KR100980300B1 - 라이신 펩토이드 잔기를 포함하는 새로운 박테리아선택성을 갖는 피시딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피시딘 (piscidin-1: Pis-1, 서열번호 1)의 8번째 아미노산인 글라이신을 라이신 펩토이드 잔기(Lys-peptoid residue: Nk)로 치환시킨 서열번호 2에 기재된 항생 펩타이드 Pis-1 NkG 과 그의 용도 및 작용기작에 관한 것이다. 본 발명의 새로운 항균 펩타이드 Pis-1 NkG는 탁월한 항균 활성을 나타내고 세포 독성이 없으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

피시딘, 항균 펩타이드, 라이신 펩토이드 잔기, 항균제, 염증치료제.

Description

라이신 펩토이드 잔기를 포함하는 새로운 박테리아 선택성을 갖는 피시딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도{Novel antimicrobial peptide containing Lys-peptoid residue and its use}

본 발명은 라이신 펩토이드 잔기를 포함하는 새로운 박테리아 선택성을 갖는 피시딘 유도체 항생 펩타이드 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피시딘 (piscidin-1)의 8번째 아미노산인 글라이신을 라이신 펩토이드 잔기(Lys-peptoid residue: Nk)로 치환시킨 항생 펩타이드와 그의 용도에 관한 것이다.

페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균을 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis ), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa ) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). 페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의 하여 항생작용을 나타낸다. 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G. J Intern Med. 2003, 254(3), 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395).

항생 펩타이드는 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형 (helical)의 양친매성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이나 트립토판등의 특정 아미노산이 풍부한 (proline-rich, Trp-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int. J. Antimicrob . Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu , D.; Rivas , L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 멜리틴 (melittin)이나 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 α-나선형을 형성하는 구조이다.

항생 펩타이드를 항생물질로서의 유용성을 가지기 위하여서는 사람의 적혈구 세포에 대하여 용혈활성을 나타내지 않는 반면에 세균에 대하여 선택적으로 강한 항균활성을 나타내어야 한다. 이런 이유로 지금까지 많은 국내외 연구자들에 의하여 α-나선형 양쪽친매성 펩타이드를 대상으로 펩타이드의 length, hydrophobocity, α-helicity, net positive charge, amphipathicity등을 조절하여 세포특이성을 지닌 선택성 펩타이드의 설계 및 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. (Blondelle, S. E., & Houghten, R.A., 1992, Biochemistry 31, 12688-12694, Dathe, M., et al., 1997, FEBS Lett . 403, 208-212, Kwon, M. Y., et al., 1998, Biochim . Biophys . Acta . 1387, 239-248, Bikshapathy, E., et al., 1999, J. Pept . Res . 53, 47-55, Shin, S. Y. et al, 2000, Biochem . Biophys . Res . Commun. 275, 904-909, Kyungik Lee et al., 2994, BBRC, 323, 712-719, Shin Saeng Lim, 2005, BBRC , 334(8), 1329-1335, Sung-Tae Yang, 2006, Biochemistry , 45(6), 1775-1784)

천연에서 발견되는 항균 펩타이드 중에는 α-나선형 구조를 취하는 것이 대부분을 차지한다. α-나선형 구조 항균 펩타이드의 중앙에 프롤린(Pro) 혹은 글리신(Gly)과 같이 α-나선형 구조를 취하기 어려운 아미노산 잔기를 도입하여 펩타이드의 중앙부위에 접힘(hinge) 혹은 꺽임(kink) 부분을 도입함으로서 펩타이드의 유동성을 증가시킴으로서 펩타이드가 숙주세포(인간의 적혈구세포)에는 작용하지 않고 박테리아 세포에만 선택적으로 작용하여 세균을 죽이는 펩타이드 항생제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. (Thennarasu, S., & Nagaraj, R. 1996, Protein Eng . 9, 1219-1224, Suh, J. Y., et al., 1999, Eur . J. Biochem . 266, 665-674, Oh, D., et al., 2000, Biochemistry 39, 11855-11864, Song, Y. M., et al., 2004, Biochem . Biophys . Res . Commun . 314, 615-621, Lim, S. S., 2005, Biochem. Biophys . Res . Commun . 334, 1329-1335)

농어에서 발견되는 항균 펩타이드인 피시딘 (Pis-1)은 높은 항균활성을 가짐과 동시에 높은 용혈활성을 가지는 양친매성 α-나선형 구조를 가지는 항생펩타이드이다 (Silphaduang U. & Noga, E. J. 2001, Nature , 414, 268-269).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 항생제에 내성을 나타내는 세균을 제거하기 위한 새로운 기전의 항생제로서 숙주세포에 대해 독성을 가지지 않는 반면에, 박테리아에 강력한 항균활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 8번째 아미노산인 글라이신을 라이신 펩토이드로 치환시킨 서열번호 2에 기재된 Pis-1 NkG 항생 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 접힘 구조를 갖는 N-말단의 유연성을 가지는 것이 바람직하고, 상기 유연성 부위는 항생 펩타이드와 세포막의 결합력 향상을 위한 접힘 구조를 형성하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포막은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되 는 어느 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열 중 8번째 아미노산이 라이신 펩토이드 보존되고 상기 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며, 항균 및 항진균 활성을 나타내는 항생 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 접힘 구조를 갖는 N-말단의 유연성을 가지며, 상기 유연성 부위는 항생 펩타이드와 세포막의 결합력 향상을 위한 접힘 구조를 형성하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며, 상기 펩타이드는 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되는 어느 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기의 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 항균용 조성물은 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되는 어느 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 동물에 대하여 독성을 가 지지 않는 것이 바람직하고, 상기 동물은 사람, 마우스, 개, 말, 소, 돼지, 닭, 양, 고양이로 구성된 군으로부터 선택된 동물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 농어에서 유래된 항생펩타이드 Pis-1의 8번째 아미노산인 글라이신을 라이신 펩토이드잔기로 치환시킴으로써 유동적인 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가지는 Pis-1 NkG 항생 펩타이드를 제공한다.

상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 Pis-1은 α-나선형 구조를 가지며 소수성 부위와 친수성 부위가 반대쪽에 위치하는 양친매성 구조를 가진 항균활성이 높은 펩타이드이다. 반면에 용혈활성도 높아 독성을 감소시키기 위해 Pis-1 NkG를 합성하였다. 이들의 항생활성은 표 2에 나타냈다.

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 항균 펩타이드 Pis-1 NkG 및 대조군 펩타이드 (Pis-1)를 Fmoc(9-fluorenylmeth -oxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 이와 같이 제조된 합성 펩타이드들은 분석형 역상크로마토그래피에 의하여 그들의 순도(purity)를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기의 항균 펩타이드 Pis-1 NkG 는 항균제으로 사용하는 용도를 제공한다.

펩타이드	아미노산서열
서열번호 1: Pis-1	FFHHIFRGIVHVGKTIHRLVTG
서열번호 2: Pis-1 NkG	FFHHIFR k IVHVGKTIHRLVTG

상기 표는 펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, k (Lysine peptoid)는 "NH₂-(CH₂)₄-NH-CH₂-COOH"를 나타낸다.

표 1은 본 발명의 줄무늬 농어 (Morone saxatilis x M. chrysops)의 지방세포 (mast cell)에서 유래된 항균펩타이드 피시딘 (piscidin-1, 이하 Pis-1로 명명함, 서열번호 1)의 8번째 아미노산인 글라이신을 펩토이드 잔기(Lys-peptoid residue: Nk)로 치환시킨 서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 Pis-1 NkG의 잔기서열을 보인다.

A : 서열번호 1: Pis-1

B : 서열번호 2: Pis-1 NkG

우선, 본 발명의 항균 펩타이드 Pis-1 NkG가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드 Pis-1 NkG 및 대조군 펩타이드에 대하여 그람-음성균 (3종류의 균주) 및 그람-양성균 (3종류의 균주)에 대하여 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 (minimal inhibitory concentration: MIC), 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스태필로코쿠스 에피더미디스 (Staphlococcus epidermidis) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 그람 음성균으로써 대장균 (Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사 (Psedomonas aeruginosa), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 를 그 대상으로 하였다.

그람-양성균과 그람-음성균 모두에 대해서 Pis-1 NkG는 대조군 펩타이드 (Pis-1) 와 거의 비슷한 강한 항균활성을 나타내었다 (표 2 참조).

본 발명의 항균 펩타이드 Pis-1 NkG가 숙주세포에 대한 독성을 조사하기 위해 인간의 적혈구세포에 대한 용혈활성을 조사 한 결과, 대조군 펩타이드인 Pis-1은 높은 용혈활성을 Pis-1 NkG는 200μM의 고농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다 (도 1 참조). 또한 도 2는 본 발명의 펩타이드 Pis-1 NkG를 마우스의 섬유아세포 NIH-3T3 세포에 대한 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survival rate으로 나타낸 것이다. 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 Pis-1을 사용하였고 이때 고농도에서도 마우스의 섬유아세포가 그대로 살아 남아 있음을 알 수 있다. 도 3은 본 발명의 펩타이드 Pis-1 NkG에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 EYPC/EYPG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)를 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 대조군 항균 펩타이드인 Pis-1에 비해서는 약하나 발명 항균펩타이드도 박테리아 세포막을 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w) 리포좀에 대해 강한 염료방출을 나타내 높은 항균활성을 가질 것임을 예측할 수 있다.

상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 2로 기재되는 펩타이드는 탁월한 항균 활성을 가지며 용혈 활성이나 마우스 섬유아세포에 독성이 전혀 없어서 높은 세균선택성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 항균펩타이드 Pis-1 NkG의 삼차원 구조를 밝히기 위해 NMR실험을 수행하여 구조 규명을 위한 주파수 지정을 완료하였다. 도 4는 그 주파수지정을 보여주는 스펙트럼이다. (도 4 참조)

본 발명은 생체막과 유사한 환경을 만들기 위해 DPC(dodecylphosphocholine)으로 이루어진 150mM의 마이셀에 Pis-1 NkG와 대조군 펩타이드들를 용해시켜 얻어진 NMR 실험결과를 분석하여 NOE 거리구속조건과 이면각 구속조건, 수소결합 조건등을 얻어서 삼차원 구조를 계산하였다. 그 결과 대조군 펩타이드인 Pis-1은 높은 양친매성 α-나선형 구조를 갖는 구조를 보이고 발명 펩타이드인 Pis-1 NkG은 펩토이드 잔기위치근처에서 접히며 Pro보다 더 큰 유동성을 가지는 삼차원구조를 가짐을 보인다. (도 5 참조)

도 6은 NMR 분광법으로 규명된 본 발명의 Pis-1 NkG 항생 펩타이드의 삼차원 구조를 안정한 20개 구조를 수렴시켜서 그린 그림이다. 대조군자료로 항균 펩타이드 Pis-1의 삼차원구조 수렴구조와 함께 나타냈다. Pis-1의 경우 20개 구조 간의 수렴도가 높음에 반해 본 발명의 펩타이드의 8번째 라이신 펩토이드 위치에서 접힌구조를 갖고 N-말단 부분의 유동적인 구조로 N-말단은 구조간 수렴이 안되는 것을 확인한 그림이다. 따라서 이러한 유동적인 접힌 구조가 세균선택성에 중요한 역할을 함을 알 수 있음을 확인하였다. 상기의 결과로부터, 본원 발명의 서열번호 2로 기재되는 펩타이드는 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

상기 서열번호 2로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 2로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 에어로졸 투여가 가능할 수 있다. 적용의 예는 캡슐, 정제, 경구 투여된 현탁액 또는 용액, 연고 또는 에어로졸 형태가 가능하다.

바람직한 적용은 정맥내, 근육내 또는 경구 투여 또는 안약일 수 있다. 사용된 용량은 특정활성 성분의 타입, 연령, 환자의 필요 및 적용증의 종류에 의존하나, 일반적으로 매일 0.1 ∼50 mg/kg 체중의 용량이 고려된다.

이들 조성물들은 정제, 드라지, 젤라틴 캡슐, 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 장 또는 구강 투여, 스프레이 형태의 코 투여, 좌약 형태의 직장 투여가 가능하다. 이들 화합물들은 근육내, 비경구 또는 정맥 내 투여가능하다.

용량은 넓은 범위 내에서 변화가능하지만 특정 상황에 알말게 조절되어야 한다. 일반적으로 구강 투여는 약 70kg 체중의 성인을 기준으로 하루에 약 3 mg에서 약 4 g, 바람직하게는 약 0.2 g에서 약 4 g, 가장 바람직하게는 0.2 g에서 2 g 사이이다. 그 용량은 바람직하게는 동량으로 하루에 1회에서 3회 투여되어야 한다. 통상적으로 아이들은 체중 및 나이에 맞추어 더 낮은 용량 투여하여야 한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 N-말단에 유동성 있는 구조를 포함함으로써 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내고, 세포독성을 가지지 않는 서열번호 2로 기재되는 Pis-1 NkG 항생 펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1> Fmoc - Nlys ( Boc )- OH 의 합성

본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 항균 펩타이드 Pis-1 NkG의 합성에 필요한 단량체인 Fmoc-Nlys(Boc)-OH (Fmoc-Lys-peptoid residue)를 다음과 같은 절차에 의하여 합성하였다.

Diaminobutane을 클로로포럼(CHCl₃)에 녹인 용액을 0℃에서 (Boc)₂O/ (1.3 당량)을 조금씩 천천히 첨가하면서 교반시킨 후, 반응용액을 실온에서 24시간 교반 시킨다. 반응용액을 감압농축하여 용매를 제거하여 생긴 oil상태의 생성물을 ether로 침전화 시키고 brine으로 세척한다. Ether층을 MgSO₄로 건조시키고 감압농축하여 crude한 생성물(N-Boc diaminobutane) (화합물 2)을 얻었다. 생성된 N-Boc diaminobutane (화합물 2) (1.1 당량), Benzyl 2-bromoacetate (1.0 당량) (화합물 1) 및 Et₃N (1.1 당량)을 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)에 녹인 후, 실온에서 5시간 정도 교반시켜서 생성된 반응혼합액을 MgSO₄로 건조시킨 후, 생성된 crude생성물을 실리카겔(silica gel)로 충진된 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)로 정제하여 순수한 생성물 (화합물 3)을 얻었다 (수율 43%). 화합물 3 (1당량), FmocOSu (1.0 당량) 및 Et₃N (1.0 당량)을 CH₃CN에 녹인 후, 혼합액을 12시간 실온에서 교반하고 난 후, 감압농축 하여 용매를 제거하고 생성된 crude 물질을 실리카겔(silica gel)로 충진된 컬럼크로마토그래피(column chromatography)로 정제하여 화합물 4를 얻었다 (수율 30%). 화합물 4를 메탄올(methanol)에 녹인 후, H₂ atmosphere하에서 10% Pd-C를 첨가하고 6시간 교반하고 난 후, Celite로 여과하고 농축하여 최종 생성물 [Fmoc-Nlys(Boc)-OH]을 얻었다 (수율 80%).

< 실시예 2> 펩타이드들의 합성 및 분리정제

서열번호 1과 2로 기재되는 항균 펩타이드 Pis-1과 Pis-1 NkG는 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC)를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H₂O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로 부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다.

이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C_{18 ,} 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH₃CN (acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.

정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

<실험 예 1> 항균활성의 측정

서열번호 1과 2로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

그람-양성균(Gram-negative bacteria)로서는 한국생명공학연구원의 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)로부터 분양받은 대장균 (KCTC 1682]), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637) 및 살모넬라 티피뮤리움 (KCTC 1926)을 사용하였으며, 그람-음성균(Gram-negative bacteria)로서는 바실러스 서브틸리스 (KCTC 3068), 스태필로코쿠스 에피더미디스 (KCTC 1917) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 (KCTC 1621)을 사용하였다. 세균수가 ml 당 2×10⁶ colony-forming units (CFUs)가 되도록 1% peptone으로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양 한 후 ELISA판독기 (Bio-Tek Instruments)로 620nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 최소성장억제농도 (MIC: minimal inhibitory concentration)를 결정한다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 Pis-1을 사용하였다.

그 결과 모든 균에 대해서 대조군인 Pis-1 항생펩타이드와 동일한 높은 항균활성을 나타냈다.

펩타이드	최소생장억제농도 MIC (μM)
	대장균	슈도모나스 에루기노사	살모넬라 티피뮤리움	바실러스 서브틸리스	스태필로코쿠스 에피더미디스	스태필로코쿠스 아우레우스
서열번호 1: Pis-1	2	4	2	1	2	1
서열번호 2: Pis-1 NkG	2	4	4	1	2	4

상기 표는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

<실험 예 2> 용혈활성의 측정

서열번호 2로 표기되는 펩타이드 Pis-1 NkG에 대하여, 사람의 적혈구 용혈활성을 통하여 세포독성 여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 사람의 적혈구(human erythrocytes)를 PBS(phosphate-buffered saline: 35 mM 포스페이트 완충용액/150 mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리 하는 것에 의하여 3회 세척한다. PBS로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 로딩한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간동안 배양한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트를 원심력 1000g로 5분간 원심분리 한다. 상층액 100㎕씩 취하여 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮긴 후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군 펩타이드로, melittin 및 Trp3-NH₂를 사용 하였다. 이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % hemolysis로서 수학식 1에 의하여 산출하였다.

여기서 A는 펩타이드 용액에서의 405 nm의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 405 nm의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 405 nm의 흡광도를 나타낸다. 이 때 대조군의 펩타이드로서 강한 용혈활성을 나타내는 항균 펩타이드로서는 Pis-1를 사용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 2로 표기되는 발명 펩타이드 Pis-1 NkG는 200μM의 고농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다.

<실험 예 3> 박테리아세포막과 적혈구 세포막을 모방하는 인공지질막에 대한 파괴능 측정

서열번호 2로 표기되는 펩타이드 Pis-1 NkG의 항균작용이 박테리아의 세포막을 표적으로 하여 세균을 죽이는 작용기작을 나타내는 것인지를 확인하기 위하여 fluorescent dye (형광염료)인 칼세인(calcein)을 포획시킨 박테리아의 세포막을 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w)로 구성된 LUVs (large unilamellar vesicle)의 리포좀(liposome)을 제작하여 다음의 형광염료방출실험(dye leakage assay)을 행하였다. EYPC/EYPG (7:3, w/w)로 구성된 인지질을 10mM/ml이 되도록 클로로포름(CHCl₃)에 녹인 다음, rotary evaporator로 클로로포름을 제거하고, 하룻밤 동안 동결건조 시킨다. 건조된 지질필름(lipid films)을 트리스-완충용액 (10mM Tris-HCl/ 0.1mM EDTA /150 mM NaCl / pH 7.4) 1ml에 calcein을 70mM이 되도록 녹인다. 리포좀 용액을 액체질소로 얼림-녹임(frozen-thaw)을 10번(ten cycles) 반복하여 행하고 polycarbonate 필터 (pore size가 100 nm인 필터를 두장을 겹친것)로 장착된 LiposoFast extruder (Avestin, Inc. Canada)장치를 이용하여 10회 통과시켜서 칼세인을 포획한 LUVs를 제작한다. 다음은 Sephadex G-50 컬럼을 이용하여 LUVs에 포획되지 않은 free calcein을 제거 하고 calcein이 포획된 리포좀을 모은다. Spectrofluorimeter (Shimadzu RF 5301 PC spectrofluorimeter, Japan)의 excitation wavelength을 490nm에 emission wavelength를 520nm에 맞춘다. 트리스-완충용액 3ml을 quartz cuvette (1cm path length)에 넣고 여기에 적당량의 LUVs 용액을 넣고, 10% Triton-X₁₀₀ 20μl를 넣어 형광세기(fluorescence intensity) 가 1000을 넘지 않도록 LUVs의 양을 조절한다. 위의 조건이 확립되면 LUVs에 펩타이드를 투여한다. 여기서 100 % dye leakage는 0.01 % Triton-X₁₀₀을 넣었을 때의 형광 세기로 표시한다. 여기서 EYPG는 egg yolk L-α-phosphatidyl-DL-glycerol의 약어이며, EYPC 는 egg yolk 1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine의 약어이다. 여기서 박테리아 세포막을 표적으로 하여 항균활성을 나타내는 대조군의 펩타이드로서는 Pis-1을 사용하여 비교하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이 대조 펩타이드인 Pis-1 는 펩타이드 농도증가에 따라서 박테리아의 세포막을 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀에서 칼세인 방출 (calcein leakage)이 증가하였으며, 1.5μM에서는 거의 100 %에 가까운 칼세인 방출을 일으켰다. 서열번호 2로 표기되는 발명 펩타이드 Pis-1 NkG는 박테리아의 세포막을 모방하는 EYPC/EYPG (7:3, w/w)로 구성된 리포좀에 대해서는 펩타이드 농도를 증가시킬때 서서히 칼세인 방출이 증가하였으며 대조 펩타이드인 Pis-1 와 같이 2μM에서 50%의 방출을, 10μM이상에서 100%의 칼세인 방출을 보였다.

<실험 예 4> 포유류 세포주에 대한 독성측정

서열번호 2로 표기되는 펩타이드 Pis-1 NkG의 포유류 세포주에 대한 독성여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 섬유아세포 NIH-3T3 세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medim) 배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2×10⁴ 세포수가 되도록 DMEM배양액 150㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, 최종 펩타이드 농도가 100μM 되게 펩타이드를 가하여 2일간 배양한다. 그 후 MTT용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20㎕을 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 배양한다. 생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan을 0.01 M염산을 포함하는 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)용액을 플레 이트의 각 웰에 40㎕씩 첨가하여 하룻밤 방치하여 잘 녹인 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 대조군 펩타이드인 Pis-1는 100μM에서 거의 100 % 세포를 죽이는 강력한 세포독성을 나타낸 반면에 Pis-1 NkG는 100μM에서 전혀 세포독성을 나타내지 않았다.

<실험 예 5> 핵자기공명분광법을 이용한 항균펩타이드의 삼차원구조연구

서열번호 1과 2로 표기되는 펩타이드 Pis-1과 Pis-1 NkG의 삼차원 구조를 규명하기 위해 핵자기공명실험을 수행하였다. 펩타이드를 150mM의 DPC micelle에 녹여 1mM의 시료를 만든다. DQF-COSY, TOCSY, NOESY등의 2차원 NMR 실험을 수행하여 주파수를 지정하였다. 도 4는 2로 표기되는 펩타이드 Pis-1 NkG의 NOESY 스펙트럼으로 주파수지정을 보여주고 있다. NOESY 스펙트럼으로부터 거리에 대한 정보를 얻고 DQF-COSY실험으로 부터 이면각 구속조건을 얻었다. 298K, 303K, 308K, 313K, 318K로 온도를 변화시키며 NMR 스펙트럼에서의 화학적이동의 변화를 관측하여 이차구조의 안정성을 측정하고 중수소치환속도를 측정하여 수소결합에 대한 정보를 얻었다. 이러한 데이터를 구속조건으로 하여 X-plor 프로그램을 이용하여 삼차원 구조를 계산하였다. 모든 NMR 실험은 건국대학교 400MHz NMR기기와 기초과학 지원센터의 500MHz 분광기를 이용하여 수행되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이 대조군 펩 타이드인 Pis-1은 선형의 양친매성을 갖는 안정된 α-나선형구조를 가짐에 반하여 Pis-1 NkG 펩타이드는 N-말단이 풀린 8번째 잔기부터 21번째 잔기까지의 양친매성 α-나선형구조를 가짐을 알수 있다. 또한 도 6에서 보이는 바와 같이 대조군 펩타이드인 Pis-1은 선형의 양친매성을 갖는 안정된 α-나선형구조를 가져서 20개의 구조가 모두 수렴이 잘 되는 반면에 서열번호 2로 표기되는 Pis-1 NkG 펩타이드는 라이신 펩토이드 잔기부터 접히며 8번째 잔기부터 21번째 잔기까지의 양쪽 친매성 α-나선형구조는 20개 구조가 수렴이 잘 되는 구조임에 반해 N-말단 부위는 20개 구조가 수렴이 안되는 유동적인 구조를 가지고 있음을 알 수 있다. 따라서 이러한 N-말단의 유동적인 구조가 박테리아세포의 선택성에 중요함을 알 수 있다.

이와 같은 사실을 바탕으로 하여 본 발명에서는 농어에서 발견되는 α-나선형 구조를 취하는 항균 펩타이드인 피시딘 (Pis-1)의 8번째의 아미노산인 글라이신 (Gly)을 펩토이드 잔기(Lys-peptoid residue: Nlys)로 치환시킨 서열번호 2로 기재되는 펩토이드 잔기를 포함한 항균 펩타이드 Pis-1 NkG를 설계하고 합성하여 숙주세포(인간의 적혈구세포)에는 전혀 작용하지 않고 박테리아 세포에만 선택적으로 작용하여 세균을 죽이는 새로운 펩타이드 항생제를 개발하였고 삼차원구조를 규명하여 α-나선형 구조 중간에 유동적인 구조가 존재하여 박테리아 선택성을 가짐을 규명하였다.

도 1은 본 발명의 펩타이드 Pis-1 NkG를 인간의 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 용혈활성을 % hemolysis로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (용혈활성을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 Pis-1을 사용하였다.

도 2는 본 발명의 펩타이드 Pis-1 NkG를 마우스의 섬유아세포(NIH-3T3)에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 독성을 측정하여 % survical rate으로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 항균 펩타이드 Pis-1을 사용하였다.

도 3은 본 발명의 펩타이드 Pis-1 NkG에 의한 형광염료(fluorescent dye) 칼세인(calcein)을 포획시킨 EYPC/EYPG (7:3, w/w) 리포좀에 대한 % 염료방출(dye leakage)를 펩타이드 농도에 따라 나타낸 것이고, 여기서는 대조군 (세포막 표적의 작용기작을 나타내는 펩타이드)으로 항균 펩타이드 Pis-1과 멜리틴을 사용하였다.

도 4는 본 발명의 Pis-1 NkG 항생 펩타이드를 150mM DPC micelle에 녹여 핵자기공명스펙트럼을 찍고 주파수를 지정한 NMR스펙트럼을 보여주는 그림이다. 여기서는 대조군자료로 항균 펩타이드 Pis-1의 스펙트럼을 나타냈다.

도 5는 본 발명의 Pis-1 NkG 항생 펩타이드의 삼차원 구조를 NMR 분광법으로 규명한것으로서 대조군자료로 항균 펩타이드 Pis-1의 삼차원구조를 나타냈다. Pis-1펩타이드의 경우 두 번째 잔기부터 21번째 잔기까지 안정된 양쪽 친매성 α-나선형 구조를 가지나 본 발명의 펩타이드가 8째잔기부터 21번째 잔기까지 양쪽 친매성 α-나선형구조를 가지며 8번째 라이신 펩토이드 위치에서 접힌구조임을 알 수 있고 N-말단 부분의 유동적인 구조를 확인한 그림이다.

도 6은 NMR 분광법으로 규명된 본 발명의 Pis-1 NkG 항생 펩타이드의 삼차원 구조를 안정한 20개 구조를 수렴시켜서 그린 그림이다. 대조군자료로 항균 펩타이드 Pis-1의 삼차원구조 수렴구조와 함께 나타냈다. Pis-1 의 경우 20개 구조간의 수렴도가 높음에 반해 본 발명의 펩타이드의 8번째 라이신 펩토이드 위치에서 접힌구조를 갖고 N-말단 부분의 유동적인 구조로 N-말단은 구조간 수렴이 안되는 것을 확인한 그림이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Novel antimicrobial peptide containing Lys-peptoid residue and its use <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pis-1 <400> 1 Phe Phe His His Ile Phe Arg Gly Ile Val His Val Gly Lys Thr Ile 1 5 10 15 His Arg Leu Val Thr Gly 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pis-1 NkG <400> 2 Phe Phe His His Ile Phe Arg Lys Ile Val His Val Gly Lys Thr Ile 1 5 10 15 His Arg Leu Val Thr Gly 20

Claims (15)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 8번째 아미노산인 글라이신을 라이신 펩토이드로 치환시킨 서열번호 2에 기재된 Pis-1 NkG 항생 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 접힘 구조를 갖는 N-말단의 유연성을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
3. 제2항에 있어서, 상기 유연성 부위는 항생 펩타이드와 세포막의 결합력 향상을 위한 접힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
4. 제 3항에 있어서, 상기 세포막은 그람 양성균, 그람 음성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
5. 제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되는 균주에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.
10. 제 9항에 있어서, 상기 항균용 조성물은 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhimurium , Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis 및 Staphylococcus aureus로 이루어진 군에서 선택되는 균주에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 동물에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 동물은 사람, 마우스, 개, 말, 소, 돼지, 닭, 양, 고양이로 구성된 군으로부터 선택된 동물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제

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