KR101038542B1

KR101038542B1 - 라이신과 프롤린 잔기 치환으로 박테리아 선택성을 높인새로운 수딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도

Info

Publication number: KR101038542B1
Application number: KR1020080071264A
Authority: KR
Inventors: 김양미; 함경수; 박윤경; 김진경
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-07-22
Filing date: 2008-07-22
Publication date: 2011-06-02
Also published as: KR20100010338A

Abstract

본 발명은 항균펩타이드 수딘 (pseudin-2: 서열번호 1)의 11번째 글라이신을 프롤린으로 치환시키고 10, 14, 18, 24번째 잔기를 라이신으로 치환시킨 서열번호 2인 Ps-6의 용도 및 작용기작에 관한 것이다. 본 발명의 새로운 항균 펩타이드 Ps-6은 강력한 항균활성을 나타내며 인간의 적혈구 용혈활성을 전혀 나타내지 않으며, 마우스의 섬유아세포(NIH-3T3)에 대해서도 전혀 독성을 나타내지 않았다. 수딘 항생펩타이드의 중간영역인 11번째 서열에 프롤린을 치환하여 구조적 유동성을 주고 라이신잔기를 치환하여 양이온성을 증가시켜 탁월한 항균 활성을 나타내고 세포 독성이 없으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

수딘, 항균 펩타이드, 라이신 잔기, 프롤린 잔기, 항균제, 염증치료제,

Description

라이신과 프롤린 잔기 치환으로 박테리아 선택성을 높인 새로운 수딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도{Novel antimicrobial peptide analogue derived from pseudin, designed by substitution with proline and lysine and its use}

본 발명은 개구리 (Pseudis paradoxa)의 표피에서 유래된 항균펩타이드 수딘 (pseudin-2: 서열번호 1)의 11번째 글라이신을 프롤린으로 치환시키고 10,14, 18, 24번째 잔기를 라이신으로 치환시킨 서열번호 2로 기재된 Ps-6의 용도 및 작용기작에 관한 것이다.

일반적으로 세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis ) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa ) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). 페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis ., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데, 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect . Dis ., 152, 365-372, 1985), 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.

이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G. J Intern Med. 2003, 254(3), 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395).

항생 펩타이드를 항생물질로서의 유용성을 가지기 위하여서는 사람의 적혈구 세포에 대하여 용혈활성을 나타내지 않는 반면에 세균에 대하여 선택적으로 강한 항균활성을 나타내어야 한다. 이런 이유로 지금까지 많은 국내외 연구자들에 의하여 α-나선형 양쪽친매성 펩타이드를 대상으로 펩타이드의 length, hydrophobocity, α-helicity, net positive charge, amphipathicity등을 조절하여 세포특이성을 지닌 선택성 펩타이드의 설계 및 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. (Blondelle, S. E., & Houghten, R.A., 1992, Biochemistry 31, 12688-12694, Dathe, M., et al., 1997, FEBS Lett . 403, 208-212, Kwon, M. Y., et al., 1998, Biochim . Biophys. Acta . 1387, 239-248, Bikshapathy, E., et al., 1999, J. Pept . Res . 53, 47-55, Shin, S. Y. et al, 2000, Biochem . Biophys . Res . Commun . 275, 904-909, Kyungik Lee et al., 2994, BBRC, 323, 712-719, Shin Saeng Lim, 2005, BBRC , 334(8), 1329-1335, Sung-Tae Yang, 2006, Biochemistry , 45(6), 1775-1784)

천연에서 발견되는 항균 펩타이드중에는 α-나선형 구조를 취하는 것이 대부분을 차지한다. α-나선형 구조 항균 펩타이드의 중앙에 프롤린(Pro) 혹은 글리신(Gly)과 같이 α-나선형 구조를 취하기 어려운 아미노산 잔기를 도입하여 펩타이드의 중앙부위에 접힘(hinge) 혹은 꺽임(kink)부분을 도입함으로서 펩타이드의 유동성을 증가시킴으로서 펩타이드가 숙주세포(인간의 적혈구세포)에는 작용하지 않고 박테리아 세포에만 선택적으로 작용하여 세균을 죽이는 펩타이드 항생제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. (Thennarasu, S., & Nagaraj, R. 1996, Protein Eng . 9, 1219-1224, Suh, J. Y., et al., 1999, Eur . J. Biochem . 266, 665-674, Oh, D., et al., 2000, Biochemistry 39, 11855-11864, Song, Y. M., et al., 2004, Biochem . Biophys . Res . Commun. 314, 615-621, Lim, S. S., 2005, Biochem. Biophys . Res . Commun . 334, 1329-1335).

개구리에서 발견되는 항균 펩타이드인 수딘 (pseudin-2)은 높은 항균활성을 가짐과 동시에 높은 용혈활성을 가지는 양친매성 α-나선형 구조를 가지는 항생펩타이드이다 (Olson L. et al ., 2001 Biochem . Biophys . Res. Commun 288: 1001-1005 ). 수딘이 발견된 이후 삼차원 구조가 아직까지 밝혀진바 없고 세포독성이 높으므로 박테리아 세포에 대한 선택성을 증가시킨 펩타이드 항생제를 개발할 필요가 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항생제에 내성을 나타내는 세균을 제거하기 위한 새로운 기전의 항생제로서 숙주세포에 대해 독성을 가지지 않는 반면에, 박테리아에 강력한 항균활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 2로 기재된 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기의 펩타이드는 수딘 (pseudin-2: 서열번호 1)의 11번째 글라이신을 프롤린으로 치환시키고 10, 14, 18, 24번째 잔기를 라이신으로 치환시킨 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 양이온성과 양친매성을 높이고 N-말단의 유동성을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 항균용 조성물은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물에 효과가 있는 것을 특징으로 하며, 상기 조성물은 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Bacillus subtilis , Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되는 어느 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명에 있어서 상기 항균용 조성물은 사람의 적혈구 세포, 마우스 섬유아세포주로 이루어진 군에서 선택되는 어느 세포주에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 중 11번째 아미노산이 프롤린으로 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명은 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Pseudin-2에 구조적 유동성을 주고 양친매성을 높이기 위해 18번 루이신을 라이신으로 치환하고, 10, 14, 24번의 음이온성을 띄는 잔기들을 라이신잔기로 치환하여 양이온성을 증가시켜 음이온성을 띄는 박테리아 세포막에 탁월한 항균 활성을 나타내고 세포독성을 완전히 없앤 서열번호 2로 기재되는 Ps-6 항생펩타이드를 제공하며 상기의 항균 펩타이드 Ps-6을 항균용으로 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 개구리에서 발견되는 α-나선형 구조를 취하는 항균 펩타이드 인 수딘 항생펩타이드의 중간영역인 11번째 서열에 프롤린을 치환하여 구조적 유동성을 주고 양친매성을 높이기 위해 18번 루이신을 라이신으로, 10, 14, 24번의 음이온성을 띄는 잔기들을 라이신잔기로 치환하여 양이온성을 증가시켜 음이온성을 띄는 박테리아 세포막에 탁월한 항균 활성을 나타내고 세포 독성이 없는 새로운 펩타이드 항생제를 개발하였고 삼차원구조를 규명하여 C-말단에 α-나선형 구조를 가지며 프롤린잔기에 접힌 유동적인 구조가 존재하여 박테리아 선택성을 가짐을 규명하였다.

이에, 본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 항균 펩타이드인 Ps-6의 항균활성 및 세포독성 및 용혈활성이 전혀 없음을 확인하고, 그 삼차원 구조를 밝히고 상기 펩타이드 유도체가 항생제로 이용될 수 있는 항생 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Pseudin-2는 α-나선형 구조를 가지며 소수성 부위와 친수성 부위가 반대쪽에 위치하는 양친매성 구조를 가진 항균활성이 높은 펩타이드이다. 반면에 용혈활성도 높아 독성을 감소시키기 위해 삼차원 구조를 기반으로 하여 Ps-6을 설계, 합성하였다. 이들의 항생활성은 표2에 나타냈다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 항균 펩타이드 Ps-6 및 대조군 펩타이드 (Pseudin=2)를 Fmoc(9-fluorenylmeth -oxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 이와 같이 제조된 합성 펩타이드들은 분석형 역상크로마토그래피에 의하여 그들의 순도(purity)를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기의 항균 펩타이드 Ps-6는 항균제으로 사용하는 용도를 제공한다.

펩타이드	아미노산서열
서열번호 1: Pseudin-2	GLNALKKVFQGIHEAIKLINNHVQ
서열번호 2: Ps-6	GLNALKKVFKPIHKAIKKINNHVK

상기 표는 펩타이드의 아미노산 서열로, 표 1은 본 발명의 개구리 (Pseudis paradoxa)의 표피에서 유래된 항균펩타이드 수딘 (pseudin-2: 서열번호 1) 11번째 아미노산인 글라이신을 프롤린 잔기로 치환시키고 10,14, 18, 24번째 잔기를 라이신으로 치환시킨 서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 Ps-6의 잔기서열을 보인다.

A : 서열번호 1: Pseudin-2

B : 서열번호 2: Ps-6

우선, 본 발명의 항균 펩타이드 Ps-6가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드 Ps-6 및 대조군 펩타이드에 대하여 그람-음성균 (3종류의 균주) 및 그람-양성균 (3종류의 균주)에 대하여 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 (minimal inhibitory concentration: MIC), 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를, 그람 음성균으로써 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사 (Psedomonas aeruginosa)를 그 대상으로 하였다.

그람-양성균과 그람-음성균 모두에 대해서 Ps-6은 대조군 펩타이드 (Pseudin-2) 와 거의 비슷한 강한 항균활성을 나타내었다. 그람 음성균에 대해서는 비슷하고 그림 양성균에 대해서는 pseudin-2보다 두배 정도 항균활성이 높았다. (표 2 참조).

본 발명의 항균 펩타이드 Ps-6가 숙주세포에 대한 독성을 조사하기 위해 인간의 적혈구세포에 대한 용혈활성을 조사 한 결과, 대조군 펩타이드인 Pseudin-2은 높은 용혈활성을 Ps-6는 100μM의 고농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다 (도 1 참조). 또한 도 2는 본 발명의 펩타이드 Ps-6를 마우스의 섬유아세포 NIH-3T3 세포에 대한 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survival rate으로 나타낸 것이다. 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 pseudin-2을 사용하였고 이때 고농도에서도 마우스의 섬유아세포가 그대로 살아 남아 있음을 알 수 있다. 도 3은 본 발명의 펩타이드 Ps-6에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아 세포막을 모방하는 음이온성이 높은 PC/PG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 형광염료 방출을 보이며 도 4는 인간적혈구의 세포막을 모방하는 PC/CH (10:1, w/w)리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)를 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이다. 대조군 항균 펩타이드인 Pseudin-2는 두 리포좀에 선택성이 없이 모두 강한 형광염료 방출을 나타냈다. 그러나 발명 항균펩타이드는 박테리아 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w) 리포좀에 대해 강한 염료방출을 나타내는 반면, 포유동물의 적혈구 세포막을 모방하는 PC/CH (1:1, w/w) 리포좀에 대해서는 거의 염료방출이 없어서 높은 항균활성을 가짐과 동시에 박테리아세포에 선택성이 높을 것임을 예측할 수 있다.

상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 2로 기재되는 펩타이드는 탁월한 항균 활성을 가지며 용혈활성이나 마우스 섬유아세포에 독성이 전혀 없어서 높은 세균선택성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 서열번호 2으로 기재되는 항균펩타이드 Ps-6의 삼차원 구조를 밝히기 위해 NMR실험을 수행하여 구조 규명을 위한 주파수 지정을 완료하였다. 도5는 그 주파수지정을 보여주는 스펙트럼이다. (도 5 참조)

본 발명은 생체막과 유사한 환경을 만들기 위해 DPC(dodecylphosphocholine)으로 이루어진 150mM의 마이셀에 Ps-6과 대조군 펩타이드를 용해시켜 얻어진 NMR 실험결과를 분석하여 NOE 거리구속조건과 이면각 구속조건, 수소결합 조건등을 얻어서 삼차원 구조를 계산하였다. 그 결과 대조군 펩타이드인 Pseudin-2는 양친매성 α-나선형 구조를 갖는 구조를 보이고 발명 펩타이드인 Ps-6는 프롤린 잔기위치근처에서 접히며 큰 유동성을 가지는 삼차원구조를 가짐을 보인다.(도 6 참조) Ps-6는 중간영역의 프롤린 근처에서 접힌구조를 갖고 N-말단 부분의 유동적인 구조로 N-말단은 흔들리며 C-말단은 안정한 helix구조를 가짐을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 2로 기재되는 펩타이드는 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 에어로졸 투여가 가능할 수 있다. 적용의 예는 캡슐, 정제, 경구 투여된 현탁액 또는 용액, 연고 또는 에어로졸 형태가 가능하다.

상기 서열번호 2로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏체중이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏체중이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 2로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 N-말단에 유동성 있는 구조를 포함함으로써 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내고, 세포독성을 가지지 않는 서열번호 2로 기재되는 Ps-6 항생 펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시 예 1: 펩타이드 합성 및 정제

서열번호 1과 2로 기재되는 항균 펩타이드 Pseudin-2와 Ps-6는 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC)를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H₂O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로 부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다. 이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C_18, 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH₃CN (acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실험 예 1: 항균활성의 측정

서열번호 1과 2로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 그람-음성균(Gram-negative bacteria)로서는 한국생명공학연구원의 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)로부터 분양받은 대장균 (KCTC 1682]), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637) 을 사용하였으며, 그람-양성균(Gram-positive bacteria)로서는 바실러스 서브틸리스 (KCTC 3068), 스태필로코쿠스 아우레우스 (KCTC 1621)을 사용하였다. 세균수가 ml 당 2×10⁶ colony-forming units (CFUs)가 되도록 1% peptone으로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양 한 후 ELISA판독기 (Bio-Tek Instruments)로 620nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 최소성장억제농도 (MIC: minimal inhibitory concentration)를 결정한다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 Pis-1을 사용하였다. 그 결과 모든 균에 대해서 대조군인 Pseudin-2 항생펩타이드와 비슷한 높은 항균활성을 나타냈다. 그람 음성균에서는 비슷하고 그람양성균에 대해서는 두배 높 은 항생활성을 나타냈다.

펩타이드	최소생장억제농도 MIC (μM)
	대장균	슈도모나스 에루기노사	바실러스 서브틸리스	스태필로코쿠스 아우레우스
서열번호 1: Pseudin-2	1	2	4	8
서열번호2: Ps-6	2	2	2	4

표 2는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

실험 예 2: 용혈활성의 측정

서열번호 2로 표기되는 펩타이드 Ps-6에 대하여, 사람의 적혈구 용혈활성을 통하여 세포독성 여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 사람의 적혈구(human erythrocytes)를 PBS(phosphate-buffered saline: 35 mM 포스페이트 완충용액/150 mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리 하는 것에 의하여 3회 세척한다. PBS로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 로딩한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간동안 배양한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트를 원심력 1000g로 5분간 원심분리 한다. 상층액 100㎕씩 취하여 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮긴 후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군 펩타이드로, melittin 및 Trp3-NH₂를 사용 하였다. 이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % hemolysis로서 수학식 1에 의하여 산출하였다. 여기서 A는 펩타이드 용액에서의 405 nm의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 405 nm의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 405 nm의 흡광도를 나타낸다. 이 때 대조군의 펩타이드로서 강한 용혈활성을 나타내는 항균 펩타이드로서는 Pseudin-2는 100μM에서 20%의 용혈활성을 가짐에 반해 서열번호 2로 표기되는 발명 펩타이드 Ps-6는 100μM의 고농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다.

실험 예 3: 포유류 세포주에 대한 독성측정

서열번호 2로 표기되는 펩타이드 Ps-6의 포유류 세포주에 대한 독성여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 섬유아세포 NIH-3T3 세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medim) 배양액으로 5% CO₂존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2×10⁴ 세포수가 되도록 DMEM배양 액 150㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 5% CO₂배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, 최종 펩타이드 농도가 100μM 되게 펩타이드를 가하여 2일간 배양한다. 그 후 MTT용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20㎕을 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 배양한다. 생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan을 0.01 M염산을 포함하는 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)용액을 플레이트의 각 웰에 40㎕씩 첨가하여 하룻밤 방치하여 잘 녹인 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 나타내었다. [도 2]에 나타낸 바와 같이 대조군 펩타이드인 Pseudin-2는 100μM에서 80 % 이상의 세포를 죽이는 강력한 세포독성을 나타낸 반면에 발명펩타이드인 Ps-6는 100μM에서 전혀 세포독성을 나타내지 않았다.

실험 예 4: 박테리아세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 인공지질막에 대한 파괴능 측정

서열번호 2로 표기되는 펩타이드 Ps-6의 항균작용이 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 세균을 죽이는 작용기작을 나타내는 것인지를 확인하기 위하여 fluorescent dye (형광염료)인 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아의 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w)로 구성된 LUVs (large unilamellar vesicle)의 리포좀(liposome)과 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH(1:10, w/w)을 제작하여 다음의 형광염료방출실험(dye leakage assay)을 행하였다. 각 구성성분의 함량대로 구성된 인지질을 10mM/ml이 되도록 클로로포름(CHCl₃)에 녹인 다음, rotary evaporator로 클로로포름을 제거하고, 하룻밤 동안 동결건조 시킨다. 건조된 지질필름(lipid films)을 트리스-완충용액 (10mM Tris-HCl/ 0.1mM EDTA /150 mM NaCl / pH 7.4) 1ml에 calcein을 70mM이 되도록 녹인다. 리포좀 용액을 액체질소로 얼림-녹임(frozen-thaw)을 10번(ten cycles) 반복하여 행하고 polycarbonate 필터 (pore size가 100 nm인 필터를 두장을 겹친것)로 장착된 LiposoFast extruder (Avestin, Inc. Canada)장치를 이용하여 10회 통과시켜서 칼세인을 포획한 LUVs를 제작한다. 다음은 Sephadex G-50 컬럼을 이용하여 LUVs에 포획되지 않은 free calcein을 제거 하고 calcein이 포획된 리포좀을 모은다. Spectrofluorimeter (Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, Japan)의 excitation wavelength을 490nm에 emission wavelength를 520nm에 맞춘다. 트리스-완충용액 3ml을 quartz cuvette (1cm path length)에 넣고 여기에 적당량의 LUVs 용액을 넣고, 10% Triton-X₁₀₀ 20μl를 넣어 형광세기(fluorescence intensity) 가 1000을 넘지 않도록 LUVs의 양을 조절한다. 위의 조건이 확립되면 LUVs에 펩타이드를 투여한다. 여기서 100 % dye leakage는 0.01 % Triton-X₁₀₀을 넣었을 때의 형광 세기로 표시한다. 여기서 PG는 L-α-phosphatidyl-DL-glycerol의 약어이며, PC 는 1,2-diacyl-sn-glycero-3- phosphocholine의 약어이다. CH는 콜레스테롤의 약자이다. 여기서 박테리아 세포막을 표적으로 하여 항균활성을 나타내는 대조군의 펩타이드로서는 Pseudin-2을 사용하여 비교하였다.

[도 3]에 보이듯이 대조 펩타이드인 Pseudin-2 는 낮은 농도에서도 박테리아의 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀에서 칼세인을 (calcein leakage)방출시켰으며 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH (10:1,w/w) 리포좀에서도 [도 4]에 보이듯이 대조 펩타이드인 Pseudin-2 는 1.5μM에서는 거의 50 %에 가까운 칼세인 방출을 일으켜서 전혀 박테리아세포에 대한 선택성을 보이지 않았다. 서열번호 2로 표기되는 발명 펩타이드 Ps-6는 [도 3]에 보이듯이 박테리아의 세포막을 모방하는 PC/PG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀에 대해서는 펩타이드 농도를 증가시킬때 칼세인 방출이 증가하였으며 4μM에서는 거의 50 %의 방출을 보였다. 그러나 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH (10:1,w/w) 리포좀에서는 [도 4]에 보이듯이 발명 펩타이드 Ps-6는 인간의 적혈구를 모방하는 PC/CH (10:1, w/w) 리포좀에서는 거의 칼세인 방출 (calcein leakage)이 일어나지 않아 MIC이상인 6μM에서도 거의 5 % 미만의 극히 적은 칼세인 방출을 일으켜 높은 박테리아 세포에 대한 선택성을 보였다.

실험 예 5: 핵자기공명분광법을 이용한 항균펩타이드의 삼차원구조연구

서열번호 1과 2로 표기되는 펩타이드 Pseudin-6와 Ps-6의 삼차원 구조를 규명하기 위해 핵자기공명실험을 수행하였다. 펩타이드를 150mM의 DPC micelle에 녹 여 1mM의 시료를 만든다. DQF-COSY, TOCSY, NOESY등의 2차원 NMR 실험을 수행하여 주파수를 지정하였다.

[도 5]는 서열번호2로 표기되는 펩타이드 Ps-6 NOESY 스펙트럼으로 주파수지정을 보여주고 있다. NOESY 스펙트럼으로부터 거리에 대한 정보를 얻고 DQF-COSY실험으로 부터 이면각 구속조건을 얻었다. 298K, 303K, 308K, 313K, 318K로 온도를 변화시키며 NMR 스펙트럼에서의 화학적이동의 변화를 관측하여 이차구조의 안정성을 측정하고 중수소치환속도를 측정하여 수소결합에 대한 정보를 얻었다. 이러한 데이터를 구속조건으로 하여 X-plor 프로그램을 이용하여 삼차원 구조를 계산하였다. 모든 NMR 실험은 건국대학교 400MHz NMR기기와 기초과학 지원센터의 500MHz 분광기를 이용하여 수행되었다. [도 6]에 나타낸 바와 같이 대조군 펩타이드인 Pseudin-2는 선형의 양친매성을 갖는 안정된 α-나선형구조를 가짐에 반하여 Ps-6 펩타이드는 11번째 잔기 주위에서 helix구조가 꺽여서 11번째 잔기부터 20번째 잔기까지의 양친매성 α-나선형구조를 가짐을 알수 있다. 서열번호 2로 표기되는 Ps-6 펩타이드는 프롤린 잔기에서 접히며 양친매성을 높이기 위해 18번 루이신을 라이신으로 치환하고, 10, 14, 24번의 음이온성을 띄는 잔기들을 라이신잔기로 치환하여 11번째 잔기부터 22번째 잔기까지의 C-말단이 양쪽 친매성 α-나선형구조를 가지고 프롤린에서 접힌, N-말단이 유동적인 구조를 가짐을 알 수 있다. 따라서 이러한 유동적인 구조가 박테리아세포의 선택성에 중요함을 알 수 있다. 또한 네 개의 잔기를 라이신잔기로 치환하여 양이온성이 증가하였으므로 음이온성을 가지는 박테리아세포에 대한 선택성이 높아졌다.

도 1은 본 발명의 펩타이드 Ps-6를 인간의 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 용혈활성을 % hemolysis로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (용혈활성을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 pseudin-2를 사용하였다.

도 2는 본 발명의 펩타이드 Ps-6를 마우스의 섬유아세포(NIH-3T3)에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survical rate으로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 pseudin-2를 사용하였다.

도 3은 본 발명의 펩타이드 Ps-6에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 PC/PG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)를 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 Pseudin-2를 사용하였다.

도 4는 본 발명의 펩타이드 Ps-6에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 PC/CH (10:1, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)를 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 pseudin-2을 사용하였다.

도 5는 본 발명의 Ps-6 항생 펩타이드를 150mM DPC micelle에 녹여 핵자기공명스펙트럼을 찍고 주파수를 지정한 NMR스펙트럼을 보여주는 그림이다.

도 6은 본 발명의 Ps-6 항생 펩타이드의 삼차원 구조를 NMR 분광법으로 규명한것으로서 대조군자료로 항균 펩타이드 Pseudin-2의 삼차원구조를 나타냈다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Novel antimicrobial peptide analogue derived from pseudin, designed by substitution with proline and lysine and its use <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudin-2 <400> 1 Gly Leu Asn Ala Leu Lys Lys Val Phe Gln Gly Ile His Glu Ala Ile 1 5 10 15 Lys Leu Ile Asn Asn His Val Gln 20 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ps-6 <400> 2 Gly Leu Asn Ala Leu Lys Lys Val Phe Lys Pro Ile His Lys Ala Ile 1 5 10 15 Lys Lys Ile Asn Asn His Val Lys 20

Claims

수딘 (pseudin-2: 서열번호 1)의 11번째 글라이신을 프롤린으로 치환시키고 10, 14, 18, 24번째 잔기를 라이신으로 치환시킨 서열번호 2로 기재된 펩타이드.
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제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 양이온성과 양친매성을 높이고 N-말단의 유동성을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물에 효과가 있는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis , Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되는 어느 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 사람의 적혈구 세포 및 마우스 섬유아세포주로 이루어진 군에서 선택되는 어느 세포주에 대하여 안전성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
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