KR100883815B1 - 트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드와 비자연계 아미노산치환 아나로그 및 그의 용도 - Google Patents

트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드와 비자연계 아미노산치환 아나로그 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트립토판(Trp) 풍부 모델형 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 및 R6L2W3) 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 8종류의 트립토판(Trp) 풍부 모델형 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 , R6L2W3, O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D)는 다양한 균주, 그 중에서도 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제에 내성을 가진 균주에서 강력한 항균활성을 나타낼 뿐 아니라 인간 적혈구 세포에서 매우 낮은 용혈활성을 나타내는 매우 높은 세균세포특이성(높은 치료지수)을 나타냄을 확인하였으므로 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
항균 펩타이드, 트립토판(Trp) 풍부 모델형 항균 펩타이드

Description

트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드와 비자연계 아미노산 치환 아나로그 및 그의 용도{Trp―rich model antimicrobial peptides and their analogues with unnatural amino acids and uses thereof}
본 발명은 트립토판(Trp) 풍부 모델형 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 및 R6L2W3) 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 8종류의 트립토판(Trp) 풍부 모델형 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 , R6L2W3, O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D) 및 그 용도에 관한 것이다.
현재에 들어서 항생제의 남용에 의하여 기존의 화학항생제에 대하여 내성을 가지는 다양한 내성균주들의 출현으로 인하여 감염성 질병치료를 위한 기존의 화학항생제의 사용이 점점 어려워지고 있는 실정이다. 최근에 들어서 곤충, 식동물계에서 다양하게 발견되는 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)가 면역 세포, 식균작용 세포 및 항체 등과 더불어 세균 감염에 대항하기 위한 선천적 면역요소(방어 물질)로서 인식되어 지고 있으며(Mookherjee, N. et. al., Cell Mol . Life Sci ., 64, 922-933, 2007; Yount, N. Y. et.al., Biopolymers 84, 435-458, 2006), 특히 기존의 화학항생제와 상이한 기작에 의하여 항균작용을 나타내므로 새로운 개념의 차세대 항생제 후보물질로서 주목을 받고 있다(Yeaman, M. R. et. al., Pharmacol . Rev., 55, 27-55, 2003). 이들 항균 펩타이드들 중에 인돌리시딘을 포함한 몇몇 항균 펩타이드는 그람-양성균, 그람-음성균, 효모, 진균, 기생충, 종양세포뿐만 아니라 바이러스(HIV)에 대하여서도 살균작용을 나타내는 광범위한 항생활성을 가지고 있어서 항균제로서만이 아니라 항바이러스제로서도 응용가능성을 가지고 있다(Krajewski, K. et. al., Bioorg . Med . Chem . Lett . 14, 5595-5598, 2004; Groot, F. et.al., Virol. 80, 9236-9243, 2006).
현재까지 발견된 항균 펩타이드를 아미노산 조성 및 구조를 고려하여 다음과 같이 4종류로 분류할 수가 있다. 첫째는 마가닌(magainin) 및 세크로핀(cecropin)등과 같이 여러 개의 라이신(Lys), 아르기닌(Arg)과 같은 염기성 아미노산들을 포함하며, 구조적으로 양쪽 친매성(amphiphatic) α-helix를 취하는 것(Chen, Y. et. al., Antimicrob . Agents Chemother . 51, 1398-1406, 2007; Deslouches, B. et. al., Antimicrob . Agents Chemother. 49, 316-322, 2005), 둘째는 PR-37, bactenecin 5(Bac 5), bactenecin 7(Bac 7)등과 같이 Pro/Arg를 많이 포함한 Pro/Arg-rich 항생 펩타이드(Sadler, K. et.al., Biochemistry 41, 14150-14157, 2002), 셋째로 인돌리시딘(indolicidin) 및 트리트립토판티신(tritrpticin)과 같이 Trp을 많이 포함하는 Trp-풍부 항생 펩타이드(Yang, S.-T. et. al., Biochim . Biophys. Acta 1758, 1580-1586, 2006), 네 번째로 프로테그린(protegrins), α-디펜신(defensins), β-디펜신(defensins)과 같이 분자 내에 다이설파이드 결합(disulfide bridge)을 포함한 Cys-풍부 펩타이드(Lai, J. R. et. al., Biochemistry 45, 15718-15730, 2006)로 나눌 수 있다. 이들 중에 가장 많이 존재하는 것이 α-헬리칼(helical) 양쪽 친매성을 취하는 항균 펩타이드이다. 이들 펩타이드의 각종 미생물에 대한 작용기작은 표적세포의 인지질 이중층막과의 결합에 관련되어 있으며, 펩타이드의 양쪽 친매성에 의한 세포막상의 이온채널(ion channel) 또는 구멍(pore)을 형성하여 세포막의 막전위(membrane potential)를 변화시키거나, 또는 세포막을 파괴(disruption/perturbation)하여 결국에는 세포의 사멸에 이르게 한다고 알려져 있다(Shai, Y. Biopolymers . 66, 236-248, 2002). 또한, 이와 같은 작용기작과는 달리 부포린(buforin) Ⅱ 및 Pro/Arg-풍부 항균 펩타이드들은 표적 세포막으로 통과하여 특정 단백질 및 DNA과의 결합에 의하여 세포의 성장을 억제시킴으로서 세포를 사멸시킨다는 것도 알려져 있다(Park, C. B., et. al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 244, 253-257, 1998; Cudic, M. et. al., Jr . Curr . Drug Targets 3, 101-106, 2002).
항균 펩타이드를 항생물질로서의 유용성을 가지기 위하여서는 사람의 적혈구 세포에 대하여 용혈활성을 나타내지 않으며, 즉 숙주세포인 진핵세포에는 영향을 주지 않으며, 세균세포에 대하여 선택적으로 강한 항균활성을 나타내어야 한다. 따라서 본인을 포함한 국내외 연구자들에 의하여 주로 α-헬리칼(helical) 양쪽 친매성 항균 펩타이드를 대상으로 펩타이드의 길이(length), 소수 성(hydrophobocity), 나선도(α-helicity), 음전하(positive charge) 및 양쪽 친매성(amphipathicity)등을 조절하든가, 관절영역(hinge region), D-유형(type) 아미노산 또는 펩토이드 잔기(peptoid residue)의 도입 등에 의하여 세균세포 특이성을 지닌 선택성 항균 펩타이드의 설계 및 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Dathe, M. et. al., Biochim . Biophys . Acta 1462, 71-87, 1999; Giangaspero, A. et. al., Eur . J. Biochem . 268, 5589-5600, 2001; Song, Y. M. et. al., Biochemistry 44, 12094-12106, 2005).
지금까지 국내외 연구에 의하면 펩타이드가 항균활성을 나타내기 위해서는 펩타이드의 아미노산 서열에 있어서 두 가지 형태의 아미노산 잔기가 필수적이다는 것이 알려져 있다. 라이신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His)과 같은 양이온성(염기성) 아미노산 잔기들은 펩타이드와 LPS(lipopolysaccharide)을 포함한 세균의 음전하를 띤(negatively charged) 세포막(cell membranes) 또는 세포벽(cell wall)과의 정전기적 상호작용에 중요하며, 또한 루이신(Leu), 페닐 알라닌(Phe) 및 트립토판(Trp)과 같은 거대한 소수성 아미노산 잔기들은 세포막의 지질 이중층을 뚫고 들어가서 최종적으로 세포막을 파괴시켜서 세포를 사멸시키는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Brown, K. L. et. al., Curr . Opin . Immunol . 18, 24-30, 2006). 이 사실은 항균 펩타이드는 간단히 염기성 아미노산과 소수성 아미노산의 간단한 조합에 의해서 설계가 가능하다는 것이 시사되어 실제로 루이신(Leu) 및 라이신(Lys)의 조합으로 이루어진 모델형 항균 펩타이드가 설계합성되고 있다(Epand, R. F. et. al., Biopolymers 71, 2-16, 2003). 따라서 항균 펩타이드의 항균활성 은 염기성 아미노산에 의한 양이온성(positive charge) 및 소수성 아미노산 잔기들에 의한 소수성(hydrophobicity)에 의해 좌우되고 진핵세포(숙주세포)에 대한 독성을 없애기 위해서는 양이온성 및 소수성의 적절한 균형이 유지되어야 한다고 알려져 있다. 또한, 소수성 아미노산 잔기중에 트립토판(Trp)은 항균 펩타이드의 항균활성뿐만 아니라 진핵세포에 대한 독성에 중요하며, 세포막과의 소수성 상호작용에도 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다.
아울러, 펩타이드 합성시 소요되는 비용을 줄이고 약제로서 개발을 위해서는 펩타이드의 길이를 가능한 짧게 설계하는 것이 중요한 요소이다. 그러나 펩타이드의 길이가 너무 짧으면 항균활성이 약한 것이 단점이다. 따라서 적절한 짧은 펩타이드의 길이를 가지며 진핵세포에 대한 독성이 없으며, 높은 항균활성을 나타내는 짧은 펩타이드(short peptide)를 설계하는 것이 중요하다.
따라서 본 발명에서는 11개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 3개의 트립토판(Trp)을 포함하며, 라이신(Lys) 또는 루이신(Leu)을 포함하는 K8W3(서열번호 1), K7L1W3(서열번호 2) 및 K6L2W3(서열번호 3)을 합성하였으며, K6L2W3의 라이신(Lys)을 같은 성질의 염기성 아미노산인 아르기닌(Arg)으로 치환한 및 R6L2W3(서열번호 4)을 합성하였으며, 항균활성은 유지시키고 사람혈청에 대한 안정성을 높이기 위해 염기성 아미노산인 라이신(Lys)과 비슷한 성질을 가진 비자연계 아미노산인 오르니틴(Orn)으로 치환하거나 소수성 아미노산인 루이신(Leu)과 비슷한 성질을 가진 비 자연계 아미노산인 노루 루이신(Nle)으로 치환한 O6L2W3(서열번호 5) 및 O6X2W3(서열번호 6)을 합성하였다. 아울러 K6L2W3의 아미노산 잔기를 모두 D-type 아미노산으로 치환한 에난티오머(enantiomer)인 K6L2W3-D(서열번호 7) 및 R6L2W3의 아미노산 잔기를 모두 D-유형(type) 아미노산으로 치환한 에난티오머(enantiomer)인 R6L2W3-D(서열번호 8)를 합성하였다.
이에, 본 발명자들은 숙주세포(인간의 적혈구 세포)에는 작용하지 않고 그람 양성균, 그람 음성균 및 항생제에 내성을 가진 세균에서만 선택적으로 살균작용을 하는 본 발명의 8종 신규한 항균 펩타이드를 제조하는 한편 그 작용기작을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 높은 항균활성을 가지고 인체에 독성이 없고 사람 혈청에 대해 안전성을 지닌 신규한 트립토판(Trp) 풍부 모델형 항균 펩타이드를 제공하는 것이며, 또한 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라이신(Lys), 아르기닌(Arg), 로이신(Leu) 또는 트립토판(Trp)으로 구성된 11개의 아미노산으로 구성된 4종류의 모델형 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 및 R6L2W3), K6L2W3의 라이신(Lys) 위치에 오르니틴(Orn)을 치환하거나 로이신(Leu)의 위치에 노루 루이신(Nle)으로 치환하여 제조한 2종류의 모델형 항균 펩타이드(O6L2W3 및 O6X2W3), K6L2W3 및 R6L2W3의 아미노산을 대응하는 D-유형(type) 아미노산으로 모두 치환하여 제조한 2종류의 에난티오머(enantiomer) 항균 펩타이드(K6L2W3-D 및 R6L2W3-D)로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 4종의 트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 및 R6L2W3)와 4종의 비자연계 아미노산 치환 항균 펩타이드(O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D)는 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제 내성 균주에 대해 강력한 항균활성을 가질 뿐 아니라 인간 적혈구 세포에서 매우 낮은 용혈활성을 나타내는 매우 높은 세균세포특이성(높은 치료지수)을 나타내고, 사람혈청에 대한 높은 안정성을 나타내었기 때문에 무독성 항균제, 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
i) 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드;
ii) 상기 i)의 펩타이드에서 라이신(Lys)이 오르니틴(Orn)으로 치환된 펩타이드;
iii) 상기 i)의 펩타이드에서 루이신(Leu)이 노루 루이신(Nle)으로 치환된 펩타이드; 및
iv) 상기 i) 내지 iii)의 펩타이드에서 모든 아미노산이 대응되는 D-유 형(type) 아미노산으로 치환된 에난티오머 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 합성 또는 재조합 항균 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드를 제조하기 위하여, 단지 11개의 아미노산으로 이루어지고 3개의 트립토판(Trp)을 포함하며, 라이신(Lys) 또는 루이신(Leu)을 포함하는 3종류의 펩타이드 K8W3(서열번호 1), K7L1W3(서열번호 2), K6L2W3(서열번호 3)을 합성하였다. 상기 3종류의 펩타이드(서열번호 1 내지 3)는 라이신(Lys)을 같은 성질의 염기성 아미노산인 아르기닌(Arg)으로 치환하여 항균 펩타이드를 합성할 수 있으며, 그 중에서 K6L2W3가 가장 높은 세균세포 특이성(높은 치료지수)을 나타내었으므로 K6L2W3의 라이신(Lys)을 같은 성질의 염기성 아미노산인 아르기닌(Arg)으로 치환한 펩타이드 R6L2W3(서열번호 4)를 합성하였다. 상기 3종류의 펩타이드(서열번호 1 내지 3)의 항균활성은 유지시키고 사람의 혈청에 대한 안정성을 높이기 위해 염기성 아미노산인 라이신(Lys)과 비슷한 성질을 가진 비자연계 아미노산인 오르니틴(Orn)으로 치환하여 항균 펩타이드를 합성할 수 있으며, 그 중에서 K6L2W3에서 치환한 펩타이드 O6L2W3(서열번호 5)을 합성하였다. 상기 3종류의 펩타이드(서열번호 1 내지 3)의 소수성 아미노산인 루이신(Leu)과 비슷한 성질을 가진 비자연계 아미노산인 노루 루이신(Nle)으로 치환한 항균 펩타이드를 합성할 수 있으며, 그 중에서 K6L2W3에서 치환한 O6X2W3(서열번호 6)을 합성하였다. 또 한, 상기 모든 항균 펩타이드들의 W3의 모든 아미노산 잔기를 대응되는 D-type 아미노산으로 치환한 에난티오머(enantiomer) 항균 펩타이드를 합성할 수 있으며, 그 중 K6L2W3-D(서열번호 7) 및 R6L2W3의 아미노산 잔기를 모두 D-type 아미노산으로 치환한 R6L2W3-D(서열번호 8)를 합성하였다.
본 발명에서는 상기 신규한 펩타이드는 Fmoc(9-fluorenylmethyloxy -carbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase synthesis; Merrifield, Science , 232, 341-347, 1986)을 이용하여 제조하였고, 대조군 펩타이드 인돌리시딘(서열번호 9) 역시 상기와 같은 방법으로 제조하였다. 이렇게 합성된 펩타이드들은 분석형 역상크로마토그래피를 이용하여 그 순도를 측정한 결과 98% 이상의 순도를 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기로부터 제조된 펩타이드의 분자량을 MALDI(matrix-assisted laser desorption ionization) 질량분석법으로 측정한 후, 상기 펩타이드의 분자량 측정치와 이들의 아미노산 서열로부터 계산한 분자량 계산치가 서로 일치하는지 조사한 결과, 합성 펩타이드가 서로 일치하는 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다(표 1 참조).
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 무독성 항균제를 제공한다.
본 발명에서는 상기에서 제조된 신규한 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여, 본 발명의 8종의 펩타이드와 대조군 펩타이드인 인돌리시딘(천연에 존재하는 트립토판을 많이 함유한 항균성 펩타이드 중 가장 강한 항균력을 지닌 펩타이드로 알려짐)에 대한 그람-양성균(3종), 그람-음성균(3종) 및 항생제-내성균(4종)에서의 항균활성을 조사하였다. 이때, 사용된 그람-양성균으로는 한국생명공학연구원으로부터 분양받은 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa , KCTC 1637) 및 살모넬라 타이피무리넘(Salmonella typhimurium , KCTC 1926)인 균주를 사용하였고, 그람-음성균으로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis , KCTC 3068), 스트렙토로코커스 에피덜미디스(Staphylococcus epidermidis , KCTC 1917) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621)를 사용하였으며, 항생제 내성 균주로는 서울여자대학교 항생제 내성 균주은행(The Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes, Seoul Women's University, CCARM)로부터 분양받은 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)인 CCARM 3001 및 CCARM 3543와 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, MDRPA)인 CCARM 2095 및 CCARM 2109를 사용하였다. 그 결과, 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제-내성균에 있어서, 본 발명의 모든 8종의 신규한 펩타이드는 대조군 펩타이드인 인돌리시딘과 거의 비슷하거나 이보다 강한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 2, 표 3 및 표 4 참조).
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드의 세균 선택성(bacterial selectivity)을 측정하기 위해 항균제의 세균선택성의 척도로 상용되고 있는 치료지수(therapeutic index: TI)를 조사하였다. 치료지수는 각 펩타이드의 최소성장 억제농도의 평균값(GM)을 용혈활성을 나타내는 최소한의 농도(MHC)로 나눈 값을 나타내는 것으로 펩타이드의 치료지수치가 높을수록 세균 선택성이 높은 것으로 간주된다. 그 결과, 본 발명의 모든 8종의 신규한 펩타이드는 대조군 펩타이드인 인돌리시딘 보다 높은 치료지수치(높은 세균선택성)을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 5 참조).
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드의 독성을 시험하기 위하여, 인간 적혈구 세포에 대한 용혈도(hemolysis)를 측정하였다. 그 결과, 대조군 펩타이드인 인돌리시딘은 50μM에서 용혈활성을 나타내는 반면, 8종의 신규한 항균 펩타이드는 400μM의 고농도에서 겨우 용혈활성을 나타내거나 400μM에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다(도 1 참조). 따라서 본 발명의 펩타이드들은 모두 인체에 안전하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드의 항균작용이 박테리아의 세포막을 표적으로 하는지 아니면 세포질을 표적으로 하는지 확인하기 위하여, 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포함한 박테리아 세포막을 모방하는 음전하를 띤 리포좀(liposome)을 제작하여 일정량의 펩타이드를 투여했을 때, 펩타이드 농도에 따른 칼세인의 방출을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 대조군 펩타이드인 인돌리시딘은 0.2μM만 투여하여도 100%에 가까운 급격한 칼세인 방출을 일어난 반면, 8종의 펩타이드들은 10μM의 고농도를 처리하여도 40%이하의 칼세인 방출에 지나지 않았다(도 2 참조). 따라서 본 발명의 펩타이드들은 전적으로 세균의 세포막을 표적으로 하지 않고 부분적으로 세포질을 표적으로 하여 살균작용을 나타 낸다는 사실을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드의 세균세포에 대한 선택성을 측정하기 위하여, 각각 박테리아 및 진핵세포의 지질막을 모방하는 인지질을 제작한 후, 트립토판 형광발산단파장이동(fluorescence blue shift)을 조사하였다. 그 결과, 박테리아의 지질막을 모방하는 리포좀 용액에서는 대조군 펩타이드인 인돌리시딘 및 모든 발명 펩타이드에 대한 트립토판 형광발산의 최대값이 트리스 완충용액에서의 최대값과 비교했을 때 짧은 파장으로의 이동(blue shift)을 일으켰다. 따라서 각 펩타이드의 트립토판이 박테리아의 지질막을 모방하는 리포좀의 소수성을 띤 지질 이중층 중심에 위치한다는 것을 알 수 있다. 이와 달리, 적혈구 세포의 외막을 모방하는 리포좀 용액에서 본 발명의 펩타이드(R6L2W3, O6X2W3, R6L2W3-D) 및 대조군 펩타이드 인돌리시딘은 상당한 정도(7.2 nm～10.2 nm)의 짧은 파장으로의 이동이 일어났다(표 6 참조). 상기 R6L2W3, O6X2W3 및 R6L2W3-D는 매우 약한 용혈활성을 가짐에도 불구하고 적혈구 세포의 외막을 모방하는 리포좀 용액에서의 상당한 정도의 짧은 파장으로의 이동을 일으킨 것은 진핵세포의 세포막을 파괴하지 않고 소수성을 띤 지질 이중층을 통과할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드가 박테리아의 세포막에 구멍(pore) 혹은 이온채널(ion channel)의 형성에 의하여 세포 내의 작은 이온(small ion)의 방출에 의한 세포막 전위(membrane potential)를 파괴함으로서 항균활성을 나타내는 것인지를 확인하기 위하여, 세포막 전위 감수성 형광염료(membrane potential-sensitive fluorescent dye)인 dSC3-5 (3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodid)를 이용하여 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus: KCTC 1621)의 세포막 전위에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 대조군 펩타이드로 사용한 인돌리시딘의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 최소성장억제농도(minimal inhibitory concentration, MIC) 값보다 상기 신규한 항균 펩타이드는 훨씬 높은 농도에서도 더 낮은 정도의 막전위 파괴활성을 나타내었다(도 3 참조). 따라서 본 발명의 펩타이드들은 세포막에 구멍(pore) 혹은 이온채널(ion channel)의 형성에 의하여 막 전위가 파괴함으로서 세균을 죽이는 기작을 가지고 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는 상기 신규한 항균 펩타이드가 사람의 혈청에 대한 안정성을 가지는지 확인하기 위해서, 사람 혈청에 의한 상기 펩타이드의 항균활성을 측정하였다. 상기 펩타이드에 의해 생성된 클리어 존(clear zone)의 직경(diameter)이 크면 클수록 펩타이드의 항균활성이 높다는 것을 의미하므로 항균활성의 세기는 생성된 clear zone의 직경(diameter)에 비례한다. 그 결과, 상기 펩타이드들은 대장균에서 혈청이 존재할 때가 혈청이 존재하지 않을 때에 비해 50% 이상의 항균활성을 유지하였다. 특히, D-유형(type) 아미노산으로 이루어진 엔난티오머(enantiomer) 펩티이드인 K6L2W3-D 및 R6L2W3-D는 혈청이 존재할 때가 혈청이 존재하지 않을 때에 비해 100% 항균활성을 유지하였다(도 4 참조). 펩타이드가 항균제로 사용되기 위해서는 사람의 혈청에 존재하는 단백질 가수분해효소에 의한 저항성 즉, 사람의 혈청에 대한 안정성을 가져야한다. 따라서 본 발명의 항균 펩타이드들 은 사람혈청에 대해 매우 높은 안정성을 가지고 있으므로 항균제로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 항균제는 임상투여시 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여할 수 있으며, 상기 펩타이드 외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트토즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제 성분을 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mark Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다. 또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사방식으로 투여할 수 있으며, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 펩타이드는 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화될 수 있다.
이때, 상기 신규한 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균제는 환자를 치료하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 일회 내지 수회로 투여 될 수 있고, 투여량은 0.5 내지 5 mg/kg이며, 바람직하게는 1 내지 2 mg/kg이다.
아울러, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제 및 화장품 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제는 식품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제 및 기능성 항생제 등이 있다.
상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 8종의 신규한 항균 펩타이드를 포함하는 화장품 이외에도 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다. 또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 상기 본 발명의 8종의 신규한 항균 펩타이드를 첨가한 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장품은 8종의 신규한 항균 펩타이드를 포함하는 조성물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 8종의 신규한 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제 및 화장품 첨가제로 이용할 경우, 제조되는 제형에 따라 다르지만 각각 상기 조성물을 0.0001 내지 50 중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 펩타이드 합성
본 발명자들은 8종의 항균 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3 , R6L2W3, O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D) 및 천연형 항균 펩타이드인 인돌리시딘(indolicidin)을 합성하기 위하여, Fmoc(9-플루오레닐-메톡시카르보닐; 9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase method; Merrifield, R. B., Science, 232, 341-347, 1986)으로 제조하였다. 구체적으로, 모든 펩타이드의 카르복실말단은 -NH2 형태이기 때문에 Fmoc-Rinked Amide-Resin을 출발물질로 사용하였다. 또한, 각 Fmoc-아미노산 연결에 의한 펩타이드 사슬 연장은 연결시약인 N-하이드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole, HOBt)와 디사이클로헥시카르보디마이드(dicyclohexycarbodiimide, DCC)를 사용하였다. 최종적으로 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 연결시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고, NMP와 디크로로메탄(dichloromethane, DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소가스로 건조시켰다. 이어, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)-페놀-티오아니솔(thioanisole)-에타네디티올(ethanedithiol)-H2O(82.5: 5: 5: 2.5: 5, 부피/부피) 용액을 가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 보호기를 제거 및 수지(resin)로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르(dietyleter)로 상기 펩타이드를 침전시켰다. 이어, 상기로부터 수득한 펩타이드를 0.05% TFA가 포함되어 있는 정제형 역상컬럼(Vydac C18, 300Å, 15μm, 2.2cm×25cm)이 부착된 아세토니트릴(acetonitrile, CH3CN)를 순차적으로 이용하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 이렇게 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF-MS(matrix-assisted laser desorption ionization)질량 분석계(시마즈사, 일본)을 이용하여 분자량을 측정하였고, 측정된 값이 모든 펩타이드 의 아미노산 서열로부터 계산한 분자량 계산치와 서로 일치함을 확인함으로써 원하는 정확한 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다(표 1 참조).
MALDI - TOF - MS 에 의해 결정된 합성 펩타이드의 분자량
펩타이드 아미노산 서열 분자량 ( Da )
계산치 측정치
K8W3 KKWKKWKKWKK-NH2(서열번호 1) 1601.1 1601.0
K7L1W3 KLWKKWKKWKK-NH2(서열번호 2) 1586.0 1585.7
K6L2W3 KLWKKWKKWLK-NH2(서열번호 3) 1571.0 1570.4
R6L2W3 RLWRRWRRWLR-NH2(서열번호 4) 1739.1 1739.7
O6L2W3 OLWOOWOOWLO-NH2(서열번호 5) 1486.9 1487.3
O6X2W3 OXWOOWOOWXO-NH2(서열번호 6) 1486.9 1486.7
K6L2W3-D KLWKKWKKWLK-NH2(서열번호 7) 1571.0 1571.2
R6L2W3-D RLWRRWRRWLR-NH2(서열번호 8) 1739.1 1738.9
인돌리시딘(Indolicidin) ILPWKWPWWPWRR-NH2(서열번호 9) 1909.3 1909.3
O: Orn(오르니틴; ornithine), X: Nle(노루 루이신; norleucine)
-D: 모든 아미노산이 D-유형(type) 아미노산,
모든 펩타이드의 카르복실말단은 아미도형(-NH2).
< 실험예 1> 펩타이드의 항균활성 측정
본 발명자들은 상기 <실시예>로부터 제조된 8종의 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3, R6L2W3, O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D)의 항균활성을 측정하기 위하여, 그람-양성균, 그람-음성균 및 항생제 내성 균주에 상기 펩타이드를 각각 처리한 후 항균활성을 비교하였다. 구체적으로, 그람-양성균(Gram-negative bacteria)은 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)로부터 분양받은 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa , KCTC 1637) 및 살모넬라 타이피무리넘(Salmonella typhimurium, KCTC 1926)을 사용하였고, 그람-음성균(Gram-negative bacteria)은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis , KCTC 3068), 스트렙토로코커스 에피덜미디스(Staphylococcus epidermidis , KCTC 1917) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus , KCTC 1621)를 사용하였으며, 항생제 내성 균주는 서울여자대학교 항생제 내성 균주은행(The Culture Collection of Antibiotic-Resistant Microbes, Seoul Women's University, CCARM)로부터 분양받은 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)인 CCARM 3001, CCARM 3089 및 CCARM 3543을 사용하였고, 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa , MDRPA)인 CCARM 2092, CCARM 2095 및 CCARM 2109를 사용하였다.
각 균주를 ml 당 2×106개의 콜로니-형성 유닛(colony-forming units, CFUs)이 되도록 1%의 펩톤(peptone)으로 희석한 다음, 100 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1%의 펩톤으로 희석한 펩타이드 용액(2:1 단계적으로 희석된 용액) 100㎕을 각 웰에 첨가하였다. 이어, 상기 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양한 다음 ELISA 판독기(Bio-Tek사, 미국)를 이용하여 620nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정한 후 각 펩타이드의 최소성장억제농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 결정하였다. 이때, 대조군으로 사용한 펩타이드는 설계 펩타이드와 길이가 비슷하고 트립토판을 많이 포함한 대표적인 천연형 항균 펩타이드인 인돌리시딘(indolicidin)을 사용하였다.
그 결과, 표 2 및 표 3에서와 같이, 모든 8종의 펩타이드는 그람-음성균 및 그람-양성균에서 대조군 펩타이드인 인돌리시딘과 유사하게 높은 향균활성을 나타내었다(MIC 값: 1μM ~ 8μM). 특히, K6L2W3은 MIC 값이 1μM ~ 2μM의 아주 강한 항균활성을 나타내었다. 비자연계 아미노산을 포함한 4종 펩타이드(O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D)도 MIC 값이 2μM ~ 4μM의 강한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
그람-음성균에 대한 상기 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
대장균 (KCTC 1682) 살모넬라 타이피무리넘 (KCTC 1926) 슈도모나스 애루지노사 (KCTC 1637)
K8W3 4 1 2
K7L1W3 2 1 2
K6L2W3 2 1 2
R6L2W3 8 2 8
O6L2W3 2 2 4
O6X2W3 2 2 4
K6L2W3-D 4 2 4
R6L2W3-D 4 2 4
인돌리시딘 4 4 8
그람-양성균에 대한 상기 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
바실러스 서브틸리스 (KCTC 3068) 스타필로코커스 아우레우스 (KCTC 1261) 스타필로코커스 에피덜미디스 (KCTC 1917)
K8W3 2 4 2
K7L1W3 2 4 2
K6L2W3 2 2 2
R6L2W3 4 4 2
O6L2W3 4 4 2
O6X2W3 2 4 2
K6L2W3-D 4 4 4
R6L2W3-D 2 2 4
인돌리시딘 2 4 8
또한, 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA) 및 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(MDRPA)에 대해서도 본 발명의 8종의 펩타이드(K8W3, K7L1W3, K6L2W3, R6L2W3, O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D)가 2μM ~ 32μM의 MIC값을 가지는 비교적 높은 항균활성을 나타내었다. 특히, K6L2W3는 2μM ~ 8μM의 MIC값을 가지는 가장 강한 항균활성을 나타내었다. 대조군 펩타이드인 인돌리시딘은 4μM ~ 8μM의 MIC값을 나타내었다(표 4 참조).
메치실린 -내성 스타필로코커스 아우레우스 ( MRSA ) 및 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사( MDRPA)에 대한 상기 펩타이드의 항균활성
펩타이드 최소성장억제농도 (μM)
MRSA 1 (CCARM 3001) MRSA 2 (CCARM 3543) MDRPA 1 (CCARM 2095) MDRPA 2 (CCARM 2109)
K8W3 8 4 8 8
K7L1W3 8 4 8 8
K6L2W3 4 2 8 8
R6L2W3 8 4 16 16
O6L2W3 8 2 8 16
O6X2W3 8 2 8 16
K6L2W3-D 8 2 16 32
R6L2W3-D 8 2 16 32
인돌리시딘 8 4 32 32
< 실험예 2> 펩타이드의 세균 선택성( bacterial selectivity ) 측정
본 발명자들은 상기 <실시예>로부터 제조된 8종의 항균 펩타이드의 세균 선택성(bacterial selectivity)을 측정하기 위해 항균제의 세균선택성의 척도로 상용되고 있는 치료지수(therapeutic index: TI)를 사용하였다. 치료지수는 각 펩타이드의 최소성장억제농도의 평균값(GM)을 용혈활성을 나타내는 최소한의 농도(MHC)로 나눈 값으로 표시된다. 따라서 펩타이드의 치료지수치가 높을수록 세균 선택성 (bacterial selectivity)이 높은 것으로 간주된다.
대조군 펩타이드인 인돌리시딘은 10.4의 치료지수치를 나타낸 반면에 K8W3, K7L1W3 및 K6L2W3는 320.0, 363.6 및 400.0의 높은 치료지수치(높은 세균선택성)를 나타내었다. 특히, R6L2W3는 K6L2W3에 비해 약 4 ~ 5배의 낮은 치료지수치을 나타내었다. 상기 결과는 같은 서열, 같은 길이, 같은 개수 및 같은 위치에 염기성 아미노산을 포함한 항균 펩타이드에서 라이신(Lys)을 포함한 펩타이드가 아르기닌(Arg)을 포함한 항균 펩타이드보다 높은 세균선택성을 나타낸다는 것을 의미한다. 또한 비자연계 아미노산을 포함한 펩타이드인 O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D 역시 111.1 ~ 266.6의 높은 치료지수치를 나타내었다(표 5 참조).
상기 펩타이드의 치료 지수( therapeutic index : TI )
펩타이드 최소성장억제농도의 평균치( GM : μM) 용혈활성을 나타내는 최소한의 농도 ( MHC :μM) 치료지수 ( therapeutic index: TI )( MHC / GM )
K8W3 2.5 400 < 320.0
K7L1W3 2.2 400 < 363.6
K6L2W3 2.0 400 < 400.0
R6L2W3 4.6 400 86.9
O6L2W3 3.0 400 < 266.6
O6X2W3 2.6 400 153.8
K6L2W3-D 3.6 400 111.1
R6L2W3-D 3.0 400 133.3
인돌리시딘 4.8 50 10.4
< 실험예 3> 펩타이드의 적혈구 용혈활성 ( hemolysis ) 측정
본 발명자들은 본 발명의 항균 펩타이드에 대한 인간 적혈구 세포의 용혈활성을 측정하기 위하여, 인간의 적혈구(human erythrocytes)에 상기 펩타이드 및 대조 펩타이드인 인돌리시딘을 각각 처리한 후 용혈활성을 비교하였다. 인간의 적혈구(human erythrocytes)를 인산완충식염수(35 mM의 인산 완충용액/150 mM의 NaCl 혼합용액, pH 7.4)로 희석한 후, 1000g에서 10분간 원심분리한 다음 세 번 세척하였다. 이어, 인산 완충 식염수로 희석한 8.0% 적혈구 세포를 96-웰 마이크로적정 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 상기 각 펩타이드를 100㎕씩 첨가한 다음 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어, 배양된 96-웰 마이크로적정 플레이트를 1000g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 수득한 후, 100㎕의 상층액을 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮겨 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 0.1%의 트리톤 X-100으로 처리했을 때의 값을 100% 용혈로 계산하여 각 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 하기 수학식 1과 같이 % 용혈도(hemolysis)로 산출하였다.
용혈도(% hemolysis)=[(ODpeptide-ODzero - lysis)/(OD100 %- lysis-ODzero - lysis)]×100=[(A - C)/(B - C)]×100
이때, 상기 A는 405nm에서 측정한 펩티드 용액의 흡광도이고, B는 405nm에서 측정한 0.1%의 트리톤 X-100의 흡광도이며, C는 405nm에서 측정한 인산완충식염수의 흡광도이다. 또한, 본 발명의 펩티드에 대한 대조군으로는 천연형 항균성 펩타이드인 인돌리시딘을 사용하였다.
그 결과, 도 1 및 표 5에서 나타낸 바와 같이 K8W3, K7L1W3, K6L2W3 및 O6L2W3은 400 μM의 고농도에서 어떠한 용혈활성을 나타내지 않았으나 R6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D는 400 μM에서 용혈활성을 나타내었다. 반면에 대조군 펩타이드로 사용한 인돌리시딘은 50μM에서 용혈활성을 나타내었다.
< 실험예 4> 펩타이드에 의한 박테리아 세포막을 모방하는 인공지질막의 파괴능 측정
본 발명자들은 본 발명의 항균 펩타이드가 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 살균작용을 하는지 아니면 세포질을 표적으로 하여 살균작용을 하는지 확인하기 위하여, 형광염료(fluorescent dye)인 칼세인(calcein)을 포함한 박테리아의 세포막을 모방하는 인공지질막인 EYPE(egg yolk L-phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol; 7:3, w/w)로 구성된 양전하를 띤 큰 단일 라멜라 소포체(large unilamellar vesicle, LUV)의 리포좀을 제작하여 형광염료 방출분석(fluorescent dye leakage assay)을 수행하였다. 구체적으로, EYPC/EYPG(7:3, w/w)로 구성된 인지질을 ml당 10mM이 되도록 클로로포름(CHCl3)에 녹인 다음, 회전식 증발기(rotary evaporator, EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai사, 일본)를 이용하여 클로로포름을 제거하고, 하루 동안 동결건조시켰다. 이어, 건조된 지질 필름(lipid film)을 칼세인 농도가 70mM이 되도록 1ml의 트리스 완충용액(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.4)에 용해시킨 다음, 이 리포좀 용액을 액체 질소에서 동결-해동(frozing-thawing) 과정을 11번 반복한 후, 폴리카르보네이트(polycarbonate) 필터(미세공 크기가 100nm인 필터를 두 장 겹친 것)를 장착한 LiposoFast 사출성형기(Avestin, Inc. 캐나다)에 10회 통과시켜 칼세인을 포함한 EYPC/EYPG(7:3, w/w) LUV를 제작하였다. 이어, 세파덱스(Sephadex) G-50 컬럼을 이용하여 LUV를 포함하지 않은 칼세인을 제거하고 칼세인을 포함한 리포좀만을 수 취하였다. 이어, 분광형광계(Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, 일본)의 여기파장(excitation wavelength)을 490nm로, 최대 흡수파장(emission wavelength)를 520nm로 맞춘 다음, 3ml의 트리스 완충용액을 석영 큐벳(quartz cuvette; 1cm 광로 길이)에 넣은 후 적당량의 LUV 용액을 넣고, 20μl의 10% Triton-X100을 첨가하여 형광 세기(fluorescence intensity)가 1000을 넘지 않도록 LUV의 양을 조절하였다. 이어, 상기 조건이 확립되면 LUV의 트리스 완충용액에 각각의 펩타이드를 투여하였다. 이때, 100% 염료방출(dye leakage)은 0.1% Triton-X100을 넣었을 때의 형광 세기로 표시하였고, 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 항균활성을 나타내는 대조군 펩타이드로는 멜리틴을 사용하여 비교하였다.
그 결과, 도 2에서와 같이 세균의 세포막을 표적으로 하여 살균작용을 하는 대조군으로 사용한 항균성 펩타이드인 인돌리시딘을 0.2μM만 투여하여도 100%에 가까운 급격한 칼세인 방출을 일으키는 반면, 본 발명의 펩타이드들은 10μM의 고농도를 처리하여도 40%이하의 칼세인 방출에 지나지 않았다. 상기 결과는, 본 발명의 펩타이드들은 전적으로 세균의 세포막을 표적으로 하지 않고 세포질을 표적으로 하여 살균작용을 한다는 것을 의미한다.
< 실험예 5> 트립토판 형광발산단파장이동 측정
본 발명자들은 본 발명의 항균 펩타이드의 세균세포에 대한 선택성을 측정하기 위하여, 각각 박테리아 및 진핵세포의 지질막을 모방하는 인지질을 제작한 후, 트립토판 형광발산단파장이동(fluorescence blue shift)을 조사하였다. 구체적으로, 박테리아의 지질막을 모방하는 인지질 조성물인 EYPE(egg yolk L-phosphatidylethanolamine)/EYPG(egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol; 7:3, w/w)(Sigma Chemical사, 미국) 및 진핵세포의 지질막을 모방하는 인지질 조성물인 EYPC(egg yolk phosphatidylcholine)/콜레스테롤(10:1, w/w)(Sigma Chemical Co. 미국)을 각각 유리판에 넣고 클로로포름으로 녹인 후, 회전식 증발탈수기(rotary evaporator, EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai사, 일본)로 용매를 제거한 다음 유리판 벽에 얇은 필름이 형성되도록 하였다. 이어, 건조된 얇은 필름에 트리스 완충용액(10mM Tris, 0.1mM EDTA, 150mM NaCl, pH 7.4)을 첨가한 후 잘 섞어 주었다. 이렇게 생성된 지질용액은 티타늄-팁 초음파처리기(titanium-tip ultrasonicator, Microson사, 미국)를 이용하여 상기 용액이 맑아질 때까지 10 내지 20분 동안 0℃에서 분쇄한 다음, EYPE/EYPG(7:3, w/w) 및 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w)의 작은 단일 라멜라 소포체(small unilamellar vesicle, SUV)를 제조하였다. 이어, 상기 지질막 모방물의 트립토판 형광발산단파장이동(fluorescence blue shift)을 모델 RF-5301PC 분광분석기(Shimadzu, 일본)를 이용하여 측정하였다. 이때, 각각의 펩타이드는 0.6mM의 리포좀(몰비율은 펩타이드:리포좀 = 1:200)을 포함한 3ml의 트리스 완충용액에 첨가하여 20℃에서 10분간 방치한 후, 280nm에서 형광을 여기(excitation)시키고, 300nm 내지 400nm에서 발산(emission)을 스캔한 다음 형광 스펙트럼으로부터 각 펩타이드의 최대 흡광도를 나타내는 파장을 정하였다.
트리스 완충용액, EYPE / EYPG (7:3, w/w) 리포좀 용액 및 EYPC /콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액에서의 펩타이드 트립토판 최대흡수파장( emission maxima )
펩타이드 트리스 완충용액( nm ) EYPE / EYPG (7:3, w/w) 리포좀 용액( nm ) EYPC /콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액( nm )
K8W3 350.0 338.6 (11.4)a 350.0 (0.0)a
K7L1W3 351.4 337.4 (14.0) 351.4 (0.0)
K6L2W3 350.6 337.4 (13.2) 347.0 (3.6)
R6L2W3 350.0 338.0 (12.0) 340.8 (9.2)
O6L2W3 350.6 339.4 (11.2) 346.4 (4.2)
O6X2W3 352.0 338.8 (13.2) 344.8 (7.2)
K6L2W3-D 350.2 335.4 (14.8) 344.4 (5.8)
R6L2W3-D 350.2 338.4 (11.8) 340.0 (10.2)
인돌리시딘 350.0 337.4 (12.6) 341.0 (9.0)
a: 최대흡수파장(emission maxima)에서의 짧은 파장으로의 이동(blue shift).
그 결과, 표 6에서와 같이 트리스 완충용액에서는 350nm의 근방의 파장에서 각 펩타이드에 대한 트립토판 형광발산의 최대값을 나타내었다. 이는 상기 펩타이드의 트립토판은 트리스 완충용액의 친수성 환경(hydrophilic environment)에 위치한다는 것을 의미한다. 박테리아의 지질막을 모방하는 EYPE/EYPG(7:3, w/w) 리포좀 용액에서는 대조군 펩타이드인 인돌리시딘 및 모든 발명 펩타이드에 대한 트립토판 형광발산의 최대값이 트리스 완충용액에서의 최대값과 비교했을 때 최대 흡수파장이 11nm이상만큼 짧은 파장으로의 이동(blue shift)을 일으켰다. 이러한 결과는, 각 펩타이드의 트립토판이 EYPE/EYPG(7:3, w/w) 리포좀의 소수성을 띤 지질 이중층 중심에 위치한다는 것을 의미한다. 이와 달리, 적혈구 세포의 외막을 모방하는 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액에서 K8W3 및 K7L1W3은 거의 짧은 파장으로의 이동이 일으나지 않았으며, K6L2W3, O6L2W3, K6L2W3-D는 중간정도(3.6 nm ~ 5.8 nm)의 짧은 파장으로의 이동이 일어났으며, 그 외 펩타이드(R6L2W3, O6X2W3, R6L2W3-D) 및 대조군 펩타이드 인돌리시딘은 상당한 정도(7.2 nm ~ 10.2 nm)의 짧은 파장으로의 이동이 일어났다.
특히, R6L2W3, O6X2W3 및 R6L2W3-D는 400μM에서 겨우 용혈현상을 나타내는 매우 약한 용혈활성을 가짐에도 불구하고 EYPC/콜레스테롤(10:1, w/w) 리포좀 용액에서의 상당한 정도(7.2 nm ~ 10.2 nm)의 짧은 파장으로의 이동(blue shift)을 일으켰다. 상기 결과는 진핵세포(eukaryotic cells)의 세포막을 파괴하지 않고 소수성을 띤 지질 이중층을 통과할 수 있음을 알 수 있다.
< 실시예 6> 펩타이드에 의한 스타필로코커스 아우레우스에 대한 막전위 파괴활성( membrane depolarization )의 측정
본 발명자들은 본 발명의 항균 펩타이드가 박테리아의 세포막에 구멍(pore) 또는 이온채널(ion channel)의 형성에 의하여 세포내의 작은 이온(small ion)의 방출에 의한 세포막 전위(membrane potential)를 파괴함으로서 항균활성을 나타내는 것인지 확인하기 위하여, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus: KCTC 1621)의 세포막 전위에 미치는 영향을 조사하였다. 이때 세포막 전위 감수성 형광염료(membrane potential-sensitive fluorescent dye)인 dSC3-5(3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodid)를 이용하였다. 먼저 37℃에서 스타필로코커스 아우레우스를 LB-배지에서 하룻밤 동안 진탕 배양(shaking incubation)한다. 이어서 일정량의 박테리아를 다시 LB-배지에서 3시간 동안 서브-배양(sub-culture) 한 후, 5mM HEPES-buffer(20mM glucose 포함, pH 7.4)로 세척 한 다음, 5mM HEPES-buffer(0.1M KCl, 20mM glucose 포함, pH 7.4)로 OD600=0.05 되도록 희석한다. 그 다음 OD600=0.05로 희석된 세포액에 20 nM의 dSC3-5를 투여하면 순간적으로 형광강도(fluorescence intensity)가 순간 증가되었다가 막전위(membrane potential)에 의해 DISC3(5)의 형광이 담금질(quenching)되어 형광이 점점 감소하게 된다. 형광의 세기가 일정하게 유지되면 일정농도의 펩타이드를 투여한다. 펩타이드에 의한 세포막에 구멍(pore) 또는 이온채널(ion channel)의 형성에 의하여 막전위가 파괴되면 세포 안쪽에 있는 dSC3-5가 세포 밖으로 방출되어 형광의 세기가 증가한다. 일정세기의 형광이 유지되는 시점에 대조군 펩타이드인 그라미시딘(gramicidin) D(최종농도: 0.2 nM)를 투여하면 작은 이온(small ion)의 방출에 의한 막전위의 파괴에 의해 형광의 세기가 증가한다(여기서 대조군 펩타이드로 사용한 그라미시딘(gramicidin) D는 세포막에 이온채널을 형성하여 세포막을 파괴하는 것으로 알려진 펩타이드이다). 막전위 파괴(membrane depolarization)는 분광 형광계(Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, 일본)의 여기파장(excitation wavelength)을 622nm로, 발산파장(emission wavelength)를 670nm로 하였을 때 DiSC3-5의 형광발산(fluorescence emission)의 강도(intensity)의 변화에 의하여 측정되었다.
이때, 0.2 nM의 그라미시딘(gramicidin) D를 투여하였을 때를 100% 막전위 파괴로 계산하여 각 펩타이드의 % 막전위 파괴(membrane depolarization)는 수학식 2로 산출하였다.
% 막전위 파괴활성(% membrane depolarization)=[(Fp - F0)/(Fg - F0)]×100
여기서 DiSC3-5를 투여한 후 평형화되었을 때 형광강도(fluorescence intensity)를 나타내며, Fp는 펩타이드를 투여한 후 5분 후의 형광강도를 나타내며, Fg는 gramicidin D를 투여한 후 형광강도를 나타낸다.
그 결과, 도 3에 나타낸 것과 같이 대조군 펩타이드로 사용한 인돌리시딘은 스타필로코커스 아우레우스에 대한 MIC 값(4μM)보다 훨씬 낮은 농도 0.1μM에서도 약 80%정도의 막전위 파괴활성을 나타내었다. K8W3, K7L1W3 및 K6L2W3는 그들의 MIC 값(2-4μM)에서 약 25% ~ 50%의 막전위 파괴활성을 나타내었다. 또한, R6L2W3, O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D는 MIC값에 가까운 4μM에서 60% 이상의 막전위 파괴활성을 나타내었다. 상기 결과는 본 발명의 펩타이드들은 세포막에 구멍(pore) 혹은 이온채널(ion channel)의 형성에 의하여 막 전위가 파괴함으로서 세균을 죽이는 기작을 가지고 있음을 알 수 있다.
< 실험예 7> 발명 펩타이드의 사람 혈청에 대한 안정성
본 발명의 K6L2W3 , R6L2W3 , O6L2W3, O6X2W3, K6L2W3-D 및 R6L2W3-D의 혈청 안정성을 조사하였다. 0.7% 아가(agar)를 포함한 LB broth에 대장균이 4×105개의 콜로니-형성 유닛(colony-forming units, CFUs)을 포함한 아가 플레이트(agar plate)를 제조한 후 사람혈청(25%)을 포함한 PBS에서 37°C, 6시간 동안 배양(incubation)한 펩타이드 용액(10μl)과 대조군으로 사람혈청을 포함하지 않은 PBS에서 37°C, 6시간 동안 배양(incubation)한다. 이어서 미리 준비해둔 대장균을 포함한 아가 플레이트위에 멸균 원형페이퍼(직경 5mm)를 깔고 여기에 각각의 펩타이드 용액(10μl)을 가하여 37°C에서 하룻밤 방치한다. 이때 각 펩타이드의 사람 혈청에 대한 안정성은 생성된 clear zone의 직경(diameter)에 의해 측정한다. 여기서 생성된 클리어 존(clear zone)의 직경(diameter)이 크면 클수록 펩타이드의 항균활성이 높다는 것을 의미한다. 즉, 항균활성의 세기는 생성된 클리어 존(clear zone)의 직경(diameter)에 비례한다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 대장균에서 K6L2W3 및 R6L2W3는 혈청이 존재할 때가 혈청이 존재하지 않을 때에 비해 66.7%의 활성을 나타내었다(펩타이드는 혈청에 존재하는 단백질 가수분해 효소에 의해 펩타이드가 분해되어 약 33.3%의 활성의 감소를 나타낸다는 것을 의미한다). 또한, O6L2W3 및 O6X2W3는 혈청이 존재할 때가 혈청이 존재하지 않을 때에 비해 약 50.1%, 80.0%의 항균활성을 나타내었다. D-유형(type) 아미노산으로 이루어진 엔난티오머(enantiomer) 펩티이드인 K6L2W3-D 및 R6L2W3-D는 혈청이 존재할 때가 혈청이 존재하지 않을 때에 비해 100% 항균활성을 유지하였다. 전체적으로 각 펩타이드의 사람혈청에 대한 안정성은 K6L2W3-D = R6L2W3-D > O6X2W3 > K6L2W3 = R6L2W3 > O6L2W3의 순서였다. 특히, D-유형(type) 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드 K6L2W3-D 및 R6L2W3-D는 항균제로서 높은 치료지수를 가지고 있으며, 사람혈청에 대해 매우 높은 안정성을 가지고 있으므로 임상적으로도 유용한 항균제임을 증명하고 있다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
< 제제예 > : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
실시예의 항균 펩타이드 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
실시예의 항균 펩타이드 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
실시예의 항균 펩타이드 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 환의 제조
실시예의 항균 펩타이드 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
5. 과립의 제조
실시예의 항균 펩타이드 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
도 1은 트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드 및 인돌리시딘(indolicidin)을 각각 인간 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 인간 적혈구 세포의 용혈도(hemolysis)를 백분율(%)로 나타낸 그래프이다.
●: K8W3,
○: K7L1W3,
▼: K6L2W3,
▽: R6L2W3,
■: O6L2W3,
□: O6X2W3,
◆: K6L2W3-D,
◇: R6L2W3-D,
▲: 인돌리시딘(indolicidin).
도 2은 형광염료인 칼세인(calcein)을 포함하고 있는 EYPC/EYPG(7:3, w/w) 리포좀에 본 발명의 모델형 항균 펩타이드 및 인돌리시딘(indolicidin)을 투여했을 때, 펩타이드 농도에 따른 % 염료방출(dye leakage)을 나타낸 그래프이다.
●: K8W3,
○: K7L1W3,
▼: K6L2W3,
▽: R6L2W3,
■: O6L2W3,
□: O6X2W3,
◆: K6L2W3-D,
◇: R6L2W3-D,
▲: 인돌리시딘(indolicidin).
도 3은 트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드 및 인돌리시딘(indolicidin)을 타필로코커스 아우레우스에 투여했을 때, 펩타이드 농도에 따른 % 막전위 파괴활성(membrane depolarization)을 나타낸 그래프이다.
●: K8W3,
○: K7L1W3,
▼: K6L2W3,
▽: R6L2W3,
■: O6L2W3,
□: O6X2W3,
◆: K6L2W3-D,
◇: R6L2W3-D,
▲: 인돌리시딘(indolicidin).
도 4는 트립토판 풍부 모델형 항균 펩타이드 및 인돌리시딘(indolicidin)을 사람혈청을 포함한 조건에서 대장균을 배양한 아가 플레이트에 접종하여 생성된 Clear Zone의 직경의 크기를 통해서 사람혈청에 대한 안정성을 나타낸 그래프이다.
<110> chosun university <120> Trp-rich model antimicrobial peptides and their analogues with unnatural amino acids and uses thereof <130> 7p-08-34 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for K8W3 <400> 1 Lys Lys Trp Lys Lys Trp Lys Lys Trp Lys Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for K7L1W3 <400> 2 Lys Leu Trp Lys Lys Trp Lys Lys Trp Lys Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for K6L2W3 <400> 3 Lys Leu Trp Lys Lys Trp Lys Lys Trp Leu Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for R6L2W3 <400> 4 Arg Leu Trp Arg Arg Trp Arg Arg Trp Leu Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for O6L2W3 <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is ornithine <220> <221> VARIANT <222> (4)..(5) <223> Xaa is ornithine <220> <221> VARIANT <222> (7)..(8) <223> Xaa is ornithine <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Xaa is ornithine <400> 5 Xaa Leu Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Leu Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for O6X2W3 <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa is ornithine <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa is norleucine <220> <221> VARIANT <222> (4)..(5) <223> Xaa is ornithine <220> <221> VARIANT <222> (7)..(8) <223> Xaa is ornithine <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa is norleucine <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Xaa is ornithine <400> 6 Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Trp Xaa Xaa 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for K6L2W3-D <220> <221> VARIANT <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-type amino acid <400> 7 Lys Leu Trp Lys Lys Trp Lys Lys Trp Leu Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Amino acid sequence for R6L2W3-D <220> <221> VARIANT <222> (1)..(11) <223> All amino acids are D-type amino acid <400> 8 Arg Leu Trp Arg Arg Trp Arg Arg Trp Leu Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Amino acid sequence for Indolicidin <400> 9 Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10

Claims (18)

  1. i) 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드;
    ii) 상기 i)의 펩타이드에서 라이신(Lys)이 오르니틴(Orn)으로 치환된 펩타이드;
    iii) 상기 i)의 펩타이드에서 루이신(Leu)이 노루 루이신(Nle)으로 치환된 펩타이드; 및
    iv) 상기 i) 내지 iii)의 펩타이드에서 모든 아미노산이 대응되는 D-유형(type) 아미노산으로 치환된 에난티오머 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ii)의 펩타이드는 서열번호 5으로 기재되는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 iii)의 펩타이드는 서열번호 6으로 기재되는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 iv)의 펩타이드는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재되는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  5. 제 1항에 있어서, 그람-양성균에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 그람-양성균은 박테리아 KCTC 1682, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KCTC 1637 및 살모넬라 티피무리넘(Salmonella typhimurium) KCTC 1926으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  7. 제 1항에 있어서, 그람-음성균에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 그람-음성균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 3068, 스타필로코커스 에피덜미디스(Staphylococcus epidermidis) KCTC 1917 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1621으로 이루어진 군으부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  9. 제 1항에 있어서, 항생제 내성균주에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항생제 내성균주는 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)인 CCARM 3001 및 CCARM 3543와 복합약제-내성 슈도모나스 애루지노사(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa , MDRPA)인 CCARM 2095 및 CCARM 2109로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 항균 펩타이드.
  11. 제 1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균제.
  12. 제 11항에 있어서, 사람의 적혈구 세포를 전혀 파괴하지 않는 것을 특징으로 하는 항균제.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 11항에 있어서, 세포막뿐만 아니라 세포질을 표적하여 살균작용을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균제.
  16. 제 11항에 있어서, 세포막에 구멍(pore) 또는 이온채널(ion channel)의 형성에 의하여 막 전위를 파괴함으로서 세균을 죽이는 기작을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균제.
  17. 제 1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제.
  18. 제 1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장품 첨가제.
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