KR100811745B1 - 세포투과성 펩타이드 Ｐｅｐ １으로부터 설계된 신규한항균 펩타이드 Ｐｅｐ 1 Ｋ 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포투과성 펩타이드인 Pep-1을 이용한 신규한 항균 펩타이드 Pep-1-K 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 세포투과성 펩타이드로 알려진 Pep-1의 2번째, 6번째 및 11번째의 아미노산인 글루탐산(Glu)을 라이신(Lys)으로 치환시켜 제조한 항균 펩타이드 Pep-1-K 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명의 Pep-1-K는 다양한 균주, 그 중에서도 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제에 내성을 가진 균주에서 강력한 항균활성을 나타낼 뿐 아니라 인간 적혈구 세포에서 어떠한 용혈활성도 나타내지 않기 때문에 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
세포투과성 펩타이드, Pep-1, Pep-1-K

Description

세포투과성 펩타이드 Ｐｅｐ １으로부터 설계된 신규한 항균 펩타이드 Ｐｅｐ 1 Ｋ 및 그의 용도{A novel antimicrobial peptide Pep-1-K designed from the cell-penetrating peptide Pep-1 and uses thereof}
도 1은 Pep-1-K, Pep-1 및 멜리틴(melittin)을 각각 인간 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 인간 적혈구 세포의 용혈도(hemolysis)를 백분율(%)로 나타낸 그래프이다.
● : 멜리틴,
○ : Pep-1,
▼ : Pep-1-K.
도 2는 박테리아의 세포막을 모방한 EYPC/EYPG(7:3, w/w) 리포좀(A) 및 진핵세포의 세포막을 모방한 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀(B)에서 각각 Pep-1-K, Pep-1 및 멜리틴에 의한 트립토판 형광발산소멸(fluorescence emission quenching) 양상을 나타낸 그래프이다.
● : 멜리틴,
○ : Pep-1,
▼ : Pep-1-K.
도 3은 형광염료인 칼세인(calcein)을 포함하고 있는 EYPC/EYPG(7:3, w/w) 리포좀에 각각 Pep-1-K, Pep-1 및 멜리틴을 투여했을 때, 시간에 따른 염료방출(dye leakage) 양상을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 세포투과성 펩타이드인 Pep-1을 이용한 신규한 항균 펩타이드 Pep-1-K 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포투과성 펩타이드로 알려진 Pep-1의 2번째, 6번째 및 11번째의 아미노산인 글루탐산(Glu)을 라이신(Lys)으로 치환시켜 제조한 항균 Pep-1-K 및 그 용도에 관한 것이다.
현재까지, 항생제에 내성을 가진 다양한 내성 균주들의 출현으로 인하여 감염성 질환에 대한 치료가 더욱 어려워지고 있는 실정이다. 이러한 항생제 내성 균주에 대항하기 위해서는 항생제 내성에 특이적인 면역 인자가 필요하며, 이러한 면역 인자로서 항균성 펩타이드, 면역세포, 식균세포 및 항체 등이 알려져 있다(Boman, H. G., Annu. Rev. Immunol., 13, 61-92, 1995; Hancock, R. E. 및 Scott, M. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 8856-8861, 2000; 및 Zasloff, M., Nature, 415, 389-395, 2002). 특히, 항균성 펩타이드(antimicrobial peptide)는 기존의 화학적으로 제조된 항생제와는 달리 그 항생 기작의 차이로 인 해 차세대 항생제 후보 물질로서 주목받고 있으며(Yeaman, M. R. 및 Yount, N. Y., Pharmacol. Rev., 55, 27-55, 2003), 국내ㆍ외적으로 항균성 펩타이드를 이용하여 인체내에서 독성이 없으며, 병원성 내성균을 특이적으로 죽일 수 있는 펩타이드 항생제 개발에 관한 연구결과로, 펩타이드의 항균력을 증가시키고, 인간의 적혈구 세포에 대한 용혈 활성이 전혀 나타나지 않아 숙주세포에 독성이 없는 항균성 펩타이드의 합성에 관한 연구결과가 보고된 바 있다(Shin, S. Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 275, 904-909, 2000; 및 Biochim. Biophys. Acta, 1463, 209-218, 2000).
한편, 올리고뉴클레오티드, 펩타이드, 단백질 및 항체 등과 같은 친수성 거대분자들은 세포막에 대한 약한 투과성 때문에 세포내로 전달하기가 어려운 문제점이 있다. 그러나, 최근에는 친수성 거대분자를 세포안으로 통과시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 몇 가지 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)가 개발됨으로써 세포내로 약물을 전달할 수 있는 약물전달시스템(drug delivery system)에 응용되고 있다(Derossi, D., et al., J. Biol. Chem., 269, 10444-10450, 1994; Prochiantz, A., Curr. Opion. Cell Biol., 12, 400-406, 2000; Hallbrink, M., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1515, 101-109, 2001; 및 Langel, U., Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications, CRC Press, Boca Raton, 2002). Pep-1은 이러한 세포투과성 펩타이드의 일종으로 인간 후천성 면역결핍 바이러스-1의 역전사 효소로부터 유래된 아미노산 서열(KETWWETWWTEW)과 시미안 바이러스(Simian virus-40, SV-40) large T 항원의 핵치환 서열(nuclear localization sequence; KKKRKV)을 스페이서 서열(spacer sequence, SQP)로 연결시킨 펩타이드로 알려져 있다(Morris, M. C., et al., Nat. Biotechnol., 19, 1173-1176, 2001; Henriques, S. T. 및 Castanho, M. A., Biochemistry, 43, 9716-9724, 2004; 및 Gros, E., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1758, 384-394, 2006). Pep-1의 아미노 말단은 소수성 트립토판이 많은 도메인(hydrophobic Trp-rich domain)으로 구성되어 있고, 카르복실 말단은 친수성 라이신이 풍부한 도메인(hydrophilic lysine-rich domain)으로 구성되어 있으며, 양이온성(cationic)을 띠고, 양극성 α-나선형구조(amphipathic α-helical structure)를 형성하는데, 이는 항균성 펩타이드에서 보이는 공통적인 특징이다.
한편, Pep-1은 세포투과성 효과 이외에 세균에 대한 항균활성을 나타내는데, 이는 종래에 보고된 세포투과성 펩타이드인 pVEC(LLIILRRRIRKQAHAH나NH2)와 TP10(AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2)에 의한 항균활성(Nekhotiaeva N, et al., FASEB J., 18, 394-396, 2004) 및 Tat(47-58; YGRKKRRQRRRD)에 의한 칸디다 알비칸스(C. albicans)에서의 항진균활성이 있다는 보고와 유사하지만(Jung, H. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 345, 222-228, 2006), 본 발명에서와 같이 세포투과성 펩타이드의 음전하를 띤 산성 아미노산을 양전하를 띤 염기성 아미노산으로 치환시켜 펩타이드와 박테리아 세포막의 음전하 인지질(negatively charged phospholipids)과의 정전기적 상호작용을 통하여 항균활성을 증가시키는 예는 전무하다. 또한, 기존에 알려진 대부분의 항균 펩타이드는 세포막 표적(membrane target; Oren, Z. 및 Shai, Y., Biopolymers., 47, 451-463, 1998; 및 Shai, Y. 및 Oren, Z., Peptides, 22, 1629-1641, 2001) 또는 세포질 표적(intracellular target)에 의해 살균작용을 하는 것으로 보고되고 있다(Park, C. B., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 244, 253-257, 1998).
이에, 본 발명자들은 세포투과성 Pep-1의 2번째, 6번째 및 11번째의 음전하를 띠는 글루탐산(Glu)을 양전하를 띠는 라이신(Lys)으로 치환시켜 숙주세포(인간의 적혈구 세포)에는 작용하지 않고 그람-양성균, 그람 음성균 및 항생제에 내성을 가진 세균에서만 선택적으로 살균작용을 하는 신규한 항균 펩타이드를 제조하는 한편 그 작용기작을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 첫째, 세포투과성 펩타이드의 음전하를 띤 산성 아미노산을 양전하를 띤 염기성 아미노산으로 치환시켜 항균활성이 향상되고 인체에 독성이 없는 신규한 항균 펩타이드를 제공하는 것이며, 둘째, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포투과성 펩타이드의 음전하를 띤 산성 아미노산을 양전하를 띤 염기성 아미노산으로 치환하여 제조되는 것을 특 징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포투과성 펩타이드의 음전하를 띤 산성 아미노산을 양전하를 띤 염기성 아미노산으로 치환하여 제조되는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서는 신규한 항균 펩타이드를 제조하기 위하여, 기존에 알려진 세포투과성 펩타이드 중 Pep-1을 이용하였다. 즉, 본 발명에서는 항균 펩타이드인 Pep-1-K를 제조하기 위하여, 공지의 세포투과성 펩타이드인 Pep-1(서열번호 1)의 2번째, 6번째 및 11번째의 음전하를 띤 산성 아미노산인 글루탐산(Glu)을 양전하를 띤 염기성 아미노산인 라이신(Lys)으로 치환시켜 합성하였는데, 이때 상기 양전하를 띤 염기성 아미노산으로는 라이신(Lys) 이외에 알기닌(Arg) 및 히스티딘(His)을 포함할 수 있다. 또한, 합성방법으로는 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase synthesis; Merrifield, Science, 232, 341-347, 1986)을 이용하였고, 상기 Pep-1-K에 대한 음성 대조군(Pep-1, 서열번호 1) 및 양성 대조군(멜리틴, Melittin, 서열번호 3) 또한 상기와 같은 방법으로 제조하였다. 이렇게 합성된 펩타이드들은 분석형 역상크로마토그래피를 이용하여 그 순도를 측정한 결과 95% 이상의 순도를 나타냄을 확인하였 다. 또한, 상기로부터 제조된 펩타이드의 분자량을 MALDI(matrix-assisted laser desorption ionization) 질량분석법으로 측정한 후, 상기 펩타이드의 분자량 측정치와 Pep-1-K 아미노산 서열로부터 계산한 분자량 계산치가 서로 일치하는지 조사한 결과, 두 펩타이드가 서로 일치하는 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다(표 1 참조).
이어, 본 발명자들은 상기에서 제조된 항균 펩타이드인 Pep-1-K(서열번호 2)의 항균활성을 측정하기 위하여, 본 발명의 항균 펩타이드인 Pep-1-K와 대조군 펩타이드인 Pep-1 및 멜리틴에 대한 그람-양성균(3종), 그람-음성균(3종) 및 항생제-내성균(6종)에서의 항균활성을 조사하였다. 이때, 사용된 그람-양성균으로는 한국생명공학연구원으로부터 분양받은 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa , KCTC 1637) 및 살모넬라 타이피무리넘(Salmonella typhimurium, KCTC 1926)인 균주를 사용하였고, 그람-음성균으로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis , KCTC 3068), 스트렙토로코커스 에피덜미디스(Staphylococcus epidermidis , KCTC 1917) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621)를 사용하였으며, 항생제 내성 균주로는 서울여자대학교 항생제 내성 균주은행(The Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes, Seoul Women's University, CCARM)로부터 분양받은 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)인 CCARM 3001, CCARM 3089 및 CCARM 3543와 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa , MDRPA)인 CCARM 2092, CCARM 2095 및 CCARM 2109를 사용하였다. 그 결과, 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제-내성균에 있어서, 본 발명의 Pep-1-K는 대조군 펩타이드인 멜리틴(천연에 존재하는 항균성 펩타이드 중 가장 강한 항균력을 지닌 펩타이드)과 거의 비슷하거나 이보다 강한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 2, 표 3, 표 4 및 표 5 참조).
아울러, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제를 제공한다.
본 발명자들은 강한 항균활성을 가진 본 발명의 Pep-1-K의 독성을 시험하기 위하여, 인간 적혈구 세포에 대한 용혈도(hemolysis)를 측정하였다. 그 결과, 도 1에서와 같이 Pep-1-K는 대조군 펩타이드인 멜리틴과 달리 고농도에서도 어떠한 용혈활성도 나타내지 않았다. 또한, 본 발명의 Pep-1-K는 기존의 Pep-1과 유사하게 낮은 용혈활성을 보였는데, 이는 본 발명의 Pep-1-K와 Pep-1 모두 인체에 안전한 항균제로 이용할 수 있음을 시사한다.
이어, 본 발명자들은 Pep-1-K가 세균에서만 선택적으로 항균활성을 나타내는지 조사하기 위하여, 트립토판 형광단파장이동(fluorescence blue shift) 및 트립토판 형광발산소멸(fluorescence emission quenching)을 측정하였고, 그 결과 본 발명의 Pep-1-K는 세균세포막의 음성 인지질에 대한 선택적 친화성에 의해 박테리아 세포에서만 선택적으로 살균작용함을 확인할 수 있었다(표 6 및 도 2 참조). 또한, 기존의 Pep-1에서도 본 발명의 Pep-1-K와 유사하거나 약한 선택적 살균작용 을 하였다. 이와 함께, 본 발명자들은 본 발명의 Pep-1-K의 항균작용이 박테리아의 세포막을 표적으로 하는지 아니면 세포질을 표적으로 하는지 확인하기 위하여, 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포함한 박테리아 세포막을 모방하는 음전하를 띤 리포좀(liposome)을 제작하여 일정량의 펩타이드를 투여했을 때, 시간에 따른 칼세인의 방출을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 Pep-1-K를 2μM 및 64μM로 투여한 경우, 시간에 따라 어떠한 칼세인도 방출시키지 않음을 알 수 있었다(도 3 참조). 이는, 본 발명의 Pep-1-K가 세포막을 표적하지 않고 세포질을 표적하여 세균을 파괴한다는 것을 시사한다.
본 발명의 항균 펩타이드인 Pep-1-K를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 사용될 수 있다. 즉, 항균제로서 상기 조성물은 임상투여시 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여할 수 있으며, 상기 펩타이드 외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트토즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제 성분을 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mark Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다. 또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사방식으로 투여할 수 있으며, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 Pep-1-K는 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.
이때, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 환자를 치료하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 일회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 0.5 내지 5 mg/kg이며, 바람직하게는 1 내지 2 mg/kg이다.
또한, 본 발명의 Pep-1-K를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 이용할 경우, 제조되는 제형에 따라 다르지만 각각 상기 조성물을 0.0001 내지 50 중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 방부제는 식품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제 및 기능성 항생제 등이 있다.
특히, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 Pep-1-K를 포함하는 화장품 이외에도 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다. 또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 상기 Pep-1-K를 첨가한 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성 물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장품은 Pep-1-K를 포함하는 조성물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 펩타이드 합성
본 발명자들은 항균 펩타이드인 Pep-1-K, 세포투과성 펩타이드인 Pep-1 및 벌독으로부터 유래된 항균 펩타드인 멜리틴(melittin)을 합성하기 위하여, 9-플루오레닐-메톡시카르보닐(9-fluorenyl-methoxycarbonyl, Fmoc)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase method; Merrifield, R. B., Science, 232, 341-347, 1986)으로 제조하였다. 구체적으로, Pep-1-K 및 Pep-1의 카르복실말단은 -COOH 형태이며 발린(Val)이기 때문에 Fmoc-Val-Wang-Resin을 출발물질로 사용하였고, 말리틴의 카르복실말단은 -NH2 형태이기 때문에 Fmoc-Rinked Amide-Resin을 출발물질로 사용하였다. 또한, 각 Fmoc-아미노산 연결에 의한 펩타이드 사슬 연장은 연결시약인 N-하이드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole, HOBt)와 디사이클로헥시카르보디마이드(dicyclohexycarbodiimide, DCC)를 사용하였다. 최종적으로 Pep-1-K 및 Pep-1의 아미노말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Lys(Boc)-OH을 연결시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고, NMP와 디코로메탄(dichoromethane, DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소가스로 건조시켰다. 이어, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)-페놀-티오애니솔(thioanisole)-에타네디시올(ethanedithiol)-H2O(82.5: 5: 5: 2.5: 5, 부피/부피) 용액을 가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 보호기를 제거 및 수지(resin)로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르(dietyleter)로 상기 펩타이드를 침전시켰다. 이어, 상기로부터 수득한 펩타이드를 0.05% TFA가 포함되어 있는 정제형 역상컬럼(Vydac C18, 300Å, 15μm, 2.2cm×25cm)이 부착된 아세토니트릴(acetonitrile, CH3CN)를 순차적으로 이용하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였 다. 이렇게 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionization)에 의한 질량 분석법(Hill, et al., Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395-OOO, 1991)을 이용하여 분자량을 측정하였고, 측정된 값이 Pep-1-K의 아미노산 서열로부터 계산한 분자량 계산치와 서로 일치함을 확인함으로써 원하는 정확한 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다(표 1).
MALDI-TOF-MS에 의해 결정된 합성 펩타이드의 분자량
펩타이드 아미노산 서열 분자량 ( Da )
계산치 측정치
Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 2848.3 2847.9
Pep-1-K KKTWWKTWWTKWSQPKKKRKV 2845.4 2845.7
멜리틴 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 2846.5 2846.4
<실시예 2> 상기 펩타이드의 항균활성 측정
본 발명자들은 <실시예 1>로부터 결정된 Pep-1-K(서열번호 2), Pep-1(서열번호 1) 및 멜리틴(서열번호 3)의 항균활성을 측정하기 위하여, 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제 내성 균주에 상기 펩타이드를 각각 처리한 후 항균활성을 비교하였다. 구체적으로, 그람-양성균(Gram-negative bacteria)은 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)로부터 분양받은 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa, KCTC 1637) 및 살모넬라 타이피무리넘(Salmonella typhimurium, KCTC 1926)을 사용하였고, 그람-음성균(Gram-negative bacteria)은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis , KCTC 3068), 스트렙토로코커스 에피덜미디스(Staphylococcus epidermidis , KCTC 1917) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621)를 사용하였으며, 항생제 내성 균주는 서울여자대학교 항생제 내성 균주은행(The Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes, Seoul Women's University, CCARM)로부터 분양받은 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)인 CCARM 3001, CCARM 3089 및 CCARM 3543을 사용하였고, 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa , MDRPA)인 CCARM 2092, CCARM 2095 및 CCARM 2109를 사용하였다.
각 균주를 ml 당 2×106개의 콜로니-형성 유닛(colony-forming units, CFUs)이 되도록 1%의 펩톤(peptone)으로 희석한 다음, 100 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1%의 펩톤으로 희석한 펩타이드 용액(2:1 단계적으로 희석된 용액) 100㎕을 각 웰에 첨가하였다. 이어, 상기 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양한 다음 ELISA 판독기(Bio-Tek사, 미국)를 이용하여 620nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정한 후 각 펩타이드의 최소성장억제농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 결정하였다. 이때, 대조군으로 사용한 펩타이드는 세포투과성 펩타이드인 Pep-1 및 천연에서 발견된 항균성 펩타이드 중 비교적 강한 항균활성을 지닌 벌독에서 유래된 항균성 펩타이드인 멜리틴(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2)을 사용하였다.
그 결과, 표 2와 표 3에서와 같이, 그람-음성균 및 그람-양성균에서 Pep-1-K는 Pep-1에 비해 매우 증가된 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 즉, Pep-1의 MIC 값은 8μM ~ 64μM 이하인 반면, Pep-1-K의 MIC 값은 1μM ~ 2μM 이다. 특히, Pep-1-K는 대조군인 멜리틴과 유사하게 강한 항균활성을 나타내었다. 또한, 표 4와 표 5에서와 같이, Pep-1-K는 항생제 내성 균주에 대해서도 MIC 값이 1μM ~ 8μM을 나타내는 강한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
그람-음성균에 대한 각 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
대장균 (KCTC 1682) 살모넬라 타이피무리넘 (KCTC 1926) 슈도모나스 애루지노사 (KCTC 1637)
Pep-1 32 64 < 64 <
Pep-1-K 2 1 2
멜리틴 2 2 4
그람-양성균에 대한 각 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
바실러스 서브틸리스 (KCTC 3068) 스타필로코커스 아우레우스 (KCTC 1261) 스타필로코커스 에피덜미디스 (KCTC 1917)
Pep-1 8 64 64
Pep-1-K 2 2 1
멜리틴 2 1 1
메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스에 대한 각 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
MRSA 1 (CCARM 3001) MRSA 2 (CCARM 3089) MRSA 3 (CCARM 3543)
Pep-1 64 < 64 < 64 <
Pep-1-K 2 2 1
멜리틴 1 2 1
복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사에 대한 각 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
MDRPA 1 (CCARM 2092) MDRPA 2 (CCARM 2095) MDRPA 3 (CCARM 2109)
Pep-1 32 64 < 32
Pep-1-K 8 8 8
멜리틴 16 8 8
<실시예 3> Pep-1-K의 적혈구 용혈활성(hemolysis) 측정
본 발명자들은 서열번호 2로 기재된 본 발명의 Pep-1-K에 대한 인간 적혈구 세포의 용혈활성을 측정하기 위하여, 인간의 적혈구(human erythrocytes)에 상기 펩타이드 및 대조군인 Pep-1과 멜리틴을 각각 처리한 후 용혈활성을 비교하였다. 인간의 적혈구(human erythrocytes)를 인산완충식염수(35 mM의 인산 완충용액/150 mM의 NaCl 혼합용액, pH 7.4)로 희석한 후, 1000g에서 10분간 원심분리한 다음 세 번 세척하였다. 이어, 인산 완충 식염수로 희석한 8.0% 적혈구 세포를 96-웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 상기 각 펩타이드를 100㎕씩 첨가한 다음 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어, 배양된 96-웰 마이크로적정 플레이트를 1000g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 수득한 후, 100㎕의 상층액을 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮겨 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군 펩타이드로는 멜리틴(melittin)를 사용하였으며, 측정값은 0.1%의 트리톤 X-100으로 처리했을 때의 값을 100% 용혈로 계산하여 각 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 하기 수학식 1과 같이 % 용혈도(hemolysis)로 산출하였다.
용혈도 (% hemolysis) = [(ODpeptide-ODzero - lysis) / (OD100 %- lysis-ODzero - lysis)]×100
= [(A - C) / (B - C)]×100
이때, 상기 A는 405nm에서 측정한 펩티드 용액의 흡광도이고, B는 405nm에서 측정한 0.1%의 트리톤 X-100의 흡광도이며, C는 405nm에서 측정한 인산완충식염수의 흡광도이다. 또한, 본 발명의 펩티드에 대한 대조군으로는 강한 용혈활성을 나타내는 항균성 펩타이드인 멜리틴을 사용하였다.
그 결과, 도 1에서와 같이, 멜리틴은 매우 강한 용혈활성을 나타낸 반면, Pep-1 및 본 발명의 Pep-1-K는 100~200μM의 고농도에서 어떠한 용혈활성도 나타내지 않았다.
<실시예 4> Pep-1-K의 세균세포에 대한 선택성 분석
<4-1> 트립토판 형광발산단파장이동 측정
본 발명자들은 상기 Pep-1-K의 세균세포에 대한 선택성을 측정하기 위하여, 각각 박테리아 및 진핵세포의 지질막을 모방하는 인지질을 제작한 후, 트립토판 형광발산단파장이동(fluorescence blue shift)을 조사하였다. 구체적으로, 박테리아의 지질막을 모방하는 인지질 조성물인 EYPE(egg yolk L-phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol; 7:3, w/w)(Sigma Chemical사, 미국) 및 진핵세포의 지질막을 모방하는 인지질 조성물인 EYPC(egg yolk phosphatidylcholine)/콜레스테롤(10:1, w/w)(Sigma Chemical Co. 미국)을 각각 유리판에 넣고 클로로포름으로 녹인 후, 회전식 증발탈수기(rotary evaporator, EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai사, 일본)로 용매를 제거한 다음 유리판 벽에 얇은 필름이 형성되도록 하였다. 이어, 건조된 얇은 필름에 트리스 완충용액(10mM Tris, 0.1mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.4)을 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 이렇게 생성된 지질용액은 티타늄-팁 초음파처리기(titanium-tip ultrasonicator, Microson사, 미국)를 이용하여 상기 용액이 맑아질 때까지 10 내지 20분 동안 0℃에서 분쇄한 다음, EYPE/EYPG(7:3, w/w) 및 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w)의 작은 단일 라멜라 소포체(small unilamellar vesicle, SUV)를 제조하였다.
이어, 상기 지질막 모방물의 트립토판 형광발산단파장이동(fluorescence blue shift)을 모델 RF-5301PC 분광분석기(Shimadzu, 일본)를 이용하여 측정하였다. 이때, 각각의 펩타이드는 0.6mM의 리포좀(몰비율은 펩타이드:리포좀 = 1:200)을 포함한 3ml의 트리스 완충용액에 첨가하여 20℃에서 10분간 방치한 후, 280nm에서 형광을 여기(excitation)시키고, 300nm 내지 400nm에서 발산(emission)을 스캔한 다음 형광 스펙트럼으로부터 각 펩타이드의 최대 흡광도를 나타내는 파장을 정 하였다.
그 결과, 표 5에서와 같이 트리스 완충용액에서는 350nm의 파장에서 각 펩타이드에 대한 트립토판 형광발산의 최대값을 나타내었다. 이는, 상기 펩타이드의 트립토판은 트리스 완충용액의 친수성 환경(hydrophilic environment)에 위치한다는 것을 의미한다. 또한, 박테리아의 지질막을 모방하는 EYPE/EYPG(7:3, w/w) 리포좀 용액에서는 Pep-1, Pep-1-K 및 멜리틴에 대한 트립토판 형광발산의 최대값이 트리스 완충용액에서의 최대값과 비교했을 때 각각 8nm, 9nm 및 11nm인 거의 유사한 최대 흡수파장에서의 짧은 파장으로의 이동(blue shift)을 일으켰다. 이러한 결과는, 각 펩타이드의 트립토판이 EYPE/EYPG(7:3, w/w) 리포좀의 소수성을 띤 지질 이중충 중심에 위치한다는 것을 의미한다. 이와 달리, EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액에서 멜리틴은 최대 흡수파장에서 13nm의 짧은 파장으로의 이동을 보인 반면, Pep-1과 Pep-1-K는 단지 1nm의 짧은 파장으로의 이동을 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 멜리틴은 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀의 소수성을 띤 지질 이중층의 소수성에 위치하지만, Pep-1과 Pep-1-K는 소수성 중심에 침투하지 못하고 친수성 환경에 위치에 위치한다는 것을 의미한다.
트리스 완충용액, EYPE/EYPG(7:3, w/w) 리포좀 용액 및 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액에서의 펩타이드 트립토판 최대흡수파장(emission maxima)
펩타이드 트리스 완충용액 ( nm ) EYPE / EYPG (7:3, w/w) 리포좀 용액 ( nm ) EYPC /콜레스테롤 (10:1, w/w) 리포좀 용액 ( nm )
Pep-1 350 342 (8)a 349 (1)a
Pep-1-K 350 341 (9) 349 (1)
멜리틴 350 339 (11) 337 (13)
a: 최대흡수파장(emission maxima)에서의 짧은 파장으로의 이동(blue shift).
<4-2> 트립토판 형광발산소멸(fluorescence emission quenching) 측정
본 발명자들은 상기 실시예 <4-1>의 트립토판 형광발산단파장이동의 결과를 검증하기 위한 추가적인 방법으로, 아크릴아미드를 형광측정(fluorescence measurement)의 수용성 소멸인자(quencher)로 사용하였다. 이때, 아크릴아미드에 대한 트립토판의 흡수를 줄이기 위하여 280nm 대신 295nm에서 트립토판을 여기(excitation)시켰으며, 펩타이드/인지질의 몰비율이 1/200인 0.6mM의 리포좀 용액에 3M의 아크릴아미드 용액을 조금씩 첨가한 후, 각 펩타이드 트립토판의 형광에 있어서 아크릴아미드의 영향을 하기 수학식 2와 같이 Stern-Volmer 방정식을 이용하여 분석하였다.
F0 / F소멸인자 ( quencher ) = 1 + Ksv [Q]
이때, F0는 아크릴아미드가 존재하지 않을 때의 형광강도(fluorescence intensity)를, F소멸인자(Fquencher)는 아크릴아미드가 존재할 때의 형광강도를 각각 의미한다. 또한, Ksv는 Stern-Volmer quenching 상수를, [Q]는 아크릴아미드의 농도를 각각 의미한다.
그 결과, 도 2A에서와 같이 EYPE/EYPG(7:3, w/w) 리포좀 용액에서는 모든 펩타이드에서 소멸인자인 아크릴아미드의 농도에 따라 유사한 트립토판의 효과적인 형광소멸(fluorescence quenching) 효과가 나타남을 확인하였다. 이는, 모든 펩타이드가 박테리아 세포막을 모방하는 음전하를 띠는 인지질막에 효과적으로 침투할 수 있다는 것을 의미한다. 반면, 도 2B에서와 같이 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액에서 멜리틴만이 아크릴아미드의 농도에 따라 트립토판의 효과적인 형광소멸 효과가 나타날 뿐 Pep-1과 Pep-1-K에서는 형광 소멸효과가 나타나지 않았다. 이는, Pep-1과 Pep-1-K는 진핵세포의 세포막을 모방하는 중성지질보다는 박테리아 세포막을 모방하는 음전하를 띠는 인지질막에 효과적으로 침투할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 결과로부터, 본 발명자들은 Pep-1과 Pep-1-K는 박테리아 세포에서만 선택적으로 살균작용을 나타내는 사실을 확인하였다.
<실시예 5> Pep-1-K에 의한 박테리아 세포막을 모방하는 인공지질막의 파괴능 측정
본 발명자들은 서열번호 2로 기재된 본 발명의 Pep-1-K가 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 살균작용을 하는지 아니면 세포질을 표적으로 하여 살균작용을 하는지 확인하기 위하여, 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포함한 박테리아의 세포막을 모방하는 인공지질막인 EYPE(egg yolk L-phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol; 7:3, w/w)로 구성된 양전하를 띤 큰 단일 라멜라 소포체(large unilamellar vesicle, LUV)의 리포좀을 제작하여 형광염료 방출분석(fluorescent dye leakage assay)을 수행하였다. 구체적으로, EYPC/EYPG(7:3, w/w)로 구성된 인지질을 ml당 10mM이 되도록 클로로포름(CHCl3)에 녹인 다음, 회전식 증발기(rotary evaporator, EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai사, 일본)를 이용하여 클로로포름을 제거하고, 하루 동안 동결건조시켰다. 이어, 건조된 지질 필름(lipid film)을 칼세인 농도가 70mM이 되도록 1ml의 트리스 완충용액(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.4)에 용해시킨 다음, 이 리포좀 용액을 액체 질소에서 동결-해동(frozing-thawing) 과정을 11번 반복한 후, 폴리카르보네이트(polycarbonate) 필터(미세공 크기가 100nm인 필터를 두 장 겹친 것)를 장착한 LiposoFast 사출성형기(Avestin, Inc. 캐나다)에 10회 통과시켜 칼세인을 포함한 EYPC/EYPG(7:3, w/w) LUV를 제작하였다. 이어, Sephadex G-50 컬럼을 이용하여 LUV를 포함하지 않은 칼세인을 제거하고 칼세인을 포함한 리포좀만을 수취하였다. 이어, 분광형광계(Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, 일본)의 여기파장(excitation wavelength)을 490nm로, 최대 흡수파장(emission wavelength)를 520nm로 맞춘 다음, 3ml의 트리스 완충용액을 석영 큐벳(quartz cuvette; 1cm 광로 길이)에 넣은 후 적당량의 LUV 용액을 넣고, 20μl의 10% Triton-X100을 첨가하여 형광 세기(fluorescence intensity)가 1000을 넘지 않도록 LUV의 양을 조절하였다. 이어, 상기 조건이 확립되면 LUV의 트리스 완충용액에 각각의 펩타이드를 투여하였다. 이때, 100% 염료방출(dye leakage)은 0.1% Triton-X100을 넣었을 때의 형광 세기로 표시하였고, 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 항균활성을 나타내는 대조군 펩타이드로는 멜리틴을 사용하여 비교하였다.
그 결과, 도 3에서와 같이 세균의 세포막을 표적으로 하여 살균작용을 하는 대조군으로 사용한 항균성 펩타이드인 멜리틴을 2.0μM로 투여한 경우에는 100%에 가까운 급격한 칼세인 방출을 일으킨 반면, Pep-1과 Pep-1-K을 각각 64μM 및 2.0μM로 투여한 경우에는 칼세인 방출을 일으키지 않았다. 이때, 상기 펩타이드의 농도는 각 세균에 대한 MIC값에 가까운 농도를 사용하기 위하여, Pep-1은 64μM로 처리하였고, Pep-1-K는 2μM로 처리하였다. 이러한 결과는, Pep-1과 Pep-1-K가 세균의 세포막을 표적으로 하지 않고 세포질을 표적으로 하여 살균작용을 한다는 것을 시사한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 항균 펩타이드인 Pep-1-K는 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제 내성 균주에 대해 강력한 항균활성을 가질 뿐 아니라 인간 적혈구 세포에 어떠한 용혈현상도 나타내지 않아 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 박테리아 KCTC 1682, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KCTC 1637 및 살모넬라 티피무리넘(Salmonella typhimurium) KCTC 1926을 포함하는 그람-양성균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 3068, 스타필로코커스 에피덜미디스(Staphylococcus epidermidis) KCTC 1917 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1621을 포함하는 그람-음성균으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  5. 제 1항에 있어서, 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)인 CCARM 3001, CCARM 3089 및 CCARM 3543와 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRPA)인 CCARM 2092, CCARM 2095 및 CCARM 2109을 포함하는 항생제 내성균주로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  6. 제 1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제.
  7. 제 6항에 있어서, 사람의 적혈구 세포를 전혀 파괴하지 않는 것을 특징으로 하는 무독성 항균제.
  8. 제 6항에 있어서, 음성인지질에 대한 선택적 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 무독성 항균제.
  9. 제 6항에 있어서, 세포질을 표적하여 살균작용하는 것을 특징으로 하는 무독성 항균제.
  10. 제 1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제.
  11. 제 1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장품 첨가제.
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