KR20030061718A - α-헬릭스 구조의 모델형 항균 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 α-헬릭스 구조 모델형 항균 펩타이드에 있어서 펩타이드의 친수성 영역과 소수성 영역의 적절한 균형조절 (1:1), α-헬리시티의 조절, 펩타이드 사슬의 꺾임(kink)을 유도하는 아미노산(Pro)의 도입 및 D-형 아미노산의 도입(입체구조 이성질체화)에 의하여 라이신, 류신 및 트립토판으로만 구성된 펩타이드들을 설계하고 합성하여 항균, 항진균활성 및 적혈구 용혈활성(인체 독성의 척도)을 측정하여 펩타이드 항생제로서의 유용성을 발명한 것이다. 본 발명은 항균활성이 우수하면서도 인체무독성을 보이는 항균 펩타이드인 서열번호 1의 아미노산 서열을 지니는 M13P-1 펩타이드 , 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 M18-1 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열을 지니는 M18-2 펩타이드 중 선택된 1종 이상의 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.

Description

α-헬릭스 구조의 모델형 항균 펩타이드{Antibiotic peptide model having α-helix structure}
본 발명은 α-헬릭스 구조의 모델형 항균 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연에 존재하는 항생 펩타이드에서 보여지는 특정구조인 α-헬릭스 구조를 취하며 라이신, 류신 및 트립토판 등의 특정 아미노산만으로 이루어진 항생 펩타이드 모델을 설계·합성하여 항균·항진균 활성, 적혈구 용혈활성, 구조-활성상관 및 항생작용 기작의 해명을 통하여 인체에 독성이 없으며, 천연의 항균 펩타이드들보다 우수한 항균·항진균 활성을 나타내는 펩타이드 항생제에 관한 것이다.
페니실린, 세파로스포린 등과 같은 현재 상용화되고 있는 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항균작용을 나타낸다. 최근에는 이들 종래의 항생물질에 대하여 내성을 가지는 다양한 내성균주들의 출현으로 인하여 감염성 질병치료를 위한 기존의 항생제의 사용이 점점 어려워지고 있는 실정이다.
또한 "죽음의 세균" 이라 불리는 MRSA는 메티실린계 항생제에 내성을 지닌 포도상구균으로서 병원 내 감염으로 사망 또는 장애에 이르는 대부분의 환자들은 이 세균에 감염되었기 때문이다. 우리나라는 특히 항생제의 오·남용이 심하여 내성율이 세계 최고 수준인 것으로 알려진다. 더욱 더 무서운 일은 MRSA에 대항 할 수 있는 유일한 항생제가 반코마이신(Vancomycin)인데 이 반코마이신에 대해서도 내성을 지닌 VREF 즉 슈퍼박테리아가 1996년 일본에서 발견되었으며 단일 항생제로 치료가 불가능하며 몇 가지 항생제를 섞은 혼합치료법으로도 완치를 확신하지못하여, 결국 치명적인 패혈증을 유발한다는 것이 알려져 있다. 따라서 펩타이드의 설계 및 합성기술을 이용하여 기존의 항생제를 대체할 수 있는 새로운 펩타이드 항생제의 개발이 시급히 요구되고 있다.
α-헬릭스 구조 모델형 항균 펩타이드에 있어서는 펩타이드의 친수성 영역(hydrophilic region)과 소수성 영역(hydrophobic region)사이의 적절한 밸런스 조절, α-헬리시티(helicity)의 조절, 펩타이드 사슬의 꺾임(kink)을 유도하는 아미노산인 프롤린(Pro)의 도입 및 D-형 아미노산의 도입에 의하여 라이신(Lys), 류신(Leu) 및 트립토판(Trp)으로만 구성된 펩타이드를 설계하였다.
합성한 펩타이드의 항균, 항진균, 항암, 적혈구용혈활성 등의 항생활성 측정을 통하여 인체무독성·고항균력을 가진 최적의 펩타이드를 선정하여 펩타이드 항생제로서의 유용성을 검토하였다.
생체막 환경에서의 펩타이드의 구조분석 및 인공 지질막과의 상호작용조사에 의하여 항생 펩타이드의 작용기작을 해명하였다.
개발된 모델형 펩타이드는 인체 무독성 및 높은 항균력을 가지므로 치료용 펩타이드로써의 적용 가능성이 기대된다. 펩타이드 항생제는 항균제, 항진균제, 항암제, 항바이러스제, 염증성 질환 치료제, 구강질환치료제, 피부질환 치료제, 안질감염 치료제, 점막 보호제, 세균성 위궤양 치료제, 낭포성 섬유증 환자의 만성적 호흡기 세균감염 치료제, 무공해 방부제 등의 임상적 치료용으로도 적용 가능할 것으로 여겨진다.
효과적인 항균 펩타이드의 개발을 위해서는 인체독성이 거의 없이 세균에 대해서만 선택적으로 강한 활성을 나타내야 하는 조건을 만족하여야 하며, 구조 생물학적 기법을 이용하여, 천연 항균 펩타이드가 가지는 구조적 공통성(Homology)에 기초한 이상적인 모델형 항균 펩타이드가 필요한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 현재까지 개발된 항균펩타이드보다 높은 항균력 및 낮은 인체독성을 지닌 이상적인 펩타이드 항생제를 개발하기 위한 것으로, 현재까지 개발된 펩타이드 항생제 중에는 Melittin과 같이 항균활성을 높으나 인체독성을 지니는 것이 있으며, 반면 Magainin 2와 같이 인체독성은 낮으나, 비교적 항균활성이 낮은 것이 있다.
즉 melitin, dermaseptins, SMAP-29와 같은 항균작용이 큰 펩타이드는 세포독성 또한 크기 때문에 안전성이 문제가 되며 한편 buforin, clavanins, magainins와 같은 항균작용이 작은 펩타이드는 세포독성 또한 작기 때문에 유효성에 문제가있는 것이다. 따라서 본 발명에서는 이들 천연 항균펩타이드의 장점만을 살리고 단점을 제거한, 즉 높은 항균력과 낮은 인체독성을 지닌 이상적인 펩타이드 항생제를 개발하는 것이다.
도 1은 M18 모델 펩타이드의 α-헬리컬 휠 다이어그램 및 치환부위를 나타낸 도면이다.
도 2는 M13 모델 펩타이드의 α-헬리컬 휠 다이어그램 및 치환부위를 나타낸 도면이다.
본 발명은 항균활성이 우수하면서도 인체무독성을 보이는 항균 펩타이드인 M13P-1 펩타이드 : KWKKLPKKLLKLL-NH2(서열번호 1), M18-1 펩타이드 : KWKKLLKKPLKL
LKKLLK-NH2(서열번호 2), M18-2 펩타이드 : KWKKLLKK P LKLLKKLLK-NH2(서열번호 3) 중 선택된 1종 이상의 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 3종류의 항균 펩타이드 외에 항균 펩타이드로 개발이 가능한 M21P 펩타이드 : KWKKLLKKLLPLLKKLLKKLK-NH2(서열번호 4), M17P 펩타이드 : KWKKLLKKPLKLLKKLL-NH2(서열번호 5), M13P 펩타이드 : KWKKLLPKLLKLL-NH2(서열번호 6), M18-4 펩타이드 : KWKKLLKKLL P LLKKLLK-NH2(서열번호 7)를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
모델 펩타이드 설계 및 합성
모델형 α-헬릭스 구조를 가지며 라이신 잔기로만 양전하를 지닌 친수성 부분과 한 개의 트립토판 잔기와 주로 류신 잔기로만 이루어진 소수성영역이 반대방향으로 배치된 M18을 설계하였다.
18개의 아미노산으로 이루어진 α-헬릭스 구조가 α-헬리컬 휠 다이어그램에서 측쇄의 공간적인 배치가 완전한 1 사이클을 구성하며, 따라서 α-헬릭스 구조의 양쪽 친매성 구조를 설계 할 때는 18개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 주로 이용하는 경우가 많다.
도 1은 M18의 α-헬리컬 휠 다이어그램으로부터 소수성영역의 중앙부위의 9번째 아미노산인 류신을 프롤린으로 치환시킨 M18-1, D-프롤린으로 치환시킨 M18-2를 설계하고 합성하였다. 또한 친수성영역의 중앙부위의 11번째 아미노산인 라이신을 프롤린으로 치환시킨 M18-3, D-프롤린으로 치환시킨 M18-4를 설계하고 합성하였다. 표 1은 18개의 아미노산으로 구성된 합성 모델 펩타이드 및 그 서열을 나타낸 것이다.
모델형 M18 펩타이드 및 유도체
Peptide명 서열 HPLC 순도 이론분자량 MASS 확인
M18 KWKKLLKKLLKLLKKLLK-NH2 99% 2262.07 2262.3
M18-1 KWKKLLKKPLKLLKKLLK-NH2 99% 2246.03 2245.2
M18-2 KWKKLLKK P LKLLKKLLK-NH2 99% 2246.03 2246.7
M18-3 KWKKLLKKLLPLLKKLLK-NH2 99% 2231.02 2230.5
M18-4 KWKKLLKKLL P LLKKLLK-NH2 99% 2231.02 2233.1
* P : D-Pro
또한 18개의 아미노산으로 구성된 상기 모델 펩타이드와 같은 방법으로 13개의 아미노산으로 구성된 모델 M13 펩타이드 유도체를 합성하였다.
아미노산 길이가 13개의 M13펩타이드(KWKKLLKKLLKLL-NH2) 및 또한 Pro을 중앙에 도입한 M13P 펩타이드(KWKKLLPKLLKLL-NH2)가 비교적 높은 항균 및 항진균활성을 나타내었으나 반면에 적혈구 용혈활성(인체독성활성)을 나타내었으므로 항균 및 항진균활성을 유지시키고 적혈구 용혈활성이 없는 펩타이드를 설계하기 위하여 다음의 펩타이드 (M13P-1)를 설계하였다.
M13의 α-헬리컬 휠 다이어그램(도 2)으로부터 M13P는 친수성 영역의 중앙부위의 7번째 아미노산인 라이신을 프롤린으로 치환시킨 것이므로 M13의 소수성영역의 중앙부분의 6번째 아미노산인 류신을 프롤린으로 치환시킨 M13P-1 펩타이드를 설계하고 합성하였다. 표 2는 13개의 아미노산으로 구성된 합성 모델 펩타이드 및 그 서열을 나타낸 것이다.
모델형 M13 펩타이드 및 유도체
Peptide명 서열 HPLC 순도 이론분자량 MASS 확인
M13 KWKKLLKKLLKLL-NH2 99% 1651.23 O.K
M13P KWKKLLPKLLKLL-NH2 98% 1620.17 O.K
M13P-1 KWKKLPKKLLKLL-NH2 99% 1635.19 O.K
모델 펩타이드의 항균 및 항진균활성
1) 모델형 M18 펩타이드 및 유도체의 항균 및 항진균활성
그람음성균 (E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa)과 그람양성균 (B. subtilis, S. aureus, S. epidermidis) 그리고 진균 (C. albicans)에 대하여 각각의 항생 활성을 측정하였다. 그람음성균 및 그람양성균에서는 M18의 소수성영역의 류신을 프롤린으로 치환시킨 M18-1이 친수성영역의 라이신을 프롤린으로 치환시킨 M18-3보다 높은 항균활성을 나타내었다. M18-1의 D-프롤린 치환 (M18-2)은 항균활성에는 거의 변화가 없었으나 M18-2의 D-프롤린 치환 (M18-4)은 2∼4배의 항균활성의 증가를 보였다.C. albicans에 대한 항진균활성에 있어서는 모든 프롤린 또는 D-프롤린 치환체는 M18에 비해 모두 4배의 항진균 활성의 상승을 보였다. 따라서 α-헬릭스 구조 M18 모델형 펩타이드에서 소수성영역의 중앙부위에 프롤린 킹크(kink)를 도입하는 것이 친수성 영역에 프롤린 킹크를 도입하는 것보다 항균력을 증가시키는데 유리하다는 것을 확인하였다.
모델형 M18 펩타이드 및 유도체의 항생 활성 (MIC: μM)
Peptide명 Gram-negative bacteria Gram-positive bacteria Fungi
E. coli S. typhimurium P. aeuroginosa B. subtilis S. aureus S. epidermidis C. albicans
M18 4 8 4 8 4 4 16
M18-1 2 2 1 2 0.5 2 4
M18-2 2 1 1 1 1 4 4
M18-3 4 4 4 4 2 2 4
M18-4 2 2 1 1 0.5-1 2 4
Magainin2 16 8 32 16 4 8 8
Melittin 4 2 2 4 1 0.5 2
2) 모델형 M13 펩타이드 및 유도체의 항균 및 항진균활성
그람음성균 (E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa)과 그람양성균 (B. subtilis, S. aureus, S. epidermidis) 그리고 진균 (C. albicans)에 대하여 각각의 항생 활성을 측정하였다. 그람음성균 및 그람양성균에서는 M13의 친수성영역의 라이신을 프롤린으로 치환시킨 M13P이 소수성영역의 류신을 프롤린으로 치환시킨 M13P-1 보다 높은 항균활성을 나타내었다.C. albicans에 대한 항진균활성에 있어서는 M13P가 M13 및 M13P-1보다 2배 높은 항진균활성을 보였다. 따라서 α-헬릭스 구조 M13 모델형 펩타이드에서 친수성영역에 프롤린 킹크를 도입하는 것이 소수성 영역에 프롤린 킹크를 도입하는 것보다 항균력을 증가시키는데 유리하다는 사실을 알았다.
모델형 M13 펩타이드 및 유도체의 항생 활성 (MIC: μM)
Peptide명 Gram-negative bacteria Gram-positive bacteria Fungi
E. coli S. typhimurium P. aeuroginosa B. subtilis S. aureus S. epidermidis C. albicans
M13 8 8 8 4 4 8 16
M13P 2 2 2 1 2 1 8
M13P-1 8 4 4 2 2 2 16
Magainin2 16 8 32 16 4 8 8
Melittin 4 2 2 4 1 0.5 2
모델 펩타이드의 인체독성
1) 모델형 M18 펩타이드 및 유도체의 인체독성
M18의 소수성영역의 류신을 프롤린으로 치환시킨 M18-1이 친수성영역의 라이신을 프롤린으로 치환시킨 M18-3보다 낮은 인체독성을 나타내었다. 유도체에서 프롤린 치환체 보다는 D-프롤린 치환체가 낮은 인체독성을 나타내었다. 특히 M18-2 펩타이드는 가장 낮은 인체독성활성을 나타내었다. 즉, 항균활성과 인체독성활성을 종합하여 검토하면 α-헬릭스 구조 모델형 펩타이드에서 항균활성을 증가시키고 인체독성이 비교적 적은 이상적인 펩타이드 항생제를 개발하기 위하여서는 α-헬릭스 구조의 소수성영역의 중앙부위의 아미노산을 프롤린이나 D-프롤린으로 치환하여 킹크를 도입하는 것이 유리하다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 개발된 M18-2 펩타이드는 비교적 높은 펩타이드 농도(25μM∼100μM)에서도 인체독성이 적으며, 높은 항균 및 항진균 활성을 나타내었다.
모델형 M18 펩타이드 및 유도체의 인체독성 (% Hemolysis)
농도이름 100μM 50μM 25μM 12.5μM 6.25μM 3.12μM 1.6μM 0.8μM 0.4μM 0.2μM
M18 56.3 56.6 45.9 42.5 40.3 31.1 23.0 9.2 4.2 1.0
M18-1 11.7 7.8 4.8 2.4 1.6 1.3 0 0 0 0
M18-2 5.4 3.2 1.5 0.6 0.2 0 0 0 0 0
M18-3 52.4 50.0 49.7 45.4 34.1 15.7 3.2 0.2 0 0
M18-4 36.7 17.5 9.8 5.0 1.5 0.4 0 0 0 0
2) 모델형 M13 펩타이드 및 유도체의 인체독성
M13의 소수성영역의 류신을 프롤린으로 치환시킨 M13-P1이 친수성영역의 라이신을 프롤린으로 치환시킨 M13P보다 낮은 적혈구 용혈활성(인체독성활성)을 나타내었다. 즉 M13-P1 펩타이드는 100μM의 높은 농도에서도 거의 적혈구 용혈활성을 나타내지 않았다. 항균활성과 인체독성활성을 종합하여 검토하여 본다면 M13P-1 펩타이드는 100μM의 높은 농도에서도 거의 적혈구 용혈활성을 나타내지 않으며, 반면에 항균 및 항진균 활성에 있어서는 M13과 비교하여 2∼4배 낮은 항균 및 항진균 활성을 나타내었다. 따라서 본 연구에서 개발된 M13P-1 펩타이드는 높은 농도(100μM)에서도 인체독성이 거의 없으며 비교적 높은 항균 및 항진균 활성을 나타내었다.
모델형 M13 펩타이드 및 유도체의 인체독성 (% Hemolysis)
농도이름 100μM 50μM 25μM 12.5μM 6.25μM 3.12μM 1.6μM
M13 72.0 62.3 34.5 19.6 7.9 2.0 0
M13P 26.1 11.9 4 0.7 0 0 0
M13P-1 0.8 0.1 0 0 0 0 0
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
(실시예 1) 모델형 M18 펩타이드 및 유도체의 구조분석
원편광이색성(CD: Circular dichroism)에 의하여 생체막과의 비슷한 환경에서의 2차 구조를 분석하여 펩타이드의 항생활성과 2차 구조와의 상관관계를 조사하였다(Jasco J-720 spectropolarimeter를 사용하였다). 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.2) 및 생체막을 모방하는 TFE 용액 및 SDS(소듐 도데실 설페이트)마이셀에서 각각의 펩타이드를 녹여 CD 스펙트라를 측정하였다. 펩타이드의 농도는 100㎍/ml로 하였으며, 1 mm pathlength 세포를 이용하여 25℃로 하였고, 190nm에서 250nm 까지 0.1 nm 간격으로 각 샘플당 4번 스캐닝하였다.
데이터 처리는 다음식에 의하여 처리하였다.
mean residue ellipticity[θ]는 deg°m2°mol-1로 표시하였다.
[θ] = [θ]obs x MRW / 10 c x d
여기서 - [θ]obs : 실험적으로 측정된 ellipicity (millidegree)
- MRW : 잔기의 평균 분자량 (분자량/펩타이드 결합의 수)
- c : 샘플의 농도 mg/mL
- d : optical pathlength of the cell in cm
각 펩타이드의 % α-헬리컬 함량은 다음식에 의하여 계산하였다.
% α-헬리컬 함량 = 100 ([θ]222- [θ]0 222) / [θ]100 222
여기서 [θ]222는 실험적으로 측정된 222 nm에서의 ellipticity이며,
[θ]100 222: 펩타이드가 100 % α-헬릭스 구조일 때의 ellipticity는 30300으로 간주하며, [θ]0 222: 펩타이드가 * 0 % α-헬릭스 구조일 때의 ellipticity는 2340으로 간주하였다.
표 7은 펩타이드의 여러 용매조건에서의 α-헬릭스 함량을 나타낸 것이다.
펩타이드의 여러 용매조건에서의 α-헬릭스 함량(%)
펩타이드명 인산 완충액 50% TFE 30 mM SDS
[θ]222 α-헬릭스 함량(%) [θ]222 α-헬릭스 함량(%) [θ]222 α-헬릭스 함량(%)
M18 -764.9 0 -22273.8 65.8 -20517.0 60.0
M18-1 153.8 0 -14368.6 39.7 -11601.2 30.6
M18-2 1100 0 -9017.0 22.0 -3463.9 3.7
M18-3 -430.2 0 -16339.1 46.2 -11676.8 29.8
M18-4 106.5 0 -7664.3 17.6 -2201.2 0
(α-헬릭스 함량 (%) = 100 ([θ]222+ 2340) / -30300)
모든 펩타이드는 인산 완충액 상에서는 거의 구조를 갖지 않았으나 50% TFE 또는 30mM SDS 마이셀에서 M18, M18-1 및 M18-3가 전형적인 α-헬릭스 구조를 나타내었다. M18-1 및 M18-3의 경우 프롤린 치환에 의하여 M18보다 α-헬릭스 함량이 격심하게 감소함을 보였다. 더욱이 D-프롤린을 포함한 유도체인 M18-2 및 M18-4는 특히 생체막을 모방하는 30mM SDS 마이셀에서는 α-헬릭스 구조가 약해지고 turn구조를 나타내었다.
(실시예 2) 모델형 M18 펩타이드의 인산 지질막과의 상호작용분석
펩타이드와 지질막과의 상호작용을 분석하기 위하여 박테리아의 내막의 주요구성 인지질인 음이온 인지질 POPG(1-팔미토일-2-올레일포스파티딜-글리세롤)로 구성된 음성 리포좀(anionic-liposome)과 적혈구 세포의 주요 구성성분인 중성 인지질 POPC(1-팔미토일-2-올레이포스파티딜콜린)로 이루어진 중성 리포좀(neutral-liposome)을 sonication 방법으로 제작하였다.
각각의 리포좀에 형광물질인 calcein을 포획시키고 각각의 펩타이드를 농도별로 투여하여 펩타이드의 리포좀 disruption에 의하여 방출되어 나오는 calcein의 양을 측정하였다. 형광분석기는 Jasco FP-750 spectrofluorimeter(Tokyo, Japan)을 사용하였으며, 490nm에서 여기시키고 리포좀으로부터 방출되는 calcein의 형광강도를 520nm에서 측정하였다.
0.1% Triton-X100로 처리하였을 때를 100% 방출로 간주하고 펩타이드를 처리하지 않았을 때를 0% 방출로 간주하였다. 다음식에 의하여 각 펩타이드의 % 방출값을 구하였다.
% 방출치 = 100 (F - F0) / (Ft- F0)
F : 펩타이드를 처리하였을 때의 형광강도
F0: 펩타이드를 처리하지 않았을 때의 형광강도
Ft: 0.1% Triton-X100로 처리하였을 때의 형광강도
POPG 리포좀 및 POPC 리포좀에 대한 농도별 펩타이드 투여에 따른 % 누출치를 나타내었다. POPG 리포좀에 있어서 각 펩타이드의 활성은 M18-3 > M18-4 >M18-2 > M18 > M18-1의 순으로 나타났으나 큰 활성의 차이는 보이지 않았다. 그러나 POPC 리포좀에 있어서는 M18 > M18-3 >> M18-1 = M18-4 > M18-2의 순으로 나타났다. 이 결과는 적혈구 용혈활성과 비슷한 경향을 나타내었다. 펩타이드 중에서 M18-2 펩타이드가 가장 POPG 리포좀에 대한 높은 선택성을 나타내었다.
M18-1, M18-4 및 M18-2에서 보이는 적혈구 용혈활성에서 보이는 낮은 활성은 POPC 리포좀에 대한 낮은 친화력에 기인한다고 볼 수 있다. 따라서 M18-1, M18-4 및 M18-2에서 보이는 높은 항균 및 항진력활성 그리고 낮은 적혈구 용혈활성(인체독성활성)은 이들 펩타이드의 중성 인지질에 대한 낮은 친화력과 산성 인지질에 대한 높은 친화력에 기인한다고 볼 수 있다.
결론적으로 본 발명에서 설계된 펩타이드 M18-1, M18-2 및 M18-4는 인체독성이 비교적 적으며 높은 항균 및 항진균활성을 나타내었다. 특히 D-프롤린을 포함한 M18-2 펩타이드(KWKKLLKK P LKLLKKLLK-NH2)는 펩타이드의 고농도에서도 아주 낮은 인체독성을 나타낸 반면에 매우 높은 항균 및 항진균활성을 나타내었으므로 펩타이드 항생제로서의 사용가능성이 매우 크다고 인식된다.
따라서 본 발명으로부터 α-헬릭스구조 펩타이드로부터 인체무독하며 높은 항균 및 항진균활성을 가진 항생제로서 유용성을 가진 펩타이드를 설계하기 위해서는 M18-2 펩타이드와 같이 양쪽친매성 α-헬릭스구조의 펩타이드의 소수성영역의 중앙에 D-프롤린을 도입하는 것이 유용하다는 사실을 인지하였다.
(실시예 3) 모델형 M13 펩타이드 및 유도체의 구조분석
원편광이색성(CD: Circular dichroism)에 의하여 생체막과의 비슷한 환경에서의 2차 구조를 분석하여 펩타이드의 항생활성과 2차 구조와의 상관관계를 조사하였다(Jasco J-720 spectropolarimeter를 사용). 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.2) 및 생체막을 모방하는 TFE 용액 및 SDS(소듐 도데실 설페이트)마이셀에서 각각의 펩타이드를 녹여서 CD 스펙트라를 측정하였다. 펩타이드의 농도는 100㎍/ml로 하였으며, 1 mm pathlength 세포를 이용하여 25℃로 하였으며, 190nm에서 250nm 까지 0.1nm 간격으로 각 샘플당 4번 스캐닝하였다.
데이터 처리는 다음식에 의하여 처리하였다.
mean residue ellipticity[θ]는 deg°m2°mol-1로 표시하였다.
[θ] = [θ]obs x MRW / 10 c x d
여기서 - [θ]obs : 실험적으로 측정된 ellipicity (millidegree)
- MRW : 잔기의 평균 분자량 (분자량/펩타이드 결합의 수)
- c : 샘플의 농도 mg/mL
- d : optical pathlength of the cell in cm
각 펩타이드의 % α-헬리컬 함량은 다음식에 의하여 계산하였다.
% α-헬리컬 함량 = 100 ([θ]222- [θ]0 222) / [θ]100 222
여기서 [θ]222는 실험적으로 측정된 222 nm에서의 ellipticity이며,
[θ]100 222: 펩타이드가 100 % α-헬릭스 구조일 때의 ellipticity는 30300으로 간주하며, [θ]0 222: 펩타이드가 0 % α-헬릭스 구조일 때의 ellipticity는 2340으로 간주하였다.
표 8은 M13 및 유도체 펩타이드의 여러 용매조건에서의 α-헬릭스 함량을 나타낸다.
M13 및 유도체 펩타이드의 여러 용매조건에서의 α-헬릭스 함량(%)
펩타이드명 인산 완충액 50% TFE 30 mM SDS
[θ]222 α-helix 함량(%) [θ]222 α-helix 함량(%) [θ]222 α-helix 함량(%)
M13 -277.2 0 -16892.4 48.0 -15052.5 42.0
M13P -425.6 0 -11057.1 28.8 -10999.8 28.6
M13P-1 75.8 0 -4909.3 8.5 -4637.3 7.6
α-헬릭스 함량 (%) = 100 ([θ]222+ 2340) / -30300
본 발명의 효과는 α-헬릭스 구조 모델형 항균 펩타이드에 있어서 펩타이드의 친수성 영역과 소수성 영역의 적절한 균형조절 (1:1), α-헬리시티의 조절, 펩타이드 사슬의 꺾임(kink)을 유도하는 아미노산(Pro)의 도입 및 D-형 아미노산의 도입(입체구조 이성질체화)에 의하여 라이신, 류신 및 트립토판으로만 구성된 펩타이드들을 설계하고 합성하여 항균, 항진균활성 및 적혈구 용혈활성(인체 독성의 척도)를 측정하여 펩타이드 항생제로서의 유용성을 발명한 것이다.
α-헬릭스 구조 모델형 항균 펩타이드의 중앙부위에 꺾임을 유도하는 프롤린 또는 D-프롤린을 도입하면 항균 및 항진균활성이 증가하거나 유지되는 반면에 인체독성이 현저하게 감소하였다. 따라서 α-헬릭스 구조형 항균 펩타이드에서 분자의 중앙부위에 프롤린 또는 D-프롤린의 도입은 인체독성이 감소시키고 항균 활성을 증가시키는 도구로써 효과적으로 적용될 수 있음이 발명되었다.

Claims (3)

  1. 항균활성이 우수하고 인체에 무독성인 서열번호 1의 아미노산 서열을 지니는 M13P-1 항균 펩타이드
  2. 항균활성이 우수하고 인체에 무독성인 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 M18-1 항균 펩타이드
  3. 항균활성이 우수하고 인체에 무독성인 서열번호 3의 아미노산 서열을 지니는 M18-2 항균 펩타이드
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017048092A1 (ko) * 2015-09-17 2017-03-23 서울대학교산학협력단 그람 음성균에 대한 항균 활성을 나타내는 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도
US9745348B2 (en) 2011-09-14 2017-08-29 The University Of Manchester Short designed peptides possessing selective actions against bacteria and cancer cells
JP2018529689A (ja) * 2015-09-17 2018-10-11 ソウル大学校産学協力団Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ＆Ｄｂ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ グラム陰性菌に対する抗菌活性を示す切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体およびその用途
JP2020522468A (ja) * 2017-05-11 2020-07-30 ロサンゼルス バイオメディカル リサーチ インスティテュート アット ハーバー− ユーシーエルエー メディカル センター アルファコアヘリックスを有する抗微生物ペプチド
WO2021201570A1 (ko) * 2020-03-30 2021-10-07 애니젠 주식회사 신규한 항균 펩타이드 및 이의 용도
WO2021206397A1 (ko) * 2020-04-07 2021-10-14 (주) 캠프테라퓨틱스 신규한 항균 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9745348B2 (en) 2011-09-14 2017-08-29 The University Of Manchester Short designed peptides possessing selective actions against bacteria and cancer cells
JP6990268B2 (ja) 2015-09-17 2022-01-12 ソウル大学校産学協力団 グラム陰性菌に対する抗菌活性を示す切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体およびその用途
WO2017048092A1 (ko) * 2015-09-17 2017-03-23 서울대학교산학협력단 그람 음성균에 대한 항균 활성을 나타내는 끊어진 또는 꺾어진 나선 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도
CN109415411A (zh) * 2015-09-17 2019-03-01 首尔大学校产学协力团 表现出抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性的断开或折叠的螺旋肽或肽类似物及其用途
EP3351553A4 (en) * 2015-09-17 2019-06-19 Seoul National University R & DB Foundation PEPTIDE OR ANALOGUE OF BROKEN OR FOLDED HELICOIDAL PEPTIDE HAVING ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST GRAM-NEGATIVE BACTERIA, AND USE THEREOF
JP2020128386A (ja) * 2015-09-17 2020-08-27 ソウル大学校産学協力団Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ＆Ｄｂ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ グラム陰性菌に対する抗菌活性を示す切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体およびその用途
JP2018529689A (ja) * 2015-09-17 2018-10-11 ソウル大学校産学協力団Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ＆Ｄｂ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ グラム陰性菌に対する抗菌活性を示す切断または折り畳まれたヘリックスペプチドまたはペプチド類似体およびその用途
US11123400B2 (en) 2015-09-17 2021-09-21 Seoul National University R&Db Foundation Broken or folded helical peptide or peptide analog exhibiting antimicrobial activity against gram-negative bacteria, and use thereof
CN109415411B (zh) * 2015-09-17 2022-06-28 首尔大学校产学协力团 表现出抗革兰氏阴性菌的抗微生物活性的断开或折叠的螺旋肽或肽类似物及其用途
JP2020522468A (ja) * 2017-05-11 2020-07-30 ロサンゼルス バイオメディカル リサーチ インスティテュート アット ハーバー− ユーシーエルエー メディカル センター アルファコアヘリックスを有する抗微生物ペプチド
US11987607B2 (en) 2017-05-11 2024-05-21 The Lundquist Institute for Biomedical Innovation at Harbor-UCLA Medical Center Antimicrobial peptides with alpha-core helices
JP7253257B2 (ja) 2017-05-11 2023-04-06 ロサンゼルス バイオメディカル リサーチ インスティテュート アット ハーバー－ ユーシーエルエー メディカル センター アルファコアヘリックスを有する抗微生物ペプチド
KR20210122189A (ko) * 2020-03-30 2021-10-08 애니젠 주식회사 신규한 항균 펩타이드 및 이의 용도
WO2021201570A1 (ko) * 2020-03-30 2021-10-07 애니젠 주식회사 신규한 항균 펩타이드 및 이의 용도
KR20210124923A (ko) * 2020-04-07 2021-10-15 (주) 캠프테라퓨틱스 신규한 항균 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도
WO2021206397A1 (ko) * 2020-04-07 2021-10-14 (주) 캠프테라퓨틱스 신규한 항균 펩타이드 또는 펩타이드 유사체 및 이의 용도

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