-sheet)"은 단백질의 2차 구조 중의 하나로, 한 폴리펩타이드 사슬과 인접한 사슬에 있는 펩티드 결합 사이의 수소 결합에 의하여 형성된 평평한 평면 형태의 2차 구조를 의미한다. 한 마디의 병풍의 길이가 0.7 nm의 길이의 구조를 가질 수 있으며, 평행한 베타 병풍 구조 또는 역평행의 베타 병풍 구조를 가지고 있을 수 있다.

본 발명의 양면성 항생 펩타이드는 하기 일반식을 가질 수 있다.

[일반식]

(Xa-Yb-)n

상기 식에서,

X는 친수성 아미노산 잔기이고,

Y는 소수성 아미노산 잔기이며,

a, b는 0 내지 5의 정수이고,

n은 1 내지 100인 정수이다.

상기 일반식에서, a, b는 반복되는 각 n번째 마다 다른 정수일 수 있으며, 바람직하게는, 1 내지 3의 정수일 수 있다.

양면성 항생 펩타이드는 그 3차원 구조에서 한쪽 측면 또는 일 부분에 소수성 부분, 다 측면 또는 타 부분에 친수성 부분이 모여있는 특징이 있으며, 이는 소수성 아미노산 잔기와 친수성 아미노산 잔기가 각각 부분에 많이 분포함으로써 생기는 현상이다. 이를 위해서는 2차원 서열상 친수성 아미노산 잔기와 소수성 아미노산 잔기가 상기 일반식과 같이 일정 개수를 번갈아 가며 존재하는 것일 수 있다.

이에 본 발명의 양면성 항생 펩타이드는 루신과 라이신으로 이루어진 모델 펩타이드인 LK 펩타이드일 수 있고, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다(서열번호 1 : LKKLLKLLKKLLKLAG). 또한, 본 발명의 양면성 항생 펩타이드는 자연 항생 펩타이드의 양면성을 가진 부위, 곧 알파나선 부위 또는 베타 병풍 부위일 수 있으며, 특히 LL37 펩타이드의 일부일 수 있고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다(서열번호 2 : FKRIVQRIKDFLR).

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드 및 자연 펩타이드인 LL37를 기준 양면성 항생 펩타이드로 하여, 본 발명의 용혈력을 감소시킨 항생 펩타이드를 제조하였다. 구체적으로, 양면성 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산 자리에 알라닌으로 치환한 펩타이드를 제조하였다(펩타이드 1a 내지 1h 및 3a 내지 3f, 라이브러리 1 및 라이브러리 3). 상기 알라닌 치환을 통하여 선택된 자리에 치환할 최적 아미노산을 스크리닝하기 위하여 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루탐산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)으로 치환한 펩타이드(2a 내지 2j 및 4a 내지 4o, 라이브러리 2 및 라이브러리 4)를 제조하였다.

한편, 본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.

알라닌A 아르기닌R

아스파라긴N 아스파르트산D

시스테인C 글루탐산E

글루타민Q 글리신G

히스티딘H 이소루신I

루신L 리신K

메티오닌M 페닐알라닌F

프롤린P 세린S

트레오닌T 트립토판W

티로신Y 발린V

본 발명에서 용어, "소수성 아미노산 잔기"는 극성이 없거나 현저히 낮은 아미노산 잔기를 의미하며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력이 없는 성질, 즉 물과 혼합되지 않는 성질을 가지는 아미노산 잔기를 의미한다. 본 발명에서 소수성 아미노산 잔기는 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 이소루신(I), 루신(L), 프롤린(P), 메티오닌(M), 또는 발린(V)일 수 있다.

본 발명에서 용어, "친수성 아미노산 잔기"는 극성을 띄는 아미노산 잔기를 의미할 수 있으며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력을 가지는, 즉 물과 혼합될 수 있는 아미노산 잔기를 의미한다. 본 발명에서 친수성 아미노산 잔기는 알라닌(A), 글라이신(G), 시스테인(C), 글루타민(Q), 아스파라긴산(D), 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 세린(S), 리신(K), 티로신(Y) 또는 히스티딘(H)일 수 있다.

본 발명에서 친수성 아미노산 잔기로 사용하는 알라닌이나 글라이신은 엄밀히는 극성을 크게 가지지 않는 비극성 아미노산 잔기에 해당하나, 아미노산의 부피가 현저히 작아 전체 펩타이드의 극성 또는 비극성을 결정하는데 큰 영향을 미치지 않는다. 이에, 커다란 소수성 아미노산을 상기 작은 비극성 아미노산인 알라닌이나 글라이신으로 치환했을 때, 펩타이드의 전체적인 소수성을 줄일 수 있어 상대적으로 소수성을 줄이는 혹은 친수성을 증가시키는 치환 잔기로 사용하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 기준 양면성 항생 펩타이드에 대하여 이를 구성하는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환한 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드 라이브러리를 구성하는 펩타이드의 용혈력을 측정하는 단계; 및 기준 양면성 항생 펩타이드에 비하여 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 양면성 항생 펩타이드, 소수성 아미노산 잔기, 및 친수성 아미노산 잔기는 상기 설명한 바와 동일하다.

상기 라이브러리를 구성하는 펩타이드는 숙주에 해당하는 동물 세포에 대한 용혈력이 기준 양면성 항생 펩타이드보다 낮아지는 것일 수 있다.

본 발명의 항생 펩타이드 라이브러리를 구성하는 펩타이드의 용혈력을 측정하는 단계는 상기 항생 펩타이드를 인간 적혈구 세포에 처리하는 단계; 및 상기 처리물의 흡광도를 405 nm에서 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 인간 적혈구 세포에 처리하여 적혈구가 용혈된 정도를 헤모글로빈(hemoglobin)을 측정할 수 있는 405 nm 파장에서 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드 및 자연 펩타이드인 LL37를 기준 양면성 항생 펩타이드로 하여, 본 발명의 용혈력을 감소시킨 항생 펩타이드를 제조하였다. 구체적으로, 양면성 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산 자리를 알라닌으로 치환한 알라닌 스캐닝 펩타이드 라이브러리를 제조하였다(펩타이드 1a 내지 1h 및 3a 내지 3f, 라이브러리 1 및 라이브러리 3). 상기 알라닌 스캐닝 라이브러리에서 선택된 자리에 치환할 최적 아미노산을 스크리닝하기 위하여 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루탐산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)으로 치환한 펩타이드 라이브러리(2a 내지 2j 및 4a 내지 4o, 라이브러리 2 및 라이브러리 4)를 제조하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기에서 제조한 펩타이드의 용혈력을 측정하기 위하여, 인간 적혈구 세포에 처리하여 확인하였다. 먼저, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 1의 펩타이드에 대하여 용혈력을 측정한 결과, 기준 모델 펩타이드는 낮은 농도(2.5 μM)에서도 65% 이상의 높은 용혈비율을 보이는데 비하여, 이의 루신 부분을 알라닌으로 치환한 펩타이드 1a 내지 1h들은 모두 낮은 농도(2.5 μM)에서 20% 안팎으로 용혈력이 현저히 낮아짐을 확인할 수 있었다(도 1). 특히, LK 펩타이드의 5번째 루신이 알라닌으로 치환된 펩타이드 1e가 세 가지 다른 농도에서 모두 가장 낮은 용혈력을 가짐을 확인하여, 다섯번째 루신 위치를 용혈력에 가장 중요한 자리로 판단하였다. 다음으로, 최적 아미노산을 스크리닝하는 라이브러리 2의 용혈력을 측정한 결과, LK 펩타이드의 5번째 루신을 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)로 치환한 2d 및 2g 펩타이드는 기존 LK 펩타이드에 비하여 용혈력이 8000배 가량 줄어드는 것을 확인하였다(표 3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항생 펩타이드 제조방법에 의하여 제조된 항생 펩타이드를 제공한다.

본 발명에서 항생 펩타이드는 임의의 자연 또는 인공 양면성 항생 펩타이드를 이용하여 제조된 것일 수 있으며, 알파나선형 또는 베타 병풍형 항생 펩타이드를 이용하여 제조된 것일 수 있으나, 상기 양면성 항생 펩타이드를 구성하는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 통하여 제조된 것인 한 제한되지 않는다. 또한, 제조된 항생 펩타이드는 기준 양면성 항생 펩타이드보다 숙주세포인 동물 세포에 대하여 용혈력이 감소된 것일 수 있다.

바람직하게는 상기 양면성 항생 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2일 수 있으며,

본 발명에 의하여 제조된 항생 펩타이드는 상기 서열번호 1의 5번째 아미노산인 루신, 또는 서열번호 2의 4번째 아미노산인 이소루신, 5번째 아미노산인 발린, 또는 11번째 아미노산인 페닐알라닌을 친수성 아미노산 잔기로 치환한 것일 수 있으며, 특히 서열번호 3 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 항생 펩타이드는 균주 등을 이용한 재조합 생산 방법 또는 순차적인 화학적 아미노산 결합반응을 이용한 생산 방법 등으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 펩타이드를 링크 아미드 MBHA 레진(0.59 mM/g)과 Fmoc 보호기로 보호된 아미노산 단위체를 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 합성하였다. 먼저, 아미노산 단위체의 Fmoc제거하고, 이에 다음 아미노산을 결합시키는 것을 반복하여 마지막 아미노산이 결합될 때까지 진행하였다. 마지막 아미노산 결합 반응이 완결된 후, 펩타이드의 N-말단의 마지막 아미노산에 존재하는 Fmoc 보호기를 제거하고 아세틸화하여 펩타이드 합성 반응을 완결하였다(실시예 1).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 항균용 조성물은 세균, 진균 또는 효모에 대해 항균 활성을 가질 수 있으며, 그람음성균 또는 그람양성균에 대하여 항균력을 가지는 것일 수 있다. 바람직하게는 더욱 바람직하게는 그람음성균인 대장균 (Escherichia coli) 또는 그람양성균인 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 항균 활성을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어, "항균"은 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효도 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다. 본 발명의 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 포함하는 조성물은 세균, 진균 및 효모를 포함하는 미생물에 대한 항균활성이 뛰어난 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "세균"은 박테리아에 속하는 생물로서, 생명체들 중에 가장 많이 번성한 종으로 대부분 병원성 균이며 원핵생물의 특징을 그대로 가지고 있으나, 핵막이나 미토콘드리아, 엽록체와 같은 구조는 가지고 있지 않다. 크기는 0.5 μm 부터 0.5 mm 까지 다양하다. 상기 세균에는 예를 들어, 포도상구균(스타필로코커스 아우레우스, Staphylococcus aureus), 대장균(에스케리치아 콜라이, Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Paeudomonas aeruginosa)가 포함된다.

본 발명에서 용어, "진균"은 곰팡이, 효모, 버섯을 포함한 72,000종 이상의 균종으로 구성되는 미생물군을 총칭하며, 핵막이 있는 진핵생물에 속하고, 미토콘드리아, 소포체 등의 세포 소기관이 발달해 있으며, 키틴, 글루칸 등으로 구성된 세포벽이 있다. 대부분은 세포성인 균사를 형성하여 신장, 발육하고 유성생식 및 무성생식을 하는 것이 특징이다. 번식체로 포자를 형성하지만 일부 균종은 단세포성 증식을 한다. 주로 부생균으로서 자연계의 유기분해에 관여하지만, 일부는 동식물에 기생 또는 공생한다. 상기 진균에는 예를 들어, 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)이 포함된다.

본 발명에서 용어, "효모"는 곰팡이, 버섯 무리이지만 균사가 없고, 광합성능이나 운동능도 가지지 않는 단세포 생물을 총칭하며, 가장 간단한 형태의 진핵생물로 인간의 세포 주기와 비슷한 세포주기를 가지는 것으로 알려져 있다. 상기 효모에는 예를 들어, 사카로마이세스 속, 피치아 속, 캔디다 속이 포함된다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명에서 제조된 펩타이드의 그람음성균인 E. coli (ATCC25922)와 그람양성균인 S. aureus (ATCC29213)에 대한 항균력을 확인하였다(실시예 3). 먼저, 모델 펩타이드 기반의 라이브러리 1 및 2의 펩타이드들은 E. coli에 대해서 모두 모델 펩타이드 1보다 항균력이 2배에서 최대 8배까지 상승하는 것을 확인하였다(표 5). 다음으로, 자연 펩타이드 LL37 기반으로 한 항균력 실험은 E. coli에 대해서 자연 펩타이드 Lt 펩타이드(펩타이드 3)와 유사한 정도의 항균력을 보이는 것을 확인할 수 있었다(표 6). 이와 같이 본 발명의 용혈력은 최소 4배에서 8배 이상 증가하는데에 반해서 항균력은 유사한 정도를 유지하거나 오히려 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명의 항균용 조성물에는 본 발명의 항생 펩타이드가 조성물의 총 중량에 대해 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 3중량% 포함될 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항균활성 효과를 갖는 각종 조성물은 예를 들면, 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 어떠한 제형으로도 응용될 수 있으며, 그 용도도 다양한 분야에 적용될 수 있다. 예를 들면 전신, 피부, 구강, 모발 등 인체관련 세정제 등 각종 화장료 조성물 등에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항균용 조성물에는 유효 성분으로서의 본 발명의 항생 펩타이드 이외에 추가적으로 당업계에 공지된 항균활성을 가진 물질이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 통하여 제조된 펩타이드는 기준이 된 모델 또는 자연 양면성 항생 펩타이드에 비해서 용혈력이 최소 4배에서 최대 8000배 낮아지는데 비하여, 항균력은 비슷하거나 최대 8배까지 증가하는 효과를 보였다. 이에 따라, 해당 항생 펩타이드를 제조하는 전략은 다양한 양면성 항생 펩타이드에 적용할 수 있을 것으로 기대되며, 이렇게 제조된 본 발명의 항생 펩타이드는 숙주세포에 대한 용혈현상은 대폭 감소하는데에 반해 항균효과는 유지되는바, 부작용이 적은 항생 펩타이드로 널리 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 1의 펩타이드에 대하여 용혈력을 측정한 도면이다.
도 2은 자연 펩타이드 LL37의 일 부분인 13개의 아미노산으로 이루어진 Lt 펩타이드를 기반으로 한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 3의 펩타이드들의 용혈력을 측정한 도면이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드들의 소수성, 알파나선도와 상기 측정한 용혈력과의 관계를 확인한 도면이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드 라이브러리 합성

펩타이드는 링크 아미드 MBHA 레진(0.59 mM/g)을 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 29.5 uM 스케일로 합성하였다. 합성에 필요한 아미노산 단위체는 모두 NovaBiochem에서 구입하였다. 모든 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하였고, 이 펩타이드들은 337 nm의 질소 레이저와 1.2 m의 filght tube를 장착하고 있는 Auto Flex Ⅱ MALDI-TOF/TOF mass spectrometer(Brucker Daltonics, 독일)를 이용하여 확인하였다. 또한, Agilent 1100 HPLC를 통하여 분리하여, 순도를 확인하였다.

1-1. 펩타이드 합성 방법

펩타이드는 상기 설명한 대로, 링크 아미드 MBHA 레진(0.59 mM/g)을 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 29.5 uM 스케일로 합성하였다. 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 레진은 DMF (4 mL, 10 분)으로 swelling한 후 20% piperidine(in DMF) 4 mL을 넣고 Discover SPS Microwave Peptide Synthesizer (CEM)을 이용하여 2분 동안 Fmoc((9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl, 9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐) 보호기를 제거하였다. 이 후, 디클로로메탄 (4 mL, 3 번), DMF (4 mL, 3 번)으로 세척하여, 레진으로부터 piperidine 용액을 완전히 제거하였다.

그 후에, 상기 레진에 첫 번째 아미노산인 Glycine을 결합하기 위하여 아미노기가 Fmoc 보호기로 보호된 Glycine 아미노산 단위체, Fmoc-Gly-OH(68 mg, 6 eq.), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrridino-phosphonium hexafluoro-phosphate (PyBOP, 110 mg, 6 eq.)를 DMF 4 mL에 녹인 후 N,N-diisopropylethylamine (DIPEA , 28 μL, 6 eq.)를 마지막에 추가하고 이 용액을 위의 Fmoc 보호기가 제거된 레진에 넣고 이 현탁물(suspension)을 synthesizer에서 5분 동안 교반하여 반응시켰다. 이후 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) test를 통해 Glycine 결합 반응이 완결되었는지 확인하고, 디클로로메탄 (4 mL, 3 번), DMF (4 mL, 3 번)으로 교반 후, 여과하면서 반응 용액을 제거하였다. 이와 같은 Fmoc제거, 아미노산 결합 반응을 계속하여 마지막 아미노산이 결합될 때까지 반복하였다.

마지막 아미노산 결합 반응이 완결된 후, 제조된 펩타이드의 N-말단의 아세틸화는 상기와 동일한 방법으로 Fmoc 보호기를 제거하고, N-Hydroxybenzotriazole (HOBt, 41.2 mg, 10 eq), 무수 아세트산 (29 μL, 10eq)를 DMF 3.6mL, 디클로로메탄 0.4mL에 녹여 이 용액을 레진에 넣고 synthesizer에서 5분간 교반하여 수행하였다.

1-2. 펩타이드의 분리 및 전제 방법

상기 실시예 1-1에서 제조된 펩타이드를 고체상(레진)으로부터 분리시키기 위해, 메탄올로 레진을 수축시키고, cleavage cocktail(1.5 mL, trifluoroacetic acid (TFA)/triisopropyl silane (TIS)/water = 95:2.5:2.5)을 넣고 2 시간 교반하여 펩타이드를 레진으로부터 분리하였다. 그 후 레진은 여과하여 제거하고, TFA (0.5 mL, 2 번)로 레진을 세척하여 남아있는 펩타이드를 회수하였다.

상기 얻어진 용액을 질소하에서 농축시킨 후 10 mL의 차가운 디에틸 에테르와 n-헥산 (v/v = 50/50)를 넣어 펩타이드를 침전시켰다. 얻어진 침전물을 13000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 펩타이드를 pellet으로 얻고 위의 상층액은 decantation하여 조심스럽게 제거하였다. 이 pellet은 10 mL의 차가운 디에틸 에테르와 n-헥산 (v/v = 50/50)으로 두 번 더 원심분리, decantation하여 세척하였다.

상기 얻어진 펩타이드 pellet을 공기 중에서 말리고, DMSO (0.2 mL)에 녹여 0.45 μm의 주사기 필터(syringe filter)로 여과시킨 후, HPLC를 이용하여 정제하였다. HPLC는 waters 600을 사용하였으며, 고정상으로 XBridgeTM Prep C18 5 μm OBDTM(19 mm x 150 mm, Waters) 이동상으로 Buffer A, 0.1% TFA(in H₂O)와 Buffer B, 0.1% TFA(in CH₃CN)를 사용하여 0 min ~ 60 min, 0 % ~ 100 % B 조건으로 농도 기울기를 주어 분리하였다.

일 예로, 서열번호 1의 펩타이드 1은 52%의 buffer B 조건에서 분리되었으며, 얻어진 펩타이드 1은 동결 건조하여 하얀색 고체 파우더를 얻었다(19.2 mg) MS [M+H]+: 1860.34(calcd), 1861.22(obsd).

1-3. 제조 펩타이드 서열 및 질량 분석

상기와 같은 방법으로 하기 표 1의 펩타이드들을 제조하였다.

먼저, 서열번호 1의 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에서 루신 아미노산 자리에 알라닌으로 치환한 모델 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리 펩타이드(1a 내지 1h, 라이브러리 1)를 제조하였다. 상기 알라닌 스캐닝 라이브러리에서 선택된 다섯번째 루신 자리에 치환할 최적 아미노산을 스크리닝하기 위하여 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루탐산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)으로 치환한 라이브러리 펩타이드(2a 내지 2j)를 제조하였다. 상기 펩타이드의 서열, 계산된 질량 및 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 측정된 질량은 하기 표 1과 같다.

모델 펩타이드 기반 라이브러리 펩타이드 서열 및 질량

라이브러리	펩타이드	서열	계산질량	측정질량
1	1 (서열번호 1)	Ac-LKKLLKLLKKLLKLAG	1860.34	1861.22
	1a (서열번호 2)	Ac- A KKLLKLLKKLLKLAG	1818.29	1819.04
	1b (서열번호 3)	Ac-LKK A LKLLKKLLKLAG	1818.29	1819.06
	1c (서열번호 4)	Ac-LKKL A KLLKKLLKLAG	1818.29	1819.14
	1d (서열번호 5)	Ac-LKKLLK A LKKLLKLAG	1818.29	1819.18
	1e (서열번호 6)	Ac-LKKLLKL A KKLLKLAG	1818.29	1819.26
	1f (서열번호 7)	Ac-LKKLLKLLKK A LKLAG	1818.29	1819.17
	1g (서열번호 8)	Ac-LKKLLKLLKKL A KLAG	1818.29	1819.12
	1h (서열번호 9)	Ac-LKKLLKLLKKLLK A AG	1818.29	1819.21
2	2a (서열번호 10)	Ac-LKKLLKL G KKLLKLAG	1804.28	1805.26
	2b (서열번호 11)	Ac-LKKLLKL S KKLLKLAG	1834.29	1835.74
	2c (서열번호 12)	Ac-LKKLLKL P KKLLKLAG	1844.31	1845.27
	2d (서열번호 13)	Ac-LKKLLKL N KKLLKLAG	1861.30	1862.58
	2e (서열번호 14)	Ac-LKKLLKL Q KKLLKLAG	1875.31	1876.37
	2f (서열번호 15)	Ac-LKKLLKL D KKLLKLAG	1862.28	1863.31
	2g (서열번호 16)	Ac-LKKLLKL E KKLLKLAG	1876.30	1877.47
	2h (서열번호 17)	Ac-LKKLLKL K KKLLKLAG	1875.35	1876.29
	2i (서열번호 18)	Ac-LKKLLKL H KKLLKLAG	1884.31	1885.53

다음으로, 상기 모델 펩타이드에 적용한 전략을 자연 펩타이드인 LL37에 도입하였다. 양면성을 가진 펩타이드로 항균력은 좋지만 부작용인 용혈현상이 있는 것으로 알려져 있는 LL37의 일 부분인 13개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 상기 전략을 도입하여 제조한 라이브러리의 펩타이드 서열, 계산된 질량 및 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 측정된 질량은 하기 표 2와 같다.

자연 펩타이드(LL37) 기반 라이브러리 펩타이드의 서열 및 질량

라이브러리	펩타이드	서열	계산질량	측정질량
3	3 (서열번호 19)	Ac-FKRIVQRIKDFLR	1759.07	1759.90
	3a (서열번호 20)	Ac- A KRIVQRIKDFLR	1683.04	1683.87
	3b (서열번호 21)	Ac-FKR A VQRIKDFLR	1717.03	1717.77
	3c (서열번호 22)	Ac-FKRI A QRIKDFLR	1731.04	1731.93
	3d (서열번호 23)	Ac-FKRIVQR A KDFLR	1717.03	1717.82
	3e (서열번호 24)	Ac-FKRIVQRIKD A LR	1683.04	1683.85
	3f (서열번호 25)	Ac-FKRIVQRIKDF A R	1717.03	1717.92
4	4a (서열번호 26)	Ac-FKR G VQRIKDFLR	1703.01	1703.89
	4b (서열번호 27)	Ac-FKR S VQRIKDFLR	1733.02	1733.88
	4c (서열번호 28)	Ac-FKR N VQRIKDFLR	1760.03	1760.85
	4d (서열번호 29)	Ac-FKR Q VQRIKDFLR	1774.05	1775.05
	4e (서열번호 30)	Ac-FKR H VQRIKDFLR	1783.05	1784.17
	4f (서열번호 31)	Ac-FKRI G QRIKDFLR	1717.03	1718.02
	4g (서열번호 32)	Ac-FKRI S QRIKDFLR	1747.04	1747.93
	4h (서열번호 33)	Ac-FKRI N QRIKDFLR	1774.05	1775.13
	4i (서열번호 34)	Ac-FKRI Q QRIKDFLR	1788.06	1788.99
	4j (서열번호 35)	Ac-FKRI H QRIKDFLR	1797.06	1798.03
	4k (서열번호 36)	Ac-FKRIVQRIKD G LR	1703.01	1703.92
	4l (서열번호 37)	Ac-FKRIVQRIKD S LR	1733.02	1733.99
	4m (서열번호 38)	Ac-FKRIVQRIKD N LR	1760.03	1761.16
	4n (서열번호 39)	Ac-FKRIVQRIKD Q LR	1774.05	1775.05
	4o (서열번호 40)	Ac-FKRIVQRIKD H LR	1783.05	1784.11

실시예 2. 합성된 펩타이드의 용혈력 측정

2-1. 용혈력 측정 방법

상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 용혈력을 측정하기 위하여, 인간 적혈구 세포에 처리하여 확인하였다.

구체적으로는, 먼저 혈액 2 mL을 항응고제 처리된 튜브에 넣고 1400 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 하층에 모인 적혈구에 PBS(phosphate-buffered saline; 100 mM NaCl, 80 mM Na₂HPO₄, pH 7.4)를 1 mL 넣고 가볍게 위 아래로 흔들어 준 후, 1400 rpm에서 5분간 원심분리 후 다시 상층액을 제거하는 방법으로 상층액이 투명해질 때까지 3번 이상 적혈구를 세척하였다.

세척이 끝난 적혈구는 적혈구 대 PBS의 부피비가 1 : 19 되도록 PBS(5% hematocrit PBS)로 희석시켜 준비하였다. 상기 펩타이드는 PBS를 이용하여 2-fold serial dilution을 통해 원하는 농도로 준비하여 각 농도의 펩타이드 용액을 200 ㎕씩 마이크로 파이펫을 사용하여 microtiter plate로 옮겼다. 그 후 준비한 적혈구를 50 ㎕씩 펩타이드 용액을 넣은 microtiter plate의 각 well에 옮겨 넣고 37℃ 인큐베이터에 3 시간 동안 두었다. 그 후 인큐베이터에서 plate를 꺼내 1400 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 따서 새로운 microtiter plate에 옮겼다. 405 nm에서 흡광도를 측정하여 용혈 비율(%)을 측정하였으며, 이때 대조군으로는 PBS와 증류수를 이용하였다.

2-2. 모델 펩타이드 기반 라이브러리 펩타이드의 용혈력 측정

먼저, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 1의 펩타이드에 대하여 용혈력을 측정하였다(도 1). 그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이, 모델 펩타이드는 낮은 농도(2.5 μM)에서도 65% 이상의 높은 용혈비율을 보이는데 비하여, 이의 루신 부분을 알라닌으로 치환한 펩타이드 1a 내지 1h 모두 낮은 농도(2.5 μM)에서 20% 안팎의 현저히 낮아진 용혈비율을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 전략인 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환할 경우 용혈력을 줄일 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 한편, LK 펩타이드의 5번째 루신이 알라닌으로 치환된 펩타이드 1e가 세 가지 다른 농도에서 모두 가장 낮은 용혈력을 가진다는 것을 확인하였다. 따라서, 다섯번째 루신 위치가 용혈력을 낮추는데 가장 중요한 자리로 판단하였다.

이에 실시예 1에 설명한 바와 같이, 최적 아미노산을 스크리닝하는 라이브러리 2에서는 LK 펩타이드의 5번째 루신을 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루타민산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)의 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드를 제조하였다. 해당 라이브러리 2의 펩타이드들에 대하여 상기와 동일한 방법으로 용혈력을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.

모델 펩타이드 및 라이브러리 2 펩타이드의 용혈력 측정

펩타이드	서열	MHC*(μM)
1	Ac-LKKLLKLLKKLLKLAG	0.08
2a	Ac-LKKLLKL G KKLLKLAG	10
2b	Ac-LKKLLKL S KKLLKLAG	20
2c	Ac-LKKLLKL P KKLLKLAG	160
2d	Ac-LKKLLKL N KKLLKLAG	640
2e	Ac-LKKLLKL Q KKLLKLAG	320
2f	Ac-LKKLLKL D KKLLKLAG	>640
2g	Ac-LKKLLKL E KKLLKLAG	320
2h	Ac-LKKLLKL K KKLLKLAG	160
2i	Ac-LKKLLKL H KKLLKLAG	80

*MHC : Minimum Hemolytic Concentration의 약자로, 용혈 현상을 10% 미만으로 일으키는 펩타이드의 최대 농도값을 의미한다.

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, LK 펩타이드의 5번째 루신을 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)로 치환한 2d 및 2g 펩타이드는 기존 LK 펩타이드에 비하여 용혈력이 8000배 가량 줄어드는 것을 확인할 수 있다.

2-3. LL37 펩타이드 기반 라이브러리 펩타이드의 용혈력 측정

다음으로, 자연 펩타이드 LL37의 일 부분인 13개의 아미노산으로 이루어진 Lt 펩타이드를 기반으로 한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 3의 펩타이드들의 용혈력을 측정하였다(도 2). 그 결과, 높은 용혈력을 보이는 Lt 펩타이드인 펩타이드 3에 비하여, 이의 소수성 부분을 알라닌으로 치환한 펩타이드 3a 내지 3f가 모두 용혈력이 현저히 낮아짐을 확인할 수 있었다. 이는 상기 모델 펩타이드에서 확인한 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환할 경우 용혈력을 줄일 수 있다는 것이 자연 펩타이드에 적용시에도 동일하게 작용함을 보여주는 것이다.

이 중에 알라닌 스캐닝 라이브러리 펩타이드 3b, 3c, 및 3e에 상응하는 4, 5, 또는 11번째 소수성 아미노산을 글라이신, 세린, 아스파라긴, 글루타민 또는 히스티딘의 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드를 제조하였다(라이브러리 4). 해당 라이브러리 4의 펩타이드들에 대하여 상기와 동일한 방법으로 용혈력을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4와 같다.

Lt 펩타이드 및 라이브러리 4 펩타이드의 용혈력 측정

펩타이드	서열	MHC*(μM)
3	Ac-FKRIVQRIKDFLR	160
4a	Ac-FKR G VQRIKDFLR	>1280
4b	Ac-FKR S VQRIKDFLR	>1280
4c	Ac-FKR N VQRIKDFLR	>1280
4d	Ac-FKR Q VQRIKDFLR	>1280
4e	Ac-FKR H VQRIKDFLR	>1280
4f	Ac-FKRI G QRIKDFLR	>1280
4g	Ac-FKRI S QRIKDFLR	640
4h	Ac-FKRI N QRIKDFLR	>1280
4i	Ac-FKRI Q QRIKDFLR	1280
4j	Ac-FKRI H QRIKDFLR	>1280
4k	Ac-FKRIVQRIKD G LR	>1280
4l	Ac-FKRIVQRIKD S LR	>1280
4m	Ac-FKRIVQRIKD N LR	>1280
4n	Ac-FKRIVQRIKD Q LR	>1280
4o	Ac-FKRIVQRIKD H LR	>1280

상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, Lt 펩타이드의 4번째 이소루신, 5번째 발린, 11번째 페닐알라닌을 글라이신, 세린, 아스파라긴, 글루타민 또는 히스티딘의 친수성 아미노산으로 치환한 상기 라이브러리 펩타이드들은 기존 Lt 펩타이드에 비하여 용혈력이 최소 4배에서 8배 이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다.

2-4. 용혈력 , 알파나선도 및 소수성과의 상관관계

일반적으로 소수성과 알파나선도는 펩타이드의 용혈현상과 깊은 관계가 있음이 알려져 있었다. 이에 소수성을 줄이는 치환을 가미한 상기 제조한 펩타이드들의 소수성, 알파나선도와 상기 측정한 용혈력과의 관계를 확인한 결과 도 3과 같은 결과를 얻었다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드들의 알파나선 구조의 약화 및 소수성의 감소가 용혈현상을 감소시키는 것과 일응 비례함을 확인하였다.

실시예 3. 펩타이드의 항균력 측정

상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 항균력은 그람음성균인 E. coli (ATCC25922)와 그람양성균인 S. aureus (ATCC29213)에 대해서 미량희석법을 이용한 감수성 검사(microdilution susceptibility testing)로 측정하였다. 두 종류의 박테리아는 Muller-Hinton broth (Difco)에서 배양하였다.

먼저 합성된 펩타이드를 2배수 계단 희석법(2-fold serial dilution)을 통해 Muller-Hinton broth로 희석하여 원하는 농도로 준비하였다. 펩타이드 용액을 200 ㎕씩 마이크로 파이펫을 사용하여 microtiter plate로 옮겼다. 펩타이드를 모두 옮긴 다음에는 각각의 well에 박테리아가 든 broth를 10 ㎕씩 넣었는데 박테리아의 최종 수가 1 mL당 5 x 10⁵ colony-forming units(CFU)가 되도록 하였다. 이 microtitier plate를 37 인큐베이터에 18시간 동안 두었다. 박테리아가 생장하지 못하도록 하는 최소 펩타이드 농도를 MIC(Minimum Inhibitory Concentration)라고 하며 MIC가 작은 값을 가질수록 우수한 항균력을 가진다.

상기 배양한 microtitier plate 상의 각 well을 육안으로 관찰하였을 때 박테리아가 자라지 못해서 투명한 상태를 유지하는 가장 낮은 펩타이드 농도를 각 펩타이드의 MIC로 측정하였다.

상기 항균력 측정 실험을 모델 펩타이드 및 자연 펩타이드 LL37에 기반한 라이브러리 펩타이드에 대하여 수행한 결과는 하기 표 5 및 표 6과 같다.

모델 펩타이드 기반 라이브러리 펩타이드의 항균력

라이브러리	펩타이드	서열	MIC(μM)
			E. coli	S. aureus
1	1	Ac-LKKLLKLLKKLLKLAG	20	10
	1a	Ac- A KKLLKLLKKLLKLAG	5	10
	1b	Ac-LKK A LKLLKKLLKLAG	5	5
	1c	Ac-LKKL A KLLKKLLKLAG	10	10
	1d	Ac-LKKLLK A LKKLLKLAG	10	10
	1e	Ac-LKKLLKL A KKLLKLAG	5	5
	1f	Ac-LKKLLKLLKK A LKLAG	5	5
	1g	Ac-LKKLLKLLKKL A KLAG	10	10
	1h	Ac-LKKLLKLLKKLLK A AG	10	10
2	2a	Ac-LKKLLKL G KKLLKLAG	2.5	5
	2b	Ac-LKKLLKL S KKLLKLAG	2.5	10
	2c	Ac-LKKLLKL P KKLLKLAG	5	>40
	2d	Ac-LKKLLKL N KKLLKLAG	2.5	>40
	2e	Ac-LKKLLKL Q KKLLKLAG	2.5	>40
	2f	Ac-LKKLLKL D KKLLKLAG	10	>40
	2g	Ac-LKKLLKL E KKLLKLAG	5	>40
	2h	Ac-LKKLLKL K KKLLKLAG	5	>40
	2i	Ac-LKKLLKL H KKLLKLAG	5	>40

먼저 표 5에서 확인할 수 있듯이, 모델 펩타이드 기반의 라이브러리 1 및 2의 펩타이드들은 E. coli에 대해서 모두 모델 펩타이드 1보다 항균력이 상승하는 것을 확인할 수 있다. 이들 라이브러리 펩타이드들은 용혈력이 모델 펩타이드에 비하여 현저히 낮아지는 것을 확인한 바 있는데, 항균력은 2배에서 최대 8배까지 상승하는 것을 확인하였다.

자연 펩타이드(LL37) 기반 라이브러리 펩타이드의 항균력

라이브러리	펩타이드	서열	MIC(μM)
			E. coli	S. aureus
3	3	Ac-FKRIVQRIKDFLR	5	>40
	3a	Ac- A KRIVQRIKDFLR	10	>40
	3b	Ac-FKR A VQRIKDFLR	5	>40
	3c	Ac-FKRI A QRIKDFLR	5	>40
	3d	Ac-FKRIVQR A KDFLR	10	>40
	3e	Ac-FKRIVQRIKD A LR	5	>40
	3f	Ac-FKRIVQRIKDF A R	10	>40
4	4a	Ac-FKR G VQRIKDFLR	10	>40
	4b	Ac-FKR S VQRIKDFLR	10	>40
	4c	Ac-FKR N VQRIKDFLR	20	>40
	4d	Ac-FKR Q VQRIKDFLR	10	>40
	4e	Ac-FKR H VQRIKDFLR	10	>40
	4f	Ac-FKRI G QRIKDFLR	5	>40
	4g	Ac-FKRI S QRIKDFLR	5	>40
	4h	Ac-FKRI N QRIKDFLR	10	>40
	4i	Ac-FKRI Q QRIKDFLR	5	>40
	4j	Ac-FKRI H QRIKDFLR	5	>40
	4k	Ac-FKRIVQRIKD G LR	20	>40
	4l	Ac-FKRIVQRIKD S LR	10	>40
	4m	Ac-FKRIVQRIKD N LR	20	>40
	4n	Ac-FKRIVQRIKD Q LR	10	>40
	4o	Ac-FKRIVQRIKD H LR	10	>40

다음으로 상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 자연 펩타이드 LL37 기반으로 한 항균력 실험은 E. coli에 대해서 자연 펩타이드 Lt 펩타이드(펩타이드 3)와 유사한 정도의 항균력을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 본 발명의 용혈력은 최소 4배에서 8배 이상 증가하는데에 반해서 항균력은 유사한 정도를 유지하는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 종합하면, 본 발명에 따라 양면성 항생 펩타이드의 용혈력을 극소화하는 펩타이드 디자인 방법을 통하여 제조한 펩타이드들은 용혈력이 현저히 감소하여, 숙주세포에 대한 독성은 현저히 줄어든 반면, 항균력은 오히려 증가되거나 원래 수준을 유지하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 현재까지 숙주세포에 대한 심각한 부작용으로 인하여, 뛰어난 항균력에도 불구하고 활용되지 못했던 양면성을 가진 항생 펩타이드들을 부작용없이 뛰어난 항균력을 유지한 상태로 활용할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> A method for designing antimicrobial peptides for reducing the hemolysis thereof <130> PA130551/KR <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK model peptide(peptide 1) <400> 1 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative(peptide 1a) <400> 2 Ala Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1b) <400> 3 Leu Lys Lys Ala Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1c) <400> 4 Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1d) <400> 5 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1e) <400> 6 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1f) <400> 7 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Ala Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1g) <400> 8 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1h) <400> 9 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ala Ala Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2a) <400> 10 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gly Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2b) <400> 11 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2c) <400> 12 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Pro Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2d) <400> 13 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Asn Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2e) <400> 14 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gln Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2f) <400> 15 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Asp Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2g) <400> 16 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Glu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2h) <400> 17 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2i) <400> 18 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu His Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Lt peptide from LL37(peptide 3) <400> 19 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 3a) <400> 20 Ala Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 3b) <400> 21 Phe Lys Arg Ala Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 3c) <400> 22 Phe Lys Arg Ile Ala Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 3d) <400> 23 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ala Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 3e) <400> 24 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 3f) <400> 25 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Ala Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4a) <400> 26 Phe Lys Arg Gly Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4b) <400> 27 Phe Lys Arg Ser Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4c) <400> 28 Phe Lys Arg Asn Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4d) <400> 29 Phe Lys Arg Gln Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4e) <400> 30 Phe Lys Arg His Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4f) <400> 31 Phe Lys Arg Ile Gly Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4g) <400> 32 Phe Lys Arg Ile Ser Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4h) <400> 33 Phe Lys Arg Ile Asn Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4i) <400> 34 Phe Lys Arg Ile Gln Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4j) <400> 35 Phe Lys Arg Ile His Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4k) <400> 36 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4l) <400> 37 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4m) <400> 38 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Asn Leu Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4n) <400> 39 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative(peptide 4o) <400> 40 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp His Leu Arg 1 5 10

Claims (17)

1. 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기는 페닐알라닌, 트립토판, 이소루신, 루신, 프롤린, 메티오닌 또는 발린인 것인, 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기는 알라닌, 글라이신, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 아르기닌, 세린, 리신, 티로신 또는 히스티딘인 것인, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 양면성 항생 펩타이드는 알파나선형 항생 펩타이드인 것인, 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 양면성 항생 펩타이드는 하기 일반식을 갖는 것인 방법:
   (Xa-Yb-)n
   X는 친수성 아미노산 잔기이고,
   Y는 소수성 아미노산 잔기이며,
   a, b는 1 내지 3의 정수이고,
   n은 1 내지 100인 정수이다.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 양면성 항생 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 서열번호 1의 5번째 아미노산인 루신, 또는 서열번호 2의 4번째 아미노산인 이소루신, 5번째 아미노산인 발린, 또는 11번째 아미노산인 페닐알라닌을 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 것인, 방법.
   
8. 기준 양면성 항생 펩타이드에 대하여 이를 구성하는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환한 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기는 페닐알라닌, 트립토판, 이소루신, 루신, 프롤린, 메티오닌 또는 발린인 것인, 방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기는 알라닌, 글라이신, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 트레오닌,아스파라긴, 아르기닌, 세린, 리신, 티로신 또는 히스티딘인 것인, 방법.
    
11. 제8항에 따른 항생 펩타이드 라이브러리를 구성하는 펩타이드의 용혈력을 측정하는 단계; 및 기준 양면성 항생 펩타이드에 비하여 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 용혈력을 측정하는 단계는 상기 펩타이드를 인간 적혈구 세포에 처리하는 단계; 및 상기 처리물의 405 nm에서의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
    
13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 항생 펩타이드.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 항생 펩타이드는 서열번호 3 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 펩타이드.
    
15. 제13항에 따른 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 항생 펩타이드는 그람 음성균 또는 그람 양성균에 대하여 항균력을 가지는 것인, 조성물.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli)인 것인, 조성물.
    
    
    
    

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