WO2017048092A1 - 그람 음성균에 대한 항균 활성을 나타내는 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도 - Google Patents

그람 음성균에 대한 항균 활성을 나타내는 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도 Download PDF

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gram
membrane
peptides
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유재훈
이연
현순실
김서연
진선미
최윤화
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to broken or broken helix peptides or peptide analogues and uses thereof, and more particularly, to the present invention, the present invention relates to Gram-negative bacterial membrane permeable peptides or peptide analogues in which alpha-helix bilateral peptides composed of hydrophobic and hydrophilic amino acids are folded.
  • An antimicrobial composition using its Gram-negative bacteria specific membrane activity, an antimicrobial composition for concomitant administration, a conjugate in which a drug is linked to the peptide or peptide analog, or an antibiotic comprising the same.
  • the ratio of resistant bacteria to antimicrobial drugs divided into gram-positive bacteria and gram-negative bacteria increased more and more, and it was not too long before only those bacteria resistant to all existing drugs exist. Hospital-acquired infection caused by such resistant bacteria is the most serious condition. For example, in 2014, only 1.7 million patients were infected in hospitals and 100,000 died. The number of deaths is greater than the number of breast cancer deaths in the United States, the leading death in the United States, and the deaths of prostate cancer, the leading death in men.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • the outer membrane of Gram-negative bacteria is a major target for the development of new drugs, and compounds that degrade or weaken it can be used as therapeutic agents for Gram-negative bacteria.
  • many kinds of antimicrobial peptides (AMPs) have an antimicrobial effect as a mechanism for decomposing such membranes.
  • the use of such AMP has been considered to introduce antibiotics that have not passed through the membrane into the bacteria. This hypothesis can be demonstrated by the synergistic effect of parallel administration of antimicrobial peptides / antibiotics.
  • peptides that loosen the membranes can penetrate into the bacteria or act on the membranes themselves without damaging the bacteria's membranes. It can be considered to be a possible peptide. Due to the rigidity of the membrane, antibiotics that could not pass through the membrane can pass through the membrane, which may indicate synergy.
  • Another object of the present invention is to provide an antimicrobial composition for concomitant administration comprising the peptide or peptide analog.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide or peptide analogue and a conjugate to which a drug is linked to the peptide.
  • the present invention is a Gram-negative bacterial membrane-permeable peptide or peptide analogue having an alpha-helix double-sided peptide composed of hydrophobic and hydrophilic amino acids has a folded structure
  • a hydrophobic amino acid portion of the alpha helical bilateral peptide or peptide analogue is selected from proline (P), aspartic acid (D), asparagine (N), glutamic acid (E), glutamine (Q), D-type amino acids thereof, and derivatives thereof
  • P proline
  • D aspartic acid
  • N asparagine
  • E glutamic acid
  • Q glutamine
  • D-type amino acids thereof and derivatives thereof
  • At least two or more amino acids constituting the alpha-helix bilateral peptide are i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer)
  • Peptides or peptide analogues are characterized in that they have an alpha helical structure which is linked through disulfide bonds, carbon-carbon bonds, maleimide bonds or amide bonds at one or more positions selected.
  • the present invention provides that the hydrophobic moiety in a bilateral antibiotic peptide (eg buforin5-21) is substituted by proline (P), aspartic acid (D), asparagine (N), glutamic acid (E), glutamine (Q) It provides a peptide or peptide analogue, characterized in that having a folded alpha helix structure.
  • a bilateral antibiotic peptide eg buforin5-21
  • D aspartic acid
  • N asparagine
  • E glutamic acid
  • Q glutamine
  • the present invention also provides an antimicrobial composition for concomitant administration comprising the peptide or peptide analog.
  • the present invention also provides the peptide or peptide analogue and a conjugate to which a drug is linked to the peptide.
  • the present invention further provides an antibiotic comprising the composition or conjugate.
  • FIG. 1 shows the results of confirming whether the peptide according to the present invention actually penetrates the outer membrane of Gram-negative bacteria by attaching TAMRA, which is a fluorescent marker, to five mutant peptides P, N, D, Q or E.
  • TAMRA which is a fluorescent marker
  • Figure 2 shows the results of confirming the permeability of MDA MB231 eukaryotic cells of the peptides according to the present invention using FACS.
  • Figure 3 is a result showing the peptide showing the lowest hemolysis of the LK or KL peptide.
  • Figure 4 shows the results confirming comprehensively whether the peptide according to the present invention has permeability and activity to the membrane of Gram-negative bacteria.
  • Figure 5 shows the results of observing fluorescence using NPN (Naphthylphenylamine) in the presence of E. coli to confirm the mechanism by which the peptide according to the invention activates the membrane.
  • Figure 6 shows the results of observing whether or not the peptide according to the present invention has the ability to disintegrate or disintegrate against the outer or inner wall of the Gram-negative bacteria.
  • Figure 7 shows changes in liposome size in the presence of liposomes and peptides consisting of LPS by DLS.
  • Figure 8 shows confocal microscopy images for NDm-1 staining in E. coli treated with TAMRA conjugated peptides.
  • Figure 9 shows the results of confirming the synergistic effect of KL-L9P and linezolide or clocksacillin.
  • Figure 10 shows the results of confirming the synergistic effect of KL-L9P and rasveratrol.
  • FIG. 11 shows the result of the correlation between the synergistic effect of logP and the hydrophilicity or hydrophobicity of the coadministered compound.
  • Figure 12 shows the results of the correlation between the molecular weight and the synergistic effect of the compound administered in combination.
  • FIG. 13 shows the result of the correlation between the synergistic effect and the total of the candidate compounds co-administered.
  • FIG. 14 shows the results of plotting the correlation between the polar surface area and the molecular weight and synergistic effects of negatively or positively charged compounds.
  • Figure 15 is a schematic diagram comparing the peptide of the double-sided alpha helix structure and the peptide of the folded or broken structure according to the present invention.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating three peptides having a synergistic effect with antibiotics due to Gram-negative bacterial outer membrane activity in a wheel diagram.
  • the hydrophobic side of the double-sided peptide is damaged by proline and is broken (see Fig. 15).
  • FIG. 18 distinguishes KL-L9P from synergistic antibiotics (shown in black) and no antibiotics (shown in gray).
  • FIG. 19 distinguishes KL-L9P from synergistic non-antibiotic drug, Neutraceutical (black) and non-antibiotic drug, Neutraceutical (grey).
  • AMPs antimicrobial peptides
  • Several antimicrobial peptides (AMPs) capable of eradicating Gram-negative bacteria known to date are known. However, most of them are eradicating pathogens by mechanisms that disrupt the cell walls of bacteria. These peptides not only disrupt the cell wall of the pathogen Gram-negative bacteria, but also disrupt the eukaryotic cells, which are host cells, and therefore have a great side effect for use as antibiotics. However, if these AMPs are mutated in various ways, their properties change little by little. Certain mutations not only reduce cell wall disruption to eukaryotic cells, but also exhibit Gram-negative bacteria-specific properties, leaving only the ability to specifically pass the Gram-negative bacteria membrane or to activate the outer membrane.
  • the present inventors continually mutated the peptide having a double-sided helical structure, and attempted to find a peptide that does not have any hemolysis or permeability to eukaryotic cells which are host cells while retaining cell permeability in Gram-negative bacteria.
  • Colistin is a cation-rich bicyclic peptide with a long carbon chain on one side.
  • the reaction mechanism is known that colistin first recognizes the lipid layer of LPS present in the Gram-negative bacterial outer membrane, enters the outer membrane to loosen the outer membrane, and penetrates the inner membrane due to the long carbon chain to kill the bacteria.
  • the mechanism of the colistin antimicrobial peptide like other antimicrobial peptides, can stay on the membrane for a long time rather than quickly remove the biofilm, so that the membrane can be loosened.
  • mutant peptides with a folded or broken structure capable of combating Gram-negative bacteria while reducing the alpha helix, substituting the most sensitive part of the minor surface with an amino acid having a hydrophilic residue, It was confirmed that due to the broken or broken structure, activity on the host cell is lost, thereby minimizing side effects.
  • some mutant peptides with a broken or broken structure were found to be able to degrade or pass through the membrane of the Gram-negative bacteria E. coli and enter the fungus, thus killing or at least loosening the Gram-negative bacteria.
  • the present invention is a peptide or peptide analogue in which a hydrophobic amino acid portion of an alpha helix double-sided peptide composed of hydrophobic and hydrophilic amino acids is substituted and has a folded or broken alpha helix structure, wherein the substituted amino acid is proline.
  • P aspartic acid
  • D asparagine
  • N glutamic acid
  • E glutamine
  • Q D-type amino acids thereof
  • peptides or peptide analogues characterized in that at least one selected from the group consisting of (Eg B (KL-L9P) and C (LK-L8D) structures in FIG. 16).
  • the present invention is directed to the hydrophobic moieties of naturally occurring bilateral antibiotic peptides (e.g. buforin5-21) in which proline (P), aspartic acid (D), asparagine (N), glutamic acid (E), glutamine (Q) It relates to a peptide or a peptide analogue, characterized in that it has an alpha helical structure is substituted by the () structure (A structure of Figure 16).
  • “bent” is used in combination with “bend, bent or broken" in the specification.
  • the "knotted” structure may be a structure formed by substituting a hydrophobic amino acid portion of the alpha helix double-sided peptide consisting of hydrophobic and hydrophilic amino acids, with an amino acid substitution portion in the alpha helix double-sided peptide
  • the alpha helix may be curved.
  • the substituted amino acid is at least one selected from the group consisting of proline (P), aspartic acid (D), asparagine (N), glutamic acid (E), glutamine (Q), D-type amino acids thereof, and derivatives thereof.
  • the membrane can be specifically activated without destroying the membrane as in the general nature of AMP. That is, it was expected that the peptides according to the present invention would pass through the membrane or loosen the membrane to facilitate invasion of other small molecule compounds into the bacteria. This can be expected to have synergistic effects with antibiotics, such as colistin, which loosens the membrane, and also allows for the repositioning of therapeutics for other uses.
  • antibiotics such as colistin
  • A corresponds to a double-sided alpha helix KL peptide structure of the structure is not bent or broken
  • B-1 is a KL-L9P peptide formed by replacing L at position 9 with proline
  • B -2 is an LK-L7PL8P peptide formed by substituting L for positions 7 and 8 with proline
  • B-3 represents an LK-L8D peptide in which L at position 8 is replaced with aspartic acid.
  • the double-sided alpha-helix peptide of the folded or unbroken structure maintains a kind of complete cylindrical structure, but the folded or broken peptide may be bent at the amino acid-substituted portion.
  • the D-type amino acid of the above-exemplified amino acids is an amino acid which does not exist in the natural state, and when substituted with the D-type amino acid, it is possible to provide a peptide forming a diastereomer with the original peptide.
  • Substitution with D-type amino acids alters the sequence of amino acid residues, which may further break the alpha helix, further reducing the toxicity to the host cell and increasing the in vivo half-life by protecting against natural enzyme attack. There is a possibility.
  • Derivatives of the amino acids exemplified above may be in a form containing various protecting groups in the amino acid, for example, as a derivative of proline, azetidine-2 carboxylic acid, homoproline, hydroxyproline (Hydroxyporline), alpha methyl proline, or 4-fluoroproline, and derivatives of glutamic acid, alpha amino adipic acid, gamma hydroxyl glutamic acid), 2-amino heptanedioic acid, or alpha amino suberic acid, but is not limited thereto.
  • the above definitions and examples may be equally applied to the derivatives used herein.
  • the Gram-negative bacterial membrane permeable peptide according to the present invention has at least two or more amino acids constituting the alpha-helix bilateral peptide i, i + 3, i + 4, i + 7, i + 8, i + 10 and i + 11 (i is an integer) at one or more positions selected from the group consisting of disulfide bonds, carbon-carbon bonds, maleimide bonds or amide bonds are connected to be folded through the alpha helix structure.
  • the staple structure is disclosed in WO2016 / 085280, filed by the inventor of the present application, which is incorporated herein by reference.
  • the peptide or peptide analog may exhibit any of the following properties:
  • ii) has the property of binding to the LPS layer on the surface of the Gram-negative bacteria envelope
  • iii) enters the outer membrane and is present only in the outer membrane, having the property of binding to the LPS layer on the surface of the Gram-negative bacteria outer membrane;
  • peptides having the same amino acid composition such as hydrophilic and hydrophobic amino acids, with some amino acids being proline (P), aspartic acid (D), asparagine (N), glutamic acid (E), glutamine (Q), and D- Compared to the peptide substituted with the amino acid type, and derivatives thereof, 6, 7, 8, 9, from the N-terminal to the C-terminal direction in a specific position, such as an alpha helix double-sided peptide according to the present invention
  • the hydrophobic amino acid is selected from proline (P), aspartic acid (D), asparagine (N), glutamic acid (E), glutamine (Q), and its D-type amino acid ,
  • peptides substituted with derivatives thereof are relatively hydrophilic;
  • alpha helix is folded by Pro, and the bent portion is hydrophobic;
  • the total amount of cationic charged amino acids is 35% (6/16) or more, or the total number of hydrophobic amino acids is 35% (6/16) or more;
  • the invention also includes “peptide analogs”.
  • the peptide analogue may comprise an analog substituted with one or more other functional groups with respect to the side chain of the amino acid or the alpha-amino acid backbone.
  • side chain or backbone modified peptide analogs include hydroxyproline in which the pyrrolidine ring is substituted with a hydroxy group, or an N-methyl glycine "peptoid”.
  • the hydrophilic amino acid of the bilateral peptide may comprise one or more selected from the group of positively charged amino acids consisting of arginine, lysine, histidine.
  • the hydrophobic amino acid may be at least one selected from the group consisting of leucine, valine, tryptophan, phenylalanine, tyrosine, isoleucine, D-type amino acids thereof and derivatives thereof.
  • the D-type amino acid of the amino acid exemplified above may provide a peptide which forms a diastereomer with the original peptide when the D-type amino acid is substituted with an amino acid which does not exist in the natural state.
  • the alpha helix double-sided peptide may include a five amino acid sequence represented by the following formula (1) or (1-1), a reverse sequence thereof, or a sequence comprising the same repeatedly.
  • X is a hydrophilic amino acid
  • Y is a hydrophobic amino acid
  • Z is an amino acid substituted for a broken or broken structure, and is proline, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, or a derivative thereof.
  • the hydrophilic amino acid may be arginine, lysine, histidine, or a derivative thereof
  • the hydrophobic amino acid may be leucine, valine, tryptophan, phenylalanine, tyrosine, isoleucine, or a derivative thereof.
  • An example of the specific sequence of the peptide corresponding to the above formula (1) or (1-1) may be KKPLK, KLDKK or QFPVG.
  • the inverse sequence refers to a sequence read in the direction defined by the formula (1) or (1-1), which is read in the 5 'end to the 3' end, from the 3 'end to the 5' end, for example,
  • the reverse sequence of the five amino acid sequence represented by formula (1) may be XYZXX.
  • the repeating sequence comprising the sequence may be repeated several times, for example, 2 to 10 times, preferably 2 to 5 times, in the direction defined by the formula (1) or (1-1) in the 5 'to 3' terminal direction. It may mean a sequence including, for example, when the sequence defined in the formula (1) or (1-1) is repeated twice may include the sequence of XXZYXXXZYX.
  • amino acid sequence may be prepared in the form of a dimer or tetramer.
  • alpha helix double-sided peptide may include a seven amino acid sequence represented by the following formula (2), or (2-1), a reverse sequence thereof, or a sequence comprising the same repeatedly.
  • An example of the specific sequence of the peptide corresponding to the above formula (2) or (2-1) may be LKKPLKL, or LKLDKKL.
  • the double-sided peptide may include a 9 amino acid sequence represented by the following formula (3) or (3-1), a reverse sequence thereof, or a sequence comprising the same repeatedly.
  • Examples of specific sequences of the peptides corresponding to the above formula (3) or (3-1) may be LLKKPLKLL, LLKLDKKLL or GLQFPVGRV.
  • the double-sided peptide may include an 11 amino acid sequence represented by the following formula (4) or (4-1), a reverse sequence thereof, or a sequence including the same repeatedly.
  • An example of the specific sequence of the peptide corresponding to the above formula (4) or (4-1) may be KLLKKPLKLLK, KLLKLDKKLLK or AGLQFPVGRVH.
  • the double-sided peptide may include a 6-amino acid sequence represented by the following formula (5), a reverse sequence thereof, or a sequence including the same repeatedly.
  • An example of the specific sequence of the peptide corresponding to the above formula (5) may be LKPPKK.
  • the double-sided peptide may include an eight amino acid sequence represented by the following formula (6), a reverse sequence thereof, or a sequence including the same repeatedly.
  • alpha helical double-sided peptide may include a 10 amino acid sequence represented by the following formula (7), a reverse sequence thereof, or a sequence including the same repeatedly.
  • alpha helical double-sided peptide may include a 12 amino acid sequence represented by the following formula (8), a reverse sequence thereof, or a sequence including the same repeatedly.
  • An example of the specific sequence of the peptide corresponding to the above formula (8) may be KKLLKPPKKLLK.
  • the alpha helical bilateral peptide may consist of 12-20, preferably 12-18, preferably 12-16, preferably 12-14 hydrophobic and hydrophilic amino acids.
  • the alpha helical bilateral peptide may include at least 35% of the total amino acids constituting the peptide by one or more residues selected from the group consisting of positively charged arginine, lysine and histidine.
  • one or more hydrophobic amino acid residues selected from the group consisting of leucine, tryptophan, valine, phenylalanine, tyrosine, and isoleucine may comprise at least 35% of the total amino acids constituting the peptide.
  • the alpha helical bilateral peptide may comprise a sequence KLLKL (SEQ ID NO: 1) or LKKLL (SEQ ID NO: 2), an inverse sequence thereof, or a repetitive sequence including the same represented by SEQ ID NO: 1 or 2 below have.
  • (LK) n or (KL) n, or (LK) m or (KL) m amino acid at the front end of SEQ ID NO: 1 or 2 may be further bound, wherein n or m are respectively May be independently an integer of 0-2.
  • the alpha helical bilateral peptide comprises a sequence LKKLLKL (SEQ ID NO: 3) or KLLKLLK (SEQ ID NO: 4), an inverse sequence thereof, or a repetitive sequence thereof including the following SEQ ID NO: 3 or 4 Can be.
  • (LK) n or (KL) n, or (LK) m or (KL) m at the front end of the SEQ ID NO: 3 or 4 may further bind, and n or m are respectively May be independently an integer of 0-2.
  • the alpha-helix bilateral peptides are located at positions 6, 7, 8, 9, 11 and 12 in the C-terminal direction at the N-terminus.
  • the amino acids present at one or more positions selected from the group consisting of can be substituted.
  • the amino acid to be substituted may be substituted with proline, aspartic acid or a derivative thereof.
  • the alpha helical bilateral peptide is LKKLLKLLKKLLKL (SEQ ID NO: 5) or KLLKLLKKLLKLLK (SEQ ID NO: 6) and is folded at position 7, leucine position of SEQ ID NO: 5, or position 9 of SEQ ID NO: 6
  • the substituted amino acid may include an amino acid sequence substituted with proline, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, or a derivative thereof, preferably proline, aspartic acid or a derivative thereof.
  • the present invention relates to an antimicrobial composition comprising the peptide or peptide analog, particularly an antimicrobial composition against Gram-negative bacteria, or an antimicrobial composition for concomitant administration.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating a microbial infection disease comprising administering the composition.
  • the present invention relates to an antibiotic comprising the composition.
  • the microorganism means pathogenic microorganisms or resistant bacteria, preferably Gram-negative bacteria pathogenic microorganisms or resistant bacteria.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of an infectious disease caused by the pathogenic microorganism or resistant bacteria by administration of the composition
  • treatment means the pathogenic microorganism or resistant bacteria by administration of the composition. It can mean any action that improves or beneficially changes the symptoms caused by an infectious disease.
  • the composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” is a liquid or solid filler, diluent, excipient involved in the transport or transport of any subject composition or component from one organ or part of the body to another organ or part of the body.
  • a pharmaceutically acceptable material, composition or vehicle such as a solvent or encapsulating material, wherein the composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredients described above for administration. .
  • the carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • compositions of the present invention can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral dosage forms, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • Such solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use include, but are not limited to, suspending agents, solvents, emulsions, syrups, and the like, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, It can be prepared by adding a preservative or the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition according to the invention can be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the condition and weight of the patient, the degree of disease Depending on the drug form, route of administration, and duration, it may be appropriately selected by those skilled in the art. It may be administered once or several times daily as needed, and used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug treatment and biological response modifiers for the prevention or treatment of pathogenic bacteria and resistant bacteria. Can be.
  • the concomitant administration may be used interchangeably with the concomitant administration, and the concomitant dosage form may include a form in which the peptide or the peptide analog and other compound are simultaneously administered or separately administered.
  • the concomitant dosage form may include a form in which the peptide or the peptide analog and other compound are simultaneously administered or separately administered.
  • one or more selected from the group consisting of a hydrophobic compound having a lopP (partition coefficient) value of 0.19 or more, a compound charged with a cation under physiological pH conditions, and colistin may be administered in combination with a peptide or a peptide analogue according to the present invention.
  • the hydrophobic compound having a lopP (partition coefficient) value of 0.19 or more may be, for example, closacillin, linezolid, resveratrol, culcumin, qualcetin, simvastatin, lovastatin, mevastatin cateken, or thymol, but is not limited thereto. It doesn't happen.
  • the compound charged with a cation at the physiological pH conditions may be, for example, erythromycin, ripoppicin, colistin, polymyxin-r, or nicotine, but is not limited thereto. .
  • the compound charged with anion at the physiological pH conditions may be, for example, ibuprofen, atorvastatin, furubastatin, pravastatin, caprofen, trans-ferulic acid, or bromfenac. It is not limited to this.
  • the synergistic effect of a combination administration with a peptide or peptide analogue according to the invention for example, a much lower concentration than when simply adding an effect derived from a plurality of peptides or peptide analogs or compounds to be administered in combination
  • Compounds exhibiting an antimicrobial effect in may be, for example, linezolid, erythromycin, ibuprofen, simvastatin, culcumin, or resveratrol.
  • the present invention relates to a peptide or peptide analog and a conjugate to which a drug is linked to the peptide or peptide analog.
  • the present invention also relates to an antibiotic comprising the conjugate.
  • the drug may be a hydrophobic compound having a lopP (partition coefficient) value of 0.19 or more, a compound charged with a cation at physiological pH conditions, and colistin.
  • lopP partition coefficient
  • the peptide or peptide analog and drug can be linked, for example, via a non-covalent or covalent bond.
  • the non-covalent bond may be, for example, one or more selected from the group consisting of hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions and cation-pi interactions.
  • the covalent bond may be a degradable or non-degradable bond, the degradable bond may be a disulfide bond, an acid decomposable bond, an ester bond, an anhydride bond, a biodegradable bond or an enzymatic decomposable bond, and the non-degradable bond is an amide bond or It may be a phosphate bond, but is not limited thereto.
  • AMPs antimicrobial peptides
  • these antimicrobial peptides are mainly peptides that are produced for the primary immune response in higher animals' immune systems, and their types and shapes vary widely.
  • AMPs antimicrobial peptides
  • these antimicrobial peptides are actually used as antimicrobial agents.
  • Their ability to kill pathogens is too low compared to other low-molecular antimicrobials, and the cost of producing peptides is not economical compared to low-molecular antimicrobials. It is an important reason that was not used.
  • the inventors of the present application continue to make efforts to actually use AMP as an antibiotic by improving three reasons. Given that many natural-derived AMPs have evolved over many years and have undergone many mutations and their own amino acid sequences maximize their AMP properties, these naturally derived peptides can be used to Giving selectivity was not easy. Therefore, the present inventors solved the above three difficulties by observing the change in the ability of the LK peptide, which is a model peptide that mimics the natural AMP, and observing the change of the ability, rather than improving the ability of the naturally occurring AMP. I tried to.
  • the present inventors have selected 14 or 16 double-sided alpha helix peptides and undergo various mutation processes. This is because the two-sided feature and alpha helix are common features that have been observed in many naturally occurring AMPs. Another reason for choosing this peptide is that the LK peptide is composed of 14-16 amino acids, so the economic burden of making the peptide is less than that of a naturally occurring peptide. It is a means to solve the second reason. The inventors first tried to solve from the third reason. The first reason is that even if the activity against the pathogen is increased, if it is toxic to the host cell eukaryotic cells without selectivity, the effort to increase the activity may be completely lost.
  • the model peptide used in the present invention also has the ability to kill eukaryotic cells which are host cells with antibacterial ability, the first mutation was attempted to alleviate this. Since the LK peptide is composed of L on the minority side and K on the hydrophilic side, it is very easy to carry out position-specific mutations. After position-specific substitution of A, hemolysis of these red blood cells was observed. When L was replaced with A at position 8, hemolysis was reduced the most, and thus, L was replaced with another amino acid to find an amino acid that minimizes hemolysis. If N (asparagine) enters position 8 (hereafter N mutation), hemolysis is reduced by 8,000 times compared to that without mutation. Moreover, N mutations could destroy E. coli at 8-fold dilutions, resulting in a 64,000-fold increase in selectivity through one mutation.
  • N mutations The exact mechanism of action for N mutations is not yet known, but the Gram-negative bacteria 'membranes can be more easily broken, as the ability to break eukaryotic cells is lost due to the temporary change in the shape of the peptide's bent helix peptide caused by the N mutation. It is assumed to be. In addition to AMP's ability to break the membrane, there is another reason for better antimicrobial activity against Gram-negative bacteria. This will allow the N mutant peptide to enter the bacteria by the mechanism of activating the membrane and bind to the substances in the bacteria to prevent and destroy the metabolism of the pathogen. In fact, N mutant peptides and the like can be strongly bound to molecules such as DNA or RNA, and this binding can lead to the death of the pathogen by metabolic stop in the pathogen associated with the DNA or RNA.
  • the increase in selectivity obtained from the above experiments is the result obtained under the condition that the peptide obtained through the mutation minimizes eukaryotic cell wall elution and cell permeation.
  • the increase in selectivity of 64,000 times is composed of 8,000 times the factor given by hemolysis, and 8 times the increase in bactericidal power against Gram-negative bacteria. Therefore, in order to observe the increase in antimicrobial activity caused by such mutations, it is desirable to carry out within a mutation that greatly reduces the hemolysis phenomenon.
  • the mutation has already been applied to five levels of D, E, N, P, and Q. It is investigated.
  • rinse amide resin 50 mg was put on a synthetic plastic column, inflated with DMF for 10 minutes, and 3 mL of 20% piperidine was added and subjected to deprotection in microwave. After deprotection, DMF 3, DCM 5, and DMF 3 were washed, 6 equivalents of amino acid and pibap were weighed in an electronic balance and dissolved in DMF. Each of 6 equivalents of amino acid, pibap, and DIPEA were put in a synthesis column to form an amide bond using microwaves. After the coupling was completed, three DMFs, three DCMs, and three DMFs were washed out.
  • the peptide was dissolved in distilled water to remove the remaining TFA, and then transferred to an e-tube, frozen in an 80 ° C. refrigerator for 2 hours, and subjected to a second lyophilization to obtain a peptide powder.
  • LK peptide amino acid sequence, LKKLLKLLKKLLKL; SEQ ID NO: 5, all peptides are N-terminally acetylated and C-terminus is amidated
  • KL peptide amino acid sequence, KLLKLLKKLLKLLK, sequence
  • KL KLLKLLKKLLKLLK (SEQ ID NO: 6) 20 20 1.25 KL-L2P KPLKLLKKLLKLLK (SEQ ID NO: 16) 5 20 20 KL-L3P KLPKLLKKLLKLLK (SEQ ID NO: 17) 10 20 40 KL-L5P KLLKPLKKLLKLLK (SEQ ID NO: 18) 5.0 20 160 KL-L6P KLLKLPKKLLKLLK (SEQ ID NO: 19) 10 > 40 1300 KL-K7P KLLKLLPKLLKLLK (SEQ ID NO: 20) 2.5 5.0 1.2 KL-K8P KLLKLLKPLLKLLK (SEQ ID NO: 21) 2.5 5.0 1.2 KL-L9P KLLKLLKKPLKLLK (SEQ ID NO: 22) 20 > 40 1300 KL-L10P KLLKLLKKLPKLLK (SEQ ID NO: 23) 2.5 20 120 KL-
  • Mammalian cytotoxicity was assessed through a hemolysis assay. Human erythrocyte cells were washed three times with PBS buffer and suspended with 5 v / v% PBS buffer against 5% hematocrite. Peptides were diluted with 2x PBS buffer and then 5% hematocrit was added. Samples were incubated for 3 hours in a 37 ° C. incubator and centrifuged for 5 minutes at 1400 rpm. The supernatant was transferred to a 96 well plate with a flat bottom and measured by 405 nm (background 700 nm) UV absorbance. Distilled water is a positive control and PBS is a negative control.
  • peptides containing Pro prepared specifically for the site could be divided into three classes.
  • the first group was peptides that replaced all Lys with Pro, which improved both the ability to kill Gram-negative bacteria / Gram-positive bacteria / hemolysis, showing no Gram-negative specific potential.
  • the second class of peptides were some of the peptides in which Leu was replaced with Pro. The MIC values for E. coli were improved, but hemolysis was quite good. Peptides belonging to this class are also highly active in Gram-negative bacteria / host cells, so the possibility of Gram-negative bacteria specificity was not high.
  • the third class of peptides were also some of the peptides with Leu-substituted Pro, which showed almost no change in MIC against E.
  • TAMRA fluorescent label attached to the N-terminus of the three peptides and examined for membrane-activity in E. coli. Fortunately, all three peptides were observed to enter E. coli at a concentration of 2.5-5 uM (FIG. 4), confirming the possibility that all three peptides could specifically activate the Gram-negative membrane.
  • the three peptides of FIG. 4 have at least one hemolytic phenomenon at a concentration of 1 mM or more in an experiment using human red blood cells, it can be expected that there are no side effects when the peptides are used for antimicrobial purposes.
  • MTX metalhotrexate
  • a compound that inhibits folic acid biosynthesis was added to the N-terminus of each peptide, and the MIC of the three conjugated compounds was measured.
  • the three MTX-conjugate peptides improved MIC values by 2 to 4 times compared to their parent peptides. This phenomenon is thought that at least the peptides selectively act on the E. coli membrane, and some of them have the effect of entering the bacteria and killing the cells. Therefore, the method of conjugation of such Gram-negative bacterial membrane specific peptides with antibiotics that are difficult to enter into bacteria can be proposed as a good method for developing new antibiotics. Many antibiotics that are difficult to penetrate into bacteria can be used as new antibiotics against Gram-negative bacteria by covalently connecting peptides that have little side effects and are capable of activating E. coli membranes and entering bacteria.
  • coli can be improved by simply mixing colistin with each peptide and treating E. coli, which is representative of Gram-negative bacteria, alone.
  • colistin significantly improves the ability to kill Gram-negative bacteria, it may be determined that the peptide is synergistic with colistin (FICI ⁇ 1.0).
  • E. coli suspension (8 ⁇ 10 7 cells / mL) was centrifuged at 10 min, 25 ° C., 13000 rpm and suspended with 5 mM HEPES buffer (pH 7.2).
  • NPN was added to the E. coli suspension and the NPN final concentration was 5 uM.
  • the fluorescence intensity of E. coli suspension was measured with a FL-55 fluorometer. Peptides were added to E. coli suspension with 5 uM NPN.
  • Fluorescence intensity FI calculated as FI of E. coli suspension including FI-5 uM NPN of peptide added to E. coli suspension.
  • KL-L9P and colistin had the property of touching the outer membrane and entering the outer membrane (FIG. 5). This was measured using KL-L9P and the competitive drug colistin, and it was found that KL-L9P had a greater effect of loosening the outer membrane than colistin when compared in units of moles. Melitin, which is known to be relatively punctured in membranes, was also able to increase NPN fluorescence. However, it is inferred that KL-L9P peptide is short in length and does not puncture.
  • the second experiment was to see if the peptides had the ability to break both the outer and inner walls.
  • Sytox Green a fluorescent material that can only dye DNA
  • E. coli suspension (2 ⁇ 10 8 cells / mL) was incubated with three peptides for 10 minutes in the presence of SYTOX Green (2.5 ⁇ M). Permeability was quantified with a fluorescent activated cell sorter. Average fluorescence intensity of 1 ⁇ 10 4 gate cells was measured.
  • Melittin (control) is a pore-forming peptide that destroys microbial cell membranes.
  • KL-L9P did not stain DNA at all, colistin was found to stain quite well. This shows that the KL-L9P peptide has no degradation or permeability to the inner wall, while colistin and melittin that make pores are well capable of this ability (FIG. 6).
  • LPS extract (sigma) and peptide were suspended in PBS buffer. Each sample was measured in three sets at 25 ° C. with LPS 0.5 mg / mL alone or with LPS 0.5 mg / mL and 500 ⁇ M peptide. The volume size value with the largest volume percentage was selected to calculate the volume size diameter (nm).
  • LK-L12P was used as a positive control. Peptides strongly induced leakage in the inner and outer membranes. Confocal images of KL-L9P show that TAMRA labeled KL-L9P is distributed in the thin periplasmic membrane region as compared to LK-L12P.
  • the KL-L9P peptide was able to penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria better than any other peptide, but it remained in that state without the ability to break the membrane. This allows the membrane to loosen, allowing small hydrophobic molecules to enter the membrane.
  • KL-L9P peptide In the presence of KL-L9P peptide, it is intended to demonstrate whether the antimicrobial ability of other compounds can be improved in Gram-negative bacteria.
  • two antibiotics Lineezolide and Croxacillin, were selected. Common to both compounds are antimicrobials, which are used only in Gram-positive bacteria, and have been found to be nearly ineffective against Gram-negative bacteria because they lack the ability to penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria. If KL-L9P has a synergistic effect on E. coli against both Lineezolide and Croxacillin Compounds, the Gram-negative bacteria specific membrane active peptides we wanted were cells of Lineezolide and Croxacillin It is expected to help penetration.
  • KL-L9P has a synergistic effect on linezolide or cloxacillin, greatly improving its ability to kill Gram-negative bacteria.
  • Our competitive drug, colistin also observed synergy with these two drugs, indicating little synergy effect (Fig. 9).
  • (1) and (2) treated with membrane active peptide KL-L9P and linezolide or xaxacillin have a synergistic effect with a FICI value of less than 0.5.
  • (3) and (4) treated with colistin and linezolide or cloxacillin have no synergistic effect with FICI near 1;
  • FICI 0.2
  • the LK-L7P or LK-L11E which is more than five times lower, has no synergy with a FICI value of more than one.
  • KL-L9P specifically activated the membrane of E. coli in these two experiments, demonstrating significant synergy.
  • Broth microdilution technique (2/3 dilution) was used with MH Broth.
  • Antibiotic and peptide treated E. coli were incubated for 18 hours in a 37 ° C. incubator.
  • colistin did not show synergistic effects (compared to KL-L9P) in combination with existing antibiotics or newly defined repositioning drugs
  • the membrane-activated peptides and MOAs of the present invention can activate membranes differently.
  • Colistin is still used as a golden standard reagent to loosen the membrane and thus can be used as an outer membrane specific active peptide.
  • the present inventors have already found that there is a high synergy between colistin and KL-L9P, so when synergistically with these two membrane active peptides, synergy such as Linezolid and Culcumin, which showed synergy with KL-K9P I confirmed how it would appear.
  • the synergistic effect on the three compounds was comparable to the best of the two (three cases). This is a very good result. Because the synergistic FICI value of the two compounds is 0.3, it is killing E. coli at a dilute concentration of about 1/7 compared with the two compounds alone. If a FICI value of 0.3 was derived, this would be the result of killing the bacteria at concentrations diluted 1/10 of the three compounds alone. In the present invention, the synergistic value of KL-L9P / colistin / linezolide was FICI 0.28.
  • the MICs were 13 uM / 0.8 uM / 60 uM and were able to kill at 1 uM / 50 nM / 6 uM, 12x / 16x / 10x lowered concentrations, respectively.
  • These results can lead to a tentative conclusion that the effect of three compounds in parallel may be greater than the synergy between two compounds. If we anticipate this way, the synergistic effect of antibiotics by n numbers is so large that it can be predicted that the amplification of antimicrobial effect caused by great synergies occurs when several compounds are mixed in nature. have. Many of these may be possible with peptides with membrane activity.
  • the synergistic effect on Gram-negative bacteria is usually expressed by the fractional inhibitory concentration index (FICI), which is considered to be synergistic if the value is less than 0.5, and at 0.2, at least 10 compared to the MIC treated with two antimicrobials alone. There is a possibility of lowering the boat more than twice.
  • FICI fractional inhibitory concentration index
  • many kinds of compounds with colistin and synergy of 0.2-0.4 were found. They select two kinds of isomers, culcumin, ibuprofen, simvastatin, and the like.
  • KL-L9P has a greater synergy than any other mutant fabtide, and it is necessary to understand its general properties.
  • the peptide has a high alpha helix at membrane conditions compared to when at 100% water conditions.
  • the peptide is deviated from the correct spiral shape by Pro, the helix-shaped hydrophilic / smooth surface is a strong membrane activity.
  • the structure of KL-L9P predicted by PyMol program also shows curved alpha helix. In general, the pro-mutated part is thought to be the peak of the alpha helix, but the shape predicted by PyMol appears to be the boundary between hydrophilicity and hydrophobicity.
  • the first screening condition selected peptides that had the least hemolysis of host cells, and mutant peptides that could form too long alpha helix were considered to have been removed.
  • the Pro amino acid in the hydrophobic surface shows hydrophobicity, it does not interfere with the recognition of the long chain of the hydrocarbons present in the membrane which has the same recognition.
  • the split hydrophilic / small water surface seems to have a structure that enables both (N- and C-terminal) recognition of the cation and hydrophilic anion on the surface of the hydrophilic surface. If this is a fully cylindrical alpha helix, the hydrophilic perception of the hydrophilic surface is weakened when the hydrophilic perception is made strong with the molecules of the membrane. It can be weak.
  • the long alpha helix shape also increases the likelihood of disrupting eukaryotic membranes, such as hemolysis of host cells.
  • LK-L7PL8P was the best synergy between colistin and synergy. This mutation is close to KL-L9P because it has a FICI of 0.3 with colistin. However, when synergistic with colistin is about 8.4 uM, KL-K9P has a disadvantage of using 4-5 times more peptide than 2.6 synergistically with colistin. LK-L7P / L8P also had synergy with Linezolide, which had a FICI value of 0.53. This had partial synergy, which was slightly lower than the KL-L9P's FICI value of 0.40 (Table 7).
  • the shape of the LK-L7P / L8P peptide predicted by the peptide shape prediction program is also a general feature of the synergistic peptide since the two alpha helices are short-circuited by the Pro portion.
  • KL-L9P-D form in which all amino acids of the KL-L9P peptide were substituted with D-amino acids, was also made to show synergistic effects with colistin and linezolide.
  • KL-L9D Like KL-L9P, KL-L9D also showed synergistic effects, but both compounds showed higher synergy compared to Asp-containing peptides. Therefore, this synergy phenomenon was confirmed that even if the hydrophobic peptide is broken by the overall double-sided by D rather than P.
  • LK-L8D which is similar in shape to LK-L7P / L8P, which has the largest synergy effect and contains two Pros, was also produced.
  • This peptide also had synergy, although not as much as KL-L9P, so that the peptide hydrophobicly shorted with Asp is similar to a membrane-activated peptide that can loosen the outer membrane of Gram-negative bacteria like a peptide substituted with Pro.
  • no synergy has been found in peptides that have penetrated the entire double sided with other hydrophilic residues (eg G, S, N, Q, E).
  • the ala-scanning method is a good way to find out which of the 14 peptides are amino acid residues that are important for chemical or biological effects.
  • the Ala substitution position of the peptide is said to be the amino acid residue position that has the greatest effect on membrane activity.
  • Ala-scanning peptides did not change more than two times than LK-L9PK14A. Since LK-L9PK14A has a better MIC value than LK-L9P, it is thought that this part of lysine is not important for membrane-activity. Synergy with colistin was then observed at 1/2 MIC concentrations of the peptides, respectively, from the amino acid residue positions with the largest changes in value relative to KL-L9P. ).
  • a peptide library was prepared in which the hydrophobic cotton leucine of KL-L9P was scanned with alanine.
  • the table below shows the amino acid sequence for each peptide and the MIC for E. coli.
  • alanine substitutions resulted in a weak interaction of the bilateral peptide hydrophobicity, resulting in a decrease in MIC compared to KL-L9P.
  • the MIC of KL-L6AL9P and KLA-L9P increased to 80 uM and> 200 uM, respectively.
  • the Leu site which has the greatest influence on the MIC of the peptide, is the 6th site, and it can be seen that the 6th site plays an important role in destroying the hydrophobic side interaction of the double-sided peptide.
  • KLA-L9P when three of the seven Leu were changed to Ala, the double-sided peptide structure was not properly formed or the hydrophobicity of the peptide was weakened, resulting in a rapid increase in MIC due to weak hydrophobic interaction between the cell membrane and the peptide of E. coli.
  • Table 15 shows FICI values when 1/4 MIC peptide and 1/2 MIC peptide are mixed with colicin. Comparing the FICI values of the 1/4 MIC peptide and the 1/2 MIC peptide reveals an important Leu site for synergistic effects of KL-L9P. If the peptide and colistin have a synergistic effect, the MIC of colistin will decrease when the peptide goes from 1/4 MIC to 1/2 MIC. In the case of synergy, when the peptide is from 1/4 MIC to 1/2 MIC, the peptide side fraction increases from 0.25 to 0.5, but the colistin side fraction decreases, so the total FICI value should increase to less than 0.25. As KL-L5AL9P, KL-L9PL10A, and KL-L9PL13A increased by 0.37, 0.31, and 0.29 from 1/4 MIC to 1/2 MIC, the colistin and synergy decreased drastically.
  • a comprehensive view of the hydrophilicity / hydrophobicity results based on how much synergy with colistin or the MIC is worsened by the membrane active ability can reveal the amino acid sequence of the important site. Synergy decreased from hydrophilic to 11, 8 and 7, and to minority from 6 to 5 and 10.
  • the amino acid sequence having an effect can be represented by KPLK in four sequences, KKPLK in five sequences, LKKPLK in six digit sequences, and LLKKPLK in seven digit sequences.
  • the alpha helix shape by the molecular model prediction program always had a bent or curved alpha helix structure like the B-1, B-2 and B-3 shapes, not the perfect cylinder (A). From these facts, it is thought that the peptide with the double structure while maintaining the double helix structure can maximize the recognition of the hydrophilic and hydrophobic molecules in the membrane. This maximization of cognition makes the membrane loose without disrupting the membrane, and hydrophobic small molecules, which could not pass without the peptide, play a big role in penetrating the membrane and entering the fungus. Even if the peptide is bent like this, it is not easy to define how much it is bent. Even with the use of a peptide shape prediction program, it is possible for several shapes to exist at the same time, with large energy differences.
  • the alpha helix can mitigate the toxicity to the host cell. Even if the double-sided peptide does not break with Pro, the artificially folded structure can activate the Gram-negative bacteria membrane to suppress the bacteria by coadministration with various compounds.
  • Gram-negative bacteria specific membrane activity is not only a model peptide having 100% bilaterality, such as LK or KL peptides, but also an appropriate level of bilateral peptides or many kinds of antimicrobial and cell-penetrating peptides present in nature. I answered if I could have the properties of a peptide. This is because the phenomenon discovered by the present inventors may be a very reasonable way to kill gram-negative bacteria invaded by plants such as culcumin rasveratrol, which is an active ingredient produced by plants. That is, culcumin is capable of killing Gram-negative bacteria, but under conditions without such membrane-active peptides, it must be killed at very high concentrations.
  • the culcumin will enter into the bacteria, and because of the synergistic effect, the bacteria can be killed even at a very low concentration range.
  • Buporin (21, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK: SEQ ID NO: 50), which is a part of histone protein 2A that exists in nature, has a null antibiotic effect. While many antibiotics are caused by membrane-degrading properties, buforin has biomembrane permeability. After penetrating the bacteria membrane and entering the bacteria, the bacteria are combined with DNA or RNA in the bacteria to kill the bacteria. In order to further weaken the fungal permeability, the present inventors reduced Buporin 5 to 16 Buporin II originally composed of 21 amino acids (5-20 of Buporin II, RAGLQFPVGRVHRLLRK: SEQ ID NO: 51). Produced -20.
  • the buforin was a peptide that was previously investigated to the extent that there was no hemolysis, no activity against Gram-positive bacteria, and little activity against Gram-negative bacteria. Moreover, these three abilities are very similar to the LK-L9P model peptides invented by the inventors.
  • Buporin 5-20 peptides were now synthesized to measure MIC values for E. coli, and the Gram-negative bacterium was activated to observe synergy with colistin or linezolide.
  • the MIC of bufolin 5-20 was 20 uM, which is almost the same as that reported in the paper.
  • the FICI values of buforin 5-20 and colistin and linezolide observed by Winley method were investigated. The values were 0.5 and 0.7. This means that Buporin 5-20, which is less than KL-L9P, possesses Gram-negative bacterial membrane activity, thus synergizing with other antibiotics.
  • the membrane activity obtained from LK-L9P and its derivatives is exactly the same as the general properties. do. Therefore, the five properties found above can be defined as the general properties of Gram-negative bacterial membrane active peptides.
  • Buphorin 5-20 is very hydrophilic because its retention time in HPLC can be relatively large in size (16 amino acids).
  • KL-L9P is highly hydrophilic with its proline-isomers in different positions, consistent with the fastest retention time under the same HPLC conditions.
  • One of the general properties of membrane active peptides is that they have a cationic charge (or hydrophobic moiety), but are arranged so that their positions are hydrophilic in nature.
  • the low molecular weight compound having synergistic effect with the membrane active peptide was investigated using conventional antibiotics and pharmacological compounds.
  • the low molecular weight compounds include antibiotics, such as linezolid, which have been used for Gram-positive bacteria, NSAID-type low molecular compounds, which are widely used for anti-inflammatory reactions and antipyretics, and low-molecular weight compounds of statins for treating hyperlipidemia. It covers a wide variety of low molecular weight compounds, including the well-known but not yet approved nutraceutical compounds.
  • the antimicrobial synergistic effect of the membrane active peptide KL-L9P and the low molecular weight was performed by calculating the FICI value by the Wimley method. This method is much more accurate than the conventional checker-board assay method, where the existing method uses the 1 / 2-dilution method, while the new method uses the 2 / 3-dilution method, resulting in the dilution of the compound or peptide. We observed the synergy effect while minimizing the possible errors.
  • synergistic compounds have various charges (neutral / positive / negative compounds), recognition with peptides with positive properties does not appear to be a source of synergistic effects.
  • double-sided peptides such as colistin not only give strong synergies with KL-L9P peptides, but simple, electrically negative compounds such as ibuprofen have strong synergies with nearly similar values.
  • Simvastatin and lovastatin are very similar in structure, but simvastatin gives a very strong synergy, while lovastatin gives a much lower synergy than this. Ibuprofen is very interesting that both mirror isomers have a synergistic effect. (FIG. 19).
  • the values indicating the hydrophilicity and hydrophobicity are logP values which are partition coefficients. This value is a log of the ratio of the concentration of the compound dissolved in hydrophobic octanol and the concentration of water dissolved in water. As logP increases, the hydrophobicity of the compound generally increases.
  • Colistin and linezolid have good synergy despite being very hydrophilic molecules.
  • aspirin and atorvastatin have no synergy despite being very hydrophobic.
  • Hydrophilic and synergistic compounds are characterized by the ability to release cations under physiological pH. Despite being hydrophobic, synergy-free compounds are more likely to be charged as anions under relatively physiological pH conditions. Considering that the inner or outer surface of Gram-negative bacteria is negatively charged, it is possible to understand why such anomalous compounds may have synergy. That is, compounds charged with cations are likely to bind to the surface of the membrane and enter the bacteria by membrane active peptides, whereas compounds charged with anions are likely to lose opportunities due to repulsion with the bacterial surface anions (Fig. 11). ).
  • synergy is highly related to the hydrophobicity of the compound (the overall logP and synergy are correlated).
  • the present invention relates to a method for finding a new antibiotic to listen to Gram-negative bacteria using KL-L9P that specifically activates the Gram-negative bacteria membrane, and a parallel therapeutic agent for suppressing Gram-negative bacteria using the same.
  • membrane active peptides are synergistic with therapeutic agents for many different kinds of purposes, up to 65%, showing the role of helping to repurpose them to gram-negative bacteria.
  • the most synergistic compounds among them are (S) -ibuprofen in NSAIDs, simvastatin in statin sequence and curcumin in natural products.
  • Lineezolide (Table 19), Cloxacillin (Table 20), Culcumin (Table 21), and Ibuprofen (Table 22) in the repositioning drugs were also tripled when mixed with KL-L9P and colistin, respectively MICs that kill E. coli when mixed are tabulated (Table 23).
  • the first row (black) represents three compounds alone, the second row (gray) represents two compounds out of three, and the third row (white) represents three compounds. This shows the MIC for E. coli when all of the mixtures were processed.
  • the first row (black) represents three compounds alone, the second row (gray) represents two compounds out of three, and the third row (white) represents three compounds. This shows the MIC for E. coli when all of the mixtures were processed.
  • the first row (black) represents three compounds alone, the second row (gray) represents two compounds out of three, and the third row (white) represents three compounds. This shows the MIC for E. coli when all of the mixtures were processed.
  • the first row (black) represents three compounds alone
  • the second row (grey) represents two compounds out of three
  • the third row (white) represents three compounds. This is the MIC for E. coli when mixed together.
  • the first row (black) represents three compounds alone
  • the second row (grey) represents two compounds out of three
  • the third row (white) represents three compounds. This is the MIC for E. coli when mixed together.
  • MIC was the highest when three compounds were used alone, and lower than that when only two were combined, and the combination of three had the lowest MIC.
  • Resistant Gram-negative bacteria do not have a drug to fight, so a new method of finding a new kind of drug must be discovered in a very short time.
  • One special method is to selectively loosen the outer membrane of Gram-negative bacteria so that the compound can pass through it.
  • a bilateral peptide containing proline was made into a library form and KL-L9P with Gram-negative bacterial membrane activity was selected as a candidate.
  • the peptides were first found to be toxic to the Gram-negative bacteria envelope without touching the host cells at all.
  • the inability to break down the membranes allows the other candidate antibiotics to pass through the membranes due to its long stay on the membranes and the loosening of the membranes.
  • Gram-negative bacterial membrane specific active peptides can replace conventional antibiotics with high side effects such as kidney toxicity and neurotoxicity such as colistin and the like.
  • a great synergistic effect can be expected, so toxic colistin can be administered at a concentration of 1/10 or less of the existing concentration to suppress gram-negative bacteria while minimizing side effects. have.
  • the membrane-activated peptide according to the present invention can add the effect of loosening the outer membrane and the effect of loosening the outer membrane of colistin, the antibiotics found by the present inventors can be used in parallel while lowering the concentration of the membrane active peptide and colistin. Gram-negative bacteria can be suppressed.
  • the outer membrane of Gram-negative bacteria is used to loosen the membrane-activated peptide alone or colistin in combination, many kinds of compounds that are not loose and difficult to penetrate into the bacteria can penetrate into the bacteria. Moreover, the possibility of searching for new antibiotics is also very high because it is possible to accurately screen whether it functions as an antibiotic by passing through the outer membrane of Gram-negative bacteria through the peptide according to the present invention.

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Abstract

본 발명은 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게 본 발명은 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드가 꺾어진 구조를 가지는 그람 음성균 막 투과성 펩타이드, 또는 이의 그람-음성균 특이적 막 활성을 이용한 항균 조성물, 병용 투여용 항균 조성물, 상기 펩타이드에 약물이 연결된 접합체 또는 이를 포함하는 항생제에 관한 것이다.

Description

그람 음성균에 대한 항균 활성을 나타내는 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도
본 발명은 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게 본 발명은 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드가 꺾어진 구조를 가지는 그람 음성균 막 투과성 펩타이드, 또는 펩타이드 유사체 또는 이의 그람-음성균 특이적 막 활성을 이용한 항균 조성물, 병용 투여용 항균 조성물, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 약물이 연결된 접합체 또는 이를 포함하는 항생제에 관한 것이다.
그람-양성균 및 그람-음성균으로 구분되는 항균 약물에 대한 내성균 비율은 점점 더 증가하여, 기존에 존재하는 모든 약에 대한 내성을 가진 균만 만연할 날이 멀지 않았다. 이와 같은 내성균에 의한 병원 내 감염 (hospital-acquired infection)이 가장 심각한 상태이다. 예를 들어 2014년 미국 내 환자만 보더라도 병원 내 감염 환자 수만 약 170만명이며 사망자 수는 10만명에 이루고 있다. 이 사망자의 숫자는 미국 내 여성 사망 1위인 유방암 사망자와 남성 사망 1위인 전립선암 사망자를 더한 숫자보다 많다.
이와 같은 내성균의 극복을 위해선 새로운 항균제가 계속 출시되어야 한다. 다행히도 그람-양성균에 대한 새로운 약들은 2000년대 들어서도 출시되어 있지만, 그람-음성균에 대한 항균 치료제는 1980년대를 끝으로 새로 나오지 않고 있다. 더욱이, 그람-음성균을 제압할 수 있는 신약을 개발하기 의한 파이프-라인에도 후보군의 화합물이 없으므로, 신약 개발을 위해서는 적어도 10-20년의 세월이 필요하다.
그람-음성균에 대한 새로운 항생제는 초를 다투어 개발해야 함에도 불구하고 약이 없는 관계로 질환을 위한 특단의 조치가 필요하다. 지금까지 FDA에서 승인된 다른 용도로 개발된 모든 약을 다시 그람-음성균에 스크리닝하여 새로운 항생제로 이용하려는 리포지셔닝 (repositioning) 또는 리퍼포징 (repurposing) 노력이 시도되었다. 727개 중 42개는 그람-양성균에, 2개는 그람-음성균에 효력이 있는 것으로 알려졌다. 그러나, 이들 2개는 매우 높은 농도에서 효과가 있는 것이므로, 실제 화합물의 독성 등을 고려하면 스크리닝에 의하여 선별된 그람-음성균에 작용 가능한 리포지셔닝 가능한 약물은 없다.
이와 관련하여, 그람-양성균에 대한 약물은 상당히 다수 존재하는데 반하여, 그람-음성균에 대한 약물은 적은 편으로, 이는 항생제의 후보물질이 그람-음성균이 구축한 외막을 통과하지 못하기 때문으로 사료된다.
LPS (Lipopolysaccharide) 층으로 시작된 외막은 LPS층에 의해 친수성 및 소수성을 모두 보유하고 있으므로 대부분의 저분자 약들은 막을 자유자재로 통과할 수 없는 것이 많기 때문이다. 그람-양성균에 잘 들으면서도 그람-음성균에 듣지 않는 항생제의 대부분이 외막을 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다. 대표적인 약으로 리네졸리드 및 클록사실린 등이 있다.
따라서, 그람-음성균의 외막은 신약을 개발하기 위한 주요 표적이며, 이를 분해하거나 약화시키는 화합물은 그람-음성균의 치료제로 사용할 수 있다. 실제로 많은 종류의 항균 펩타이드 (antimicrobial peptide, AMP)가 이와 같은 막을 분해하는 기작으로 항균효과를 가진다. 이와 같은 AMP를 이용하여 막에 의해 통과하지 못하였던 항생물질을 균 내에 도입하는 방법을 고려하여 왔다. 이 가설은 항균 펩타이드/항생제의 병행투여에 의한 시너지효과가 있느냐에 따라 입증될 수 있다.
그러나, 기 보고된 병행투여에 의한 시너지 효과는 실험방법의 오류에 의한 잘못된 결과 (false-positive)로 밝혀졌으며, 항균 펩타이드/항생제 사이에 시너지가 없었다. 즉, 막을 분해하는 항생 펩타이드를 이용하여 기존 항생물질의 시너지를 높이는 방법은 기대한 만큼 작용하지 않음이 판명난 것이다. 항균 펩타이드의 막 붕괴에 의한 항생제의 균 내 침투에 의한 시너지 없음은 아마도 시간차에 의한 부조화 예를 들어, 항균 펩타이드는 매우 빠른 속도로 막을 붕괴하는 반면, 대부분의 항생제는 이보다는 느린 속도로 약효를 내기 때문에 기인한 현상일 수 있을 것으로 사료된다.
이에, 균의 막을 빠른 속도로 분해하여 손상시키는 펩타이드 보다는, 균의 막을 손상하지 않으면서도 막을 통과하여 균 안으로 들어갈 수 있거나 막 자체에 활성을 줄 수 있어서 막을 느슨하게 하는 펩타이드가 오히려 유용하게 시너지 효과를 줄 수 있는 펩타이드가 될 수 있을 것으로 사료된다. 막의 경직도 때문에 막을 통과하지 못하였던 항생제가 막을 통과할 수 있게 되어 시너지를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원 발명자들은 특이적으로 그람 음성균의 외막에만 작용하여 막을 느슨하게 할 수 있는 능력을 가진 그람 음성균 막 활성 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 일부가 치환된 끊어진 또는 꺾어진 알파나선 구조를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 포함하는 병용 투여용 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 상기 펩타이드에 약물이 연결된 접합체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드가 꺾어진 구조를 가지는 그람 음성균 막 투과성 펩타이드 또는 펩타이드 유사체이고,
i) 상기 알파나선형 양면성 펩타이드 또는 펩타이드 유사체의 소수성 아미노산 일부가 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 이의 D-형 아미노산, 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로 치환되어 꺾어진 알파나선 구조를 가지거나,
ii) 상기 알파나선형 양면성 펩타이드를 구성하는 적어도 2개 이상의 아미노산이 i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치에서 이황화 결합, 탄소-탄소 결합, 말레이이미드 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결되어 꺾어진 알파나선 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 제공한다.
경우에 따라서, 본 발명은 양면성 항생 펩타이드 중 (예를 들어 buforin5-21) 소수성 부분이 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q)에 의해 치환되어 꺾어진 알파나선 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 포함하는 병용 투여용 항균 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 상기 펩타이드에 약물이 연결된 접합체를 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 조성물 또는 접합체를 포함하는 항생제를 제공한다.
도 1은 5개의 돌연변이 펩타이드 P, N, D, Q 또는 E에 형광 표지자인 TAMRA를 달아 실제로 본 발명에 따른 펩타이드가 그람-음성균의 외막에 투과되는지 여부를 FACS 실험으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 FACS를 이용하여 본 발명에 따른 펩타이드의 MDA MB231 진핵세포에 대한 투과도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 LK 또는 KL 펩타이드 중 가장 낮은 용혈현상을 나타내는 펩타이드를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드가 그람-음성균의 막에 대한 투과성 및 활성을 보유하고 있는지를 포괄적으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드가 막을 활성화시키는 기작을 확인하기 위하여 E.coli 존재하에서 NPN (Naphthylphenylamine)을 이용한 형광을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드가 그람-음성균의 외벽 또는 내벽에 대한 분해력 또는 해체능력을 보유하고 있는지 여부를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 DLS에 의한 LPS로 이루어진 리포솜 및 펩타이드 존재하의 리포솜 크기의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 TAMRA 접합된 펩타이드를 처리한 E.coli에서 NDm-1 염색에 대한 공초점 현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 KL-L9P와 리네졸리드 또는 클록사실린의 시너지 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 KL-L9P와 라스베라트롤의 시너지 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 병용투여되는 화합물의 친수성 또는 소수성을 나타내는 logP와 시너지 효과 사이의 상관관계를 도식화한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 병용투여되는 화합물의 분자량과 시너지 효과 사이의 상관관계를 도식화한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 병용투여되는 후보 화합물의 전체와 시너지 효과 사이의 상관관계를 도식화한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 음전하 또는 양전하로 하전된 화합물의 극성 표면적(polar surface area) 및 분자량과 시너지 효과 사이의 상관관계를 도식화한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 양면성 알파나선 구조의 펩타이드와 본 발명에 따른 꺽어진 또는 끊어진 구조의 펩타이드를 비교하여 도식한 것이다.
도 16은 본 발명에서 그람-음성균 외막 활성이 있어 항생제와 시너지 효과를 보인 3개의 펩타이드를 휠 다이아그램 (wheel diagram)으로 도식한 것이다. 일반적으로 양면성 펩타이의 소수면이 프롤린에 의해 손상되어 꺾인 (도 15 참조) 구조를 나타낸다.
도 17은 시너지 효과를 평가하기 위한 Wimley의 방법 (BBA, 2015, v. 1848(1), pp. 8-15.)을 나타낸 것이다.
도 18은 KL-L9P와 시너지효과가 있는 항생제(검정색으로 표시)와 없는 항생제(회색으로 표시)를 구분한 것이다.
도 19는 KL-L9P와 시너지 효과가 있는 비항생제 약물, 뉴트라슈티컬(Neutraceutical) (검정색)과 없는 비항생제 약물, 뉴트라슈티컬(Neutraceutical) (회색)을 구분한 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
지금까지 알려진 그람-음성균을 박멸할 수 있는 항균 펩타이드(antimicrobial peptide; AMP)가 여러 개 알려져 있다. 그러나, 이들의 대부분은 박테리아의 세포벽을 붕괴시키는 기작으로 병원체를 박멸하고 있다. 이와 같은 펩타이드들은 병원체인 그람-음성균의 세포벽을 붕괴시킬 뿐만 아니라, 숙주세포인 진핵세포도 붕괴시키므로 항생제로 사용하기엔 부작용이 크다. 다만 이들 AMP를 여러가지로 돌연변이 시키게 되면, 성질이 조금씩 변하게 된다. 이 중 특정한 돌연변이는 진핵세포에 대한 세포벽 붕괴가 줄 뿐 아니라, 그람-음성균의 막을 특이적으로 통과하거나 외막만 활성있게 만드는 능력만을 남겨 그람-음성균 특이적인 성질만을 나타내기도 한다.
이에, 본 발명자들은 양면성 나선 구조를 하고 있는 펩타이드를 계속 돌연변이 시킴으로써, 그람-음성균에 세포투과 성질이 남아 있으면서 숙주세포인 진핵세포에 대한 용혈이나 투과가 전혀 없는 펩타이드를 찾고자 시도하였다.
1950년대 초에 개발되었지만 독성이 심하여 그람-음성균 치료제로 잘 쓰고 있지 않은 화합물이 폴리믹신 계열의 항생제인 콜리스틴이다. 콜리스틴은 양이온이 풍부한 고리 형태이면서, 한쪽에 긴 탄소사슬을 가진 양면성 펩타이드이다. 반응 기작은 우선 콜리스틴이 그람-음성균 외막에 존재하는 LPS의 지질층을 인식하여 외막 내에 들어와 외막을 느슨하게 하며, 긴 탄소사슬 부분 때문에 내막도 뚫고 들어가 균을 죽이는 것으로 알려져 있다. 즉, 콜리스틴 항균 펩타이드의 기작은 다른 항균 펩타이드와 같이 빠르게 균막을 없애기 보다는 긴 시간 동안 막에 머물 수 있으면서 막을 느슨하게 만들 수 있는 성질을 가지고 있어, 실제로 몇 개의 저분자 항생제 분자와 시너지를 관찰할 수 있음이 보고되었다. 이러한 콜리스틴은 외막을 느슨하게 하는 역할을 하는 황금 기준 (golden standard)으로 쓰이고 있으며, 그람-음성균 이외의 진핵세포의 막엔 비교적 작용하지 않는 측면이 있다. 본 발명에선 외막을 자극하는 것은 콜리스틴과 비슷하지만 더욱 독성이 없으면서 외막을 흔드는 능력이 더욱 극대화 된 펩타이드를 양면성 펩타이드의 돌연변이에서 찾고자 한다.
알파나선을 감소시키면서 그람-음성균을 퇴치할 수 있는 꺾인 또는 끊어진 구조를 가진 일부 돌연변이 펩타이드의 여러 돌연변이 연구와 관련하여, 그 중 소수면의 가장 민감한 부분을 친수성 잔기를 가진 아미노산으로 치환하면, 알파나선의 꺾인 또는 끊어진 구조로 인하여 숙주 세포에 대한 활성이 없어져 부작용을 최소화 할 수 있음을 확인하였다. 이외에도, 꺾인 또는 끊어진 구조를 가진 일부 돌연변이 펩타이드는 그람-음성균인 E.coli의 막을 분해하거나 통과하여 균의 안쪽으로 들어갈 수 있으므로, 그람-음성균을 죽이거나 적어도 막을 느슨하게 할 가능성이 있음을 발견하였다.
이를 바탕으로, 본 발명은 일 관점에서, 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 일부가 치환되어 꺾어진 또는 끊어진 알파나선 구조를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체이고, 이 때 치환된 아미노산은 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 이의 D-형 아미노산, 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 관한 것이다 (예를 들어 도 16의 B (KL-L9P) 및 C (LK-L8D) 구조).
경우에 따라서, 본 발명은 자연에 존재하는 양면성 항생 펩타이드 중 (예를 들어 buforin5-21) 소수성 부분이 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q)에 의해 치환되어 꺾어진 알파나선 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 관한 것이다 (도 16의 A 구조).본 명세서에서 “꺽어진”은 명세서 중 “굽어진, 휘어진 또는 끊어진”과 병용하여 동일한 의미로 사용될 수 있고, 상기 “꺽어진” 구조는 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 일부가 치환되어 형성된 구조일 수 있으며, 알파나선형 양면성 펩타이드에서 아미노산 치환 부분을 중심으로 알파나선이 굽은 형태일 수 있다.
이 때 치환된 아미노산은 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 이의 D-형 아미노산, 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이다.
특히, 소수성 아미노산으로 구성된 소수면을 프롤린 (P)을 이용하여 돌연변이시켜 펩타이드를 제작하면, AMP의 일반적 성질과 같이 막을 망가뜨리지 않으면서 막을 특이적으로 활성화 할 수 있음이 밝혀졌다. 즉, 본 발명에 따른 펩타이드들은 막 안쪽으로 통과하든지, 또는 막을 느슨하게 하여 다른 저분자 화합물이 균 안으로의 침임을 용이하게 할 것이 기대되었다. 이를 이용하면 막을 느슨하게 하는 콜리스틴과 같이 항생제 등과 시너지 효과를 줄 것을 기대할 수 있게 되었으며, 다른 용도로 쓰고 있는 치료제의 리포지셔닝 (repositioning)도 가능하게 되었다.
이와 관련하여, 도 15에 따르면, A는 꺽어지거나 끊어지지 않은 구조의 양면성 알파 나선 KL 펩타이드 구조에 해당하고, B-1은 9번 위치의 L을 프롤린으로 치환하여 형성된 KL-L9P 펩타이드이며, B-2는 7 및 8번 위치의 L을 프롤린으로 치환하여 형성된 LK-L7PL8P 펩타이드이며, B-3은 8번 위치의 L을 아스파르트산으로 치환한 LK- L8D 펩타이드를 나타낸다.
또한, 도 16에 따르면, 꺽어지거나 끊어지지 않은 구조의 양면성 알파나선 펩타이드는 일종의 완전한 원통 구조를 유지하나, 꺽어진 또는 끊어진 펩타이드는 아미노산이 치환된 부분에서 굽은 모양을 할 수 있다.
상기 예시된 아미노산의 D-형 아미노산은 L-형 아미노산과 달리, 천연 상태에서 존재하지 않는 아미노산으로, D-형 아미노산으로 치환되면 원래의 펩타이드와 부분이성질체를 이루는 펩타이드를 제공할 수 있다. D-형 아미노산으로 치환되면 아미노산 잔기의 배열이 달라지면서 알파나선을 더 깰 가능성이 있어서 숙주세포에 대한 독성을 더 감소 시킬 수 있을 가능성과, 자연적인 효소에 의한 공격으로부터 보호되어 생체내 반감기를 늘릴 수 있는 가능성이 있다.
상기 예시된 아미노산의 유도체는 아미노산에 다양한 보호기를 함유하고 있는 형태일 수 있으며, 예를 들어 프롤린의 유도체로 아제티딘-2-카르복시산(Azetidine-2 carboxylic acid), 호모프롤린 (Homoproline), 하이드록시프롤린(Hydroxyporline), 알파 메틸 프롤린 (Alpha methyl proline), 또는 4-플루오로프롤린 (4-fluoroproline)이고, 글루탐산의 유도체로 알파 아미노 아디프산 (alpha amino adipic acid), 감마 하이드록실 글루탐산 (gamma hydroxyl glutamic acid), 2-아미노 헵탄디오산 (2-amino heptanedioic acid), 또는 알파 아미노 수베르산 (alpha amino suberic acid)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용된 유도체에 위와 같은 정의 및 예시가 동일하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 그람 음성균 막 투과성 펩타이드는 알파나선형 양면성 펩타이드를 구성하는 적어도 2개 이상의 아미노산이 i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치에서 이황화 결합, 탄소-탄소 결합, 말레이이미드 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결되어 꺾어진 알파나선 구조를 가진다. 상기 스테이플 구조는 본 출원의 발명자에 의해 출원된 WO2016/085280에 개시되어 있으며, 본 출원에 참조로 도입된다.
상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체는 다음의 특성 중 어느 하나를 나타낼 수 있다:
숙주세포에 대한 용혈 활성이나 그람-양성균에 대한 활성이 전혀 없으면서 그람-음성균에 활성을 가짐;
ii) 그람-음성균 외막의 표면에 있는 LPS층과 결합할 수 있는 성질을 가짐;
iii) 그람-음성균 외막의 표면에 있는 LPS 층과 결합할 수 있는 성질을 가지면서 외막에 들어가 외막에만 존재함;
iv) 그람-음성균의 외막을 뚫고 들어가 외막에만 존재하는 성질을 가지면서도 그람-음성균의 외막 또는 내막을 붕괴하는 능력은 없음;
v) 동일한 아미노산 조성을 가지는 펩타이드 예를 들어 친수성 아미노산 및 소수성 아미노산을 포함하면서 일부 아미노산이 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 이의 D-형 아미노산, 및 이의 유도체로 치환된 펩타이드와 비교하여, 본 발명에 따른 양면성 펩타이드 중 특정 위치 예를 들어 알파나선형 양면성 펩타이드에서 N 말단에서 C 말단 방향으로 6번, 7번, 8번, 9번, 11번 및 12번 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 위치에, 소수성 아미노산이 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 이의 D-형 아미노산, 및 이의 유도체로 치환된 펩타이드가 상대적으로 친수성이 강함;
vi) Pro에 의해 알파나선이 꺾인 구조를 하고 있으며, 꺾인 부분은 소수성을 띠고 있음;
vii) 양이온 하전된 아미노산이 전체적으로 35% (6/16), 또는 그 이상이거나, 소수성 아미노산이 전체적으로 35% (6/16) 또는 그 이상임;
viii) 숙주세포에 대한 용혈활성 및 그람-양성균에 대한 활성은 없음; 및
ix) 그람-음성균에 대한 활성이 약하게 남아 있음 (MIC = 10-20 uM).
본 발명은 또한 “펩타이드 유사체”를 포함한다. 상기 펩타이드 유사체는 아미노산의 측쇄 또는 알파-아미노산 백본에 대하여 하나 이상의 다른 기능기로 치환된 유사체를 포함할 수 있다. 측쇄 또는 백본 개질화 펩타이드 유사체의 예로는 피롤리딘 고리가 하이드록시기로 치환된 하이드록시프롤린이나, N-메틸 글리신 "펩토이드"를 들 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 양면성 펩타이드의 친수성 아미노산은 알지닌, 라이신, 히스티딘으로 이루어진 양전하는 띤 아미노산 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 소수성 아미노산은 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 이소루신, 이의 D-형 아미노산 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 예시된 아미노산의 D-형 아미노산은 앞서 언급한 바와 같이, 천연 상태에서 존재하지 않는 아미노산으로, D-형 아미노산으로 치환되면 원래의 펩타이드와 부분이성질체를 이루는 펩타이드를 제공할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (1) 또는 (1-1)로 표시되는 5개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
XXZYX (1)
XYZYY (1-1)
상기 식에서, X는 친수성 아미노산, Y는 소수성 아미노산, Z는 꺾어진 또는 끊어진 구조를 위해 치환된 아미노산으로, 프롤린, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 또는 이의 유도체이다. 이 때, 상기 친수성 아미노산은 알지닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이의 유도체 일 수 있고, 소수성 아미노산은 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 이소루신, 또는 이의 유도체일 수 있다.
위 식 (1) 또는 (1-1)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 KKPLK, KLDKK 또는 QFPVG일 수 있다.
상기 역서열은 5’ 말단에서 3’ 말단 방향으로 읽히는 위 식 (1) 또는 (1-1)로 정의된 서열을 3’ 말단에서 5’ 말단 방향으로 읽은 서열을 의미하며, 예를 들어, 상기 식 (1)로 표시되는 5개 아미노산 서열의 역서열은 XYZXX일 수 있다.
상기 서열을 포함하는 반복서열은 위 식 (1) 또는 (1-1)로 정의된 서열을 5’ 말단에서 3’ 말단 방향으로 수회 예를 들어 2 내지 10회, 바람직하게 2-5회 반복적으로 포함하는 서열을 의미할 수 있으며, 예를 들어 위 식 (1) 또는 (1-1)로 정의된 서열이 2회 반복되는 경우 XXZYXXXZYX의 서열을 포함할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 아미노산 서열을 다이머나 테트라머 형태로 제작할 수도 있다.
또한, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (2), 또는 (2-1)로 표시되는 7개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
YXXZYXY (2)
YXYZYYX (2-1)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (2) 또는 (2-1)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 LKKPLKL, 또는 LKLDKKL일 수 있다.
또한, 상기 양면성 펩타이드는 다음의 식 (3) 또는 (3-1)로 표시되는 9개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
YYXXZYXYY (3)
YYXYZYYXY (3-1)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (3) 또는 (3-1)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 LLKKPLKLL, LLKLDKKLL 또는 GLQFPVGRV일 수 있다.
또한, 상기 양면성 펩타이드는 다음의 식 (4) 또는 (4-1)로 표시되는 11개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
XYYXXZYXYYX (4)
YYYXYZYYXYX (4-1)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (4) 또는 (4-1)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 KLLKKPLKLLK, KLLKLDKKLLK 또는 AGLQFPVGRVH일 수 있다.
또한, 상기 양면성 펩타이드는 다음의 식 (5)로 표시되는 6아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
YXZZXX (5)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (5)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 LKPPKK일 수 있다.
또한, 상기 양면성 펩타이드는 다음의 식 (6)로 표시되는 8개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
YYXZZXXY (6)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (7)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 LLKPPKKL일 수 있다.
또한, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (7)로 표시되는 10개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
XYYXZZXXYY (7)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (7)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 KLLKPPKKLL 일 수 있다.
또한, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (8)로 표시되는 12개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
XXYYXZZXXYYX (8)
상기 식에서, X, Y 및 Z는 위 식 (1)에서의 정의와 동일하다.
위 식 (8)에 해당하는 펩타이드의 구체적 서열의 예로는 KKLLKPPKKLLK 일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 12-20개, 바람직하게 12-18개, 바람직하게 12-16개, 바람직하게 12-14개의 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성될 수 있다.
경우에 따라서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 양전하를 띄는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 펩타이드를 구성하는 총 아미노산의 35% 이상 포함할 수 있다.
또한, 루신, 트립토판, 발린, 페닐알라니, 타이로신, 및 이소루신으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 펩타이드를 구성하는 총 아미노산의 35% 이상 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 1 또는 2로 표시되는 서열 KLLKL (서열번호 1) 또는 LKKLL (서열번호 2), 이의 역서열 또는 이를 포함하는 반복서열을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 1 또는 2의 전단에 (LK)n 또는 (KL)n, 또는 후단에 (LK)m 또는 (KL)m의 아미노산이 추가로 결합할 수 있으며, 상기 n 또는 m은 각각 독립적으로 0-2의 정수일 수 있다.
또 하나의 실시예에서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 3 또는 4로 표시되는 서열 LKKLLKL (서열번호 3) 또는 KLLKLLK (서열번호 4), 이의 역서열 또는 이를 포함하는 반복서열을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 서열번호 3 또는 4의 전단에 (LK)n 또는 (KL)n, 또는 후단에 (LK)m 또는 (KL)m의 아미노산이 추가로 결합할 수 있으며, 상기 n 또는 m은 각각 독립적으로 0-2의 정수일 수 있다.
이러한 알파나선형 양면성 펩타이드 중 꺽어진 또는 끊어진 펩타이드 구조를 형성하기 위하여, 예를 들어 알파나선형 양면성 펩타이드 N 말단에서 C 말단 방향으로 6번, 7번, 8번, 9번, 11번 및 12번 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산이 치환될 수 있다. 이 때 치환되는 아미노산은 예를 들어 프롤린, 아스파르틱 산 또는 이의 유도체로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 실시예에서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 LKKLLKLLKKLLKL (서열번호 5) 또는 KLLKLLKKLLKLLK (서열번호 6)이고, 서열번호 5의 7,8번 류신 위치, 또는 서열번호 6의 9번 위치에 꺾어진 구조를 위해 치환된 아미노산을 포함할 수 있다. 이 때 치환된 아미노산은 프롤린, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 또는 이의 유도체, 바람직하게 프롤린, 아스파르틱 산 또는 이의 유도체로 치환된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 포함하는 항균 조성물, 특히 그람-음성균에 대한 항균 조성물, 또는 병용 투여용 항균 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 미생물 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 항생제에 관한 것이다.
이 때, 상기 미생물은 병원성 미생물 또는 내성균, 바람직하게 그람 음성균의 병원성 미생물 또는 내성균을 의미한다. 본 발명에서, "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 상기 병원성 미생물 또는 내성균에 의한 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 병원성 미생물 또는 내성균 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭하며, 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 병원성 세균 및 내성균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 상기 병용 투여는 병행 투여와 교차하여 사용할 수 있으며, 병용 투여 형태는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체와 기타 화합물을 동시 투여하거나, 또는 별도 투여하는 형태를 모두 포함할 수 있다. 이 때, lopP (partition coefficient) 값이 0.19이상인 소수성 화합물, 생리적 pH 조건에서 양이온으로 하전된 화합물 및 콜리스틴으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상과 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 병용 투여할 수 있다.
상기 lopP (partition coefficient) 값이 0.19이상인 소수성 화합물은 예를 들어, 클로사실린, 리네졸리드, 레스베라트롤, 컬큐민, 퀄세틴, 심바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴 카테켄, 또는 타이몰일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생리적 pH 조건 예를 들어, pH 7.3~7.4에서 양이온으로 하전된 화합물은 예를 들어, 에리쓰로마이신, 리팝피신, 콜리스틴, 폴리믹신-비, 또는 니코틴일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생리적 pH 조건 예를 들어, pH 7.3~7.4에서 음이온으로 하전된 화합물은 예를 들어 이부프로펜, 아토바스타틴, 후루바스타틴, 프라바스타틴, 카프로펜, 트란스-페룰릭산, 또는 브롬페낙 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체와의 병용 투여를 통해 시너지 효과 예를 들어, 병용 투여 대상 복수의 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 또는 화합물로부터 유래된 효과가 단순히 더해진 경우에 비해 훨씬 더 적은 농도에서도 항균 효과가 나타나는 화합물은 예를 들어, 리네졸리드, 에리쓰로마이신, 이부프로펜, 심바스타틴, 컬큐민, 또는 레스베라트롤일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 펩타이드, 또는 펩타이드 유사체 및 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 약물이 연결된 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 접합체를 포함하는 항생제에 관한 것이다.
상기 약물은 lopP (partition coefficient) 값이 0.19이상인 소수성 화합물, 생리적 pH 조건에서 양이온으로 하전된 화합물 및 콜리스틴일 수 있다. 각 구성의 정의는 앞서 언급한 바와 동일하다.
상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체와 약물은 예를 들어, 비공유 결합 또는 공유 결합을 통해 연결될 수 있다. 상기 비공유 결합은 예를 들어, 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 및 양이온-파이 상호작용으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 공유 결합은 분해성 또는 비분해성 결합일 수 있으며, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합일 수 있고, 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 포스페이트 결합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1.양면성 LK 펩타이드의 돌연변이 합성과 그람-음성균 막-특이적 펩타이드의 선택
자연엔 많은 종류의 항생 펩타이드 (antimicrobial peptide, AMP)가 있다. 이것들은 주로 고등동물의 면역체계 중 1차적인 면역반응을 위해 만들어 내는 펩타이드 들이며, 그 종류 및 모양도 매우 다양하다. 최근 이와 같은 항균 팹타이드의 생체 내 새로운 기능이 밝혀지면서 이와 같은 항생 펩타이드에 대한 관심은 계속 높아지고 있다. 그러나 이들 항균 펩타이드를 실제로 항균제로 사용한 예는 지금까지 단 한 건도 없다. 이들이 병원균을 죽일 수 있는 능력이 다른 저분자 항균물질에 비하여 지나치게 떨어지며, 펩타이드의 생산 단가가 저분자 항균물질에 비해 경제적이지 못하며, 항균 펩타이드가 숙주세포인 진핵세포를 손상시킬 수 있는 부작용 등이 AMP가 약으로 쓰이지 못한 중요 이유이다.
본 출원의 발명자들은 세 가지 이유를 개선하여 AMP를 실제로 항생제로 쓰기 위한 노력을 계속 해 오고 있다. 많은 자연 유래 AMP는 오랜 세월을 거쳐오면서 많은 돌연변이 과정을 거치면서 그 나름대로의 아미노산 서열이 AMP의 성질을 극대화 하도록 진화해 온 것이 사실임을 감안하면, 이와 같은 자연유래 펩타이드를 가지고 그 능력을 향상 시키거나 선택성을 주기는 쉽지 않아 보였다. 따라서 본 발명자들은 자연유래 AMP의 능력을 개선하기 보다는, 자연 AMP를 모방하는 모델 펩타이드인 LK펩타이드에서 여러 가지 돌연변이를 시켜 그 능력의 변화를 관찰하고, 개선된 펩타이드를 도출 함으로서 위의 세가지 난점을 해결하려고 시도하였다.
그 노력의 하나로 본 발명자는 14개 혹은 16개로 이루어진 양면성 알파나선 펩타이드를 선정해 여러 돌연변이 과정을 거치고 있다. 양면성이라는 특징과 알파나선은 많은 많은 자연유래 AMP에선 관찰되어 온 일반적인 특징이기 때문이다. 이 펩타이드를 선택한 또 하나의 이유는 LK펩타이드는 14-16개의 아미노산으로 구성되어 있으므로 펩타이드를 만드는 경제적 부담이 자연 유래 펩타이드에 비해 적다는 것도 하나의 이유가 된다. 두 번째 이유를 해결하기 위한 수단이다. 본 발명자들은 우선 세 번째 이유부터 해결하고자 노력했다. 첫 번째 이유인 병원체에 대한 활성을 높인다고 해도 이것이 선택성이 없이 숙주세포인 진핵세포에 대해 독성이 나타난다면 활성을 높인 노력이 완전히 없어질 수도 있기 때문이다. 실제로 잘 쓰고 있는 약의 특징을 보아도, 약효가 높은 것도 중요하지만, 선택성 또는 치료범위(therapeutic window) (또는 치료 인덱스: therapeutic index)가 커서 부작용 없이 높은 농도로 약을 쓸 수 있는 약이 좋은 신약이 될 수 있기 때문이라 할 수 있다. 특히, 항생 펩타이드의 경우는 이 점을 눈여겨 보아야 한다. 왜냐하면 항균 펩타이드의 작용 기작이 병원균의 막을 망가뜨리는 것이 주를 이루고 있으며, 이 능력은 숙주세포인 진핵세포의 벽도 망가뜨릴 수 있기 때문이다.
본 발명에서 쓰고 있는 모델 펩타이드도 항균능력과 함께 숙주세포인 진핵세포를 죽일 수 있는 능력이 있으므로 이를 경감하고자 첫번째 돌연변이를 시도하였다. LK펩타이드는 소수면에는 L, 친수면에는 K로 구성되어 있으므로, 위치 특이적인 돌연변이를 시키기 매우 용이하다. 위치 특이적으로 A을 치환시킨 후, 이것들의 적혈구에 대한 용혈현상을 관측했다. 8번 자리에 L이 A로 치환되었을 때 가장 크게 용혈 현상이 감소되었으므로, 이 L을 다른 아미노산으로 치환하여 용혈현상을 최소화 하는 아미노산을 찾아냈다. 만약 8번 위치에 N (아스파라진)이 들어가게 되면 (이하, N 돌연변이) 돌연변이가 되지 않은 것에 비해 용혈현상이 8,000배 감소한 것이 밝혀졌다. 더욱이, N 돌연변이는 대장균을 8배 묽은 농도에서도 괴멸시킬 수 있었으며, 이 결과로 하나의 돌연변이를 통해 64,000배의 선택성 증가를 가지고 왔다.
N 돌연변이에 대한 정확한 작용 기작은 아직 정확하게 밝혀져 있지 않지만, N 돌연변이 때문이 일어난 펩타이드의 일시적으로 굽어진 나선 펩타이드의 모양 변화 때문에 진핵세포를 망가뜨리는 능력은 없어지면서, 그람-음성균의 막은 더 쉽게 망가뜨릴 수 있을 것으로 추정하고 있다. 막을 망가뜨릴 수 있는 AMP의 능력과 더불어 그람-음성균에 더 좋은 항균력을 가진 또 하나의 이유가 있다. 이는 N 돌연변이 펩타이드가 막을 활성화 시키는 기작에 의해 균 내로 들어가 균 내에 있는 물질과 결합하여 병원균의 대사를 막아 괴멸시킬 수 있을 것이다. 실제로 N 돌연변이 펩타이드 등은 DNA 또는 RNA등의 분자와 강력한 결합을 할 수 있고, 이 결합은 DNA 또는 RNA가 관련된 병원균내의 대사정지에 의한 병원균의 죽음으로 이어질 수 있다.
위 실험의 결과 얻어진 선택성의 증가는 돌연변이를 통해 얻어진 펩타이드가 진핵세포 세포벽 용출 및 세포 투과가 최소화 되는 조건에서 얻어진 결과이다. 즉 64,000 배의 선택성의 증가에서 용혈현상이 준 요소가 8,000 배, 그람-음성균에 대한 살균력의 증가 요소가 8배로 구성되어 있다. 따라서 이와 같은 돌연변이에 의한 항균력의 증가를 관찰하려면, 용혈 현상을 대폭적으로 줄이는 돌연변이 내에서 수행하는 것이 바람직하며, 선행연구의 결과로 이 돌연변이는 D, E, N, P, Q의 다섯 가지 정도로 이미 조사되어 있다. 그람-음성균에 병원체에 대한 세포 투과력을 빠르게 점검해 보고자 8번 위치의 각각의 아미노산을 이용한 돌연변이 5개를 만들어보았다 (L8N, L8Q, L8D, L8E 및 L8P). 8번 위치가 가장 진핵세포 용혈에 민감한 자리임을 이미 수행한 실험을 통해 알고 있으므로, 이곳의 변화는 또 다른 큰 변화를 일으킬 수 있다고 예상 할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 5개의 돌연변이 펩타이드에 형광 표지자인 TAMRA를 달아 실제로 이 펩타이드가 그람-음성균에 들어가는지를 FACS 실험으로 확인하였으며 그 결과를 도 1에 표시하였다.
본 발명자들의 생각대로, 이 돌연변이 펩타이드들은 그람-음성균인 대장균에 꽤 많은 농도로 들어가는 것을 관찰하였다. 도 1에서 보듯이 그람-음성균에 잘 들어가는 정도는 P>>N=D>Q=E 로 나타났으며, 가장 좋은 P-의 경우, 2.5 microM 정도의 농도를 사용시에 약 60%정도 펩타이드가 균으로 들어가는 것을 알 수 있었다. 이 돌연변이 펩타이드는 적어도 100 microM 까지는 전혀 용혈현상을 안 일으킬 뿐만이 아니라, MDA MB231 세포주로 실험한 진핵세포에 FACS를 이용한 대한 세포 투과도 5 microM의 농도에서 거의 일어나지 않는 것으로 조사되었다 (도 2). 또한 이 P-돌연변이 펩타이드는 그람-양성균에서도 들어가지 않는 것을 확인 할 수 있었다 (데이터 도시하지 않음). 결론적으로, P-돌연변이 펩타이드는 그람-음성균에만 선택적으로 세포 투과 또는 막을 활성화 할 수 있으므로, P-돌연변이 펩타이드를 이용하면 그람-음성균에 선택적인 약 전달이 가능하다.
실시예 2. 프롤린을 이용한 돌연변이 펩타이드의 합성과 그람-음성균 막 특이적 돌연변이의 선택
(1) 고체상 펩타이드 합성법을 이용한 Pro 돌연변이 LK, KL 펩타이드 라이브러리 제조
링크 아마이드 레진 (0.52g/mmol) 50 mg을 합성용 플라스틱 컬럼에 넣고 DMF로 10분동안 부풀린 뒤 20% 피페리딘을 3mL 넣고 마이크로 웨이브에서 디프로텍션 반응을 했다. 디프로텍션이 끝나고 DMF 3번, DCM 5번, DMF 3번 씻고, 6당량의 아미노산과 파이밥을 전자 저울로 측량한 뒤 DMF에 녹였다. 각각 6당량에 해당하는 아미노산, 파이밥, DIPEA를 합성용 컬럼에 넣고 마이크로웨이브를 이용하여 아미드 결합을 만들었다. 커플링이 끝나고 DMF 3번, DCM 3번, DMF 3번 씻어냈다. 1 % TNBS 테스트 용액과 10% DIPEA 용액을 각각 1방울 씩 레진에 떨어뜨려 반응 완결 여부를 확인했다. 해당 아미노산 서열을 모두 커플링 시켜 준 뒤 6당량 HOBt와 6당량 무수 아세트산을 이용해서 펩타이드의 N 말단을 아세틸화 했다. 레진에서 합성된 펩타이드는 95 % v/v TFA, 2.5 % v/v 증류수, 2.5 % v/v TIS 용액을 컬럼에 넣고 2시간 동안 800-1000 rpm으로 돌려 레진으로부터 떼어냈다. 15 mL 팔콘 튜브에 끊어진 펩타이드 용액을 옮긴 뒤 질소 기체로 TFA를 날렸다. - 20℃에서 보관한 결정 용액(n-헥세인 50 % v/v, 다이 에틸 에터 50 % v/v)을 15 mL 팔콘 튜브에 총 부피가 10 mL이 되도록 부어 주고 1분 동안 볼텍싱해서 결정이 생기도록 했다. 볼텍싱한 뒤 무게를 맞춘 15 mL 팔콘 튜브를 하나 더 준비해서 원심분리기 기계에 넣은 후 20분, 4℃, 4500 rpm 조건으로 원심분리했다. 결정을 제외하고 결정용액을 따라낸 뒤 볼텍싱을 다시 하고 원심분리기로 동일한 조건으로 원심분리 했다. 펩타이드 결정이 생긴 상등액을 제거하고 남은 결정 용액은 질소 기체로 날린 후 DMSO로 다시 결정을 녹여 0.45 μm 필터로 거른 후 고성능 액체 크로마토그래피로 분리했다. 고성능 액체 크로마트그래피의 컬럼으로는 C-18 컬럼을 사용했으며 사용한 용매는 아세토나이트릴(0.1 % v/v TFA)과 증류수(0.1 % v/v TFA)이다. 고성능 액체 크로마토그래피로 분리한 펩타이드는 MALDI TOFF를 이용해서 m/z 값을 측정해서 확인했다. 고성능 액체 크로마토그래피로 분리한 펩타이드는 - 80℃ 냉장고에서 2시간 동안 얼린 뒤 1차 동결건조했다. 1차 동결건조가 끝나고 남아있는 TFA를 제거하기 위해 펩타이드를 증류수에 녹인 뒤 e-tube에 옮겨서 - 80℃ 냉장고에서 2시간 동안 얼리고 2차 동결건조를 해서 펩타이드 파우더를 얻었다.
(2) 그람-음성균 막 특이적 돌연변이의 선택
실시예 1에 기술하였듯이, Pro-돌연변이를 이용하여 굽어진 알파나선 펩타이드를 제조하면, 그람-음성균 막-특이적인 펩타이드가 될 가능성을 보였다. 본 발명에선 14개의 아미노산으로 구성된 LK 펩타이드 (아미노산 서열, LKKLLKLLKKLLKL; 서열번호 5, 모든 펩타이드는 N-말단은 아세틸화 되어 있으며 C-말단은 아미드화 되어 있음) 및 KL 펩타이드 (아미노산 서열, KLLKLLKKLLKLLK, 서열번호 6)의 N-말단 또는 C-말단 외 위치하는 모든 Lys 및 Leu을 Pro로 치환한 펩타이드를 만들어 꺾인 구조를 가진 펩타이드 라이브러리를 제조하여 이 중 어떤 돌연변이가 가장 그람-음성균 막 특이적인 성질을 가지는가를 조사하였다. 꺾인 구조는 알파나선을 급격하게 감소시켜 숙주세포에 대한 독성을 크게 감소시킬 가능성이 있다. 또한, 그람-음성균 막 특이성을 나타낼 가능성 때문에 Pro-돌연변이를 위치 특이적으로 제조하였다. 제조된 펩타이드를 이용하여 그람-음성균인 E.coli 또한 그림-양성균인 S.aureus등에 대한 MIC 및 숙주 세포에 대한 용혈 현상을 알아보았다 (표 1).
LK peptide Pro-mutant의 아미노산 서열 및 Escherichia coli (ATCC 25922) 및Staphylococcus aureus (ATCC 29213) 에 대한 MIC 값 및 용혈현상에 대한 MHC 값들.
Peptide Sequence MIC [μM] [a]AgainstE. coli MIC [μM]Against S. aureus MHC [μM][b]
LK LKKLLKLLKKLLKL(서열번호 5) 20 20 0.3
LK-L4P LKKPLKLLKKLLKL(서열번호 7) 5 40 160
LK-L5P LKKLPKLLKKLLKL(서열번호 8) 5.0 20 160
LK-K6P LKKLLPLLKKLLKL(서열번호 9) 2.5 5.0 0.60
LK-L7P LKKLLKPLKKLLKL(서열번호 10) 2.5 20 160
LK-L8P LKKLLKLPKKLLKL(서열번호 11) 10 >40 1280
LK-K9P LKKLLKLLPKLLKL(서열번호 12) 5.0 5.0 0.60
LK-K10P LKKLLKLLKPLLKL(서열번호 13) 5.0 5.0 0.60
LK-L11P LKKLLKLLKKPLKL(서열번호 14) 5 >40 >1280
LK-L12P LKKLLKLLKKLPKL(서열번호 15) 2.5 10 160
[a] MIC(Minimum inhibitory concentration)는 대표적 그람음성균인 Escherichia coli (ATCC 25922) 성장을 20%로 저해하는데 요구되는 펩타이드 농도[b] MHC(Minimum hemolytic concentration)는 hRBC에서 10% 용혈에 요구되는 펩타이드 농도
KL peptide Pro-mutant 의 아미노산 서열 및 Escherichia coli (ATCC 25922) 및Staphylococcus aureus (ATCC 29213) 에 대한 MIC 값 및 용혈현상에 대한 MHC 값들.
Peptide Sequence MIC [μM] [a]AgainstE. coli MIC [μM]Against S. aureus MHC [μM][b]
KL KLLKLLKKLLKLLK(서열번호 6) 20 20 1.25
KL-L2P KPLKLLKKLLKLLK(서열번호 16) 5 20 20
KL-L3P KLPKLLKKLLKLLK(서열번호 17) 10 20 40
KL-L5P KLLKPLKKLLKLLK(서열번호 18) 5.0 20 160
KL-L6P KLLKLPKKLLKLLK(서열번호 19) 10 >40 1300
KL-K7P KLLKLLPKLLKLLK(서열번호 20) 2.5 5.0 1.2
KL-K8P KLLKLLKPLLKLLK(서열번호 21) 2.5 5.0 1.2
KL-L9P KLLKLLKKPLKLLK(서열번호 22) 20 >40 1300
KL-L10P KLLKLLKKLPKLLK(서열번호 23) 2.5 20 120
KL-L12P KLLKLLKKLLKPLK(서열번호 24) 2.5 20 320
KL-L13P KLLKLLKKLLKLPK(서열번호 25) 5 10 40
[a] MIC(Minimum inhibitory concentration)는 대표적 그람음성균인 Escherichia coli (ATCC 25922) 성장을 20%로 저해하는데 요구되는 펩타이드 농도[b] MHC(Minimum hemolytic concentration)는 hRBC에서 10% 용혈에 요구되는 펩타이드 농도
용혈 어세이를 통해 포유동물 세포 독성을 평가하였다. 인간 적혈구 세포를 PBS 버퍼로 3회 수세하고, 5 % 헤마토크리트 (hematocrite)에 대하여 PBS 버퍼 5 v/v %로 서스펜션하였다. 펩타이드를 2배의 PBS 버퍼로 희석하고, 이후 5 % 헤마토크리트를 첨가하였다. 샘플을 37 ℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 1400 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 옮기고, 405 nm (background 700 nm) UV 흡광도로 측정하였다. 증류수가 양성 대조군이고, PBS는 음성대조군이다.
도 3에 따르면, 위치 특이적으로 제조된 Pro를 함유하고 있는 펩타이드들을 세 가지 부류로 나눌 수 있었다. 첫 번째 부류는 모든 Lys을 Pro로 치환한 펩타이드 들인데 이들은 그람-음성균을 죽이는 능력/그람-양성균을 죽이는 능력/용혈현상이 모두 향상되어 전혀 그람-음성균 특이적 가능성이 보이지 않았다. 두 번째 부류에 해당하는 펩타이드는 Leu이 Pro로 치환된 일부의 펩타이드들이었는데, E.coli에 대한 MIC값도 향상되어 있지만 있으면서 용혈현상도 꽤 잘 일어나는 편이었다. 이 부류에 속한 펩타이드 들도 그람-음성균/숙주세포에 대한 활성이 같이 움직이고 있으므로, 그람-음성균 특이적일 가능성이 그리 높게 평가되지는 못했다. 세 번째 부류에 해당하는 펩타이드들은 역시 Leu이 Pro로 치환된 펩타이드 들 중 일부였는데, 이들은 용혈현상과 그람-양성균에 대한 활성이 거의 없어졌으면서 E.coli에 대한 MIC는 치환되지 않은 것에 비해 거의 변화가 없거나 조금 향상된 것들이었다. 비록 그람-음성균에 대한 MIC에 대한 변화의 차이는 있어도, 큰 폭의 용혈현상의 감소 및 그람-양성균에 대한 현저한 MIC 값을 가진 공통점이 있었으므로, 이 카테고리의 펩타이드들은 그람-음성균 특이적으로 움직일 가능성이 있는 것으로 가정하고 다음 실험 대상으로 삼았다. 요약하면, 양면성 알파나선의 꺾인 구조를 만드는 방법은 크게 두 가지, 즉 친수성 쪽에 프롤린을 도입하여 꺾느냐 또는 소수성 쪽에 프롤린을 도입하여 꺾느냐이다. 위 표 1 및 2와 용혈현상의 도 3은 소수성 쪽에 도입한 프롤린에 꺾인 구조만이 용혈 현상을 일으키지 않으면서 그람-음성균에 변화를 줄 수 있는 여지를 제공한다.
실시예 3. 선택된 그람-음성균 막 특이적 펩타이드와 항생제인 메토트랙세이트 컨쥬게이션 및 MIC값의 향상
우선 3개의 선택된 펩타이드들이 그람-음성균의 막에 활성을 가질 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 3개의 펩타이드의 N-말단에 TAMRA라는 형광표지자를 달아 대장균에 막-활성이 있는지를 조사하였다. 다행스럽게도 2.5-5 uM정도의 농도에서 세 개 펩타이드 모두 대장균 안쪽으로 들어가는 것으로 관측 (도 4)되어, 세 펩타이드 모두 특이적으로 그람-음성균의 막을 활성화시킬 수 있는 가능성을 확인했다.
도 4의 세 펩타이드는 적어도 사람의 적혈구를 이용한 실험에서 1mM 이상의 농도에서 용혈현상이 없으므로, 펩타이드들을 항균 목적으로 사용하였을 경우엔 부작용이 없음을 예상할 수 있다. 그러나, 펩타이드들은 한결 같이 대장균에 대한 항균력이 그리 강하지 않은 공통점을 지니고 있었다 (MIC = 10-20 uM). 이 MIC 값을 향상하기 위해 엽산의 생합성을 저해하는 화합물인 MTX (methotrexate)를 각각의 펩타이드의 N-말단에 달아 세 가지 컨쥬게이트 화합물의 MIC를 측정 해 보았다. 아래 표 3에 제시한 것과 같이 세 개의 MTX-컨쥬게이트 펩타이드는 그것들의 모체가 되는 펩타이드에 비해 2배에서 4배 정도 MIC 값이 향상되었다. 이와 같은 현상은 적어도 펩타이드들이 선택적으로 대장균 막에 작용하고 있으며, 그 일부는 균 내로 들어와 세포를 죽이는 효과를 가지는 것으로 사료된다. 따라서 이와 같은 그람-음성균 막 특이적 펩타이드와 균에 들어가기 어려운 항생제와의 컨쥬게이션 방법은 새로운 항생제를 개발하기 위한 좋은 방법으로 제안 될 수 있다. 균 내로의 투과가 힘든 많은 종류의 항생제를 부작용이 적으면서 대장균의 막을 활성화하여 균 안으로 들어갈 수 있는 가능성이 있는 펩타이드와 공유결합으로 연결하여 그람-음성균에 대한 새로운 항생제로 이용할 수 있다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000001
실시예 4. 막-활성 펩타이드에 의한 새로운 항생제의 발견
용혈 현상의 극소화 되어 있으면서 그람-음성균의 막을 활성화 시킬 수 있는 세 개의 펩타이드를 이용한 다음 실험은 콜리스틴과 시너지 효과가 있는지를 조사하는 것이었다. 콜리스틴은 그람-음성균의 외막을 건드리는 효과가 있으므로, 펩타이드 중 어느 것이라도 E.coli의 외막을 건드리는 콜리스틴의 항균력을 향상시켜주는 것이라면 E.coli 막 특이적 활성을 가질 가능성이 있을 것이라는 추론에서 비롯되었다. 이미 그람-음성균에 잘 들어가는 성질로서 선택된 세 개의 펩타이드 (LK-L8P, KL-L6P, KL-L9P) 및 특히 MIC 값이 좋은 LK-L11P 등 네 개의 펩타이드가 콜리스틴과 시너지가 있는지를 조사하였다. 실험방법은 각각의 펩타이드에 콜리스틴을 단순히 섞어 그람-음성균의 대표격인 대장균에 처리함으로써, 단독으로 펩타이드나 콜리스틴을 쳤을 때에 비해 대장균을 죽일 수 있는 능력이 향상될 수 있는 것을 조사하는 실험이었다. 특히 콜리스틴이 그람-음성균을 죽일 수 있는 능력이 많이 향상된다면 이는 펩타이드가 콜리스틴과 시너지가 좋다고 (FICI < 1.0) 판단될 수 있다. 시너지가 좋다는 것은 결국 두 개의 화합물 (여기선 콜리스틴과 펩타이드)이 서로 도움을 주어 두 개의 효과가 단순히 더해진 (FICI = 1.0) 경우보다 훨씬 더 적은 농도에서도 균을 죽일 수 있다는 것을 의미한다.
아래 표 4에서 보듯이 콜리스틴과의 시너지는 KL-L9P 펩타이드가 가장 향상시켜, FICI (fractional inhibitory concentration index) 값이 0.57 로서 다른 펩타이드에 비해 월등하게 콜리스틴과의 시너지가 좋았다. 펩타이드의 특징은 다른 세 가지 펩타이드와 비교하여 단일 펩타이드로 있을 때의 MIC 값이 다른 펩타이드에 비해 5배나 좋지 않음에도 불구하고 콜리스틴과 좋은 시너지를 가지고 있다는 것 이었다. 아마도 세 개의 MIC가 좋은 펩타이드가 막을 붕괴하는 일반적인 항균 펩타이드의 성질을 가지고 있는데 반해, KL-L9P 펩타이드는 좀 다른 능력을 가지고 있을 것이라는 추측이 가능하다. 펩타이드를 일단 E.coli-특이적 막 활성 펩타이드로 정하고 다음 연구를 시도하였다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000002
실시예 5. 선택된 KL-L9P 펩타이드의 막 활성 기작
다음은 선택된 KL-L9P 펩타이드가 어떤 기전에 의해 막을 활성화시키는 지를 확인하였다. 미생물 외부막 투과는 NPN 처리된 E.coli 형광 강도 (λex = 355 nm, λem = 405 nm)로 측정하였다. E. coli 서스펜션 (8×107 cells/mL)을 10 min, 25℃, 13000 rpm 조건으로 원심분리하고, 5 mM HEPES 버퍼 (pH 7.2)로 서스펜션하였다. NPN를 E.coli 서스펜션에 추가하여, NPN 최종 농도는 5 uM이었다. E.coli 서스펜션의 형광 강도를 FL-55 형광측정기로 측정하였다. 펩타이드를 5uM NPN과 함께 E.coli 서스펜션에 추가하였다. 형광 강도 F.I= E.coli 서스펜션에 추가된 펩타이드의 F.I.- 5 uM NPN을 포함한 E.coli 서스펜션의 F.I.로 계산된다.
우선 NPN (Naphthylphenylamine)을 이용한 형광을 E.coli 존재하에서 관찰했는데, KL-L9P와 콜리스틴 모두 외막을 건드려 외막 안으로 들어오는 성질을 가지고 있었다 (도 5). 이를 KL-L9P 및 경쟁약물인 콜리스틴을 이용하여 측정하였는데, KL-L9P가 단위 몰로 비교 했을 때 콜리스틴보다 외막을 느슨하게 하는 효과가 크다는 것을 알았다. 상대적으로 막에 구멍을 내는 것으로 알려진 멜리틴도 NPN형광을 늘리는 능력이 많았다. 그러나, KL-L9P 펩타이드는 길이가 짧아 구멍을 내지는 못하는 것으로 추론된다.
두 번째 실험으로는 펩타이드 들이 외벽/내벽을 다 깰 수 있는 능력을 가지고 있는지를 보는 실험이었다. 이를 위하여 특이적으로 DNA만 염색 할 수 있는 형광물질인 Sytox Green을 이용하였고, SYTOX Green이 처리된 E.coli 평균 형광 강도로부터 미생물막 투과도를 평가하였다. SYTOX Green (2.5 μM) 존재하에서 10분 동안 E. coli 서스펜션(2×108 cells/mL)을 3가지의 펩타이드와 인큐베이션 하였다. 투과도는 형광 활성 세포 분류기로 정량하였다. 1×104 게이트 세포의 평균 형광 강도를 측정하였다. 멜리틴 (대조군)은 미생물 세포막을 파괴하는 공극 형성 펩타이드이다.
KL-L9P가 전혀 DNA를 염색하지는 못하는 반면 콜리스틴은 꽤 염색을 잘 시키는 것으로 조사되었다. 이는 KL-L9P 펩타이드는 내벽에 대한 분해력 또는 투과력은 없는 반면 콜리스틴 및 공극을 잘 만드는 멜리틴도 이 능력이 있음을 보이고 있다 (도 6).
LPS 추출물 (sigma)와 펩타이드를 PBS 버퍼에 서스펜션하였다. 25℃에서 LPS 0.5 mg/mL 단독 또는 LPS 0.5 mg/mL와 500 μM 펩타이드를 포함한 조건에서 각 샘플을 3세트로 측정하였다. 가장 큰 부피백분율을 가지는 부피 크기값을 선별하여, 부피 크기 직경 (nm)을 계산하였다.
LPS로 이루어진 리포솜의 안정성을 KL-L9P 및 콜리스틴 존재하에 확인 한 바, 콜리스틴은 리포솜을 잘게 쪼개버리는 성질을 가지고 있는 반면, KL-L9P는 이런 능력이 있지만 그 정도가 심하지 않음을 알 수 있다 (도 7).
E.coli NDm-1을 OD600 = 0.5로 희석하였다. 2.5 μM의 펩타이드를 30분 동안 37℃ 인큐베이터에서 미생물에 처리하였다. LK-L12P를 양성대조군으로 사용하였다. 펩타이드는 내부 막 및 외부 막에서 누출을 강하게 유도하였다. KL-L9P의 공초점 이미지를 통해 LK-L12P와 비교하여, TAMRA 라벨링된 KL-L9P가 얇은 주변세포질막 부위에 분포하고 있음을 나타낸다.
실제로 KL-L9P에 형광을 부착시킨 펩타이드의 존재를 E.coli에서 공초점 형광현미경으로 관찰하게 되면 고리모양의 거의 모든 E.coli에 고르게 형광 분자가 환의 형태를 가지고 분포 함을 볼 수 있다. 이는 좀 더 MIC 값이 좋으면서 막을 붕괴시킬 수 있는 능력을 가진 LK-L12P 펩타이드가 균 전체를 염색시키는 모양 또는 좀 더 많은 부분의 균이 형광 표지된 펩타이드에 의해 표지되는 것과 확실히 구별된다 (도 8).
위 네 가지 실험의 결론으로, KL-L9P 펩타이드는 그람-음성균의 외막을 파고 들 능력이 다른 어떤 펩타이드 보다 뛰어나지만, 이 막을 깰 수 있는 능력은 없으면서 그 상태로 머물고 있음을 알 수 있었다. 이렇게 되면 막을 느슨하게 할 수 있어서 들어가지 못했던 작은 소수성 분자들이 이제 막 안으로 들어갈 수 있게 된다.
실시예 6. KL-L9P존재하에 리포지셔닝한 약물과의 시너지 효과
KL-L9P 펩타이드 존재하에 그람-음성균에서 다른 화합물의 항균능력이 향상될 수 있는가를 입증하고자 한다. 이를 위해 두 가지 항생제인 리네졸리드 및 크록사실린을 선별하였다. 이 두 화합물의 공통점은 모두 그람-양성균에만 쓰이는 항생제로 특히 그람-음성균의 외막을 통과할 수 있는 능력이 결여되어 그람-음성균에는 거의 약효가 없는 것으로 조사된 항균물질이다. 만약, KL-L9P가 리네졸리드 및 크록사실린 두 화합물에 대해 E.coli에 항균력에 시너지 효과를 가지면, 우리가 원하던 그람-음성균 특이적 막 활성 펩타이드가 리네졸리드 및 크록사실린두 화합물의 세포 투과를 도와 준 것으로 예상된다.
KL-L9P는 리네졸리드 또는 클록사실린에 시너지 효과를 가지고 그람-음성균을 죽이는 능력을 크게 향상시켰다. 우리의 경쟁약물인 콜리스틴도 이 두 약물에 대한 시너지가 있는지를 관찰 한 바, 시너지 효과가 거의 없음을 알 수 있었다 (도 9). 막활성 펩타이드인 KL-L9P와 리네졸리드 또는 클록사실린의 시너지효과. 막활성 펩타이드인 KL-L9P와 리네졸리드 또는 클록사실린을 처리한 (1), (2)는 FICI 값이 0.5 미만으로 시너지 효과가 있다. 콜리스틴과 리네졸리드 또는 클록사실린을 처리한 (3), (4)는 FICI가 1 부근으로 시너지 효과가 없다.
그렇다면, 다른 유사한 펩타이드는 항균력이 알려진 화합물과 시너지가 없는 것인지 확인하기 위해 가장 E.coli에 대한 항균력이 강한 LK-L7P와 LK-L11E의 시너지 효과를 약하나마 항균력이 있다는 라스베라트롤과 시너지 효과가 있는지를 여부를 관측하였다. 도 10에서 보는 바와 같이 막에 머물고 있는 KL-L9P는 좋은 시너지가 있는 반면, 나머지 두 펩타이드는 강력한 항균력에도 불구하고 시너지가 없었다. 막활성 펩타이드인 KL-L9P와 라스베라트롤의 시너지효과와 관련하여, 막활성 펩타이드인 KL-L9P는 라스베라트롤과 강력한 시너지를 가지는 반면 (FICI = 0.2), 이 보다 E.coli에 대한 MIC값이 5배 이상 낮은 (좋은) LK-L7P 또는 LK-L11E는 FICI 값이 1이상으로 시너지 효과가 없다.
결국, 위의 두 실험에서 KL-L9P가 특이적으로 E.coli의 막을 활성화시켜 큰 시너지가 있음을 증명하였다.
이제 KL-L9P에 대한 시너지 효과를 항생제가 아닌 비 항생제로 확장하는 실험을 수행하였다. 시너지 효과를 보기 위하여 기존 약 중 가장 흔하게 쓰이는 약 중에 NSAID 중에 아스피린, 이부프로펜, 아세타미노펜 등, 매출액에서 부동의 1등을 고수하고 있는 고지혈증 치료제인 아트로바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 또한 여러 약효가 알려져 있으면서도 물에 대한 용해도 및 효능에 문제가 있었던 커큐민 (curcumin), 베르베닌 (berberine) 등의 천연물 등을 선발하였다. KL-L9P와 시너지 효과를 볼 화합물들은 이미 그람-음성균에 미약하나마 약효를 가질 수 있음이 이미 보고된 바 있었으므로, 이들에 대한 항균능력은 어느 정도 주지된 사실이다. 하지만, 그람-음성균에 대해 막 활성 펩타이드와 같이 병행투여 하여 낮은 농도에서도 그람-음성균을 죽일 수 있다는 보고는 없는 상태였으므로 이 약들이 큰 시너지 효과가 있음은 이들 약들을 항생제로 재사용할 수 있는지 여부를 결정할 수 있는 실험이었다.
시너지 효과는 신규한 항생제 상호작용 어세이 (antibiotic interaction assay : Wimley, 2015)를 통해 평가하였다. Wimley의 방법 (BBA, 2015, v. 1848(1), pp. 8-15.) 방법을 이용해서 막 활성 펩타이드와 항생제 간의 시너지 효과를 FICI 값으로 측정했다 (도 17). MIC assay는 실험 조건에 따라 값이 2-4배 정도 흔들리므로 시너지 효과를 정확하게 조사하기 위해선 1/2 묽힘 방법 보다는 2/3 묽힘 방법으로 화합물을 묽혀 좀 더 촘촘한 화합물의 농도 간격에서 MIC를 관찰하는 것이 통계적으로 강점이 있다. 즉, 3 x MIC가 되는 막 활성 펩타이드 (첫째 행)의 농도로 시작하여 2/3씩 묽힌 행을 만들어 MIC를 측정하고, 같은 방법으로 항생제 또는 repositioning drug (둘째 행)의 MIC를 측정한다. 세 번째 행은 두 개의 화합물을 반반씩 넣어 MIC를 측정한다. 그림7에서 두 개를 합친 행이 각각의 화합물 처리군에 비해 더 낮은 농도에서 잘 죽일 수 있으면 시너지 효과가 크다고 할 수 있다.
브로스 미세희석 기술 (Broth microdilution technique (2/3 dilution))을 MH 브로스 (MH Broth)와 함께 사용하였다. 항생제 및 펩타이드 처리된 E.coli를 18 시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
실험 결과 69%에 해당하는 많은 약들이 KL-L9P와 좋은 시너지 효과 (FICI < 10)가 있었으며, 이들을 단독으로 써서 E.coli를 죽이는 농도에 비해서 훨씬 적은 농도에서 E.coli를 죽일 수 있게 되었다 (표 5). 예를 들어 클록사실린의 경우 128-배 묽혀진 0. 3 uM의 MIC값을 가지게 되었으며, 리네졸리드는 1/16정도 묽혀진 농도인 10 uM의 MIC값을 가지게 되었다. NSAID중엔 이부프로펜이 3000-배 정도 묽혀진 3 uM의 MIC를, 컬큐민은 330-배 묽혀진 4 uM의 MIC값을 가지게 되었다. 이 화합물들은 모두 그람-음성균 막 활성 펩타이드인 KL-L9P가 1 uM존재 하에 이와 같은 시너지 효과를 낼 수 있었다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000003
실시예 7. KL-L9P/콜리스틴 동시 존재하에 리포지셔닝 약물과의 시너지 효과
콜리스틴은 비록 기존 항생제 또는 새롭게 항생제로 규명된 리포지셔닝 약물과 병행 투여하여 시너지 효과를 (KL-L9P에 비하여) 크게 나타내진 못했지만, 본 발명에서 발명한 막 활성 펩타이드와 MOA가 다르게 막을 활성화 시킬 수 있다. 콜리스틴은 아직도 막을 느슨하게 하는 황금 표준 (golden standard) 시약으로 쓰이고 있으므로 외막 특이적 활성 펩타이드로 사용할 수 있다. 또한 콜리스틴과 KL-L9P 사이에는 높은 시너지가 있다는 것이 이미 본 발명자들이 알아냈으므로, 이 두 개의 막 활성 펩타이드가 동시에 있을 때, KL-K9P와 시너지를 보였던 리네졸리드 및 컬큐민등의 시너지가 어떻게 나타날 것인가를 확인하였다. 이를 위해 본 발명에선 막 활성 펩타이드인 KL-L9P와 콜리스틴이 동시에 존재할 때에 리포지셔닝 약물의 시너지 효과를 조사하였다. 세 개 화합물을 그람-음성균의 박멸을 위해 섞어 병행투여 하되, 그 두 가지는 막 활성 펩타이드인 KL-L9P와 콜리스틴으로 넣고, 다른 한 가지는 기존 항생제나 리포지셔닝 약물로 하였다.
막활성 펩타이드와 리포지셔닝 약물의 시너지 효과 측정은 10× 화합물을 준비한 후, 이것을 증류수로 2/3 농도가 되도록 계속 묽혀 나갔다. MH 브로스 (900ul)를 10× 화합물 (100ul)에 넣어 JR은 후, 이중 200uL를 취하여 96-웰 플레이트에 넣었다. 하루 동안 배양한 E.coli를 MCFarland를 이용해서 0.5 MCF로 맞추고, 이를 10배 묽힌 후 well 당 10 ul를 넣었다 (5×105 CFU/mL). 균을 넣은 plate를 37℃에서 18시간 배양한 후, UV-Vis (600nm)에서 OD 값을 측정했다. 균의 살아있는 정도 (cell viability; %) = (OD600 of sample-OD600 of negative control)/(OD600 of positive control-OD600 of negative control) × 100. MIC는 Cell viability < 20% 인 농도를 기준으로 선택했다.
세 가지 화합물에 대한 시너지 효과는 두 개에 대한 시너지 효과 (세 가지 경우)중 가장 좋은 것에 버금가게 도출되었다. 이는 매우 좋은 결과이다. 왜냐하면, 두 개 화합물이 섞인 시너지 FICI 값이 0.3 이면 두 개의 화합물을 단독으로 처리 했을 때에 비해 약 1/7 씩 묽혀진 농도에서 E.coli를 죽이고 있는데 반해, 세 개의 화합물이 섞인 병행투여에서 똑 같은 FICI 값이 0.3 이 도출되었다면 이것은 세 개의 화합물을 단독으로 처리한 것에 비해 1/10 씩 묽혀진 농도에서 균을 죽이는 셈이 되기 때문이다. 본 발명에선 KL-L9P/콜리스틴/리네졸리드의 시너지값인 FICI 가 0.28로 조사되었다. 세 화합물이 단독으로 있을 때의 MIC가 13 uM / 0.8 uM / 60 uM이었던 것을 각각 12배/16배/10배 낮춘 농도인 1 uM / 50 nM / 6 uM에서 죽일 수 있게 되었다. 이와 같은 결과는 2개의 화합물간 시너지 효과 보다 3개의 화합물을 병행투여 했을 때의 효과가 더 클 수 있다는 잠정적인 결론을 도출 할 수 있게 된다. 만약 이런 식으로 예상을 해 보면 n개 숫자에 의한 항생물질의 시너지 효과는 상상을 초월 할 정도로 커서, 자연에서 여러 화합물이 섞여 있을 때에 큰 시너지 효과에 의한 증폭된 항균작용이 나타나는 것으로 예측 해 볼 수 있다. 그 중 다수는 막 활성이 있는 펩타이드 이어야 가능할 수 도 있겠다.
또한, 두 화합물 짝에 의한 세 개의 시너지 효과 중 가장 큰 시너지 효과는 KL-L9P를 사용한 경우이므로, 시너지 효과에 가장 큰 영향을 미치는 인자는 역시 우리가 발굴한 KL-L9P 펩타이드가 될 수 있음을 보여주고 있으며, 이 인자에 종속적인 시너지 효과가 나타난다고 할 수 있다. 하지만 콜리스틴 시너지 효과에 대해 주목하고 싶다. 콜리스틴이 KL-L9P에 비해 시너지 효과가 적다고는 하지만, 만약 기존에 다른 목적으로 사용하고 있는 약들에서 그람-음성균을 괴멸할 수 있는 시너지 효과를 낼 수 있다면 당장 이들 두 가지의 병행치료제는 독성이 없는 한 약으로 사용될 수 있기 때문이다. 즉, 이미 두 약이 모두 상용으로 쓰이고 있으므로, 진정한 의미의 약물 리포지셔닝이 가능하다. 그람-음성균에 대한 시너지 효과는 보통 FICI (fractional inhibitory concentration index)로 나타내는데 이 값이 0.5이하이면 시너지 효과가 있는 것으로 보고 있으며, 0.2 정도가 되면 두 개의 항균물질을 단독으로 처리한 MIC에 비해 적어도 10배 이상 낮출 수 있는 가능성이 있다고 보고 있다. 본 발명에서는 콜리스틴과 시너지가 0.2-0.4에 달하는 많은 종류의 화합물을 찾아냈다. 이들은 컬큐민, 이부프로펜의 두 종의 이성질체, 심바스타틴 등을 선택하고 있다.
실시예 8. 막 활성 펩타이드의 일반적인 성질 확인
A) 막 활성 펩타이드의 일반적 조건
KL-L9P는 다른 어떤 돌연변이 팹타이드에 비해 큰 시너지 효과를 주고 있으며, 이 화합물의 일반적 성질을 파악할 필요가 있다. 우선 이 펩타이드는 100% 물 조건에 있을 때에 대비하여 막 조건에서 높은 알파 나선도를 갖는다. 비록 이 펩타이드가 Pro에 의해 정확한 원통 모양의 정확한 나선모양에선 벗어나 있지만, 나선 모양에 의한 친수면/소수면이 분리된 모양이 막 활성을 강력하게 주는 것이 확실하다. PyMol 프로그램에 의해 예측 해 본 KL-L9P의 구조도 굽은 알파나선을 보여주고 있다. 일반적으로 Pro가 돌연변이 된 부분이 알파 나선이 꺾인 정점을 이룰 것으로 사료되지만, PyMol에 의해 예측 된 모양은 꺾인 부분은 친수성과 소수성의 경계부분인 것으로 보인다. 이 부분은 상세한 모양에 대한 연구가 이루어져야 정확한 모양이 나올 수 있을 것으로 사료되지만, 꺾인 모양에 의해 펩타이드가 막에 머물 수 있는 시간이 늘어날 수 있다는 사실은 여러 가지 화학물질학적 실험을 통해 알 수 있다. 이 때 지나치게 긴 알파 나선을 형성할 수 있는 돌연변이 펩타이드는 이미 첫 번째 스크리닝에서 제외 된 상태이다. 첫 번째 스크리닝의 조건으로 숙주세포에 대한 용혈현상이 가장 없는 펩타이드를 골랐는데, 이때 지나치게 긴 알파 나선을 형성할 수 있는 돌연변이 펩타이드는 이미 다 제거되었을 것으로 사료된다.
이처럼 짧지만 높은 알파나선을 가지고 있는 펩타이드가 막에 오래 머물게 되면, 그람-음성균의 외막에선 이 펩타이드를 정점으로 이온-재배치 (ion-clustering)가 일어날 수 있을 것으로 사료된다. 이렇게 되면 막 내의 분자들의 흐름이 많아지면서 막 자체가 느슨해 질 수 있다. 막이 느슨하게 되면, 느슨하지 못한 막 구조에선 통과하지 못했던 많은 항생제 후보 물질 저분자가 이제 막을 통과하여 균 안으로 들어갈 수 있으므로, 결국 펩타이드와 시너지 효과를 내며 항균효과를 보인다.
소수면에 넣은 Pro 아미노산은 소수성을 나타내므로, 이것과 인식을 같이하는 막에 존재하는 탄화수소의 긴 사슬과의 인식을 방해하지 않고 있다. 또한 꺾어진 친수/소수면의 분리는 친수면이 가지고 있는 양이온과 막 표면에 있는 음이온과의 인식을 양쪽 (N-과 C-말단)에서 다 가능하게 하는 구조로 되어 있는 듯 하다. 만약 이것이 완전한 원통모양의 알파 나선을 이룬다면, 친수면의 인식이 막의 분자와 강력하게 만들어지면 소수면의 인식이 약화되며, 또한 소수면 의 인식이 막에 있는 분자와 강력하게 만들어지면 친수성 부분의 인식력은 약해질 수 있기 때문이다. 긴 알파나선 모양은 숙주세포에 대한 용혈 현상 등 진핵세포의 막을 붕괴시킬 가능성도 높인다.
KL-L9P가 다른 위치에 프롤린이 들어간 이성질체와의 상의점은 이 펩타이드가 매우 친수성이어서 똑 같은 HPLC조건에서 가장 빠른 보유 시간 (retention time)을 가지고 있음을 알 수 있다. 이는 KL-L9P에서 양이온의 하전이 전체적으로 한쪽으로 몰리는 현상 때문에 일어나는 것으로 사료되며, 이렇게 되면 더욱 극명한 양면성을 가질 수 있다. 막 활성 펩타이드가 일반적으로 가장 빠른 보유 시간을 가지고 있는 사실은 프롤린이 두 개 들어간 화합물 중 가장 시너지가 좋은 LK-L7PL8P 및 LK-L8D의 경우에도 해당한다.
B) 두 개의 Pro가 치환한 펩타이드의 합성과 시너지 효과
그렇다면, LK 또는 KL의 가능한 모든 돌연변이 중에 KL-L9P만 이와 같은 그람-음성균의 외막을 활성화시킬 수 있는 것인가? 우선 LK 펩타이드와 KL-펩타이드의 Pro에 의한 돌연변이를 한 곳에서 두 곳으로 늘렸다. Pro-돌연변이가 꺾은 구조를 연출할 수 있으므로, 하나 보다는 두 개의 Pro를 펩타이드에 첨가하게 되면 펩타이드가 더 꺾인 모양을 할 수 있기 때문이었다. 여러 개의 가능한 자리 중 2 개의 자리를 Pro로 돌연변이 시킨 펩타이드를 만들어 보았으며, 이를 아래 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000004
Pro가 두 개 들어간 펩타이드에 대한 스크리닝은 역시 콜리스틴과의 시너지 효과가 있느냐를 보았다. 이들 Pro가 두 개 들어간 펩타이드 특징은 LK-L4PL5P, LK-L11PL12P를 제외하고 역시 그람-음성균에 대한 MIC값이 Pro가 하나 들어간 펩타이드에 비해 현저하게 높아 그람-음성균을 죽이는데 몇십 uM이상의 농도가 필요한 것이다. 이는 막을 투과하거나 망가뜨릴 수 있는 능력이 현저하게 감소한다는 것을 의미하며, 이렇게 되면 숙주세포에 대한 독성도 현저하게 감소할 가능성이 높으므로, 펩타이드 신약으론 좋은 결과이다. E.coli에 대해 2.5 uM의 낮은 MIC를 보이는 LK-L11PL12P는 펩타이드 단독으로 신약으로 활용될 수도 있다. 여러 개의 Pro가 두 개 들어간 펩타이드 중에 콜리스틴과 시너지가 가장 좋은 돌연변이는 LK-L7PL8P였다. 이 돌연변이는 콜리스틴과의 FICI 가 0.3에 이르고 있으므로, KL-L9P와 거의 필적한다고 볼 수 있다. 다만 콜리스틴과의 시너지를 이룰 때의 농도가 8.4 uM 정도 되므로, KL-K9P가 2.6 uM에서 콜리스틴과의 시너지 효과가 최대로 되는 것에 비해 4-5배의 펩타이드를 더 사용해야 하는 단점이 있다. LK-L7P/L8P는 리네졸리드와도 시너지가 있었는데 FICI값이 0.53 정도였다. 이는 KL-L9P의 FICI값이 0.40인 것에 비해 조금 떨어지는 부분적인 시너지를 가지고 있었다 (표 7). LK-L7PL8P 펩타이드는 펩타이드/콜리스틴/리네졸리드 등 세 가지를 섞은 경우엔 LK-L9P와 비슷한 FICI (= 0.27)값을 주고 있으므로, 이 펩타이드에 의한 시너지 효과가 작지 않다 할 수 있다 (표 8). 펩타이드 모양예측 프로그램에 의해 예측된 LK-L7P/L8P 펩타이드의 모양도 두 개의 알파 나선이 Pro부분에 의해 단락된 모양을 하고 있으므로, 이 모양은 시너지를 주고 있는 펩타이드의 일반적인 특징이 될 수 있다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000005
Figure PCTKR2016010408-appb-T000006
C) D-아미노산을 이용한 D-form 펩타이드 제작
KL-L9P 펩타이드의 모든 아미노산을 D-아미노산으로 치환한 KL-L9P-D 형도 만들어 콜리스틴 및 리네졸리드와의 시너지 효과를 보았다. KL-L9P-D형 펩타이드를 만든 목적은 자연에 존재하는 L-아미노산으로 이루어진 펩타이드에 비해 화학적 안정성 및 자연효소인 프로테이즈에 대한 안정성이 월등할 것으로 생각되는 데다가, 펩타이드와 막과의 인식이 카이랄한 구조에 영향을 받지 않을 가능성이 높아 D-form도 L-form에 못지않은 시너지 효과를 가질 수 있다고 고려하였기 때문이다. 다만, D-form은 시너지 효과가 L-form에 비해 크지 않음을 알 수 있었다. 콜리스틴의 경우 FICI = 0.38, 리네졸리드의 경우 FICI = 0.66으로 부분적인 시너지를 보이고 있었다. 이는 펩타이드가 인식하는 부위가 막의 카이랄 부분과 상관없는 부분도 꽤 많이 인식하지만, 카이랄과 관계가 있는 부분 (예를 들어 포스페이트의 음이온 등)도 가능하다는 결론을 도출하게 한다. 그러나 D형도 전반적인 시너지 효과가 있는 것으로 미루어 막에 존재하는 카이랄 하지 않은 부위의 인식이 주가 되므로, 그람-음성균을 퇴치하기 위한 시너지 효과를 낼 수 있는 펩타이드로는 손색이 없다.
D) Pro 이외 아미노산을 이용한 돌연변이에 의한 꺾인 구조의 창출
Pro 말고도 양면성 펩타이드의 소수면에 친수성 아미노산을 넣으면 알파나선의 전체적인 양면성은 깨어질 수 있으며 굽은 모양을 부분적으로 연출 할 수 있다. 이와 같은 양면성의 붕괴와 더불어 알파나선의 감소로 인한 숙주세포에 대한 부작용도 적어질 수 있으므로, Pro가 들어간 것과 같은 효과를 가질 수 있다. 따라서 이미 시너지 효과를 가지고 있는 KL-L9P에서 Pro대신 다른 친수성 아미노산을 넣은 (G, S, N, Q, D 및 E) 돌연변이 펩타이드를 만들고 이들의 시너지 효과를 관찰하였다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000007
Figure PCTKR2016010408-appb-T000008
Figure PCTKR2016010408-appb-T000009
간결한 실험에 의해 L9와 더불어 L9D만이 시너지 효과를 관측 할 수 있었으며, Wimley방법으로 콜리스틴과 심바스타틴과 시너지 효과를 FICI 값으로 측정했다. 아래 표 12에서 나타낸 것처럼 KL-L9D의 콜리스틴 및 심바스타틴과의 FICI 값은 각각 0.46 및 0.61로서 시너지는 있으나 0.26 및 0.18의 FICI를 주는 KL-L9P 펩타이드에 비해선 많이 떨어지는 효과를 주고 있다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000010
KL-L9P와 같이 KL-L9D도 시너지 효과를 보이고 있었지만 두 화합물의 경우 모두 Pro를 함유하고 있는 펩타이드가 Asp를 함유한 펩타이드에 비해 시너지가 높았다. 따라서 이와 같은 시너지 현상은 소수면 펩타이드가 P가 아닌 D에 의해서 전체적인 양면성이 깨진다 해도 관측되고 있음을 확인할 수 있었다.
시너지 효과가 가장 크고 두 개의 Pro를 함유하고 있는 펩타이드인 LK-L7P/L8P와 비슷한 모양을 하고 있는 LK-L8D도 만들어 시너지 효과를 보았다. 이 펩타이드도 KL-L9P보다는 못하지만 시너지를 가지고 있었으므로, Asp로 소수성 부분이 단락된 펩타이드는 Pro로 치환 된 펩타이드 처럼 그람-음성균의 외막을 느슨하게 만들 수 있는 막 활성 펩타이드에 가깝다고 할 수 있다. 하지만, 다른 친수성 잔기 (예를 들어 G, S, N, Q, E)로 전체적인 양면성을 헤친 펩타이드에선 어떤 시너지도 발견되지 않았다.
E) KL-L9P의 Ala-scanning을 이용한 시너지 효과의 변화관측
Ala-scanning 방법은 14개의 펩타이드 중 어떤 아미노산이 화학적 또는 생물학적 효과를 내는데 중요한 위치의 잔기인가를 알아낼 수 있는 좋은 수단이므로, 많은 펩타이드의 연구에 쓰이고 있는 방법이다. 본 발명에서도 같은 방법을 사용하면, 어떤 아미노산이 막 활성을 일으켜 소분자와 큰 시너지 효과를 낼 수 있는지를 판가름 할 수 있다. 따라서 본 발명에선 이 Ala-scanning된 라이브러리를 이루는 각각의 펩타이드에 대해, 콜리스틴과의 시너지를 먼저 확인하는 실험을 수행하였다. 펩타이드의 시너지 효과에 가장 영향을 많이 끼치는 아미노산 위치를 찾기 위해, KL-L9P와 콜리스틴 사이의 시너지를 기준으로 그 값이 가장 크게 변화한 펩타이드를 고른다. 해당 펩타이드의 Ala 치환 위치가 막 활성에 가장 큰 영향을 끼치는 아미노산 잔기 위치라고 할 수 있다. 하지만 Ala-scanning된 펩타이드가 LK-L9PK14A말고는 2 배 이상의 큰 변화가 없었다. LK-L9PK14A는 LK-L9P보다도 오히려 MIC값이 좋아졌으므로, 이 부분의 라이신이 막-활성을 위해 중요하지는 않을 것으로 사료되는 결과이다. 이제 각각 펩타이드의 1/2 MIC 농도에서 콜리스틴과 시너지를 관찰하여, KL-L9P를 기준으로 그 값이 가장 크게 변화한 아미노산 잔기 위치로부터, 시너지의 변화가 적은 위치를 나열할 수 있었다 (표 13).
Figure PCTKR2016010408-appb-T000011
안쪽에 자리잡은 KL-L9P/K11A, KL-L9P/K8A, KL-L9P/K7A 등의 시너지가 가장 감소했으므로 이 자리의 아민 작용기는 시너지 효과를 내기 이해 매우 중요할 것으로 사료되었으며, 반면 양 끝 쪽에 알라닌이 치환된 KL-L9P/K1A 또는 KL-L9P/K14A 등의 시너지 효과는 거의 감소하지 않았다. 이 두 개의 라이신이 시너지 효과에 그리 크게 영향을 끼치지 않고 있음을 감안하면 이것을 없앤 12개로 이루어진 펩타이드도 KL-L9P와 비슷한 콜리스틴과 비슷한 시너지 효과를 예상 할 수 있다.
다음으로 소수성 면 아미노산이 막 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 KL-L9P의 소수성 면의 류신을 알라닌으로 스캐닝한 펩타이드 라이브러리를 제조하였다. 아래 표는 각각의 펩타이드에 대한 아미노산 서열과 E.coli에 대한 MIC를 정리한 표이다. 예상했던 결과와 같이 알라닌 치환으로 인해 양면성 펩타이드 소수성 면의 상호작용이 약해지면서 KL-L9P에 비해서 MIC가 감소했다. 특히 KL-L6AL9P와 KLA-L9P의 MIC는 각각 80 uM, >200 uM로 MIC가 크게 증가했다. 펩타이드의 MIC에 가장 큰 영향을 주는 Leu 자리는 6번 자리로 6번 자리가 양면성 펩타이드의 소수성 면의 상호작용을 파괴하는 데 중요한 역할을 함을 알 수 있다. KLA-L9P는 Leu 7개 중 3개의 Leu을 Ala으로 바뀌면 양면성 펩타이드 구조가 제대로 형성되지 않거나 펩타이드의 소수성 감소로 인해 E.coli의 세포막과 펩타이드 사이의 소수성 상호작용이 약해져 MIC의 급격한 증가가 일어났다.
다음으로 MIC가 많이 감소한 KL-L6AL9P와 KLA-L9P를 제외하고 콜리스틴과의 시너지 효과를 측정했다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000012
아래 표 15는 1/4 MIC 펩타이드와 1/2 MIC 펩타이드를 콜릭스틴과 섞었을 때 FICI값이다. 1/4 MIC 펩타이드와 1/2 MIC 펩타이드의 FICI값을 비교하면 KL-L9P의 시너지 효과에 중요한 Leu 자리를 알 수 있다. 만약 펩타이드와 콜리스틴이 시너지 효과가 있다면 펩타이드가 1/4 MIC에서 1/2 MIC가 될 때 콜리스틴의 MIC는 감소할 것이다. 즉 시너지가 있을 경우 펩타이드가 1/4 MIC에서 1/2 MIC가 될 때 펩타이드 쪽의 분율은 0.25에서 0.5로 증가하지만 콜리스틴 쪽의 분율은 감소하므로 전체 FICI 값은 0.25보다 적게 증가해야 한다. KL-L5AL9P, KL-L9PL10A, KL-L9PL13A는 1/4 MIC에서 1/2 MIC가 될 때 0.37, 0.31, 0.29씩 증가했으므로 콜리스틴과 시너지가 급격하게 감소함을 알 수 있다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000013
KL-L9P의 시너지 효과에 중요한 Leu자리를 살펴보면 Pro 옆 자리인 10번 자리로 KL-9P 펩타이드의 꺾인 구조가 시너지 효과에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. 또한 5번 자리, 13번 자리 Leu이 Ala으로 치환될 때 시너지 효과가 감소한 것으로 보아 꺾인 자리로부터 양쪽으로 4개까지 (P까지 포함하여 9개의) 아미노산 서열이 중요함을 알 수 있다.
막 활성 능력에 의해 콜리스틴과의 시너지가 얼마나 감소했는가 또는 MIC가 얼마나 나빠졌는가를 기준으로 친수성/소수성 결과를 종합적으로 관찰하면, 중요한 자리의 아미노산 서열을 볼 수 있다. 친수면에선 11번 8번 7번 순서로, 소수면에선 6번 5번 10번 순서로 시너지가 감소했다. 이것을 종합하여 효과가 있는 아미노산 서열을 네 개의 서열로 표현하면 KPLK, 다섯 개의 서열로 표현하면 KKPLK, 여섯 자리 서열로 표현하면 LKKPLK, 일곱 자리 서열로 표현하면 LLKKPLK로 나타낼 수 있다.
F) 시너지 효과를 가진 막 활성 펩타이드의 모양
제작된 84개의 펩타이드 중에 막에 활성을 주어 화합물과 항생제 시너지 효과를 내는 펩타이드는 4개의 밖에 없었다. 따라서 이 4개 펩타이드의 구조적 특징을 알아보면, 막 활성의 일반적 성질을 알 수 있는 방법이 될 수 있다. 펩타이드 구조를 파악 하기 위해 CD 및 분자 예측 프로그램을 도입하였다. 우선 CD를 보면 KL-L9P (70%), KL-L9D (50%), LK-L8D (50%), LK-L7PL8P (60%) 비교적 높은 알파나선이 막 조건에서 발견되었다. 이와는 대조되게 물 조건에선 알파나선이 거의 없었다 (10% 미만). 따라서 균의 외막 조건에서도 높은 알파나선을 지니고 있을 것으로 예상된다. 하지만 도 15에서와 같이, 분자 모델 예측 프로그램에 의한 알파나선 모양은 완전한 원통 (A)이 아닌 B-1, B-2, B-3 모양과 같이 언제나 꺾어진 또는 굽은 알파나선 구조를 하고 있었다. 이와 같은 사실로 미루어 짐작하면 알파나선도가 높아 양면성이 유지되면서도 꺾인 구조를 가진 펩타이드는 막에 있는 친수성 및 소수성 분자와의 인식을 극대화 할 수 있을 것으로 사료된다. 이와 같은 인식력의 극대화는 막을 붕괴시키지 않으면서도 막을 느슨하게 만들어, 펩타이드가 없으면 통과하지 못했던 소수성 저분자들이 막을 뚫고 균 안으로 들어가는데 큰 역할을 하고 있음으로 사료된다. 펩타이드가 이처럼 꺾인 모양을 하고 있다고 하더라도 어느 정도 꺾였는가에 대한 정의를 하기는 쉽지 않다. 펩타이드 모양 예측 프로그램을 동원해도, 여러 하나의 펩타이드에서 여러 가지 모양이 큰 에너지 차이를 보이면서 동시에 존재 할 가능성이 있기 때문이다.
G) 꺾어진 모양을 이용한 펩타이드의 시너지 효과
그렇다면 꺾인 알파나선 구조를 위해 Pro의 함유가 필수적인가? 이를 알아보기위해 본 발명자들은 다이설파이드 결합을 통해 인위적으로 꺾인 구조가 들어간 펩타이드를 만들어 보았다. 즉 아래 표 16과 같이 KL 펩타이드와 똑 같은 아미노산 서열을 가지되 알파나선의 위와 아래인 i 및 i+4 (또는 i+3)위치에 시스틴을 치환하여 알파나선의 위와 아래를 묶거나, i 및 i+8 위치에 탄화수소 스테이플 링커 (hydrocarbon staple linker)를 연결하여 꺾어진 모양을 유도하였다. 이 두 개의 펩타이드를 제조한 후, 이것과 콜리스틴의 시너지 효과를 보았다 (표 17). 두 펩타이드 모두 Pro을 함유한 펩타이드보다는 약하지만, 콜리스틴과 부분적인 시너지 효과를 가지고 있었으며, 펩타이드/콜리스틴/리네졸리드 등 세가지 화합물을 섞은 혼합물에서도 시너지 효과가 나타났다 (표 18). 비록 시너지 효과는 KL-L9P보다는 적게 나타났지만, 다이설파이드 결합에 의해 꺾인 구조를 하고 있는 펩타이드에서 명백한 시너지 효과를 보인 것은 고무적이다. 또한 콜리스틴 및 리네졸리드의 농도는 KL-L9P 존재하에 얻어진 MIC농도와 비교하여 유사하거나 조금 높은 농도로 여전히 의미가 있으며, 꺾인 펩타이드 자체의 MIC가 KL-L9P보다 상당히 진보된 결과를 보여 펩타이드의 사용농도를 낮출 수 있는 특징을 지닌다. 이 꺾인 구조로 인하여, 알파 나선구조가 숙주세포에 주는 독성을 완화될 수 있는 것도 이 펩타이드의 장점이라 할 수 있다. 양면성 펩타이드가 Pro를 넣어 꺾지 않더라도, 인위적으로 꺾인 구조를 만들면 그람-음성균의 막을 활성화하여 여러 가지 화합물과 병행투여로 균을 제압할 수 있다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000014
Figure PCTKR2016010408-appb-T000015
Figure PCTKR2016010408-appb-T000016
H) 뷰포린 (LK 또는 KL 펩타이드 이외에 Pro에 의해 꺾인 자연 펩타이드)의 막 활성 성질
본 발명자들은 LK 또는 KL 펩타이드처럼 양면성이 확실하게 100% 있는 모델 펩타이드 뿐만 아니라, 적절한 수준의 양면성 펩타이드 또는 자연에 존재하는 많은 종류의 항균활성 펩타이드 및 세포 투과 펩타이드가 이와 같은 그람-음성균 특이적 막 활성 펩타이드의 성질을 가질 수 있을까에 대한 고민을 해 보았다. 왜냐하면 본 발명자가 발견한 현상은 식물이 만들어 낸 유효성분 인 컬큐민 라스베라트롤 등이 식물에 침입한 그람-음성균을 죽일 수 있는 매우 합리적인 방법일 수 있기 때문이다. 즉, 컬큐민은 그람-음성균을 죽이는 능력이 있지만, 이와 같은 막 활성 펩타이드가 없는 조건에선 매우 높은 농도를 가져야만 균을 죽인다. 그런데 발명자가 발명한 것과 같은 KL 또는 LK와 같은 막 활성 펩타이드가 자연에 존재한다면 이를 이용하여 컬큐민은 균 내로 들어갈 것이고, 시너지 효과로 인해 매우 낮은 농도 범위에서도 균을 죽일 수 있기 때문이다.
자연에 존재하는 히스톤 단백질 2A의 일부인 뷰포린 (21개, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK: 서열번호 50)은 널은 영역의 항생효과를 가진다. 많은 종류의 항생효과가 막을 분해하는 성질로 인해서 생기는 데 반해 이 뷰포린은 균막 투과 성질을 가지고 있다. 균 막을 투과하여 균 안으로 들어간 후에 균 안에 있는 DNA 또는 RNA와 결합하여 균을 죽이는 것으로 되어 있다. 본 발명자들은 이 균 투과성질을 좀 더 약화시키면서 막 활성을 유지하기 위해 원래 21개의 아미노산으로 구성된 뷰포린 II 16개 (뷰포린 II의 5-20번, RAGLQFPVGRVHRLLRK: 서열번호 51)로 줄인 뷰포린 5-20을 생산했다. 이 뷰포린은 용혈현상이 없으면서 그람-양성균에 대한 활성도 없고, 그람-음성균에 대한 활성이 약간 있는 정도로 전에 조사된 펩타이드였다. 더구나, 이 세가지 능력은 발명자들이 발명한 모델 펩타이드인 LK-L9P와 매우 유사한 성질이라 할 수 있다.
이제 뷰포린 5-20 펩타이드를 합성하여 이것의 대장균에 대한 MIC값을 측정하고, 그람-음성균 막을 활성화시켜 콜리스틴 또는 리네졸리드와 시너지가 있는지를 관찰하였다. 우선 뷰포린5-20의 MIC값은 20 uM로서 논문에서 보고한 값과 거의 같았다. Winley방법으로 관찰한 뷰포린5-20과 콜리스틴 및 리네졸리드의 FICI값은 조사하였으며 이 값은 0.5 및 0.7이었다. 이는, KL-L9P보다는 못하지만 뷰포린5-20이 그람-음성균 막 활성을 가지고 있으며, 이이 따라 다른 항생제들과 시너지 효과가 있음을 의미하고 있다. 뷰포린5-20의 아미노산 서열은 KL-L9P에 비해 현저하게 다르지만, 1) 양면성의 알파나선 모양을 하고 있다는 점, 2) Pro에 의해 알파나선이 꺾인 (또는 굽어진) 구조를 하고 있으며, 꺾인 부분은 소수성을 띈 부분, 3) 양이온 하전 된 아미노산이 전체적으로 35% (6/16) 라는 점, 4) 소수성 아미노산이 전체적으로 35% (6/16)라는 점, 5) 숙주세포에 대한 용혈활성 및 그람-양성균에 대한 활성은 전혀 없다는 점, 6) 그람-음성균에 대한 활성이 약하게 남아 있다는 점 (MIC = 10-20 uM) 등은 LK-L9P 및 그 유도체에서 얻어낸 막 활성이 일반적 성질과 정확하게 일치한다. 따라서 위에서 발견한 다섯 가지 성질은 그람-음성균 막 활성 펩타이드가 가지는 일반적 성질로 정의하여도 무리가 없다고 사료된다.
뷰포린 5-20는 그 크기 (16개의 아미노산)이 가질 수 있는 HPLC에서의 retention time이 상대적으로 매우 빠르므로, 매우 친수성의 특징을 가진다. 또한 전에 지적했듯이 KL-L9P가 다른 위치에 프롤린이 들어간 이성질체와의 상의점이 매우 친수성이어서 똑 같은 HPLC조건에서 가장 빠른 retention time을 가진 것과 일치하는 결과이다. 막 활성 펩타이드의 일반적 성질로서 양이온 하전 (또는 소수성 부분)을 가지되 이것의 위치가 전체적으로 친수성 성질을 가지도록 배치되는 것이, 막 활성 펩타이드의 일반적 성질 중 하나로 꼽을 수 있다.
실시예 9. 막 활성 펩타이드와 시너지를 갖는 화합물의 일반적 성질
막 활성 펩타이드와 시너지 효과가 있는 저분자 화합물을 기존의 항생제 및 약리단 화합물을 이용하여 조사하였다. 저분자 화합물로는 기존에 그람-양성균에 쓰이고 있는 리네졸리드를 비롯한 항생제를 비롯하여, 항염증 반응 및 해열제로 많이 쓰이고 있는 NSAID 계열의 저분자 화합물들, 고지혈증 치료제인 스타틴 계통의 저분자 화합물들, 또한 약효가 잘 알려져 있지만 아직 약으로 허가 받지 못한 nutraceutical 화합물 등, 많은 종류의 저분자 화합물 종류를 망라하였다.
막 활성 펩타이드의 종류 (실시예 8)가 다양하여 각각의 펩타이드가 막에 작용하는 메커니즘이 다소 다를 수 있지만, 시너지 효과의 산출을 위해선 KL-L9P 펩타이드를 사용하였다. 왜냐하면 이 펩타이드는 가장 적절한 단 단위의 마이크로 몰 농도에서 저분자 화합물과 쉽게 시너지 효과를 확인 할 수 있다. 이와 같은 단 단위 마이크로몰 농도는 펩타이드와 시너지를 갖는 많은 종류의 새로운 그람-음성균 후보 항생제의 실험관 기법 실험에서 유효농도와도 비슷하기 때문에, 후보 화합물의 농도 차이에서 오는 오차를 최소로 줄일 수 있기 때문이다.
막 활성 펩타이드인 KL-L9P와 저분자의 항균 시너지 효과는 Wimley 방법에 의해 FICI 값을 산출하는 방식으로 수행하였다. 이 방법은 기존 방법인 checker-board assay방법보다는 훨씬 정확한 방법으로, 기존 방법이 1/2-묽힘 방법을 사용한 반면, 새 방법은 2/3-묽힘 방법을 사용함으로서, 화합물 또는 펩타이드의 묽힘에서 올 수 있는 오차를 최소한으로 줄이면서 시너지 효과가 있는지를 관찰하였다.
앞 부분의 시너지 효과에서 이미 기술한 바와 같이, 놀라울 정도로 높은 비율 (약 69%)의 저분자 화합물들이 KL-L9P와 시너지가 있었다 (도 18).
시너지 효과를 주는 화합물이 다양한 전하 (중성/ 양전하/음전하 화합물)를 띄고 있는 것으로 보아 양성을 띄고 있는 성질을 가진 펩타이드와의 인식이 시너지 효과의 원천으로 보이진 않는다. 왜냐하면 콜리스틴과 같은 양면성 펩타이드도 KL-L9P 펩타이드와 강력한 시너지를 줄 뿐만 아니라 이부프로펜과 같은 간단하면서도 전기적으로 음성을 지닌 화합물도 거의 비슷한 값으로 강력한 시너지를 주기 때문이다. 매우 그 구조가 비슷한 심바스타틴과 로바스타틴의 경우도 심바스타틴은 아주 강력한 시너지를 주는 반면 로바스타틴은 이것보다는 한참 떨어지는 시너지를 주고 있다. 이부프로펜은 두 개의 거울면 이성질체 모두 시너지 효과가 있음이 매우 흥미롭다. (도 19).
그러나 모든 화합물이 다 시너지 효과를 주는 것인 아니다. 항생제 중엔 D-cycloserine, vancomycin, tetracyclin, ciprofloxacin 등이 시너지가 없었다. 이 화합물 중 vancomycin은 그람-음성균에 그리 많이 발현이 안된 효소의 저해제이며, tetracyclin 및 ciprofloxacin은 균 막에 준재하는 porin 단백질을 통해 균 내로 들어가는 기작을 가지고 있다. NSAID중엔 아스피린과 아세토아미노펜의 시너지가 없었다. 이들 역시 분자량으로 볼 때 매우 작은 물질이다. Nutraceutical중엔 베르베린이 시너지가 없다는 것은 특이하다. 이 화합물은 원래 항생제로 알려진 화합물이므로 당연히 시너지가 있는 것으로 사료되었지만 FICI 값이 1.5에 이르고 있을 정도로 전혀 시너지가 없다.
그렇다면, 막 활성 펩타이드와 시너지 효과를 주는 저분자들은 일반적으로 어떤 특징을 가지고 있는 것인가? 항생제 중 시너지 효과가 없었던 화합물을 보면 porin 단백질을 통해 균 안으로 들어가는 화합물들이었다. 또한 아스피린 아세타미노펜 등은 매우 분자량이 200 이하의 분자들 이었다. 즉, 이들은 지나치게 친수성을 가지고 있으므로, 일반적인 투과가 막으로 직접 투과되는 경로를 이용하지 않을 것으로 예상된다. 이 사실로 미루어보면 시너지가 있는 화합물들은 막 활성 펩타이드에 의해 느슨해진 소수성 막을 통과해서 균 안으로 들어가야 하는데, 그렇다면 화합물이 소수적 성질을 많이 가지고 있어야 할 것으로 보인다. 이 친수성 및 소수성을 표시하는 값이 partition coefficient 인 logP 값이다. 이 값은 화합물이 소수성인 옥타놀에 녹아있는 농도와 물에 녹아있는 농도의 비에 log를 취한 값으로 logP가 커지면 일반적으로 화합물의 소수성이 증가한다.
화합물의 친수/소수성을 나타내는 logP와 시너지 효과는 관계가 있을까? 일반적으로 FICI 값이 작으면 시너지 효과가 크므로 그것의 역수와 logP의 상관관계를 도식화하였다. 아래 그림에서 보듯이 KL-L9P를 막 활성 펩타이드로 사용했을 때 화합물의 소수성은 시너지 효과와 강력한 상관관계가 있었다. 즉 화합물의 소수성이 증가 할수록 시너지 효과는 크다고 할 수 있다. 시너지는 FICI값으로 1 이하가 되면 효과가 있는 것으로 정의되므로, lopP 값이 0.19이상이 되면 시너지 효과가 있을 수 있는 것으로 보인다. 하지만, 하지만 이 정의에도 예외는 있다. 콜리스틴과 리네졸리드는 매우 친수성 분자임에도 불구하고 좋은 시너지를 가진다. 또한 아스피린, 아토바스타틴 등은 매우 소수성 성질인데도 불구하고 시너지가 없다. 친수성이면서도 시너지가 좋은 화합물의 특징은 생리적 pH조건에서 양이온을 띨 수 있는 성질이다. 소수성인데도 불구하고 시너지가 없는 화합물은 상대적으로 생리적 pH조건에서 음이온으로 하전되어 있을 가능성이 크다. 그람-음성균의 내막 또는 외막 표면이 음하전 되어있음을 생각하면, 이와 같은 예외가 되는 화합물이 왜 시너지를 가질 수 있는지 이해 할 수 있게 된다. 즉, 양이온으로 하전 된 화합물은 막의 표면에 결합하여 막 활성 펩타이드에 의해 균 안으로 들어갈 가능성이 있는 반면, 음이온으로 하전 된 화합물은 균 표면 음이온과의 반발력에 의해 기회를 잃어버릴 가능성이 크다 (도 11).
분자량과 시너지 효과 사이의 상관관계도 도식화 해 보았다 (도 12). 분자량과 시너지 효과 사이엔 큰 상관관계는 없지만, 분자량이 200이 되지 않는 대부분의 화합물들은 시너지 효과를 주고 있지 않다. 위의 친수/소수성 상관관계와 결합하면, 종합적으로 분자량이 200이상 되는 비교적 소수성 화합물들 만디 막 활성 펩타이드에 의해 그람-음성균 외막을 통과하여, 균 내외에 있는 표적에 결합함으로서 항균력을 나타내고 있다. 이미 기작이 규명된 항생제를 제외하고, 새롭게 항생효과를 가지는 재활용 가능한 약들 (예를 들어 이부포로펜 심바스타틴 등)의 기작은 새롭게 밝혀져야 하나, 이 발명의 범위를 넘으므로 이 발명에서 취급하지 않는다.
도 13에 따르면, 막 활성 펩타이드와 시너지를 낼 수 있는 화합물의 logP값과 화합물 전체의 시너지의 상관관계는 있었지만 그리 강하지 못했다. 이를 좀 더 분석하고 시너지 있는 화합물의 일반적 성질에 대해 규명 해 보고자, 시너지 있는 화합물을 세 종류로 나누어 보았다. 첫 번째는 전체적으로 하전이 없는 화합물 (charge 0), 음하전 되어 있는 화합물 군 (charge -1), 또한 양하전 되어 있는 화합물 군이다.
우선 하전이 없는 화합물의 logP값과 시너지 효과는 매우 좋은 상관 관계를 보이고 있었다. 이는 모든 화합물을 포함해서 시너지 효과와의 상관 관계를 본 것에 비해 훨씬 상관관계의 일치함을 보여주고 있다.
하지만 음하전 또는 양하전 된 화합물들은 logP에서 일반적으로 산출하는 화합물의 친수/소수성의 비가 잘 맞지 않는 듯 하다. 그래서 새로운 변수인 화합물의극성을 띄는 표면적을 분자량으로 나눈 값을 도입했다. (이는 단위 분자량 당 극성분자의 표면적을 나타내는 지표, PSA/MW) 결국 이 값이 작으면 단위 분자량당 극성의 면적이 적어진 것이고, 이 값이 크면 단위 분자량당 극성의 면적이 상대적으로 거친 것을 의미한다. 음이온을 띄고 있는 화합물에선 이 값과 화합물의 시너지 효과가 역상관성을 가지고 있었다. 이는 결국 단위 분자량 당 극성이 차지하는 표면적이 적을수록 시너지 효과가 크다는 것으로 해석될 수 있다.
양이온을 띄고 있는 화합물도 단위 분자당 극성분자의 표면적을 나타내는 지표 (PSA/MW)를 가로축으로 시너지 효과를 나타내는 1/FIC값을 세로축으로 상관관계를 보았다 (도 14). 예상과 같이 극성분자들의 표면적이 상대적으로 크면 시너지 효과가 큰 상관관계가 있었다. 이는 양이온으로 하전 된 표면적이 클수록 시너지 값이 커질 수 있음을 의미한다.
종합해 보면 시너지 효과는 화합물의 소수성과 관계가 크며 (전체적인 logP와 시너지 효과는 상관관계가 있음). 하지만 다소의 예외는 있어서, 음이온으로 하전 된 화합물은 이 하전 부위가 적을수록, 양이온으로 하전 된 분자는 양이온 하전부위가 클수록 시너지 효과가 크게 나타났다. 이는 그람-음성균 부위가 음하전 되어 있어, 양하전 된 분자가 막 활성 펩타이드에 의해 균 안으로 들어가는데 음하전 된 분자에 비해 유리할 것이라는 사실을 증명 해 주고 있다.
결국 그람-음성균 외막 중, 특히 소수성 부분에 의해 통과되지 못하던 화합물이 막 활성 펩타이드에 의해 균 안으로 들어가는 기작으로 균에 대한 새로운 항균성이 생기는 것으로 사료된다. 상대적으로 분자량이 적은 물질은 비교적 소수성 이기도 하지만, porin 등 막 이외의 다른 부분의 도움으로 균 안으로 들어갈 수 있으며, 이 분자들은 막-활성 펩타이드에 의한 시너지 효과가 상대적으로 약한 것도 위의 기작을 설명할 수 있는 또다른 증거이기도 하다. 양전하를 띈 물질은 음 전하를 띈 물질에 비해 상대적으로 시너지가 좋다. 이는 균 표면의 음하전과 무관한 것 같지 않아 보이지만, 외막 또는 내막에 있는 음 하전 때문인지는 확실한 파악이 되지 않는다.
양하전된 분자들의 상관관계는 데이터의 양이 적어 보여주지 못했다. 전체적으론 막 활성 펩타이드와 시너지를 이루는 화합물은 소수성이 있는 (logP > 0.19) 화합물로 상관관계를 정의 할 수 있지만, 지나치게 분자량이 적은 화합물들 (M.W. < 200)은 시너지 효과가 작으며, 지나치게 logP가 커서 물에 대한 용해도가 문제가 되는 화합물 들도 시너지의 큰 증가를 기대할 수 없다. 따라서 실제로 시너지가 있는 화합물의 범위는 0.19 < logP < 5.0 정도로 예상된다.
실시예 10. 펩타이드와 병용 치료
본 발명에선 그람-음성균 막을 특이적으로 활성화시키는 KL-L9P를 이용하여 그람-음성균에 듣는 새로운 항생제를 찾아내는 방법 및 이를 이용한 그람-음성균 제압을 위한 병행치료제에 대한 것이다. 즉, 막 활성 펩타이드는 65%에 달하는 많은 종류의 다른 목적을 위한 치료제와 시너지가 있어서, 이들 치료제를 그람-음성균의 치료제로 리퍼포징 (repurposing)하는데 도와주는 역할을 보여주고 있다. 이들 중에 가장 시너지가 큰 화합물은 NSAID중에는 (S)-ibuprofen, 스타틴 게열 중에는 simvastatin, 천연물 중엔 curcumin을 들 수 있겠다. 그람-음성균의 외막을 자극하는 기 존재하는 약물 중 하나가 콜리스틴도 KL-L9P 펩타이드와 시너지가 있었는데, 이는 둘 다 외막을 건드리되 약간의 작용 기상에 차이가 나는 것으로 조사되었다. 외막 활성을 가진 두 펩타이드 존재 하에, 리포지셔닝 약물 (repositioning drug)은 더욱 시너지 효과가 커져 FICI 값으로는 0.3 보다 적은 값을 가진다. 이는, 세 개의 화합물 (LK-L9P, 콜리스틴, repositioning drug) 각각 단독으로 있을 때의 MIC에 비해 적어도 10배 이상 낮은 농도에서 그람-음성균을 죽이는 효과를 가지고 있다는 것과 같다. 이를 잘 이용하면, 세 화합물의 독성 및 세포독성을 피하여 매우 여린 농도에서도 그람-음성균을 죽일 수 있으므로, 당장 내성을 가진 그람-음성균에 적용 해 볼 수 있는 새로운 항균제가 될 것으로 사료된다. 리포지셔닝 약물 중 리네졸리드 (표 19), 클록사실린 (표 20), 컬큐민 (표 21), 및 이부프로펜 (표 22)을 각각 KL-L9P와 콜리스틴과 이중으로 섞었을 때, 또한 3중으로 섞었을 때 E.coli를 죽이는 MIC를 표로 나타냈다 (표 23).
표 19에서, 첫 번째 행 (검은색)은 세 개의 화합물을 각각 단독으로 쳤을 때, 두 번째 행 (회색)은 세 개의 화합물 중 두 개 만을 병행처리 했을 때, 세 번째 행 (흰색)은 세 화합물을 모두 섞어 처리했을 때의 E.coli에 대한 MIC를 표시한 것이다. 표 20에서, 첫 번째 행 (검은색)은 세 개의 화합물을 각각 단독으로 쳤을 때, 두 번째 행 (회색)은 세 개의 화합물 중 두 개 만을 병행처리 했을 때, 세 번째 행 (흰색)은 세 화합물을 모두 섞어 처리했을 때의 E.coli에 대한 MIC를 표시한 것이다. 표 21에서, 첫 번째 행 (검은색)은 세 개의 화합물을 각각 단독으로 쳤을 때, 두 번째 행 (회색)은 세 개의 화합물 중 두 개 만을 병행처리 했을 때, 세 번째 행 (흰색)은 세 화합물을 모두 섞어 처리했을 때의 E.coli에 대한 MIC를 표시한 것이다. 표 22에서 첫 번째 행 (검은색)은 세 개의 화합물을 각각 단독으로 쳤을 때, 두 번째 행 (회색)은 세 개의 화합물 중 두 개 만을 병행처리 했을 때, 세 번째 행 (흰색)은 세 화합물을 모두 섞어 처리했을 때의 E.coli에 대한 MIC를 표시한 것이다. 표 23에서 첫 번째 행 (검은색)은 세 개의 화합물을 각각 단독으로 쳤을 때, 두 번째 행 (회색)은 세 개의 화합물 중 두 개 만을 병행처리 했을 때, 세 번째 행 (흰색)은 세 화합물을 모두 섞어 처리했을 때의 E.coli에 대한 MIC를 표시한 것이다.
모든 경우에서 세 개의 화합물을 단독단독 쳤을 때 MIC가 가장 크게 나왔으며, 두 개만을 병행 처리했을 때에는 이보다는 낮아지며, 세 개를 섞은 병행처리에선 가장 낮은 값의 MIC를 갖는 것으로 조사되었다.
Figure PCTKR2016010408-appb-T000017
Figure PCTKR2016010408-appb-T000018
Figure PCTKR2016010408-appb-T000019
Figure PCTKR2016010408-appb-T000020
Figure PCTKR2016010408-appb-T000021
내성을 가진 그람-음성균은 퇴치할 약이 없어, 특단의 방법으로 빠른 시일 내에 새로운 종류의 약을 발굴하여야 한다. 특단의 방법 중 하나는, 그람-음성균의 외막을 선택적으로 느슨하게 만들어, 화합물이 들어가지 못했던 것을 통과 시킬 수 있도록 만드는 것이다. 프롤린이 포함된 양면성 펩타이드를 라이브러리 형태로 만들고, 그람-음성균 막 활성을 가진 KL-L9P를 후보로 선택했다. 이 펩타이드는 우선 숙주 세포를 전혀 건드리지 않아 독성이 없으면서, 그람-음성균 외막을 파고드는 성질이 있음을 알았다. 하지만 막을 붕괴할 수 있는 능력이 없어, 막에 장시간 머물며 막을 느슨하게 하는 효과로 인해, 다른 후보 항생물질이 막을 통과하는 것을 돕고 있다. 항균력을 실험한 화합물 중 전엔 그람-음성균의 항균효과가 알려져 있지 않았던 많은 종류의 화합물들이 균막 활성 펩타이드의 존재 하에 항균효과를 가지게 되었다. 그 예로 리네졸리드는 16 uM에서 그람-음성균을 죽일 수 있게 되었다. 균의 외막을 느슨하게 하는 또 다른 화합물인 콜리스틴과 이 KL-L9P 펩타이드와 같이 그람-음성균의 막을 자극하면, 시너지효과를 내고 있는 화합물들의 시너지 효과가 더욱 커짐을 알 수 있었으며, 이 때는 리네졸리드 농도가 6.7 uM 만 되어도 대장균을 잘 죽이고 있었다. 이와 같은 막 활성 펩타이드는 양면성을 지닌 알파나선 모양이 굽어진 모양을 만들 때 가장 효과가 극대화되면서 숙주세포에 대한 독성도 없다는 것이 증명되었다. 막 활성 펩타이드와 시너지를 이루는 화합물은 분자량이 200이상되는 소수성 분자 (logP > 0.19)이면 효과를 보여주는 것으로 조사되었으므로, 많은 종류의 그람-음성균을 제압할 수 있는 새로운 물질을 도출할 수 있다. 이 사실은 지금까지 그람-음성균 특이적 항균제가 개발되기 어려웠던 이유가 결국 그람-음성균의 외막에 있다는 것을 의미하고 있다. 본 발명에선 또한 외막을 느슨하게 하여 투과력이 없었던 저분자 화합물을 균 안으로 넣을 수 있는 막 활성 펩타이드 존재야말로 그람-음성균 특이적 항균제를 개발하는 가장 빠르고 확실한 방법임을 증명하고 있다.
그람-음성균 막 특이적 활성 펩타이드의 개발은 콩팥독성 및 신경독성과 같이 부작용이 큰 종래의 항생제 예를 들어, 콜리스틴 등을 대체할 수 있다. 또한, 펩타이드와 콜리스틴을 병행투여 했을 때, 큰 시너지 효과를 기대할 수 있으므로 독성이 강한 콜리스틴을 기존의 농도에 비해 1/10 이하의 농도로 투여하여 부작용을 최소화하면서 그람-음성균을 제압할 수 있다. 본 발명에 따른 막 활성 펩타이드가 외막을 느슨하게 하는 효과와 콜리스틴의 외막을 느슨하게 하는 효과가 더해질 수 있다면, 개발한 막 활성 펩타이드와 콜리스틴의 사용 농도를 낮추면서 본 발명자가 찾은 항생제를 병행으로 사용하여 그람-음성균을 제압할 수 있다. 그람-음성균의 외막을 느슨하게 하는데 막 활성 펩타이드 단독으로 또한 콜리스틴을 병행하여 사용한다면, 느슨하지 못해서 균 내의 침입이 어려웠던 많은 종류의 화합물들이 균 내로 침투하는 것이 가능하게 된다. 더욱이, 본 발명에 따른 펩타이드를 통해 그람-음성균의 외막 내로 통과하여 항생물질로서의 역할을 하는지를 정확하게 스크리닝 할 수 있으므로 신규 항생제를 탐색할 가능성 역시 매우 크다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (27)

  1. 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 알파나선형 양면성 펩타이드가 꺾어진 구조를 가지는 그람 음성균 막 투과성 펩타이드 또는 펩타이드 유사체이고,
    i) 상기 알파나선형 양면성 펩타이드의 소수성 아미노산 일부가 프롤린 (P), 아스파르트산 (D), 아스파라긴 (N), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 이의 D-형 아미노산, 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로 치환되어 꺾어진 알파나선 구조를 가지거나,
    ii) 상기 알파나선형 양면성 펩타이드를 구성하는 적어도 2개 이상의 아미노산이 i, i+3, i+4, i+7, i+8, i+10 및 i+11 (i는 정수)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치에서 이황화 결합, 탄소-탄소 결합, 말레이이미드 결합 또는 아미드 결합을 통해 연결되어 꺾어진 알파나선 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  2. 제1항에 있어서, 다음의 특성 중 어느 하나를 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    i) 숙주세포에 대한 용혈 활성이나 그람-양성균에 대한 활성이 전혀 없으면서 그람-음성균에 활성을 가짐;
    ii) 그람-음성균 외막의 표면에 있는 LPS층과 결합할 수 있는 성질을 가짐;
    iii) 그람-음성균 외막의 표면에 있는 LPS 층과 결합할 수 있는 성질을 가지면서 외막에 들어가 외막에만 존재함;
    iv) 그람-음성균의 외막을 뚫고 들어가 외막에만 존재하는 성질을 가지면서도 그람-음성균의 외막 또는 내막을 붕괴하는 능력은 없음;
    v) 동일한 아미노산 조성을 가지는 펩타이드 중 상대적으로 친수성이 강함;
    vi) Pro에 의해 알파나선이 꺾인 구조를 하고 있으며, 꺾인 부분은 소수성을 띠고 있음; 및
    vii) 양이온 하전된 아미노산이 총 아미노산의 수를 기준으로 35% 이상이거나, 소수성 아미노산이 총 아미노산의 수를 기준으로 35% 이상임.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 12-20개의 소수성 아미노산 및 친수성 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 양면성 펩타이드의 친수성 아미노산은 알지닌, 라이신, 히스티딘으로 이루어진 양전하는 띤 아미노산 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소수성 아미노산은 루신, 발린, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 이소루신, 이의 D-형 아미노산 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (1) 또는 (1-1)로 표시되는 5개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    XXZYX (1)
    XYZYY(1-1)
    상기 식에서, X는 친수성 아미노산,
    Y는 소수성 아미노산,
    Z는 꺾어진 또는 끊어진 구조를 위해 치환된 아미노산으로, 프롤린, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 또는 이의 유도체이다.
  7. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (2) 또는 (2-1)로 표시되는 7개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    YXXZYXY (2)
    YXYZYYX (2-1)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  8. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (3) 또는 (3-1)로 표시되는 9개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    YYXXZYXYY (3)
    YYXYZYYXY (3-1)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  9. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (4) 또는 (4-1)로 표시되는 11개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    XYYXXZYXYYX (4)
    YYYXYZYYXYX (4-1)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  10. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (5)로 표시되는 6개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    YXZZXX (5)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  11. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (6)로 표시되는 8개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    YYXZZXXY (6)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  12. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (7)로 표시되는 10개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    XYYXZZXXYY (7)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  13. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 식 (8)로 표시되는 12개 아미노산 서열, 이의 역서열 또는 이를 반복적으로 포함하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체:
    XXYYXZZXXYYX (8)
    상기 식에서, X, Y 및 Z는 제5항의 정의와 동일하다.
  14. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 양전하를 띄는 알지닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 잔기를 펩타이드를 구성하는 총 아미노산의 35% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 루신, 트립토판, 발린, 페닐알라니, 타이로신, 및 이소루신으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 펩타이드를 구성하는 총 아미노산의 35% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 1 또는 2로 표시되는 서열, 이의 역서열 또는 이를 포함하는 반복서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
    KLLKL (서열번호 1)
    LKKLL (서열번호 2)
  17. 제1항에 있어서,
    상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 다음의 서열번호 3 또는 4로 표시되는 서열, 이의 역서열 또는 이를 포함하는 반복서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
    LKKLLKL (서열번호 3)
    KLLKLLK (서열번호 4)
  18. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드에서 N 말단에서 C 말단 방향으로 6번, 7번, 8번, 9번, 11번 및 12번 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는 아미노산이 치환되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  19. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드에서 프롤린, 아스파르틱 산 또는 이의 유도체로 치환되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  20. 제1항에 있어서, 상기 알파나선형 양면성 펩타이드는 LKKLLKLLKKLLKL (서열번호 5) 또는 KLLKLLKKLLKLLK (서열번호 6)인 것을 특징으로 하는 펩타이드이고, 서열번호 5의 7,8번 류신 위치, 서열 번호 6의 9번 위치에 꺾어진 구조를 위해 치환된 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체를 포함하는 병용 투여용 항균 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 펩타이드는 lopP (partition coefficient) 값이 0.19이상인 소수성 화합물, 생리적 pH 조건에서 양이온으로 하전된 화합물 및 콜리스틴으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상과 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 약물이 연결된 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 약물은 lopP (partition coefficient) 값이 0.19 이상인 소수성 화합물, 생리적 pH 조건에서 양이온으로 하전된 화합물 및 콜리스틴으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 접합체.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 펩타이드 또는 펩타이드 유사체와 약물은 공유 결합에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  26. 제21항의 조성물을 포함하는 항생제.
  27. 제23항의 접합체를 포함하는 항생제.
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